Methodenartikel

Een microfluïdisch platform om microbiële neerslag van metaaloxiden in poreuze media te onderzoeken

243 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

12 juni 2026

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een microfluïdisch systeem voor het bestuderen van de microbiële neerslag van mangaanoxidemineralen. Biomineraalvorming wordt ter plaatse gemeten met optische microscopie en beeldanalyse. Deze benadering kan worden aangepast om de neerslag van andere karakteristiek gekleurde biogene mineralen in poreuze omgevingen te onderzoeken.

Samenvatting

Micro-organismen slaan vaak metaaloxide-nanodeeltjes neer in bodems, sedimenten en andere milieurelevante poreuze media. De vorming en reactiviteit van mangaan (Mn) en ijzer (Fe) oxiden blijven echter slecht gekarakteriseerd in fysisch complexe omgevingen. Hoewel laboratoriumsystemen poreuze media als substraat kunnen gebruiken, vereisen ze destructieve bemonstering en zijn ze niet gemakkelijk geschikt voor porieschaalanalyses. De dynamische maar ontoegankelijke aard van poreuze media vereist daarom het vermogen om microbieel gemedieerde mineraalprecipitatie ter plaatse en in real time op te lossen. Om deze kloof te dichten, wordt een microfluïdisch platform ontwikkeld om de microbiële neerslag van metaaloxiden in een modelporieruimte te evalueren. Dit platform is gevalideerd met de Mn-oxiderende bacterie Pseudomonas putida GB-1. Biofilmontwikkeling en bijbehorende Mn-oxide neerslag worden onder continue stroom met time-lapse kleurbrightfield microscopie gevisualiseerd. Een beeldsubtractie-algoritme wordt vervolgens gecombineerd met eindpuntmassametingen om de snelheid van Mn-oxide neerslag te schatten. Deze benadering biedt een hulpmiddel om systematisch te testen hoe microbiële neerslag van metaaloxiden varieert als reactie op veranderende fysieke en chemische omstandigheden.

Inleiding

Metaaloxidemineralen spelen een cruciale rol in biogeochemische cyclus1. Mangaanoxiden (Mn) en ijzer (Fe) zijn negatief geladen bij circumneutrale pH en absorberen gemakkelijk kationische metalen 2,3,4,5,6,7,8, wat de beschikbaarheid van micronutriënten en de mobiliteit van verontreinigingen in de rhizosfeer en hyporeïsche zone reguleert. Deze mineralen beïnvloeden de stabiliteit en afbraak van organisch materiaal 9,10,11,12, en bepalen de opname van koolstof door planten en bodemmicroben. In technische systemen (bijv. waterzuiveringsfilters, aangelegde wetlands) wordt metaaloxide-neerslag direct benut voor het verwijderen van Mn of Fe en het saneren van samenvallende verontreinigingen 13,14,15,16,17. Deze metaaloxiden zijn herkenbaar aan hun karakteristieke kleuren, die variëren van oker tot donkerbruin tot zwart18,19.

De neerslag van metaaloxiden wordt vaak mogelijk gemaakt door micro-organismen in een proces dat bekend staat als biomineralisatie 20,21,22. Talrijke Mn-oxiderende bacteriën en schimmels synthetiseren multikoperoxidasen en peroxidasen die de elektronenoverdracht van Mn(II) naar Mn(III) en Mn(IV) katalyseren onder aerobe omstandigheden, wat resulteert in de precipitatie van birkesietachtige Mn(III, IV) oxidemineralen 2,23,24. Daarnaast oxideren diverse Fe-oxiderende bacteriën enzymatisch Fe(II) tot Fe(III) in circumneutrale of zure omgevingen met beperkte zuurstof, waardoor Fe(II, III) (oxyhydr)oxiden ontstaan, waaronder ferrihydriet en magnetiet 25,26,27,28. Deze biogene mineralen slaan neer naast celoppervlakken en hopen zich op op extracellulaire polymeren, omhulsels en andere cellulaire structuren, waardoor microbe-mineraalassemblages 2,23,25,27,29,30 ontstaan.

Ondanks de alomtegenwoordigheid van Mn- en Fe-biomineralisatie in complexe omgevingen, ontbreken inzichten op porieschaal. Porieruimten zijn structureel heterogeen en vertonen een voorkeursvloeistofstroom en niet-uniforme reaganttransport die de verdeling van biogeochemische reacties bepalen31,32,33,34,35. Bovendien kan microbiële activiteit lokale geochemische gradiënten genereren die biomineralisatie bevorderen of beperken, terwijl fluctuaties in de chemie van porievloeistof (bijv. pH, opgeloste zuurstof, redoxpotentiaal) de mineraalprecipitatie kunnen versterken of de oplossingkunnen bevorderen 34,35. Studies naar Mn- en Fe-biomineralisatie baseren zich doorgaans op goed gemengde batchcondities30, 36, 37, 38, 39, 40 of kolommen41, 42, 43, 44 om oxidatiekinetiek te kwantificeren of biomineraalprecipitaten te karakteriseren. Batch-experimenten missen echter de ruimtelijke heterogeniteit die inherent is aan poreuze systemen. Kolommen met verpakte granulaire media bieden relevante fysieke architectuur, maar zijn beperkt in hun bruikbaarheid omdat ze destructieve bemonstering op statische tijdstippen vereisen, wat de voortgang van het experiment stopt en onverstoorde porieschaalwaarnemingen voorkomt. Daarom zijn nieuwe experimentele benaderingen nodig om de microbiële neerslag van metaaloxiden in poreuze media te onderzoeken.

Microfludiïdische systemen zijn een hulpmiddel om biogeochemische reacties ter plaatse en in realtime te bestuderen. Microfluidische reactoren kunnen snel en tegen lage kosten worden vervaardigd met reproduceerbare en aanpasbare geometrieën die natuurlijke of geïdealiseerde poreuze mediasimuleren. De resulterende apparaten zijn optisch transparant, wat niet-destructieve visualisatie en kwantificering van porieschaalprocessen mogelijk maakt, waaronder biofilmvorming 46,47,48,49, hotspotontwikkeling 50,51, abiotische metaalprecipitatie52,53 en calcietbiomineralisatie 34,54,55,56. Daarnaast stellen microfluïdische systemen gebruikers in staat om randvoorwaarden te regelen en systematisch te variëren, waaronder metaalconcentratie, aanwezigheid of afwezigheid van opgeloste zuurstof en vloeistofstroomsnelheid. Ten slotte kunnen, afhankelijk van het materiaal van het reactorsubstraat, directe metingen van microbe-mineraal-vloeistofinteracties worden verkregen met behulp van röntgen-, Raman- of infraroodspectroscopie57. De ontwikkeling van zo'n op microfluidica gebaseerd platform om de microbiële neerslag van metaaloxiden te bestuderen, biedt daarmee een weg voor nieuw onderzoek naar de vorming en reactiviteit van Mn- of Fe-mineraalfasen die de cyclus van koolstof, nutriënten en verontreinigingen in poreuze omgevingen aansturen.

