Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Samenvatting

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Samenvatting

Muize-oocytatie in vitro , gecombineerd met in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek, maakt de generatie van pre-implantatie embryo's mogelijk onder bepaalde voorwaarden. Deze procedures vergemakkelijken het onderzoek naar de biologische functies en moleculaire mechanismen achter de rijping, bevruchting en vroege embryoontwikkeling van de oocyten. De succesvolle toepassing van deze methode hangt echter af van zorgvuldige behandeling van oöcyten en zaadcellen, geschikte kweekomstandigheden en nauwkeurige beoordeling van de ontwikkelingsprogressie in elke fase. Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van onrijpe cumulus–oocytencomplexen (COCs) uit muiseierstokken, in vitro rijping van oocyten, in vitrofertilisatie en in vitro kweek van embryo's naar het blastocyststadium. Deze procedures omvatten het voorbereiden en in balans brengen van media- en kweekschotels, het isoleren en selecteren van COC's na de ovariumdissectie, het verzamelen van sperma en het capaciteren ervan, het uitvoeren van inseminatie onder gestandaardiseerde omstandigheden, en vervolgens het kweken van embryo's voor ontwikkelingsbeoordeling. De ontwikkelingsprogressie wordt beoordeeld aan de hand van morfologische criteria, waaronder de vorming van mannelijke en vrouwelijke pronuclei, splitsing tot het tweecelstadium en de vorming van blastocysten. Dit protocol kan worden geïntegreerd in studies naar oocytrijpingsfase en de functie van maternale factoren, en biedt een waardevol hulpmiddel voor fundamenteel onderzoek in de voortplantingsbiologie van zoogdieren.

Inleiding

Het begrijpen van de kwaliteit van de oocyten en de ontwikkelingscompetentie is essentieel voor succesvolle bevruchting en daaropvolgende embryonale ontwikkeling ^1,2. Oocytrijping vereist niet alleen nauwkeurige chromosoomsegregatie tijdens de nucleaire rijping, maar ook cytoplasmatische rijping, inclusief organelherverdeling en de ophoping van maternale mRNA's en eiwitten³. Vroege embryonale ontwikkeling is afhankelijk van maternale mRNA's en eiwitten, en de maternale voorraden in de oocyt ondersteunen de preimplantatieontwikkeling. De identiteit en functies van veel moederlijke regulatoren van de embryogenese van zoogdieren zijn echter nog onvolledig begrepen⁴. Daarom zijn verdere systematische studies nodig om de mechanismen achter de rijping, bevruchting en embryoontwikkeling van de eiercellen te verduidelijken.

De muis is een veelgebruikt modelsysteem voor het onderzoeken van de ontwikkeling van pre-implantatie embryo's. In vitro rijping (IVM) verwijst naar het verzamelen van onrijpe oocyten uit de eierstok en hun rijping onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden⁵. Vervolgens maakt in-vitrofertilisatie (IVF) het mogelijk om rijpe oöcyten samen te bevruchten met gecondenseerd sperma om zygoten te vormen voor vroege embryonale ontwikkelingsstudies. Echter, in vergelijking met conventionele IVF met in vivo-gerijpte oocyten, vertonen IVM-afgeleide oocyten vaak lagere rijpings- en bevruchtingspercentages en een verminderde ontwikkelingsvaardigheid⁶. Deze beperkingen worden grotendeels toegeschreven aan asynchronie tussen nucleaire en cytoplasmatische rijping onder in vitro kweekomstandigheden. Bovendien is de stabiliteit van de meiotische spil in muis-oocyten gevoelig voor veranderingen in pH en temperatuur tijdens IVM, en een verstoring van de spil kan bijdragen aan rijpingsstop⁷. Daardoor blijft de verminderde competentie van IVM-afgeleide oocyten een grote belemmering, die de efficiënte embryoproductie voor ontwikkelings- en mechanistische studies beperkt.

