Hier presenteren we een protocol om een microfluïdisch systeem te fabriceren en te bedienen dat endotheelcellen blootstelt aan gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulserende schuifspanning. Deze benadering biedt een fysiologisch relevant in vitro model voor het bestuderen van diabetische endotheeldysfunctie. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van oxidatieve stress en endotheelcelresponsen mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Endotheeldisfunctie bij diabetische vasculaire complicaties omvat complexe interacties tussen metabole stoornissen, specifiek oscillerende glucose (OG) en pulsatieve schuifstress (PSS). Hoewel deze factoren geïsoleerd zijn onderzocht, blijven conventionele modellen beperkt tot statische hoge glucose of vereenvoudigde laminaire stroming, zonder het vermogen om de geïntegreerde ruimtelijke temporele koppeling in de diabetische bloedvaten na te bootsen. Door gebruik te maken van een programmeerbaar microfludiïdisch platform biedt dit protocol een waardevol platform om de geïntegreerde effecten van gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en fysiologische PSS op endotheelcellen te onderzoeken. Dit protocol heeft als doel endotheeldisfunctie te modelleren onder fysiologisch relevante gekoppelde metabole en mechanische omstandigheden. Het gebruik van een polydimethylsiloxaan (PDMS) chip gecombineerd met een drukgestuurd besturingssysteem maakt precieze, onafhankelijke modulatie van stroomgolfvormen en glucoseconcentratieprofielen mogelijk. De hemodynamische trouw van het systeem wordt gevalideerd door Micro-Particle Image Velocimetrie (Micro-PIV), terwijl de cellulaire respons kwantitatief wordt gekarakteriseerd door het monitoren van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus en cellevensvatbaarheid. Representatieve resultaten tonen aan dat fysiologische PSS effectief de oxidatieve schade die door OG wordt veroorzaakt, vermindert. Dit effect wordt aangetoond door verlaagde intracellulaire ROS-niveaus en verbeterde cellevensvatbaarheid onder gecombineerde stimulatiecondities. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters zoals schuifspanningspatronen, glucoseoscillatiefrequenties en kanaalgeometrieën worden aangepast. Deze methode dient als een veelzijdig hulpmiddel voor mechanistische studies van mechanobiologische routes en medicijnscreening voor therapeutische interventies bij diabetische vasculaire ziekten.
Inleiding
Endotheeldisfunctie is een cruciale vroege gebeurtenis in de ontwikkeling van diabetische vasculaire complicaties, veroorzaakt door zowel metabole verstoringen als abnormale hemodynamische krachten 1,2. OG-niveaus, in plaats van alleen aanhoudende hyperglykemie, worden steeds vaker erkend als krachtige veroorzakers van oxidatieve stress en ontstekingssignalering in endotheelcellen, wat leidt tot vasculaire schade en verstoorde homeostase 3,4,5. Tegelijkertijd is hemodynamische schuifs....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethische verklaring:
OPMERKING: Alle reagentia, apparaten en software die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Microfluidische chipfabricage
- Gebruik computerondersteund ontwerp (CAD) software om de structuur van de microfluidische chip te ontwerpen (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figuur 1A) en maak de SU-8 meestermal via een commercieel bedrijf.
- Meng PDMS uithardingsmiddel en prepolymeer in een verhouding van 10:1 per gewicht in een schone mengbeker en roer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Micro-PIV validatie van het stroomveld binnen het microfluïdische kanaal
Figuur 1D geeft een overzicht van het microfluïdische platform dat wordt gebruikt om endotheelresponsen op gekoppelde metabole en mechanische stimulatie te onderzoeken. Het systeem integreert een rechtkanaals PDMS microfluidische chip met een drukgestuurde flowregelmodule, waardoor de toepassing van de OG-conditie samen met fysiologische PSS mogelijk is. Een program.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin beschreven microfluidische systeem biedt een robuust en fysiologisch relevant platform om de geïntegreerde effecten van OG en PSS op de functie van endotheelcellen te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze methode ligt in het vermogen om mechanische en biochemische prikkels binnen een gedefinieerde microomgeving nauwkeurig te controleren en te ontkoppelen. In tegenstelling tot conventionele statische culturen die geen hemodynamische krachten hebben of diermodellen di.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflict aan.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Stichting voor Natuurwetenschappen van China (subsidienummers 12372304, 12172081) en de Fundamentele Onderzoeksfondsen voor de Centrale Universiteiten (DUT25YG272).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211052 | Celdissociatie |
| 1 mL spuit | Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd. | 1mL | Vloeistof injecteren |
| 60 mm kweekschaal | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 705001 | Celcultuur |
| 90° gebogen roestvrijstalen connector | Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd. | 1.3 mm | Adapter afdichtingsapparaat |
| AutoCAD software | Autodesk | RRID:SCR_014981 | Computerondersteund ontwerpsoftware |
| Boronized glazen fles | Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd. | Dubbele doorgang 100mL | reservoir |
| Calcein-AM/PI Kit | Beyotime | byt-c2015 | Kleuren |
| Cel incubator | ESCO | Esco CelMate | Celcultuur |
| CellROX Deep Red | Invitrogen | C10422 | Kleuren |
| D-glucose | Sigma Aldrich | 47249 | Glucose |
| D-mannitol | Macklin | M813423 | Balans osmotische druk |
| DynamicStudio | Dantec Dynamics | V8.6 | PIV analysesoftware |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Gibco | 14190-094 | Medium |
| Fibronectine | Sigma Aldrich | F-2006 | Celhechting |
| Fluorescente microdeeltjes | Thermo Scientific | G0100 | Micro-PIV |
| Glaze dekglas | Citotest Scientific Co.,Ltd. | #1 | Microfluidische chip |
| Hoge glucose DMEM | Solarbio | 12100 | Medium |
| Hogesnelheidscamera | Dantec Dynamics | FlowSense EO | Micro-PIV |
| ImageJ | NIH | RRID:SCR_003070 | Beeldverwerkingssoftware |
| Omgekeerde fluorescentiemicroscoop | Olympus | IX73 | Celviabiliteit |
| Omgekeerde fluorescentiemicroscoop | Olympus | IX83 | Observatie en acquisitie |
| Lage glucose DMEM | Solarbio | 31600 | Medium |
| Origin | OriginLab | RRID:SCR_014212 | Data-analyse- en grafieksoftware |
| PDMS | Dow lnc. | 184 | Microfluidische chip |
| Penicilline/streptomycine (P/S) | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211092 | Medium |
| Fosfaat bufferoplossing (PBS) | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211031 | Celcultuur |
| Plasma cleaner | Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd. | PC-6D | Microfluidische chip |
| Programmeerbaar drukregelsysteem | Elvesys | OB1 MK4 | Stroomcontrole |
| Siliconen buis | Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd. | 96410 | 1mm*3mm |
| SU-8 master mal | Boao Biology Group Co. Ltd. | N/A | Microfluidische chip |
| Ventilatiesturing | Elvesys | MUX Wire V3 | Stroomcontrole |
Referenties
- Zhang, H., Dellsperger, K. C., Zhang, C. The link between metabolic abnormalities and endothelial dysfunction in type 2 diabetes: An update. Basic Research in Cardiology. 107 (1), 237(2011).
- Yang, D. R., Wang, M. Y., Zhang, C. L., Wang, Y.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