Dit werk gebruikt Mn-biomineralisatie als casestudy om de microbiële neerslag van metaaloxiden in een dynamische poreuze omgeving te kwantificeren. Het volgende protocol demonstreert hoe een microfluïdische reactor kan worden vervaardigd en geïnëntificeerd met Pseudomonas putida GB-1, een modelbacterie die bekend staat om het oxideren van Mn(II) tot Mn(III, IV) in de stationaire groeifase 58,59. Met behulp van een drukgebaseerd stromingscontrolesysteem worden nutriëntrijk groeimedium en minimale zoutoplossing sequentieel geïnjecteerd om de vorming van biofilms te bevorderen en Mn-oxide neerslag te induceren. Heldere kleurenbeelden van de microfluïde porieruimte worden op regelmatige tijdsintervallen verzameld, waarbij het kleurcontrast tussen P. putida GB-1 biofilms en ophopende Mn-oxiden wordt vastgelegd. Aan het einde van elk experiment worden alle Mn-oxiden in de reactor verteerd en wordt de totale massa gemeten met inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (ICP-MS). De snelheid van Mn-oxide neerslag wordt geschat als functie van de tijd door deze eindpuntmassametingen te integreren met een beeldaftrekalgoritme. Deze workflow kan gemakkelijk worden aangepast om andere organismen of metaaloxide-neerslagprocessen onder verschillende omgevingsomstandigheden te onderzoeken.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol maakt verschillende aannames over de achtergrondkennis van gebruikers en de beschikbare instrumentatie. Ten eerste moeten gebruikers toegang hebben tot een cleanroom en bekend zijn met fotolithografieprocedures om een microfluïdische mal te vervaardigen, of een commerciële mal aanschaffen. Vervolgens moeten gebruikers bekend zijn met basismethoden in de microbiologie, zoals het gebruik van aseptische technieken, het bereiden van bouillonoplossingen en het strepen van platen. Gebruikers hebben ook toegang nodig tot een autoclave, microcentrifuge, shaker-incubator en massaspectrometer. Tot slot moeten gebruikers bedreven zijn in optische microscopie en beeldanalyse.

1. Microfluidische reactorfabricage en assemblage

OPMERKING: De microfluidische reactoren die in dit protocol worden gebruikt, zijn ontworpen in AutoCAD met een zandkorrelgeometrie die is aangepast van Wang et al.55. Elke mal produceert zes replicatiekanalen met een porieruimte van 15 mm × 10 mm, een porositeit van 0,41 en een porievolume van 2,3 μL. Behalve voor plasmabehandeling worden reactoren vervaardigd in een laminaire stroomkast om een stofarm milieu te behouden.

  1. Giet de microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van zachte lithografie.
    1. In een plastic beker weeg je de elastomeerbasis en uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 (hier respectievelijk 25 g en 2,5 g).
    2. Meng met een plastic mes de elastomeerbasis en het uithardingsmiddel grondig gedurende 10 minuten.
    3. Ontgass het PDMS in de cup met een vacuüm desiccator gedurende 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
    4. Giet het PDMS in de mal en ontgass 30 minuten om eventuele resterende lucht te verwijderen.
    5. Plaats de mal op een hete plaat en hard het 3 uur uit bij 95 °C.
    6. Als het uitgehard en afgekoeld is, gebruik je een scalpel om het PDMS eruit te snijden en uit de mal te pellen.
    7. Op een snijmat snijd je de zes microfludiïdische kanalen uit elkaar met een scheermesje, waarbij je 2–3 mm rond de rand van elk kanaal laat. Sla inlaat- en uitlaatgaten in elk kanaal met een biopsiepunch.
    8. Bedek beide zijden van elk microfluïdisch kanaal met een strook doorzichtig tape om stofophoping te voorkomen en bewaar in een petrischaal van 100 mm.
  2. Een dag voor het experiment assembleer je de uiteindelijke microfluïdische reactor met luchtplasma.
    1. Verwijder het doorzichtige tape uit een microfluïdisch kanaal, spoel dan de PDMS en een glazen afdekplaat af met 70% ethanol en droog met geperste stikstof.
      VOORZICHTIG: Ethanol is brandbaar. Hanteer en bewaar volgens het veiligheidsgegevensblad.
    2. Plaats het microfluidische kanaal en de afdekplaat met de afbeelding naar boven in een plasmareiniger. Ontruim de kamer voor 1 minuut, en breng daarna plasma toe voor 1 minuut (18 W en ~0,5 torr).
    3. Verwijder het microfluïdische kanaal en de deksel van de plasmareiniger en plaats de deksel op de PDMS, waarbij je zachtjes tikt om de hechting te garanderen. Bewaar de gemonteerde reactor een nacht in een 100 mm petrischaal.

2. Microfluïdisch stroombeheersysteem

OPMERKING: Een modulair systeem van Elveflow wordt gebruikt om sequentiële vloeistofinjectie te faciliteren met minimale verstoringen in druk en debiet. Systeemcomponenten omvatten een luchtcompressor, debietregelaar, distributieventiel, debietsensor, vloeistofreservoirrek (voor 15-mL conische buizen) en Elveflow Smart Interface (ESI) software (Figuur 1). Andere stroomregelsystemen, zoals spuitpompen, kunnen worden gebruikt in infusie- of aftrekmodus, met speciale spuiten of reservoirs voor elke influente oplossing en een splitsklep met laag dode volume om sequentiële vloeistofinjectie via een enkele buisleiding te faciliteren. Er moet echter voorzichtig worden geacht met spuitpompen om drukfluctuaties te minimaliseren die biofilms kunnen losmaken.

figure-protocol-1
Figuur 1: Stroomregelsysteem en geometrie van de microfluïdische reactor. Het experimentele systeem bestaat uit een debietregelaar (1) die via pneumatische buizen is verbonden (2) met een vloeistofreservoirrek, (3), een distributieklep om sequentiële injectie van groeimedium (GMMn) en zoutoplossing (SSMn) (4) te bieden, (4), een stroomsensor (5) verbonden met de stroomregelaar om realtime feedback en stroomaanpassing te bieden, (6), PEEK-buizen met een kleine binnendiameter om vloeistofweerstand te bieden, (7), een bubbelval (8) stroomopwaarts van de microfludiïdische reactor (9). Systeemschema niet op schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Stel alle hardware op en kalibriseer ze volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Het vloeistofreservoirrek, distributieventiel en debietsensor zijn geïnstalleerd in een speciaal gebouwde microscoopincubator om het experiment op 30 °C te houden.
  2. Stel de drukregelaar van de luchtcompressor in op 3 bar en verbind de luchtcompressoruitlaat met pneumatische polyurethaanbuis op de inlaat van de stroomregelaar.
  3. Bevestig een hydrofobe filter aan de uitlaat van de stroomregelaar om terugstroming van vloeistof te voorkomen, en verbind de stroomregelaar vervolgens met pneumatische polyetherpolyurethaanbuis op twee inlaatpoorten van het vloeistofreservoirrek met behulp van een spruitstuk en weerhaakadapters.
  4. Verbind het vloeistofreservoirrek, distributieventiel en debietsensor met de buis als volgt, met flensloze fittingen voor 1/16 inch buitendiameter buis, tenzij anders vermeld.
    1. Verbind twee uitlaatpoorten van het vloeistofreservoirrek met de eerste twee inlaatpoorten van het distributieventiel met 80 cm 1/32 inch binnendiameter (ID) polytetrafluorethyleen (PTFE) buis.
    2. Verbind de uitlaatpoort van het distributieventiel met de inlaatpoort van de debietsensor met 15 cm 500-μm ID PTFE-slang en een adapterbevestiging.
    3. Bevestig 60 cm 63,5-μm ID polyetherether keton (PEEK) buis aan de uitgang van de stroomsensor met behulp van een adapterbevestiging.
      OPMERKING: Voor experimenten met verschillende debietsnelheden kun je de lengte van de PEEK-buis aanpassen naar behoefte om voldoende vloeistofweerstand te bieden voor stromingsstabiliteit.
    4. Verbind de PEEK-slang met 10 cm 500-μm ID PTFE-slang met een aansluiting.
    5. Bevestig de PTFE-slang aan de inlaatpoort van een microfluïdische bellenval die is uitgerust met een PTFE-membraanfilter (poriegrootte ~10 μm).
    6. Bevestig 75 cm 200-μm ID PTFE-slang aan de uitlaatpoort van de bubbelval om tegendruk te creëren voor effectieve bubbelverwijdering. Deze buis zal worden bevestigd aan het inlaatgat van de microfluidische reactor.
  5. Steriliseer voor elk experiment het stroomregelsysteem met alle slangen en hardware verbonden door een bleekoplossing van 1% te spoelen voor drie keer het systeemvolume (~4 uur per buisleiding bij 7,0 μL·min-1), gevolgd door steriel ultrazuiver water voor dezelfde duur.
  6. Tussen de experimenten door maak je het stroomregelsysteem als volgt schoon.
    1. Spoel het distributieventiel en de debietsensor door 100% isopropanol en steriel ultrazuiver water door te spoelen om ophoping van residuen of neerslagstoffen te voorkomen.
      VOORZICHTIG: Isopropanol is brandbaar. Hanteer en bewaar volgens het veiligheidsgegevensblad.
    2. Autoclave: de bubbelval.
    3. Vervang na elk experiment het bubbelvangmembraanfilter en de 200-μm ID PTFE-buis om verstopping (membraanfilter) of bacteriële kolonisatie (buis) te voorkomen.