Muizen-preimplantatieembryo's kunnen ook worden verkregen door in vivo-afgeleide zygoten te verzamelen en deze in vitro (IVC) te kweken. In vivo-afgeleide zygoten verzameld uit de eierleiders bieden een relatief gesynchroniseerd startpunt voor experimenten gericht op post-fertilizatiegebeurtenissen⁸. Echter, de rijping van de oocyten en de ophoping van maternale factoren vindt plaats vóór bevruchting in vivo; Zygoten van in vivo zijn dus minder vatbaar voor experimentele manipulatie van rijpingscondities of maternale voorraden om hun effect op de latere embryoontwikkeling te beoordelen⁴. Daarom is het optimaliseren van IVM- en IVF-protocollen en het aannemen van gestandaardiseerde werkprocedures met strenge kwaliteitscontrole (bijvoorbeeld strikte beheersing van temperatuur, pH en behandelingspraktijken) essentieel om proceduregerelateerde variabiliteit te minimaliseren en de ontwikkelingscompetentie van oocyten en embryo's te beschermen.

Hier beschrijven we een IVM–IVF–IVC-protocol dat mediavoorbereiding, isolatie en selectie van COCs, IVM- en IVF-procedures, en in vitro embryokweek beschrijft (Figuur 1). Het protocol omvat praktische, stadiale specifieke controlepunten voor routinematige kwaliteitscontrole, waaronder de eerste polaire lichaamsextrousie (PB1), vorming van mannelijke en vrouwelijke pronuclei (2PN), tweecelssplitsing en blastocystvorming. Dit protocol maakt reproduceerbare en efficiënte generatie van preimplantatieembryo's mogelijk onder bepaalde voorwaarden, wat mechanistische studies, kweekoptimalisatie en latere toepassingen in de ontwikkelings- en voortplantingsbiologie ondersteunt.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Northwest A&F University, China (vergunningsnummer: 20230503).

1. Dierenonderhoud

1. Verzamel wildtype vrouwelijke C57BL/6 en mannelijke DBA/2 muizen en houd ze onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden, met een 12 uur licht-donker cyclus bij een temperatuur van 20–22 °C en 55% ± 10% luchtvochtigheid. Geef een voortplantingsdieet en water ad libitum. Mannetjesmuizen alleenstaande huismuizen (één mannetje per kooi).

2. Voorbereiding van media

1. Om een 50 IU/mL PMSG-werkoplossing te bereiden, los 5.000 IE drachte merrieserum gonadotropine (PMSG) op in 100 ml steriele fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS).
   OPMERKING: Aliquot de oplossing in 1 mL wegwerpdelen en bewaar deze bij –20 °C. Ontdooi elke aliquot op kamertemperatuur direct voor gebruik.
2. Om IVM-kweekmedium te bereiden, voeg je de in Tabel 1 vermelde ingrediënten toe aan 100 mL van Medium 199 (M199) basismedium. Stel de pH in op 7,3–7,4 en filter vervolgens het medium steriel door een 0,22 μm filter in steriele mediumflessen. Label de fles met "IVM" met initialen, maakdatum en houdbaarheidsdatum, en bewaar tot 1 maand bij 4 °C.
3. Om een 0,1% (w/v) hyaluronidase-oplossing te bereiden, los je 10 mg hyaluronidase op in 10 mL M2 medium.
   OPMERKING: Bewaar in wegwerp-aliquots van 1 ml bij –20 °C en warm tot 37 °C vóór gebruik.

3. Bereiding van gerechten (Figuur 2)

OPMERKING: Pas het aantal IVM-, IVF- en IVC-druppels aan volgens het verwachte aantal COC's en embryo's, met 20–30 COCs per 100 μL drop voor IVM en IVF en 20–30 embryo's per 100 μL drop voor embryokweek.

