Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie

Summary

Hier presenteren we een protocol om een microfluïdisch systeem te fabriceren en te bedienen dat endotheelcellen blootstelt aan gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulserende schuifspanning. Deze benadering biedt een fysiologisch relevant in vitro model voor het bestuderen van diabetische endotheeldysfunctie. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van oxidatieve stress en endotheelcelresponsen mogelijk.

Abstract

Endotheeldisfunctie bij diabetische vasculaire complicaties omvat complexe interacties tussen metabole stoornissen, specifiek oscillerende glucose (OG) en pulsatieve schuifstress (PSS). Hoewel deze factoren geïsoleerd zijn onderzocht, blijven conventionele modellen beperkt tot statische hoge glucose of vereenvoudigde laminaire stroming, zonder het vermogen om de geïntegreerde ruimtelijke temporele koppeling in de diabetische bloedvaten na te bootsen. Door gebruik te maken van een programmeerbaar microfludiïdisch platform biedt dit protocol een waardevol platform om de geïntegreerde effecten van gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en fysiologische PSS op endotheelcellen te onderzoeken. Dit protocol heeft als doel endotheeldisfunctie te modelleren onder fysiologisch relevante gekoppelde metabole en mechanische omstandigheden. Het gebruik van een polydimethylsiloxaan (PDMS) chip gecombineerd met een drukgestuurd besturingssysteem maakt precieze, onafhankelijke modulatie van stroomgolfvormen en glucoseconcentratieprofielen mogelijk. De hemodynamische trouw van het systeem wordt gevalideerd door Micro-Particle Image Velocimetrie (Micro-PIV), terwijl de cellulaire respons kwantitatief wordt gekarakteriseerd door het monitoren van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus en cellevensvatbaarheid. Representatieve resultaten tonen aan dat fysiologische PSS effectief de oxidatieve schade die door OG wordt veroorzaakt, vermindert. Dit effect wordt aangetoond door verlaagde intracellulaire ROS-niveaus en verbeterde cellevensvatbaarheid onder gecombineerde stimulatiecondities. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters zoals schuifspanningspatronen, glucoseoscillatiefrequenties en kanaalgeometrieën worden aangepast. Deze methode dient als een veelzijdig hulpmiddel voor mechanistische studies van mechanobiologische routes en medicijnscreening voor therapeutische interventies bij diabetische vasculaire ziekten.

Introduction

Endotheeldisfunctie is een cruciale vroege gebeurtenis in de ontwikkeling van diabetische vasculaire complicaties, veroorzaakt door zowel metabole verstoringen als abnormale hemodynamische krachten ^1,2. OG-niveaus, in plaats van alleen aanhoudende hyperglykemie, worden steeds vaker erkend als krachtige veroorzakers van oxidatieve stress en ontstekingssignalering in endotheelcellen, wat leidt tot vasculaire schade en verstoorde homeostase ^3,4,5. Tegelijkertijd is hemodynamische schuifstress een belangrijke factor van het endotheelfenotype, waarbij PSS onder fysiologische inspanningsomstandigheden de productie van stikstofmonoxide, antioxidantenverdediging en vasculaire bescherming bevordert ^6,7,8. Daarom is het begrijpen van de geïntegreerde effecten van oscillerende hyperglykemie en hemodynamische stimulatie essentieel om mechanismen van endotheeldisfunctie te verduidelijken.