3. Experimentele media en oplossingen

  1. Maak vloeibare Luria-bouillon (LB, Miller's formulering) medium door 2,5% LB-poeder te autoklaveren in ultrazuiver water bij 121 °C gedurende 20 minuten. Voor LB-agarplaten, autoclave, 2,5% LB-poeder en 1,5% agar in ultrazuiver water bij 121 °C gedurende 20 minuten, daarna giet je in 100 mm petrischaaltjes (~20 mL per schaal) en laat ze afkoelen tot ze stevig zijn.
  2. Uit filtergesteriliseerde voorraadoplossingen bereid met American Chemical Society (ACS) of bacteriologische reagentia in ultrazuiver water, maak 30 mL van elk van de volgende ingrediënten. De samenstelling van zoutoplossing en groeimedium zijn aangepast aan Gehin et al.59.
    1. Bereid zoutoplossing voor zonder Mn(II) (SS0): 0,4 mM CaCl2·2H2O, 0,25 mM MgSO 4,7H2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O en 40 μM EDTA aangepast naar pH 6,5 met 1M NaOH), 10 mM HEPES-buffer (aangepast naar pH 7,0 met 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4, en spoormetalen (40 nM CuSO4·5H2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2·6H2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) in steriel ultrazuiver water.
    2. Bereid zoutoplossing voor met Mn(II) (SSMn): Hetzelfde als SS0 met 50 μM MnCl2·4H2Otoegevoegd.
    3. Bereid groeimedium voor zonder Mn(II) (GM0): Hetzelfde als SS0 met 1,5 g· L-1 gistextract en 1,5 g· L-1 casaminozuur toegevoegd.
    4. Bereid groeimedium voor met Mn(II) (GMMn): Hetzelfde als GM0 met 50 μM MnCl2·4H2O toegevoegd.
      VOORZICHTIG: Zoutoplossingen en groeimedia bevatten metalen met zowel gezondheids- als milieugevaren. Hanteer en bewaar volgens de veiligheidsgegevens.
  3. Bereid een zuuroplossing voor met 40 mM oxaalzuurdihidraat en 2% salpeterzuur in ultrazuiver water voor de vertering van de Mn-oxiden in de microfluidische reactor.
    VOORZICHTIG: Oxaalzuurdihydraat en salpeterzuur zijn corrosief, en salpeterzuur is een sterke oxidator. Hanteer en bewaar volgens de veiligheidsgegevens.
  4. Bereid een 1% salpeterzuuroplossing voor in ultrazuiver water voor ICP-MS monsterverdunning.

4. Bacteriële kweek

OPMERKING: Bacteriële kweek wordt uitgevoerd met aseptische techniek op het werkblad met een bunsenbrander. Materialen zijn steriel, tenzij anders vermeld. De incubatieduur is specifiek voor P. putida GB-1 en kan worden aangepast voor andere micro-organismen.

  1. Vanaf een -80 °C kolf streep P. putida GB-1 op een LB agarplaat. Incubeer de plaat ongeveer 20 uur bij 30 °C om de groei van bacteriekolonies mogelijk te maken.
  2. Voeg de avond voor het experiment 10 mL LB-medium toe aan een 50 mL kegelvormige buis en inoculeer met één plaatkolonie. Incubeer de LB-precultuur in een shaker-incubator bij 30 °C en 180 tpm gedurende 16 uur om de stationaire fase te bereiken.
  3. Na 16 uur incubatie wordt 1 mL LB voorgekweekt in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en 1 minuut gecentrifugeerd op 8.000 x g om de bacterie te pelleten.
  4. Was de aliquot drie keer om het gebruikte LB-medium te verwijderen door het supernatant weg te gooien, de celpellet opnieuw te suspenderen in 1 mL SS0 en te centrifugeren gedurende 1 minuut op 8.000 x g. Suspendeer de laatste pellet opnieuw in 1 mL SS0.
  5. Meet de optische dichtheid (OD600) van de gewassen cel-suspensie in een niet-steriele cuvette met een celdichtheidsmeter. De verwachte OD600 voor P. putida GB-1 is 3,6–3,8 in deze stap, dus een minstens 5-voudige verdunning in SS0 is vereist.
  6. Inoculeer 20 ml GM0 met gewassen cel-suspensie tot een initiële OD600 van 0,01 in een 50 mL Erlenmeyer-kolf. Incubeer 6 uur bij 30 °C en 180 toeren per minuut om de midden-exponentiële fase te bereiken.

