Associatie van serum lncRNA CASC11 met de ernst en ontsteking van het letsel bij ruggenmergletsel

Samenvatting

Bij patiënten met ruggenmergletsel (SCI) is de opregulering van CASC11 geassocieerd met de ernst van het letsel. In vitro verminderde CASC11-downregulatie apoptose en ontsteking, wat wijst op een associatie met de miR-130b-5p/SPP1-as . Deze resultaten suggereren de potentiële rol van CASC11 als biomarkerkandidaat in de pathogenese van SCI.

Samenvatting

Ruggenmergletsel (SCI) is een ernstig trauma aan het centrale zenuwstelsel. Deze enkel-centraal, observationele en in vitro studie onderzocht het diagnostisch potentieel van CASC11 en het mogelijke regulerende mechanisme bij SCI met behulp van klinische serummonsters en lipopolysaccharide-gestimuleerde celmodellen. CASC11, miR-130b-5p en SPP1-niveaus werden gemeten met real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Cellulaire functies en doelwitten werden beoordeeld via celtelkit-8 (CCK-8), flowcytometrie, western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dual-luciferase reporter en RNA immunoprecipitation (RIP) assays. CASC11 was sterk tot expressie gebracht in SCI en geassocieerd met ontsteking als een potentiële diagnostische biomarker. In met lipopolysacchariden (LPS)-behandelde PC-12-cellen verminderde het dempen van CASC11 onderdrukte celactiviteit, apoptose en ontsteking, wat werd omgekeerd door miR-130b-5p-remmer. Deze bevindingen suggereren dat CASC11 geassocieerd is met de ernst van SCI, terwijl in vitro gegevens wijzen op betrokkenheid bij inflammatoire en apoptotische reacties via de CASC11/miR-130b-5p/SPP1-as . Deze studie wordt beperkt door het ontwerp met één centrum en het ontbreken van in vivo validatie.

Inleiding

Ruggenmergletsel (SCI) duidt op een tijdelijke of permanente systemische aandoening die ontstaat door schade aan het ruggenmerg veroorzaakt door externe krachten of ziekten, wat resulteert in een beperking van de motorische, sensorische, reflex- en autonome zenuwstelselfuncties ^1,2. Patiënten ervaren vaak levenslange fysieke functionele tekorten en complicaties, wat aanzienlijke pijn en lasten oplegt voor individuen en families. De etiologie van SCI wordt grofweg ingedeeld in traumatische en niet-traumatische oorsprongen³. Traumatische verwondingen, voornamelijk het gevolg van wervelkolomfracturen door externe krachten zoals verkeersonvallen, vallen van hoogte en sportgerelateerde incidenten, vormen een groeiende uitdaging in het klinische beheer van SCI⁴. Ondertussen worden de secundaire letselcascade die na de primaire schade wordt geïnitieerd, met name de ontregeling van de ontstekingsreactie en neuronale apoptose, beschouwd als cruciale factoren die bijdragen aan de voortdurende achteruitgang van de neurologische functie. Recente studies hebben de cruciale rol van neuro-inflammatie, regeneratie en functioneel herstel in de pathofysiologie en herstel van SCI⁵ benadrukt. Als centrale secundaire respons speelt neuroontsteking een dubbele rol in het proces van weefselbeschadiging en -herstel. Gezien de beperkte regeneratieve capaciteit van het beschadigde ruggenmerg is een synergetische therapeutische aanpak nodig die ontstekingsremmende behandeling, celtransplantatie, revalidatie en moleculaire interventies combineert⁶. Hoewel er een reeks diagnostische en therapeutische strategieën voor SCI is vastgesteld, is de huidige klinische praktijk voornamelijk afhankelijk van beeldvormende onderzoeken⁷. Deze technieken worden echter beperkt door hun hoge eisen aan geavanceerde apparatuur, strikte patiëntenvereisten en aanzienlijke financiële kosten⁸. Daarom is er een dringende en onvervulde behoefte aan een handige, nauwkeurige en niet-invasieve laboratoriumbiomarker. De identificatie van zo'n marker zou een vroege diagnose van SCI mogelijk maken zonder conventionele behandelprotocollen te verstoren, waardoor de ontwikkeling van snellere en effectievere therapeutische interventies mogelijk wordt.