Conventionele in vitro modellen, die vaak vertrouwen op statische hoge glucosecondities of vereenvoudigde laminaire stroming, slagen er niet in de complexe, dynamische wisselwerking tussen metabole en mechanische signalen die in vivo ^aanwezig zijn^, te repliceren^. Hoewel diermodellen systemische aspecten van diabetes vastleggen, missen ze de cellulaire resolutie die nodig is om signalering onder gecontroleerde micro-omgevingsomstandigheden te dissectieren¹². Microfluidische technologie biedt een effectief alternatief, met precieze ruimtelijke en temporele controle van biochemische en biomechanische stimuli in fysiologisch relevante geometrieën¹³, en heeft belangrijke recente ontwikkelingen in diverse innovatieve biomedische toepassingen^{gestimuleerd 14,15}. Zo ontwierpen Chen et ^al.16 een microfluïdisch apparaat met ruimtelijke en temporele wandafschuifspanning en ATP-signalering voor het bestuderen van intracellulaire Ca²⁺-dynamiek van endotheelcellen. Yu et ^al.11 ontwikkelden een hemodynamisch microfluïdisch chipsysteem om cellulaire responsen te detecteren onder verschillende combinaties van fysiologische PSS en hoge glucoseconcentraties. Hoewel deze systemen zijn gebruikt om endotheelreacties op schuifstress of enkelvoudige metabole verstoringen te bestuderen, zijn er maar weinig die zowel glucose-oscillaties als PSS succesvol hebben geïntegreerd binnen één systeem. Daarom ontbreekt er nog steeds een gestandaardiseerd, reproduceerbaar protocol dat beide factoren synchroniseert in een gecontroleerde microfluidische setting.

Deze methode vult deze kloof door een reproduceerbaar microfluidisch systeem te creëren dat gekoppelde OG en PSS kan leveren. Het primaire doel van deze benadering is het modelleren van oxidatieve stress, verminderde cellenvatbaarheid en mechanobiologische reacties die ten grondslag liggen aan endotheeldisfunctie op een fysiologisch relevante manier. In tegenstelling tot statische kweek of conventionele perfusiekamers verbetert deze aanpak bestaande modellen door gelijktijdige en gecontroleerde modulatie van zowel metabole als mechanische stimuli mogelijk te maken, waardoor de diabetische vaatmicro-omgeving nauwer wordt nagebootst. Bovendien is het systeem compatibel met live-cel beeldvorming, realtime monitoring en moleculaire analyse, waardoor het geschikt is voor een breed scala aan toepassingen, waaronder mechanistische studies, ziektemodellering en geneesmiddelenscreening voor endotheelfunctie en letsel.

Protocol

Ethische verklaring:

OPMERKING: Alle reagentia, apparaten en software die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Microfluidische chipfabricage

1. Gebruik computerondersteund ontwerp (CAD) software om de structuur van de microfluidische chip te ontwerpen (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figuur 1A) en maak de SU-8 meestermal via een commercieel bedrijf.
2. Meng PDMS uithardingsmiddel en prepolymeer in een verhouding van 10:1 per gewicht in een schone mengbeker en roer handmatig 5 minuten lang.
3. Plaats de container minimaal 15 minuten in een vacuümkamer onder -0,08 MPa om luchtbellen te verwijderen die tijdens het mengproces zijn vastgehouden.
   OPMERKING: Om het verwijderen van de bubbel te versnellen en overloop te voorkomen, laat de kamer tijdelijk luchten op atmosferische druk om de grote bellen te laten barsten, en pas het vacuüm vervolgens onmiddellijk opnieuw aan. Herhaal deze ventilatiecyclus 2–3 keer totdat het bulkmengsel volledig transparant is en vrij van macroscopische bellen.
4. Giet de PDMS op de wafer die in een glazen petrischaal is geplaatst.
5. Degas de PDMS die nog eens 15 minuten op de wafer in een desiccator werd gegoten om eventuele bubbels te verwijderen die tijdens het gieten gevormd zouden kunnen zijn.
   OPMERKING: Als er hardnekkige microbellen blijven vastzitten nabij of binnen de SU-8 master mold-structuren, blaas ze dan voorzichtig naar de rand of laat ze barsten met een handmatige rubberen luchtblazer. Volledige verwijdering van luchtbellen is cruciaal om structurele defecten in de microkanalen te voorkomen.
6. Plaats de petrischaal met schimmel en polymeer in een hete oven die op 80 °C is ingesteld voor 2 uur.
   VOORZICHTIG: Gebruik hittebestendige handschoenen bij het hanteren van hete materialen
7. Haal voorzichtig de gestolde polymeerplaat van de mastermal met een scalpel.
8. Gebruik een kernponsgereedschap (bijvoorbeeld 1,2 mm diameter) om inlaat- en uitlaatpoorten te maken bij de aangewezen kanaaluiteinden van de polymeerplaat.
9. Maak de glazen deklaag en het patroonoppervlak van de polymeerplaat schoon met lijmtape.
   PAUZEPUNT: De uitgeharde en geperforeerde PDMS-platen kunnen enkele weken op kamertemperatuur worden bewaard in een schone container (bijvoorbeeld een afgesloten petrischaal) op kamertemperatuur voordat plasmabehandeling en binding plaatsvinden.
10. Behandel zowel de polymeerplaat als de glazen deklaag met een plasmareiniger op 65W vermogen onder kamerlucht gedurende 60 seconden.
11. Lijn het polymeerkanaalvlak onmiddellijk uit op de behandelde zijde van de glazen deklaag.
12. Druk zachtjes om een permanent, gesloten microfluïdisch kanaal te creëren.