5. Biomineralisatie-experiment

  1. Op de ochtend van het experiment zet je het stroomcontrolesysteem voor.
    1. Verwarm de microscoop-incubator voor tot 30 °C.
    2. Giet 10 mL GMMn en SSMn in twee 15-mL conische buizen en verbind de buizen met het vloeistofreservoirrek. Spoel SSMn ongeveer drie keer het systeemvolume (~4 uur bij 7,0 μL·min-1), gevolgd door GMMn voor dezelfde duur.
  2. Verzadig de voorbereide microfluïdische reactor 5 uur na het inoculeren van de midden-exponentiële cultuur.
    OPMERKING: Reactorverzadiging en inoculatie worden uitgevoerd met aseptische techniek op het werkblad met een bunsenbrander. Materialen zijn steriel, tenzij anders vermeld.
    1. Ontgass de reactor in een vacuüm desiccator gedurende 20 minuten.
    2. Terwijl de reactor ontgasst, zuig je 1–2 mL SS0 in een 3 mL plastic spuit, bevestig vervolgens een stompe naald en 20 cm 0,02-inch ID Tygon-buis. Druk op de spuitzuiger totdat de slang volledig verzadigd is.
    3. Verwijder de reactor van de desiccator, bevestig vervolgens de buis aan het uitlaatgat van de reactor met een schuine pincet en dod de reactor handmatig met de spuit totdat er een druppel ontstaat bij het inlaatgat van de reactor.
    4. Bevestig 20 cm 0,02-inch ID Tygon-buis aan het inlaatgat van de reactor. Blijf SSMn in de reactor doseren totdat alle luchtbellen zijn verwijderd (200–300 μL).
  3. Bereid het reactorinoculum voor en inoculeer de microfluïdische reactor.
    1. Verwijder de mid-exponentiële kweek 6 uur na de inoculatie uit de shaker-incubator en meet de OD600. De verwachte OD600 is 1,6–1,8 in deze stap, dus een viervoudige verdunning in SS0 wordt aanbevolen.
    2. Verdun de mid-exponentiële cultuur in 2 mL SSMn tot een initiële OD600 van 0,005 in een 2-mL microcentrifugebuis. Draai de buis meerdere keren om te mengen.
    3. Plaats de reactorinlaatbuis in de microcentrifugebuis, zodat een druppel vloeistof contact maakt met het inoculum om luchtinstroming in de buis te voorkomen. Sluit de microcentrifugebuis gedeeltelijk en sluit het deksel vast met tape om besmetting te voorkomen.
    4. Trek 4–5 mL SSMn uit een 5-mL glas, gasdichte spuit om de loop nat te maken, en doseer vervolgens totdat er 0,5 mL in de spuit zit. Laad de spuit in een spuitpomp.
    5. Haal de naald uit de plastic spuit en bevestig deze aan de glazen spuit, waarbij je erop let dat er geen lucht in de naaldnaaf wordt vastgehouden.
    6. Inoculeer de reactor met de spuitpomp door het inoculum 20 minuten in de reactor te trekken met een debiet van 8,33 μL·min-1 (~70 porievolumes).
    7. Na de inenting zet je de spuitpomp uit en laat je de bacteriën zich 1 uur lang vastzetten zonder doorstroming.
    8. Na 1 uur haal je de spuit uit de spuitpomp, maar laat je hem aangesloten op de uitlaatbuis.
  4. Verbind de geïnënteerde microfluïdische reactor met het stroomregelsysteem.
    1. Verplaats de reactor en spuit van het werkblad naar de microscoopincubator.
    2. Verwijder in de microscoopfase de inlaatbuis van de reactor.
    3. Duw zachtjes op de spuitzuiger om een druppel bij het inlaatgat van de reactor te creëren.
    4. Buig de PTFE-buis van het stroomregelsysteem handmatig onder een rechte hoek (~1 cm vanaf het uiteinde van de buis) zodat deze loodrecht op het PDMS-oppervlak aansluit, waardoor zijwaartse krachten en luchtintrusie in het reactorinlaatgat worden geminimaliseerd.
    5. Doop het uiteinde van de PTFE-buis in een oplossing van 1% polypolyeenglycoldiacrylaat (PEG-DA) om de hydrofobe buis aan de buitenkant te bevochtigen. Zorg ervoor dat er een druppel GMMn aan het uiteinde van de PTFE-buis zit en bevestig de buis aan het inlaatgat van de reactor.
    6. Koppel de spuit los en plaats de uitlaatbuis in een niet-steriele 5-mL microcentrifugebuis om het reactorafvalwater op te vangen.
    7. Stel de debiet in op 1,33 μL·min-1 in de software van het stroomregelsysteem. Een programma opgezet om GMMn 15 uur (~500 porievolumes) te leveren om biofilmvorming te bevorderen, gevolgd door SSMn voor 28,5 uur (~1.000 porievolumes) om Mn-biomineralisatie te induceren.
  5. Monteer de microfluidische reactor in de microscoopfase-insert.
    OPMERKING: Een speciaal gebouwd ultraviolet-C (UVC) bestralingssysteem dat aan de microscoopfase is bevestigd, wordt gebruikt om ongewenste bacteriële groei en mineraalprecipitatie buiten de microfluïde porieruimte te beperken (Figuur 2). Dit ontwerp is aangepast van Ramos et al.60 en kan worden aangestuurd met een geautomatiseerd programma. Zie Fadely et al.61 voor details.
    1. Plaats een monsterframe onder de reactor voor stabiliteit, monteer het frame en de reactor vervolgens stijf in de stage-insert, zodat ze volledig geïmmobiliseerd zijn.
    2. Bevestig de PTFE-buis met een stuk tape aan de inzet van de trap om te voorkomen dat de buis losraakt van het inlaatgat van de reactor.
    3. Lijn de UVC-armen op een afstand van 3 mm van de porierand aan de inlaatzijde en 2 mm aan de uitlaatzijde om verspreiding van ultraviolet licht en biofilmschade binnen de porieruimte te minimaliseren.
      OPMERKING: Een juiste UVC-uitlijning zal resulteren in weinig tot geen biomassa-ophoping in het reactorinlaatgebied (Figuur 3A). Uitlijning van de UVC-armen te ver van de inlaatrand van de porieruimte (Figuur 3B) of het ontbreken van bestraling (Figuur 3C) resulteert in minerale neerslag stroomopwaarts van de porieruimte.
    4. Stel een programma op voor reactorbestraling. Behandel de inlaat- en uitlaatregio's van de reactor gedurende 5 minuten bij t = 0 uur om de tijdens de inenting afgezette bacteriën te inactiveren, en behandel daarna de uitlaatregio slechts 5 minuten bij t = 17,5 uur om eventuele resterende biofilms te inactiveren.

figure-protocol-2
Figuur 2: Speciaal gebouwd ultraviolet-C (UVC) bestralingssysteem voor microfluïdische reactoren. (A). Bovenaanzicht van het systeem gemonteerd op de microscoopfase-insert met poseerbare armen (blauw) met bevestigde UVC-lichtdiode (LED) arrays (gele rechthoeken) en een microfluidische reactor gemonteerd op een monsterframe (kleine grijze rechthoek). (B). Onderaanzicht van het systeem met UVC-LED's (tan squares) ingebed in de poseerbare armen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Effect van UVC-bestraling op het inlaatgebied van de microfludiïde reactor. (A). Reactorinlaatgebied met een 5-minuten UVC-behandeling bij t = 0 uur, waarbij de juiste uitlijning wordt getoond voor volledige verwijdering van ongewenste biofilms. (B). Reactorinlaatgebied met een verkeerd uitgelijnde UVC-array, waardoor resterende biofilms in het inlaatgat en buiten de porieruimte zijn achtergelaten, waardoor Mn-oxiden stroomopwaarts kunnen neerslaan. (C). Reactorinlaatgebied zonder UVC-behandeling, wat leidt tot uitgebreide biofilmgroei en mineraalprecipitatie. Grijze schaduw markeert de porieruimte. De schaalbalk is 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Optische time-lapse microscopie

OPMERKING: Een Nikon Ti2 Eclipse omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera (2304 x 2304 pixels per gezichtsveld), een witlichtmotor, 4x objectief (1,62 μm·pixel-1) en NIS Elements-software wordt gebruikt voor kleurhelderveldbeelden. Andere optische microscopen die kleurbeeldvorming kunnen uitvoeren zijn ook geschikt. Het gebruik van kleurbeeldvorming verbetert de gevoeligheid voor een lage Mn-oxidemassa. Als timelapse-automatisering geen optie is, kunnen gebruikers afbeeldingen handmatig verzamelen en deze als tijdreeks achteraf verwerken.