Lang niet-coderend RNA (lncRNA) vormen een belangrijke categorie functionele RNA-moleculen die, ondanks het ontbreken van eiwitcoderend potentieel, integraal zijn voor een breed scala aan biologische functies, waaronder de regulatie van ontsteking en apoptose⁹. LncRNA's fungeren als moleculaire sponsjes voor microRNA's (miRNA's), waardoor deze miRNA's effectief worden belemmerd om te binden aan en hun doelgerichte mRNA's^te dempen. Zo mediteert lncRNA MAGI2-AS3 miR-223-3p om de genezing van de breuk^te versnellen. Het richten op het lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2-netwerk biedt een veelbelovende therapeutische aanpak om het herstel bij SCI¹² te verbeteren. CASC11, gekenmerkt door een 872-bp transcript op chromosoom 8q24.21, wordt erkend als een molecuul met een ontregelde expressie in verschillende menselijke kankers¹³. CASC11 vertoont positieve expressie bij patiënten met postmenopausale osteoporose en heeft het vermogen om getroffen personen te onderscheiden van gezonde controles¹⁴. Bovendien vertoont CASC11 een vergelijkbaar upregulatiepatroon en therapeutisch potentieel bij patiënten met fracturen¹⁵. Op basis van deze rapporten kan CASC11 ontstekingsreacties en celactiviteit reguleren. Ondanks deze inzichten blijven het expressiepatroon en de biologische rol van CASC11 bij SCI volledig onbekend. Aangezien hyperontsteking en apoptose belangrijke oorzaken zijn van secundaire SCI, hebben we de hypothese gesteld dat CASC11 mogelijk een kandidaatbiomarker en regulerende factor bij SCI is. Deze studie onderzocht de klinische associatie en het biomarkerpotentieel van CASC11 bij SCI door patiëntcohorten en in vitro celmodellen te analyseren (Figuur 1). Daarnaast onderzochten we een mogelijk moleculair mechanisme van CASC11, inclusief de mogelijke rol ervan bij het moduleren van de ontstekingsrespons na SCI.

Protocol

Inschrijving van vakken

Patiënten met acuut ruggenmergletsel (n = 300) die van januari 2023 tot mei 2025 in het ziekenhuis werden behandeld, werden geselecteerd en geclassificeerd in de groep volledige ruggenmergletsel (CSCI) (graad A, n = 98), incomplete ruggenmergletsel (ISCI) groep (graden B, C en D; n = 95) en de normale neurologische functie (NNF) groep (graad E, n = 107) volgens de American Spinal Injury Association Impairment Scale (AIS-classificatie). Voor patiënten in de NNF-groep werd radiologisch bewijs van SCI, zoals oedeem, kneuzing of compressie, bevestigd door magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), maar er werden geen sensorische of motorische tekorten aangetoond. Nog eens 90 gezonde deelnemers die in dezelfde periode werden gerekruteerd, werden geselecteerd als controlegroep. Inclusiecriteria waren: (1) diagnose van SCI bevestigd door beeldvorming (MRI of CT), in overeenstemming met de vastgestelde klinische richtlijnen¹⁶; (2) trauma opgelopen binnen 24 uur vóór ziekenhuisopname; en (3) volwassen deelnemers met volledige klinische gegevens. Uitsluitingscriteria waren: (1) voorgeschiedenis van eerdere operaties gerelateerd aan een fractuur of SCI; (2) ernstige coronaire hartziekte of significante cardiopulmonale aandoening; (3) acute ernstige craniocerebrale letsel; en (4) kwaadaardige tumoren, cardiovasculaire/cerebrovasculaire aandoeningen of immuunziekten. Goedkeuring voor deze studie werd verkregen van de Ethische Commissie van het Vierde Volksziekenhuis van Shenzhen, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de proefpersonen. De procedures die in deze studie werden gebruikt, hielden zich aan de principes van de Verklaring van Helsinki.

Verzameling exemplaren

Veneuze bloedmonsters (5 mL) werden bij opname bij opname afgenomen met serumseparatorbuizen binnen 24 uur na de verwonding. Het bloed werd 30 minuten bij kamertemperatuur laten stollen en vervolgens 10 minuten bij 3.000 × g gecentrifugeerd bij 4 °C. Het supernatantserum werd zorgvuldig gescheiden, gealiquoteerd in RNase-vrije microbuizen en opgeslagen bij -80 °C tot nadere analyse.