2. Endotheelcelvoorbereiding en zaaien

1. Plaats de gebonden microfludiïsche chip in een geboroniseerde glazen fles gevuld met gedeïoniseerd water en steriliseer door autoclaving te doen bij 121 °C en 15 psi gedurende 20 minuten.
   OPMERKING: Dompel de chip tijdens autoclaven in water om de druk gelijk te maken en vervorming van PDMS-microkanalen te voorkomen. Dit helpt ook om gevangen luchtbellen te verwijderen en de kanalen te voorbereiden voor de volgende vloeistofintroductie.
   PAUZEPUNT: De gesteriliseerde microfluïdische chips kunnen veilig worden bewaard in de afgesloten glazen fles op kamertemperatuur tot enkele weken totdat ze nodig zijn voor celzaaien.
2. Plaats de gesteriliseerde chip in een 60 mm kweekschaal gevuld met een 1:1 mengsel van fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met weinig glucose.
3. Breng 100 μg^·mL-1 fibronectine in het kanaal met een 1 mL spuit en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de microfluidische chip onder het vloeistofniveau wordt geplaatst. Verbind de adapterslang met de spuitnaald, vul de slang met vloeistof en steek deze onder het waterniveau, sluit de inlaat aan en injecteer dan om te zorgen dat er geen belletjes binnenkomen.
4. Voeg 24,5 mM D-mannitol toe aan een DMEM met een lage glucose (5,5 mM glucose) om de osmotische druk te verhogen. Voeg 5 mM D-glucose toe aan een hoge glucose DMEM (25 mM glucose) aan een uiteindelijke 30 mM glucose. Maak een normaal glucose (NG) kweekmedium en een hoog glucose (HG) kweekmedium, aangevuld met respectievelijk 20% foetaal rundserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine (P/S).
5. Warm 1× PBS, trypsine, NG en HG-kweekmedia in een waterbad bij 37 °C. Oogst de menselijke navelvenendotheelcellen (HUVEC's) uit de kweekschotel bij 90% confluentie. Verwijder de cellen met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing en incubeer bij 37 °C gedurende 30 seconden. Tel de geoogste cellen en pas de concentratie aan op respectievelijk 1 x 10⁶ cellen/mL in NG-medium en HG-medium.
6. Injecteer 100 μL celsuspensie in de inlaatpoort van een microfluïdische chip met een 1 mL spuit, waarbij NG-medium voor de controlegroep en HG-medium voor de experimentele groep worden gebruikt. Plaats microfluïdische chips in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5%_CO2 gedurende 48 uur.
   OPMERKING: Laat cellen minstens 4 uur hechten voordat ze verder worden verwerkt. Wissel handmatig de twee kweekmedia elke 2 uur af om oscillerende hyperglykemie te stimuleren tijdens de statische kweekfase. Houd de cellen 's nachts op 5,5 mM glucose om de in vivo situatie na te bootsen (Figuur 1B).