  1. Voor beelden van hoge kwaliteit voer u de volgende uitlijnings- en correctiestappen uit:
    1. Om een gelijkmatige belichting te garanderen, stel je de Köhler-uitlijning handmatig aan volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Optimaliseer de brightfield-verlichting om onder- of oversaturatie te voorkomen (Fusion Pad > Color > Auto Brightness en Fusion Pad > Color > Auto White).
      OPMERKING: Het is het beste om de brightfield-verlichting slechts één keer te optimaliseren op een reactor die al biofilms en Mn-oxiden bevat, en vervolgens dezelfde belichtingstijd en kleurbalans toe te passen op alle volgende experimenten voor consistente belichting. Hier wordt een 5 ms verlichting gebruikt met rood op 97,58%, groen op 44,76% en blauw op 100%.
    3. Om quilt-artefacten te voorkomen bij het maken van gestikte afbeeldingen van de microfluïdische porieruimte, pas je een schaduwcorrectie toe (Acquire > Shading Correction Panel).
  2. Stel de middencoördinaat van de gestikte afbeelding in (ND Acquisition > XY).
  3. Stel het gestikte beeldscangebied in (hier, 5 x 4 gezichtsvelden) en pas een overlap van 1% toe (ND-opname > grote afbeelding).
  4. Stel de opname van kleurhelderveldbeelden in met het 4x-objectief (ND Acquisition > λ).
  5. Stel de beeldvormingsfrequentie in met intervallen van 1 uur voor 15 uur (groeifase) en 0,5 uur voor 28,5 uur (mineralisatiefase) (ND Acquisitie > Tijd), en voer vervolgens het time-lapse programma uit.
    OPMERKING: De duur van de groei- en mineralisatiefasen is specifiek voor P. putida GB-1 en kan indien nodig worden aangepast voor andere micro-organismen.
  6. Wanneer het experiment voltooid is, exporteer je de afbeeldingen als Tagged Image File Format (TIFF) (Macro Panel > Export Images naar TIFF).

7. Zure vertering en Mn-massameting

OPMERKING: Een ICP-MS wordt gebruikt om de Mn-massa te meten die in de microfluïdische reactor wordt behouden, maar ook andere instrumenten, zoals optische emissiespectrometers (ICP-OES), zijn acceptabel. Als analytische instrumentatie niet beschikbaar is, kunnen zuurverteerde monsters naar een commercieel laboratorium worden gestuurd.

  1. Aan het einde van het experiment verwijder je de reactor uit de microscoopfase-insert en koppel je de inlaat- en uitlaatbuis los.
  2. Haal 1,5 mL zuuroplossing uit een 5 mL glas, gasdichte spuit (los van de inoculatiespuit). Bevestig een stompe naald en 20 cm 1/32-inch ID PTFE-slang aan de spuit en doseer handmatig zuur totdat er een druppel aan het uiteinde van de buis ontstaat.
  3. Op het werkblad laad je de spuit in een spuitpomp en verbind je de slanging met het inlaatgat van de reactor, waarbij je erop let dat er geen luchtbellen worden vastgehouden, die kunnen voorkomen dat de zuuroplossing alle poriën doordringt. Verbind 30 cm 1/32-inch ID PTFE-buis met het reactoruitgangsgat en plaats het uiteinde van de uitlaatbuis in een 2-mL microcentrifugebuis.
  4. Injecteer een zure oplossing in de reactor gedurende 10 minuten met een debiet van 100 μL·min-1.
  5. Na injectie van de zuuroplossing koppel je de stompe naald los van de glazen spuit. Vul een 10-mL plastic spuit met lucht en sluit aan op de stompe naald, doseer vervolgens handmatig alle lucht in de spuit om het resterende zuur uit de reactor en slang in de 2-mL microcentrifugebuis te laten lopen.
    OPMERKING: Hoewel een klein volume zuuroplossing na luchtinjectie in de porie kan blijven vastzitten, is dit verwaarloosbaar ten opzichte van het totale geïnjecteerde volume. Gebruikers die werken met geometrieën met lagere porositeit kunnen overwegen extra hoeveelheden lucht door te spoelen om vloeistoffilms en restzuur uit slecht verbonden poriën te verwijderen.
  6. Verdun het verteerde monster met 1% salpeterzuur volgens het ICP-MS kalibratiebereik. Bereid hier een 100x verdunning voor (5 mL totaal volume) in een 15 mL conische buis.
  7. Meet de Mn-concentratie in het verdunde monster met ICP-MS. Corrigeer de gemeten concentratie met de verdunningsfactor en het totale monstervolume om de Mn-massa die in de reactor blijft vasthouden, te bepalen.

8. Beeldanalyse

OPMERKING: MATLAB wordt aanbevolen vanwege de ingebouwde functies voor beeldanalyse, die in de tekst zijn opgenomen. Andere tools zoals ImageJ of de beeldanalysebibliotheken van Python kunnen echter ook worden gebruikt om vergelijkbare analyses uit te voeren. Belangrijke stappen in beeldanalyse zijn weergegeven in Figuur 4. Alle beeldanalysescripts worden geleverd als aanvullende bestanden (Supplementair Bestand 1, Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3).