Celkweek en LPS-inductie

Rattenpheochromocytoomcellen (PC-12) en muis-microgliale cellen (BV-2) werden gekweekt in Dulbecco's aangepaste Eagle-medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum bij 37 °C. Om in vitro ontstekingsbeschadigingsmodellen op te stellen, werden PC-12 en BV-2 cellen blootgesteld aan lipopolysaccharide (LPS) bij concentraties van 0, 1, 5 en 10 μg/mL gedurende 12 uur^{en 17}. Elke concentratie werd getest in drie onafhankelijke biologische replicata.

RT-qPCR

Het totale RNA werd geïsoleerd uit de monsters met behulp van een fenol-chloroform-extractieprotocol, gevolgd door precipitatie met isopropanol. De zuiverheid van RNA werd beoordeeld met spectrofotometrie, en monsters met een A_{260/280 nm-verhouding} binnen het bereik van 1,8–2,1 werden gebruikt voor downstream-analyse. RNA werd reverse-getranscribeerd in cDNA volgens het reverse transcription kit-protocol, en het resulterende cDNA werd gebruikt als sjabloon voor RT-qPCR-reacties met een SYBR Green-premix op een PCR-instrument. Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd gebruikt als referentiegen voor CASC11 en SPP1 mRNA, en klein nucleair RNA (U6) werd gebruikt als referentiegen voor miR-130b-5p. Voor serummonsters werd synthetisch cel-miR-39 in het serum gespiked vóór RNA-extractie om variaties in RNA-terugwinning te controleren. De primers waren als volgt: CASC11 forward 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3' en reverse 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p vooruit 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' en achteruit 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; en SPP1 mRNA vooraan 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' en achteraan 5'-CATGGTCATCATCATCTCTTCA-3'. De expressie werd berekend met behulp van de ^{2-ΔΔCt-methode} . Elke RT-qPCR-reactie werd uitgevoerd in drievoudige technische replicaten met drie biologische replicaten.

Transfectie

Silencing CASC11 (si-CASC11), miR-130b-5p mimic/inhibitor, SPP1 overexpressieplasmide (ov-SPP1) en hun respectievelijke negatieve controles (NC) werden gesynthetiseerd en getransfecteerd in PC-12 en BV-2 cellen met behulp van een transfectie-reagentia. De transfectie-efficiëntie werd 48 uur na transfectie beoordeeld in drievoudige biologische replicaten.

Proliferatie- en apoptosetest

Voor de cellevensvatbaarheidstest werden cellen in 96-wellplaten geplaatst met 5 × 10³ cellen per put en 24 uur gekweekt om hechting mogelijk te maken. Na deze incubatie werd 10 μL CCK-8-reagens in elke put gedoseerd, gevolgd door 2 uur incubatie bij 37 °C. De optische dichtheid werd vervolgens geregistreerd op 450 nm met een microplaatlezer. Voor apoptosedetectie werden de cellen losgemaakt met trypsine, tweemaal afgespoeld met fosfaatgevulde zoutoplossing (PBS) en in de bindingsbuffer gesuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van 1 × 10⁶ cellen per put. Vervolgens werd 100 μL van de suspensie in een 5 mL flowcytometriebuis geplaatst, gevolgd door toevoeging van 5 μL Annexin V-FITC en 5 μL propidiumjodide (PI) kleuringsoplossing. Monsters werden voorzichtig gemengd en 15 minuten op kamertemperatuur bewaard om tegen licht te beschermen. Vervolgens werd een bindingsbuffer toegevoegd aan een laatste extra volume van 400 μL per buis, en apoptotische cellen werden gekwantificeerd met flowcytometrie. Alle condities werden geanalyseerd met drie technische replicaten in drie onafhankelijke biologische experimenten.

Dual-luciferase activiteitstest

De downstream-doelen van CASC11 en miR-130b-5p werden voorspeld via bio-informaticawebsites (lncRNASNP2 en TargetScan). Fragmenten met de wild-type (wt) of mutant (mutant) complementaire sequenties werden gesynthetiseerd en gekloond tot een dual-luciferase reportervector om wt- en mut-reporterplasmiden te construeren. PC-12-cellen werden gezaaid en co-transfecteerd met miR-130b-5p mimic/inhibitor en de geconstrueerde wt/mut plasmiden met behulp van een lipide-gebaseerd transfectie-reagens. Na 48 uur werd de activiteit van luciferase gekwantificeerd om de interactie te beoordelen. Elke groep bestond uit drie technische replicaten en drie biologische replicaten.