3. Dynamische stimulatie-opstelling

1. Vul twee reservoirs van 100 mL met respectievelijk NG- en HG-kweekmedia en verbind deze met de bijbehorende kanalen van het programmeerbare drukregelsysteem.
2. Verbind de reservoirs, de twee-positie drieweg magnetische klep en de microfluidische chip met siliconenbuis.
3. Gebruik 1,3 mm diameter 90° schuine roestvrijstalen connectoren om de inlaat- en uitlaatpoorten van de PDMS-chip aan de buis te bevestigen.
   OPMERKING: Steriliseer de 100 mL reservoirs, siliconen buizen en roestvrijstalen connectoren vooraf in een hogedruk, hoogtemperatuurautoclaaf.
4. Bereken de benodigde debiet (Q) om de beoogde PSS (τ) te bereiken. Gebruik de formule τ = (6μQ)/(wh²), waarbij μ de viscositeit, w de kanaalbreedte is en h de kanaalhoogte.
5. Stel een fysiologische doel-PSS in (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz), die overeenkomt met een berekende debiet van 200 ± 40 μL·^min-1.
6. Programmeer de programmeerbare luchtpomp om een sinusgolffunctie te genereren om de PSS te behouden. Programmeer de klepcontroller om elke 5 minuten van kanaal te wisselen om tijdens de dynamische stimulatie een vierkante golf glucose-oscillatie te genereren.
7. Start het programmeerbare pompsysteem om de gecombineerde OG en PSS voor in totaal 30 minuten te leveren.

4. Micro-PIV voor verificatie van het stromingsveld

1. Bereid de NG- en HG-media voor met een volumeconcentratie van 0,05% fluorescerende microdeeltjes (1 μm). Zorg ervoor dat de deeltjes gelijkmatig verspreid zijn en vrij van aggregatie.
2. Plaats een schone, celvrije microfluïdische chip (identiek aan die gebruikt in de celexperimenten) op het podium van de omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
3. Verbind alle componenten in het systeem (Figuur 1C).
   1. Verbind de drukbron met de drukregelaar.
   2. Verbind de drukregelaar met de klepregelaar, die is gekoppeld aan de computer voor geautomatiseerde regeling van drukgolfvormen.
   3. Verbind de drukregelaaruitgangen met de HG- en NG-reservoirs via aparte buizen.
   4. Verbind beide reservoirs met het 3/2 drukventiel, dat schakelt tussen HG- en NG-media volgens het geprogrammeerde oscillerende glucoseprotocol.
   5. Verbind de uitlaat van de 3/2 drukklep met de inlaat van de microfluïdische chip via een slang.
   6. Verbind de uitlaat van de microfluidische chip met het afvalreservoir.
   7. Plaats de microfluïdische chip op het microscooppodium voor live-celbeeldvorming gedurende het hele experiment.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alle slangverbindingen veilig en lekvrij zijn voordat je met de stroming begint.
4. Activeer de hogesnelheidscamera (die werkt op 15 Hz in dubbelbeeldmodus) nadat de stroming stabiel is om sequentiële beeldparen van de stromende microdeeltjes vast te leggen. Stel de precieze tijdsvertraging (Δt) tussen de twee frames van elk paar in op 80 μs.
5. Maak beelden voor de Region of Interest (ROI) binnen het kanaal. Selecteer de ROI in het midden van het rechte kanaalgedeelte (Figuur 2A), gelijk ver van zowel de inlaat als de uitlaat, om eindeffecten te voorkomen en representatieve debietmetingen te garanderen.
6. Verwerk de verkregen beeldparen met behulp van PIV-analysesoftware. Gebruik een adaptief multi-pass cross-correlatie-algoritme, beginnend met een initiële interrogatieruimte van 64 × 64 pixels en verfijnd tot een uiteindelijke oppervlakte van 16 × 16 pixels met een rasterstapgrootte van 8 × 8 pixels, om de verplaatsingsvector (Δx) van de deeltjes tussen de twee frames te bepalen.
7. Bereken de snelheidsvector (v) voor elk interrogatiegebied met behulp van de formule v = Δx / Δt.