figure-protocol-4
Figuur 4: Beeldaftrekworkflow om Mn-oxide neerslagen te isoleren. Uit time-lapse kleurhelderveldbeelden werd een referentiebeeld (tref) (1) geïdentificeerd om de intensiteit van de onderliggende stationaire fase biofilms uit alle daaropvolgende tijdpuntbeelden (tn) te verwijderen. (2) Binaire maskers van alle tn werden gegenereerd (3) en vermenigvuldigd met zowel tref (4) als de bijbehorende tn (5) om de biofilm-biomineraalomvang vast te leggen. Ten slotte werden de gemaskerde tn afgetrokken van de gemaskerde tref (6). De resulterende intensiteitsgecorrigeerde matrices kwantificeren de afname in intensiteit (a.u.) door de ophoping van Mn-oxide bij elke pixel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Laad een hoge-resolutie TIFF van de microfluidische porieruimtegeometrie (geëxporteerd uit AutoCAD) in de werkruimte om te gebruiken als korrelmasker (onleesbaar).
  2. Zet de kleurheldere beelden recht en registreer ze om het korrelmasker effectief aan te brengen.
    1. Genereer een registratiebinaire van het eerste tijdpuntbeeld (t = 0 h).
      1. Laad de color brightfield TIFF in de werkruimte (imread).
      2. Snijd het beeld iets groter dan de grootte van de porieruimte (onbesnijden).
      3. Verscherp het beeld om de resolutie van korrelgrenzen te verbeteren (onscherp).
      4. Binariseer het beeld met een adaptieve drempel die donkere kenmerken prioriteert (rgb2gray, adaptthresh met voorgrondpolariteit = "donker" en gevoeligheid aangepast indien nodig, imbinariseer, imcomplement).
      5. Vul de korrels van de resulterende registratiebinaire om solide kenmerken te maken (invul met de "gaten" gespecificeerd). Let op dat niet alle korrels gevuld mogen worden.
      6. Erode de registratiebinaire naar behoefte om achtergrondruis te verwijderen, en verwijd vervolgens om verloren pixels aan korrelranden te vervangen (imerode, imdilate).
    2. Gebruik een schaalinvariant feature transform (SIFT) registratie-algoritme om de transformatiematrix te berekenen die nodig is om het registratiebinaire deel uit te lijnen met het korrelmasker (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d met transformatietype = "affiene").
    3. Pas deze transformatiematrix toe op het registratiebinaire en het eerste tijdpuntbeeld, en leg deze vervolgens over het korrelmasker om de passing te beoordelen (imwarp, imshowpair).
    4. Als slechte uitlijning blijft bestaan na de SIFT-registratie, pas dan lokale registratie toe indien nodig (cpselect, fitgeotform2d met transformtype = "lwm", imwarp).
    5. Snijd het geregistreerde beeld en korrelmasker bij indien nodig om registratieartefacten aan de matrixranden te verwijderen, en pas vervolgens de grootte aan naar de porieruimteafmetingen (15 mm x 10 mm) (imcrop, imresize).
    6. Loop door alle kleurkleur-brightfield-afbeeldingen om dezelfde registratie (imwarp) toe te passen.
  3. Identificeer visueel een referentiebeeld (tref, Paneel 1 in Figuur 4) wanneer biofilms voor het eerst in de stationaire fase komen, bepaald als een gebrek aan voortdurende beweging of groei (hier t = 18,5 uur).
  4. Binariseer elk tijdpuntbeeld (tn, Paneel 2 in Figuur 4) (rgb2gray, adaptthresh met voorgrondpolariteit = "donker" en gevoeligheid aangepast indien nodig, imbinariseer, imcomplement) zodat biofilm-biomineraalassemblages = 1 en korrels en lege poriën = 0. Vermenigvuldig elk tijdpuntmasker met het omgekeerde korrelmasker (imcomplement) om resterende korrelgrenzen te verwijderen.
  5. Vermenigvuldig tn met het bijbehorende tijdpuntmasker (Paneel 3 in Figuur 4) om het biofilm-biomineraalgebied van belang te isoleren (Paneel 5 in Figuur 4), en vermenigvuldig vervolgens tref met elk tijdpuntmasker om hetzelfde gebied te isoleren (Paneel 4 in Figuur 4).
  6. Trek alle gemaskeerde tn af van de gemaskeerdet-ref om de afname van pixelintensiteit te kwantificeren die samenhangt met de ophoping van Mn-oxide op elk tijdstip (imsubtract), en converteer vervolgens naar samengestelde intensiteitsgecorrigeerde matrices (rgb2gray, Paneel 6 in Figuur 4).
  7. Om de minerale ruimtelijke verdeling over de porieruimte (a.u.) te evalueren, tel je op langs de kolommen (som met dimensie = 1) van elke intensiteitsgecorrigeerde matrix.
  8. Om de snelheid van Mn-oxide neerslag over de tijd te schatten (μg·h-1):
    1. Tel elke intensiteitsgecorrigeerde matrix op (som met dimensie = "alle") om de totale gecorrigeerde intensiteit op elk tijdstip te kwantificeren.
    2. Deel de totale gecorrigeerde intensiteit op elk tijdstip door de totale gecorrigeerde intensiteit op het laatste tijdstip zodat het eindtijdpunt = 1 is en alle voorgaande waarden fractioneel zijn. Herschalen naar μg door te vermenigvuldigen met de Mn-massa gemeten met ICP-MS.
    3. Neem de afgeleide met betrekking tot tijd door de massatoename (μg) tussen opeenvolgende tijdspunten (diff) te delen door het tijdsinterval tussen beelden (0,5 uur).

Resultaten

Dit protocol biedt een experimenteel platform voor ruimtelijk opgeloste beeldvorming van biofilmvorming en Mn-biomineralisatie. Kleurhelderveldbeelden toonden aan dat P. putida GB-1 biofilms gelijkmatig verdeeld waren over de microfludiaanse porieruimte op t = 18,5 uur vóór het begin van Mn-oxide neerslag (Figuur 5A). Vervolgens hoopten Mn-oxiden zich bij voorkeur op aan de inlaatzijde van de porieruimte het dichtst bij de influerende Mn(II)-bron (Figuur 5B). Het verschil tussen het referentiebeeld en latere beeldtijdpunten toonde de geïsoleerde bijdrage van Mn-oxideprecipitaten aan de totale beeldintensiteit (Figuur 5C) en maakte kwantificering mogelijk van de waargenomen reactorschaalgradiënt in mineraalophoping (Figuur 5D). Op biofilmschaal legde deze beeldsubtractiemethode de geleidelijke neerslag van Mn-oxiden op biofilmoppervlakken en de ophoping van mineralen aan de randen van biofilms in contact met porievloeistof vast (Figuur 6).

Het protocol biedt verder een workflow om de kinetiek van Mn-oxide neerslag te schatten uit beeldsubtractie en ICP-MS-metingen. Drievoudige microfluidische reactoren bevatten 4,29 ± 0,22 μg Mn op het laatste experimentele tijdstip. De zuurvertering van de reactorinhoud werd eerder gevalideerd met synchrotron-gebaseerde metingen van de Mn-oxidemassa en bleek minder dan 18% fout61 te geven. Daarom werden de intensiteitsgecorrigeerde matrices opnieuw geschaald naar deze uiteindelijke massa. De resulterende geschatte neerslag van Mn-oxide was niet-monotoon, met een steil toename tussen t = 19,5 uur en t = 21 uur, voordat het piekte op 0,29 ± 0,04 μg·u-1 en geleidelijk vertraagde tot t = 43,5 uur (Figuur 7). Het moet worden opgemerkt dat deze snelheidsberekening geen rekening houdt met nanopartikel-Mn-oxiden onder de resolutie van de optische microscoop of met enige oxidemassa die verloren gaat door transport gedurende de experimentduur, die naar verwachting minimaal zal zijn. Deze benadering maakt daarom gebruik van toegankelijke microscopietechnieken om semi-kwantitatief temporele trends in biomineralisatiekinetiek te evalueren.