1. Bereid een passend aantal oocytenverzamelschalen van 35 mm voor, elk met 2 mL M2-medium aangevuld met 0,2 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX). Gebruik één schaal voor eierstokpunctie en COC-verzameling (één schaal per twee vrouwen), en een andere voor het wassen van COC's. Verwarm de gerechten voor gebruik tot 37 °C.
2. Maak IVM-gerechten klaar.
   1. In een schaal van 60 mm bereid je vijf druppels IVM-medium van 100 μL voor om te wassen (label de schaal als "IVM wash").
   2. In een apart schaaltje van 60 mm bereid je meerdere druppels IVM-medium van 100 μL voor voor rijping (label de schaal als "IVM").
   3. Voeg zorgvuldig voldoende minerale olie toe om de druppels te bedekken en houd de gerechten in evenwicht bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende minstens 2 uur voordat je begint met het verzamelen van de eicellen.
3. Maak IVF-gerechten klaar.
   1. In een schaal van 60 mm bereid je één of twee druppels van 300 μL pre-equilibrated embryokweekmedium voor spermaafgifte en capaciteit (label de schaal als "Sperma-capaciteit").
      OPMERKING: De tweede capaciteitsdruppel wordt voorbereid als reserve voor gevallen waarin de zaadmotiliteit in de eerste druppel onvoldoende is, een nieuw bijlniddymast spermamonster moet worden verzameld en gecapaciteerd, of de spermaconcentratie moet worden aangepast vóór inseminatie.
   2. Bereid twee aparte schalen van 60 mm voor, elk met vijf druppels 100 μL voorgebalanseerd kweekmedium voor het wassen (label de schaal als "IVF wash").
      OPMERKING: Gebruik één "IVF was" schaal om IVM gerijpte COCs te wassen vóór inseminatie, en gebruik de andere "IVF was" schaal om vermoedelijke zygoten na co-incubatie te wassen om cumuluscellen en resterende zaadcellen te verwijderen.
   3. In een apart schaaltje van 60 mm bereid je meerdere druppels van 100 μL pre-equilibrated embryokweekmedium voor inseminatie (label het schotel als "IVF").
      OPMERKING: Pre-equilibrated embryokweekmedium wordt gebruikt voor zowel spermacapaciteit als inseminatie om consistente omstandigheden te behouden tijdens spermavoorbereiding en bevruchting.
   4. Voeg zorgvuldig voldoende minerale olie toe om de druppels te bedekken en houd de schalen in evenwicht bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende minstens 12 uur voordat je begint met de sperma-capaciteitsprocedure.
4. Maak IVC-gerechten klaar.
   1. In een schaal van 60 mm bereid je vijf druppels van 100 μL pre-equilibrated embryokweekmedium voor het wassen van embryo's (label de schaal als "IVC wash").
   2. In een apart schaaltje van 60 mm bereid je meerdere druppels van 100 μL pre-equilibrated embryokweekmedium voor embryokweek (label het gerecht als "IVC").
   3. Voeg voorzichtig voldoende minerale olie toe om de druppels te bedekken en houd de gerechten in evenwicht bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende minstens 12 uur voordat je met de embryokweek begint.

4. Eierstokverzameling

1. Geef 10 IE PMSG intraperitoneaal aan 8–10 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen.
2. Na 48 uur na de PMSG-injectie euthanaseert u de muis door een cervicale dislocatie en plaatst u deze op zijn rug. Spuit de buik in met 70% ethanol om de vacht nat te maken en te voorkomen dat deze de buikholte binnendringt.
3. Maak met een fijne dissectieschaar een kleine incisie in de onderbuikhuid en open voorzichtig de huid met handschoenen om het buikvlies bloot te leggen.
4. Open het peritoneale membraan en beweeg de darmen voorzichtig opzij. Zoek de baarmoederhoorn en volg deze richting de eierstok. Identificeer de eierstok nabij de nier, meestal omgeven door een vetkussen.
5. Gebruik een fijne dissectieschaar om de eierstok van de baarmoederhoorn te scheiden en overtollig bindweefsel en vet weg te knippen.
6. Zet de eierstokken onmiddellijk over in voorverwarmd M2-medium aangevuld met IBMX. Herhaal de procedure om de contralaterale eierstok te verzamelen en deze over te brengen naar hetzelfde schaaltje.
7. Plaats de schotel onder een stereomicroscoop en ga verder met follikelpunctie en het verzamelen van COC's.