5. Dataverzameling

OPMERKING: Kwantificeer de levensvatbaarheid en functie van cellen met behulp van de Calcein-AM/propidium jodide (PI) Kit en de fluorescerende sonde van levende cellen oxidatieve stress om de schade veroorzaakt door glucosefluctuaties te verifiëren en het effect van co-stimulatie te evalueren.

1. Cellevensvatbaarheid
   1. Bereid de Calcein-AM/PI werkoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant op het experimentele eindpunt.
      VOORZICHTIG: PI is een bekend mutageen en vermoedelijk een kankerverwekkend stof die in DNA wordt geïntercaleerd. Ga er uiterst voorzichtig mee om. Draag handschoenen en hanteer het binnen een aangewezen veilige werkplek.
   2. Spoel het kanaal één keer af met PBS en breng de Calcein-AM/PI werkoplossing in het kanaal. Incubeer het apparaat op 37 °C met 5%_CO2 gedurende 30 minuten in het donker.
   3. Maak onmiddellijk fluorescerende beelden van de gekleurde cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een objectief van 10×. Gebruik het FITC (groen) filter voor Calcein-AM en het TRITC- of Rhodamine (rood) filter voor PI.
2. Meet intracellulaire ROS
   1. Bereid de werkoplossing voor de oxidatieve stressfluorescerende probe (zie Materiaaltabel) voor bij de concentratie die door de fabrikant (5 μM) in PBS is gespecificeerd.
      VOORZICHTIG: Fluorescerende probes en hun gebruikelijke standaardoplossingsmiddelen (zoals DMSO) kunnen giftig zijn en kunnen de opname van gevaarlijke stoffen via de huid bevorderen. Draag handschoenen en hanteer het binnen een aangewezen veilige werkplek.
   2. Spoel het kanaal drie keer door met PBS en breng de live-cell oxidatieve stressfluorescerende probe-oplossing in het kanaal. Incubeer de chip bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 30 minuten in het donker.
   3. Spoel het kanaal drie keer door met PBS om de ongebonden probe te verwijderen. Maak onmiddellijk fluorescerende beelden met het Far-Red filterset (excitatie 640 nm, emissie 665 nm) door een 20× objectieflens, waarbij exact dezelfde belichtingsparameters voor alle groepen behouden blijven.
      OPMERKING: Verhoogde fluorescentieintensiteit duidt op hogere ROS-niveaus.

6. Data-analyse

PAUZEPUNT: Zodra alle ruwe fluorescerende beelden en hogesnelheidscamerabeelden zijn gemaakt en veilig op een harde schijf zijn opgeslagen, kunnen de daaropvolgende beeldverwerking, kwantitatieve analyse en statistische vergelijkingen worden gepauzeerd en op elk later moment worden uitgevoerd.