figure-results-1
Figuur 5: Reactorschaalverdeling van biofilms en Mn-oxiden. (A). Kleurhelder veld van P. putida GB-1 biofilms binnen de microfludische porieruimte bij het begin van de stationaire fase (t = 18,5 h, tref). (B). Kleurhelderveldbeeld van Mn-oxide neerslaat op en rond P. putida GB-1 biofilms op het laatste experimentele tijdstip (t = 43,5 uur). (C). Intensiteitsgecorrigeerde matrix van mineraalaccumulatie op het laatste experimentele tijdstip (t = 43,5 uur), met korrels grijs en poriën wit weergegeven. De schaalbalk is 1 mm. (D). Eendimensionale ruimtelijke verdeling van totale gecorrigeerde intensiteit van de inlaat (links) naar de uitlaatzijde (rechter) van de porieruimte (t = 43,5 uur). De doorgetrokken lijn stelt een voortschrijdend gemiddelde van 1 mm voor langs de porieruimte van inlaat tot uitgang, gemiddeld over drievoudige experimenten, en de schaduwwerking geeft de standaardafwijking aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 6: Biofilmschaal Mnoxide-accumulatie. (A). Selecteer kleurhelderveldbeelden van representatieve P. putida GB-1 biofilms. Mangaanoxiden waren eerst detecteerbaar als kleurverandering van grijs naar bruin op biofilmoppervlakken (getoond bij t = 20 uur en t = 21 uur) en later als een ophoping van donkerbruine neerslagen aan de randen van biofilm (getoond bij t = 33 uur en t = 43 uur). (B). Intensiteitsgecorrigeerde matrices van mineraalophoping met korrels in donkergrijs, poriën in wit en onderliggende biofilms in lichtgrijs. De schaalbalk is 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 7: Schatting van de neerslagsnelheid van Mn-oxide over de tijd. De snelheid (μg·h-1) werd gekwantificeerd door de totale gecorrigeerde intensiteit op elk tijdstip te herschalen naar het eindpunt Mn-massa gemeten met ICP-MS, en vervolgens de afgeleide te nemen met betrekking tot tijd. Markers geven het gemiddelde van drievoudige experimenten weer en de schaduw geeft de standaardafwijking aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Step1_ImageRegistration.00 uur.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Step2_ImageSubtraction.00Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Step3_Figures.00 uur.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit experimentele platform biedt unieke mogelijkheden om ruimtelijk-temporele dynamiek van biogeochemische processen in poreuze omgevingen te onderzoeken, vrij van artefacten die het verkrijgen van hooggetrouwde data verhinderen. Deze benadering is bijzonder geschikt voor Mn- en Fe-biomineralisatie, die mineraalprecipitaten produceren met karakteristieke oker-, bruin- en zwarte tinten die gemakkelijk kunnen worden gesegmenteerd met optische microscopie en beeldanalyse. Met Mn-biomineralisatie als casestudy is het mogelijk om patronen en snelheden van mineraalprecipitatie in situ te evalueren met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Verschillende aspecten van dit protocol maakten het mogelijk om reproduceerbare metingen van biogeochemische transformaties te verzamelen. Ten eerste maakte het gebruik van een sequentiële injectieklep met een laag dode volume experimenten met meerdere vloeistoffen mogelijk zonder de biofilms in de microfluïdische porieruimte te verstoren. Deze opstelling behield de initiële biofilm-ruimtelijke verdeling door drukpieken te voorkomen die kunnen leiden tot afwerpen of verplaatsing van biofilms bij het wisselen van geïnjecteerde vloeistoffen, wat kan voorkomen bij andere instrumenten zoals spuitpompen. Deze component biedt de gebruiker bovendien de flexibiliteit om de geochemische omstandigheden die aan de aanwezige micro-organismen worden opgelegd aan te passen. Ten slotte, omdat het de initiële biofilmdistributie behoudt, stelt deze opstelling de gebruiker in staat systematisch te testen hoe verschillende biofilmmorfologieën of biomassahoeveelheden de distributie en snelheid van Mn-oxide neerslag beïnvloeden.

Ten tweede maakte het beperken van de vorming en intrusie van bellen in de microfluïde porieruimte het mogelijk om meerdaagse experimenten te doen die de milieurelevante tijdschalen van Mn-biomineralisatie vastlegden. Bellen, een veelvoorkomend en vaak onvermijdelijk probleem in lange experimenten boven een kamertemperatuurvan 62,63, kunnen individuele poriën fragmenteren en blokkeren, vloeistofstroom omleiden en het reactieproces verstoren. Om te voorkomen dat bubbels in de porieruimte vastzitten, was de reactor volledig verzadigd vóór de inenting. Om de introductie van bellen via het stroomcontrolesysteem te minimaliseren, werd de microscoopincubator ruim voor het experiment op 30 °C gezet, en werden meerdere volumes influente oplossing doorgespoeld voordat de geïnënfiseerde reactor werd aangesloten. Deze stap verwijderde gevangen lucht uit de buizen en koppelingen en minimaliseerde het risico op vloeistofuitlating tijdens het experiment. Een bubbelval was ook geïntegreerd in het stroomregelsysteem om eventuele resterende belletjes op te vangen, met een lengte van 200 μm ID PTFE-buis bevestigd aan de vanguitlaat om de weerstand te verhogen en de efficiëntie van het verwijderen van de bubbels te verbeteren. Ten slotte, om te voorkomen dat lucht vastloopt of lekkage aan de interface tussen de influentiebuis en het inlaatgat van de reactor, werden alle verbindingen gemaakt met druppels vloeistof aan beide uiteinden van de buis en het geponste gat, werd de hydrofobe PTFE-buis bedekt met 1% PEG-DA, en het uiteinde van de ingevoegde buis bleef loodrecht op het PDMS-oppervlak gedurende het hele experiment.

Ten derde handhaafde het integreren van een speciaal gebouwd UVC-bestralingssysteem in het experimentele platform een gedefinieerde geochemische grensconditie en beperkte reproduceerbaar de Mn-biomineralisatie binnen de microfluïdische porieruimte. Pilotexperimenten toonden aan dat overbodige biofilms in het reactorinlaatgebied Mn-oxiden stroomopwaarts van de porieruimte neersloegen, waardoor de beschikbaarheid van Mn(II) stroomafwaarts werd beperkt. Door de inlaat- en uitlaatgebieden van de reactor kort te bestralen met de juiste uitlijning na de periode zonder doorstroming, werd biofilmontwikkeling van aanvankelijk afgezette bacteriën voorkomen. Continue eenrichtingsvloeistofstroom voorkwam herkolonisatie van het reactorinlaatgebied na deze initiële UVC-behandeling. Het bestralen van het reactoruitlaatgebied op t = 17,5 uur vóór het begin van de stationaire fase en zichtbare Mn-oxideprecipitatie minimaliseerde de hoeveelheid minerale ophoping stroomafwaarts van de porieruimte. Dit maakte directe vergelijking mogelijk van kleurhelderveldbeeldgegevens met Mn-massa die werd verteerd en gemeten met ICP-MS.

De combinatie van beeldsubtractie en eindpuntmassametingen bood een semi-kwantitatieve methode om de kinetiek van Mn-oxide neerslag in situ te evalueren. Het is echter belangrijk op te merken dat pixelintensiteit bij zeer hoge mineraaldichtheid niet meer direct evenredig is met de Mn-oxidemassa vanwege de beperkte cameragevoeligheid voor donkere kleuren61. De evaluatie van dit niet-lineaire gedrag kan worden verbeterd door zuurverteringsmonsters op bepaalde tijdstippen te vergeleken en de verteerde massa te vergelijken met de oorspronkelijke massa geschaald door het uiteindelijke experimentele tijdstip. Als exacte kwantificatie van de mineraalmassa vereist is, kunnen gebruikers een kalibratiecurve ontwikkelen met behulp van mineraalmonsters van bekende intensiteit en massa, wat eerder is aangetoond in Fadely et al.61, of directe metingen uitvoeren met synchrotron-gebaseerde röntgenfluorescentie.