5. COC's collectie en cultuur

1. Onder een stereomicroscoop prikt je zichtbare antrale follikels voorzichtig met een steriele spuitnaald om COCs in het M2-medium vrij te geven.
   OPMERKING: Bij het verzamelen van eiercellen in het GV-stadium van de muis prikt u bij voorkeur zichtbaar grote antrale follikels op het eierstokoppervlak, die doorgaans uitpuilend en halfdoorschijnend lijken met een heldere antrale holte.
2. Met een fijn getrokken glazen Pasteur-pipet, verzamel je de vrijgekomen COC's en breng je ze over in een schone 35-mm schaal met voorverwarmd M2-medium aangevuld met IBMX.
3. Was de COC's door seriële overdracht naar een schoon deel van de 35 mm schaal indien nodig om losgekomen granulosacellen en weefselresten te verwijderen, waarbij bij elke overdracht resten achterblijven (Figuur 3).
   OPMERKING: Gebruik alleen COC's met drie of meer compacte cumuluscellagen en uniform gegranuleerd cytoplasma zonder vrije ruimtes voor de volgende stappen ^9,10. Onthulde GV-oocyten en gedeeltelijk cumulus-omsloten GV-oocyten zijn uitgesloten van dit protocol. Onder onze experimentele omstandigheden werd gemiddeld 26 onvolwassen COCs per vrouwelijke muis verkregen.
4. Na het verwijderen van het afval breng je de COCs over in de IVM-afwasvaat en spoel je ze door sequentiële overdracht door vijf druppels IVM-wasmedium van 100 μL.
   OPMERKING: Tijdens het overbrengen moet het overgedragingsvolume minimaal worden om kruisbesmetting tussen de druppels te voorkomen.
5. Leg de gewassen COCs over in 100 μL druppels IVM-medium (20–30 COCs per druppel) en kweek bij 37 °C in 5%_CO2 gedurende 14 uur.
   OPMERKING: Verzamel, was en breng COC's over naar IVM-medium met minimale vertraging om het ontwikkelingspotentieel te behouden.
6. (Optioneel) Na IVM incubeer je de COC's kort in 1 mg/mL hyaluronidase en pipetteer je ze voorzichtig herhaaldelijk met een micropipet totdat de cumuluscellen volledig zijn verwijderd.
   OPMERKING: Beperk de blootstelling aan hyaluronidase tot maximaal 3 minuten, omdat langdurige blootstelling de oöcyten kan beschadigen.
7. (Optioneel) Was de ontblote oocyten in vers M2-medium op een verwarmde fase, en beoordeel vervolgens de rijping van de oocyten onder een stereomicroscoop.
8. (Optioneel) Oocyten met een geëxtrudeerd eerste polair lichaam worden als rijp beschouwd en in het metafase II (MII) stadium. Bereken de rijpingssnelheid als het aantal oöcyten met een geëxtrudeerd eerste polaire lichaam gedeeld door het totale aantal gekweekte eicellen.
   OPMERKING: Stappen 5.6–5.8 worden gebruikt om de eierceltrijping na IVM te beoordelen door een aangewezen beoordelingscohort te deduden vóór de PB1-score. Deze stappen zijn niet vereist voor COC's die direct doorgaan naar IVF.

6. Spermaverzameling en voorbereiding

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de verzameling en capaciteit van vers sperma. Voorafgaand aan inseminatie moet vers vrijgegeven zaadcellen worden geïncubeerd in een pre-equilibrated embryokweekmedium bij 37 °C gedurende 1 uur om capaciteit mogelijk te maken.

1. Euthanaseer één volwassen mannelijke DBA/2-muis (10–16 weken oud) en verwijder zijn cauda epididymiden, waarbij zoveel mogelijk vet, bloed en weefselvloeistof worden vermeden (Figuur 4).
2. Voor elk mannetje wordt beide cauda epididymiden overgebracht naar een druppel van 300 μL pre-equilibreerd G-IVF-medium voor spermaafgifte en capaciteit.
3. Immobiliseer de bijslag cauda met een paar tangen, maak vijf tot zeven sneden in de bijbal met een steriele spuitnaald en knijp voorzichtig in het weefsel om geconcentreerd sperma vrij te geven.
   OPMERKING: Evalueer de zaadmotiliteit en ga alleen verder wanneer de meerderheid van de zaadcellen progressieve motiliteit (PR) vertoont, gedefinieerd als actieve voorwaartse beweging, in plaats van niet-progressieve motiliteit (NP) of immotiliteit¹¹.
4. Incubeer de schaal op 37 °C in 5% CO₂ gedurende 1 uur om spermacapaciteit mogelijk te maken.