1. Kwantificeer cellevensvatbaarheid
   1. Open de verkregen Calcein-AM (groen) en PI (rood) beelden in ImageJ (zie Materiaaltabel). Stel handmatig de drempel voor elk kanaal aan om fluorescerende signalen van de achtergrond te onderscheiden. Gebruik de celtellerfunctie om fluorescerende cellen te tellen, waarbij de minimale celgrootte wordt aangepast aan de waargenomen celgrootte, en het aantal levende (N_levende) en dode (N_dode) cellen in meerdere gezichtsvelden wordt geteld.
      OPMERKING: N_Live verwijst naar het aantal Calcein-AM-positieve (groene) cellen, N_Dead naar het aantal PI-positieve (rode) cellen.
   2. Bereken het percentage levende cellen (N_Live / (N_Live + N_Dead) x 100%) voor elke experimentele conditie met behulp van spreadsheetsoftware. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie over meerdere gezichtsvelden met behulp van statistische analysesoftware voor vergelijking tussen groepen.
2. Kwantificeer intracellulaire ROS
   1. Drag afbeelding naar keuze in ImageJ. Stel de schaal in door de pixelgrootte te kalibreren met behulp van de metadata van de microscoop (of een bekend referentierooster): Analyseren | Stel de schaal in.
   2. Verwijder een niet-specifiek uniform achtergrondsignaal uit het gehele beeld met behulp van de achtergrondaftrekfunctie: Proces | Achtergrond aftrekken.
   3. Pas handmatig de drempelschuif aan om het intracellulaire ROS-signaal te segmenteren en te definiëren: Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Zodra de drempel is ingesteld, gebruik je Analyze | Stel metingen in om de Gebieds- en Gemiddelde grijswaarde te kiezen. Stel de minimale celgrootte in volgens de waargenomen celgrootte en meet de gemiddelde intensiteit van het gesegmenteerde signaal binnen de celmonolaag ROI: Analyseren | Analyseer deeltjes.
   4. Rapporteer het ROS-niveau voor elke experimentele conditie als het gemiddelden van de gemeten waarden (bijv. gemiddelde intensiteit) die zijn afgeleid van ten minste drie willekeurig geselecteerde gezichtsvelden per chip.
3. Statistische vergelijkingen uitvoeren
   1. Voer de kwantitatieve resultaten (levensvatbaarheidspercentage en ROS-gemiddelde intensiteit) in in data-analyse- en grafieksoftware (zie Materiaaltabel).
   2. Bepaal de statistische significantie door de experimentele groepen te vergelijken met de controlegroep via een tweerichtings-variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's post-hoc test, met een significantieniveau van p = 0,05. Gebruik de software om de analyse uit te voeren en genereer grafieken met foutbalken die standaardafwijking (SD) weergeven.

Results

Micro-PIV validatie van het stroomveld binnen het microfluïdische kanaal
Figuur 1D geeft een overzicht van het microfluïdische platform dat wordt gebruikt om endotheelresponsen op gekoppelde metabole en mechanische stimulatie te onderzoeken. Het systeem integreert een rechtkanaals PDMS microfluidische chip met een drukgestuurde flowregelmodule, waardoor de toepassing van de OG-conditie samen met fysiologische PSS mogelijk is. Een program...

Discussion

Het hierin beschreven microfluidische systeem biedt een robuust en fysiologisch relevant platform om de geïntegreerde effecten van OG en PSS op de functie van endotheelcellen te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze methode ligt in het vermogen om mechanische en biochemische prikkels binnen een gedefinieerde microomgeving nauwkeurig te controleren en te ontkoppelen. In tegenstelling tot conventionele statische culturen die geen hemodynamische krachten hebben of diermodellen di...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Celdissociatie
1 mL-seringpomp	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Vloeistof injecteren
60 mm kweekbakje	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Celcultuur
90° hoekige roestvrijstalen connector	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1.3 mm	Adapter afdichtingsapparaat
AutoCAD software	Autodesk	RRID:SCR_014981	Computer-aided design software
Boronized glasfles	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Dubbel-pass 100mL	reservoir
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	byt-c2015	Vlek
Celincubator	ESCO	Esco CelMate	Celcultuur
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Vlek
D-glucose	Sigma Aldrich	47249	Glucose
D-mannitol	Macklin	M813423	Osmotische druk balanceren
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	PIV analyse software
Fetaal bovien serum (FBS)	Gibco	14190-094	Medium
Fibronectine	Sigma Aldrich	F-2006	Cel adhesie
Fluorescente microdeeltjes	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Glasdeksel	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Microfluidic chip
High glucose DMEM	Solarbio	12100	Medium
High-speed camera	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Beeldverwerkingssoftware
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX73	Cellevensvatbaarheid
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX83	Observatie en acquisitie
Low glucose DMEM	Solarbio	31600	Medium
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Gegevensanalyse en grafiek software
PDMS	Dow lnc.	184	Microfluidic chip
Penicilline/streptomycine (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medium
Fosfaat bufferoplossing (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Celcultuur
Plasma cleaner	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Microfluidic chip
Programmeerbaar drukcontrolesysteem	Elvesys	OB1 MK4	Stroomcontrole
Siliconen buis	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 master mal	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Microfluidic chip
Ventilatie controller	Elvesys	MUX Wire V3	Stroomcontrole