Het hier gepresenteerde microfluidische platform kan worden toegepast om biomineralisatieprocessen onder een breed scala aan omgevingsomstandigheden te onderzoeken. Hoewel representatieve experimenten geoptimaliseerd waren voor P. putida GB-1, kan deze opstelling systematisch worden gebruikt om een reeks invloedrijke oplossingschemieën te testen (bijv. Mn- of Fe-concentratie, koolstofbron, aanwezigheid van samenkomende metalen), debietsnelheden, temperaturen of de aanwezigheid van een microbieel consortium. Specifieke zure of suboxische omstandigheden, zoals die gunstig zijn voor Fe-oxiderende bacteriën, kunnen worden gesimuleerd door de influente pH te verlagen of het PDMS te coaten met een zuurstofondoorlatend polymeer. Inzichten in de microbiële controles op biomineralisatie kunnen worden verkregen door het implementeren van reporter genfusiestammen en het volgen van de resulterende optische fluorescentie59,64. Microfluidische reactoren kunnen worden herontworpen om een reeks poreuze omgevingen te simuleren door de deeltjesgrootteverdeling, deeltjesvorm of porositeit te veranderen, of door het PDMS te functionaliseren om de oppervlaktelading van kleideeltjes of natuurlijk organisch materiaal na te bootsen. Met aanvullende aanpassingen (bijvoorbeeld het vervangen van het glasreactorsubstraat door plastic) kunnen reactoren directe spectroscopische metingen ondersteunen van metaaloxidatietoestand, mineralogie, organo-mineraalassociaties of de sorptie of co-precipitatie van secundaire metalen. Ten slotte kan dit experimentele platform worden uitgebreid om de precipitatie van andere metaalbiomineralen (bijv. fosfaten, carbonaten, sulfiden) te onderzoeken, mits hun optische eigenschappen voldoende verschillend zijn om beeldsegmentatie mogelijk te maken. Dit protocol biedt daarom een kader om biomineralisatie en microbe-mineraal-vloeistofinteracties in relevante poreuze omgevingen grondig te onderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door het U.S. National Science Foundation Center for Bio-mediated and Bio-inspired Geotechnics (ERC-1449501), de Swiss National Science Foundation (200021_188546) en de U.S. National Science Foundation (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Een deel van deze studie werd uitgevoerd bij het UC Davis Center for Nano and Micro Manufacturing (CNM2). Wij danken Steven Lucero en de UC Davis Tech Foundry voor het ontwerp en de fabricage van de microscoopincubator en het UVC-bestralingssysteem. We danken ook Dr. Yuze Wang en Dr. Jason DeJong voor het leveren van de poreuze mediumgeometrie die wordt gebruikt voor de fabricage van microfluidische reactoren, en Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noah Goshi, Dr. Gregory Girardi en Dr. Hyehyun Kim voor nuttige discussies en/of het geven van training in fotolithografie en zachte lithografie. Tot slot danken wij Dr. Gaitan Gehin, Dr. Tonya Kuhl, Dr. Filippo Miele en Dr. Charles Graddy voor waardevolle discussies over experimenteel ontwerp en beeldanalyse.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Gebaat om verbinding te maken tussen stroomsensor en flensloze fittingen.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Wordt gebruikt om platen te gieten voor het uitstreken van bevroren voorraden.
Luchtcompressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110Wordt gebruikt om de flowcontroller onder druk te zetten.
Ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Wordt gebruikt voor experimentele media en oplossingen.
Schuine pincetTDI International7-SAWordt gebruikt om slangen aan de microfluïdische reactor te bevestigen.
AutoCAD-softwareAutodesk--Wordt gebruikt om de geometrie van de microfluïdische reactor te ontwerpen.
AutoclaafSteris--Wordt gebruikt om materialen en vloeistoffen te steriliseren.
BalansMettler ToledoME2002TWordt gebruikt om PDMS-elastomeerbasis en uithardingsmiddel af te wegen.
Barbed adapter (1/4-28 draaibaar naar 3/32-in gebarbed)ElveflowKFI-06Wordt gebruikt om polyether polyurethaanbuizen aan te sluiten op de verdeler en het vloeistofreservoirrek.
Biopsiepomp (Rapid-Core, 1,2 mm diameter)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Wordt gebruikt om inlaat-/uitlaatgaten in PDMS-microfluïdische kanalen te ponsen.
Bleekwater (Chlorox)ULINES-19719Wordt gebruikt om het flowcontrolsysteem te steriliseren. Verdunnen tot 1% in ultrapuur water.
Blunt-tip naald (Jensen Global, 21-gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Wordt gebruikt om slangen op spuiten aan te sluiten. Gesteriliseerd door 30 minuten te autoclaven.
Bunsen-branderHumboldtH-5970Wordt gebruikt om een steriele experimentele werkruimte te onderhouden.
Calciumchloridedihydraat (CaCl2&#middot;2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Wordt gebruikt voor experimentele media en oplossingen.
Casaminozuur (Fisher BioReagents, zure caseïne pepton)Fisher ScientificBP1424Wordt gebruikt voor experimentele media.
Celdichtheidsmeter (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Wordt gebruikt om de OD600 van bacterieculturen te meten.
Kleurloze tape (Scotch Magic)ULINES-10223Wordt gebruikt om stof te voorkomen dat het zich aan de PDMS-microfluïdische kanalen hecht.
Kobalt(II)chloride hexahydraat (CoCl2&#middot;6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Wordt gebruikt voor experimentele media en oplossingen.
Gecomprimeerde stikstofAirgasNIUHP300Wordt gebruikt om microfluïdische reactorcomponenten te drogen.
Conische buis (Falcon, 15-mL volume, polypropyleen)Fisher Scientific14-959-49BWordt gebruikt voor instroomoplossingen en ICP-MS-monsters. Voorgesterileerd.
Conische buis (Falcon, 50-mL volume, polypropyleen)Fisher Scientific14-432-22Wordt gebruikt voor LB-precultuur. Voorgesterileerd.
Koper(II)sulfaat pentahydraat (CuSO4&#middot;5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Wordt gebruikt voor experimentele media en oplossingen.
SnijmatULINES-18543Wordt gebruikt om PDMS-microfluïdische kanalen te snijden en inlaat-/uitlaatgaten te ponsen.
Cuvet (Fisherbrand, 1,5-mL volume, polystyreen)Fisher Scientific14-955-127Wordt gebruikt om de OD600 van bacterieculturen te meten.
Digitale camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Wordt gebruikt voor time-lapse kleurenbrightfield-beeldvorming van microfluïdische experimenten.
Distributieklep (MUX)ElveflowMUX-D-12Wordt gebruikt om meerdere vloeistoffen sequentieel te injecteren.
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow--Wordt gebruikt om de stroomsnelheid/drukfeedback tussen flowcontroller en flowsensor te regelen en om de distributieklep om te schakelen.
Erlenmeyerkolf (Fisherbrand, 50-mL volume)Fisher ScientificFB50050Wordt gebruikt voor midden-exponentiële cultuur. Gesteriliseerd door 30 minuten te autoclaven.
Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% zuiverheid, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Wordt gebruikt om PDMS en deksels voor reactorfabricage schoon te maken. Verdund tot 70% in ultrapuur water.
Ethyleendiaaminetetraazijnzuur (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSWordt gebruikt voor experimentele media en oplossingen.
Flensloze fitting (1/4-28 voor 1/16-in OD-buis)ElveflowKFI-17Wordt gebruikt om slangen aan Elveflow-hardwarecomponenten te verbinden. Kit bevat ferrules en draadmoeren.
Flowcontroller (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Wordt gebruikt om stroomsnelheid/drukfeedback te bieden voor gecontroleerde vloeistofinjectie.
Flowsensor (MFS2)ElveflowMFS-D-2Wordt gebruikt om stabiele stroom te handhaven voor microfluïdische experimenten met behulp van drukfeedback van de flowcontroller.
VloeistofreservoirrekElveflowKPT-4SWord

Referenties

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Neerslag van metaaloxidenmangaanoxidenijzeroxidenbiofilmontwikkelingPseudomonas putidaveldmicroscopiebeeldsubtractie
Een microfluïdisch platform om microbiële neerslag van metaaloxiden in poreuze media te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.