7. In-vitrofertilisatie

1. Na 14 uur IVM spoel je de COCs door sequentiële overdracht door vijf druppels van 100 μL IVF-wasmedium, en vervolgens de gewassen COCs over te brengen in de IVF-inseminatiedruppels (20–30 COCs per 100 μL druppel).
2. Pre-incubeer de bevruchtingsschotel met COC's bij 37 °C in 5% CO gedurende 30 minuten voordat je inseminatie.
3. Na de capaciteit bepaal je de zaadconcentratie met een hemocytometer.
4. Op basis van de spermaconcentratie bereken je het benodigde inoculumvolume en voeg je gecapaciteerd sperma toe aan elke IVF-druppel om een uiteindelijke concentratie van 4 × 10⁵ –1 × 10⁶ zaadcellen per ml te bereiken.
   OPMERKING: Controleer na de toevoeging van sperma dat er beweeglijke zaadcellen aanwezig zijn bij elke inseminatiedruppel.
5. Incubeer de IVF-schotels met COCs en sperma bij 37 °C in een 5% CO₂-incubator gedurende 4–6 uur.

8. Embryocultuur

1. Na 4–6 uur incubatie gebruik je een fijngetrokken glazen Pasteur-pipet met een binnendiameter iets groter dan de oocyt om vermoedelijke zygoten in minimaal volume te aspireren en over te brengen in de IVF-wasdruppels.
2. Was de vermoedelijke zygoten door sequentiële overdracht via vijf IVF-wasdruppels, waarbij je voorzichtig in elke druppel pipetteert om overtollig sperma en vuil te verwijderen (Figuur 5).
3. Overbreng de gewassen vermoedelijke zygoten naar de IVC-wasschaal en spoel ze door sequentiële overdracht via vijf vooropgewarmde embryocultuur medium wasdruppels, waardoor de overdracht van IVF-medium wordt geminimaliseerd.
4. Plaats de vermoedelijke zygoten in embryo-kweekmedium kweekdruppels en kweek bij 37 °C in 5% CO₂ (20–30 embryo's per 100 μL druppel).
5. Na 6–8 uur na inseminatie wordt de bevruchting onder een stereomicroscoop beoordeeld door de aanwezigheid van mannelijke en vrouwelijke pronuclei te beoordelen, en oocyten weggegooid die slechts één polair lichaam behouden en geen zichtbare pronuclei tonen.
6. Tel 24 uur na inseminatie het aantal tweecelembryo's en bereken de tweecelsnelheid als (tweecelembryo's / geïnsemineerde eicellen).
7. Na het tellen verwijder en gooi je de ongekloven embryo's weg en ga je verder met het cultiveren van de resterende gespleten embryo's.
   OPMERKING: In dit stadium kunnen embryo's worden gevitriseerd, overgedragen aan ontvangende vrouwtjes of in cultuur worden bewaard tot het blastocyststadium.
8. Blijf de embryo's kweken onder dezelfde incubatieomstandigheden tot 96 uur na inseminatie (hpi). Beoordeel de vorming van blastocysten bij 96 hpi op basis van morfologische criteria.
   OPMERKING: Er is geen verdere mediumwissel nodig gedurende deze periode. Een normale blastocyst wordt geïdentificeerd door de aanwezigheid van een zichtbare blastocoelholte, een duidelijke binnenste celmassa en een intacte trofocodedermlaag.

Resultaten

Met dit protocol werden muis-COC's sequentieel verwerkt via in vitro-rijping , in-vitrofertilisatie en daaropvolgende in vitro embryokweek, wat resulteerde in reproduceerbare generatie van pre-implantatieembryo's en ontwikkeling naar het blastocyststadium onder de beschreven omstandigheden. Na 14 uur IVM vertoonden COCs typisch cumulusexpansie en intacte oocytmorfologie. De meiotische rijping van de oocyten werd gekwantificeerd door een aangewezen beoordelingsc...

Discussie

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde procedure voor muize-oocyten in vitro rijping, in vitrofertilisatie en in vitro kweek met behulp van onrijpe COCs, waardoor reproduceerbare generatie en evaluatie van pre-implantatieembryo's via de blastocystfase onder gedefinieerde in vitro omstandigheden mogelijk is. In veel studies zijn IVM-uitkomsten gevoelig voor laboratoriumspecifieke verschillen in media, incubatietijden en hantering, wat de ontwikkeling...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) embryo culture medium
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X