RNA-immunoprecipitatie (RIP) assay

RIP werd uitgevoerd met behulp van een RNA-bindend eiwit immunoprecipitatiekit. Cellen werden gelyseerd met een lysisbuffer en geïncubeerd met een anti-Ago2-antilichaam of een normaal IgG-antilichaam. RNA-eiwitcomplexen werden verrijkt met magnetische kralen. Na het wassen werden gebonden eiwitten verwijderd en werd immunoprecipiteerd RNA geïsoleerd. De verrijkingsniveaus van CASC11 en miR-130b-5p werden gekwantificeerd door RT-qPCR. Elke groep bestond uit drie technische replicaten en drie biologische replicaten.

Westelijk vlek

Eiwitlysaten werden bereid uit PC-12- en BV-2-cellen met behulp van een cellysebuffer, en het totale eiwitgehalte werd gemeten met een BCA-assay. Voor elk monster werd 30 μg eiwit geladen op 12% SDS-PAGE-gels en na elektroforetische scheiding overgedragen aan PVDF-membranen. De membranen werden 2 uur lang geblokkeerd bij kamertemperatuur in 5% magere melk, verdund in TBST, en vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen Bcl-2, Bax, gesplitste caspase-3 en GAPDH bij een verdunning van 1:1.000. Na het wassen werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antistoffen. Eiwitsignalen werden geanalyseerd met behulp van beeldanalysesoftware en banddichtheden werden gebruikt om de expressie van apoptose-gerelateerde eiwitten te beoordelen. De western blot-experimenten omvatten drie biologische replicaten, met drie technische replicaten per groep.

ELISA

De concentraties van ontstekingscytokines TNF-α, IL-1β en IL-6 in patiëntserum en PC-12 en BV-2 celsupernatanten werden gekwantificeerd met ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden geïncubeerd in voorgecoate putten en detectieantilichamen werden toegevoegd voor verdere incubatie. Enzymconjugaten werden toegevoegd en geïncubeerd. Na het wassen werden substraten toegevoegd voor kleurontwikkeling en werden de reacties beëindigd. De absorptie werd gemeten bij 450 nm met een microplaatlezer en omgezet naar concentraties van ontstekingsfactoren op basis van de verstrekte standaardcurve. Elke ELISA-assay werd uitgevoerd in driedubbele technische replicaten over drie onafhankelijke biologische replicaten.

Statistische analyse

Continue variabelen werden gerapporteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), en categorische variabelen werden gepresenteerd als getallen en percentages (n, %). Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van de Student's t-test. Voor vergelijkingen met meer dan twee groepen werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) toegepast, gevolgd door Tukey's post-hoc test. Het vermogen van CASC11 om te onderscheiden tussen klinische groepen werd geëvalueerd met behulp van een analyse van de receiver operating characteristic (ROC). Associaties tussen twee variabelen werden onderzocht met Pearson-correlatieanalyse. Voor celgebaseerde experimenten bevatte elke groep drie onafhankelijke biologische replicaten, en elke meting werd herhaald in drie technische replicaten. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05.

Resultaten

Basisgegevens van de proefpersonen

De basiskenmerken van patiënten in de Control-, NNF-, ISCI- en CSCI-groepen worden weergegeven in Tabel 1. Statistische analyse toonde geen significante intergroepsverschillen aan in variabelen zoals geslacht, leeftijd, body mass index (BMI), etiologie van het letsel en het tijdstip van het letsel (P > 0,05). Significante verschillen tussen de vier groepen werden waargenomen voor ver...

Discussie

SCI is een verwoestende aandoening van het centrale zenuwstelsel die vaak leidt tot aanzienlijke tekorten in gevoel, motorische controle en autonome functie, waardoor de kwaliteit van leven en de langetermijnprognose van een patiënt aanzienlijk afneemt¹⁸. Patiënten kunnen zich presenteren met functionele beperking en sensorisch verlies na spinaal trauma, en beeldvormende onderzoeken (zoals MRI) kunnen worden ingezet om het optreden van SCI¹⁹

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	pmirGLO vector
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Image analysis software	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	ImageJ software
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Lysis buffer	Beyotime, China	P0013D	RIPA lysis buffer
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 and BV-2 cells	ATCC, Manassas, USA
Phenol-chloroform reagent	Thermo, USA	15596026	Trizol reagent
Reverse transcription kit	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
RNA-binding protein immunoprecipitation kit	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
RNase-free microtubes	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Serum separator tubes	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Statistical analysis software	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq