Een vormanalyse-algoritme kwantificeert de ruimtelijke morfologie en context van 2D- naar 3D-celkweek voor nieuwe kwantificatie van fenotypen

Summary

Dit artikel legt uit hoe nieuwe morfologische kenmerken in cellen en organoïden kunnen worden gekwantificeerd met behulp van de linearized compressed polar coordinates (LCPC)-transformatie, een ruimtelijk algoritme dat eigenschappen vastlegt die traditionele metrieken zoals oppervlakte, volume en oppervlakte, niet kunnen. Best practices voor vormoriëntatie en uitlijning worden besproken.

Abstract

Talrijke studies hebben aangetoond dat het morfologisch fenotype van een cel of organoïde correleert met de vatbaarheid voor antikankermiddelen. Traditionele methoden om fenotype te meten zijn echter gebaseerd op ruimtelijke metrieken zoals oppervlakte, volume, omtrek en signaalintensiteit, die werken maar beperkt zijn. Deze benaderingen kunnen veel cruciale kenmerken van de ruimtelijke context niet meten, zoals chiraliteit, een eigenschap van links- en rechtshandigheid. Volume kan niet worden gebruikt om chiraliteit te registreren omdat de linker- en rechterschoenen hetzelfde volume hebben. Hoewel ruimtelijke context in de vorm van chiraliteit, zwaartekrachtrichting en polariteitsas intuïtief is voor mensen, kunnen de traditionele meetmethoden die tot nu toe door celbiologen, pathologen, radiologen en machine learning-praktijken worden gebruikt, deze fundamentele begrippen niet vastleggen. De linearized compressed polar coördinates (LCPC) transformatie is een nieuw algoritme dat ruimtelijke context kan vastleggen zoals geen enkele andere metriek. De LCPC-transformatie vertaalt een tweedimensionale (2D) contour naar een discrete sinusgolf door een rastersysteem over elkaar te leggen dat de snijpunten tussen de contour en de rasterlijnen volgt. Het verandert de contour in een reeks paren discrete coördinaten, waarbij de onafhankelijke coördinaat (x-coördinaat) overeenkomt met opeenvolgende posities in de 2D-ruimte. Elke afhankelijke coördinaat (y-coördinaat) bestaat uit de afstand tussen een snijpunt van de contour en de rasterlijn tot de oorsprong of basislijn van het rastersysteem. In de vorm van een discrete sinusoïde golf wordt vervolgens de Snelle Fouriertransformatie op de data toegepast. Op deze manier worden de vormen van cellen in 2D- en 3D-celkweek systematisch en multidimensionaal weergegeven, waardoor robuuste kwantitatieve stratificatie mogelijk wordt die inzicht geeft in therapieresistentie.

Introduction

Driedimensionale (3D) organoïdecultuur is superieur gebleken aan tweedimensionale (2D) celkweek in het nabootsen van in vivo biologie ^1,2. Organoïden zijn onmisbaar geworden in kankeronderzoek voor screening op effectieve behandelingen en om inzicht te krijgen in de ziekteprogressie 3,4,5,6. Hoewel het in de kankerbiologie algemeen bekend is dat verschillen in morfologie correleren met verschillend biologisch gedrag van cellen en weefsels, is het vakgebied gebaseerd op traditionele vormmetingen die beperkt zijn in reikwijdte. Deze studie beschrijft een nieuw ruimtelijk algoritme dat subtiele morfologische kenmerken objectief kwantificeert met ongekende precisie, waarmee het traditionele benaderingen zoals oppervlakte, volume en oppervlakte overtreft.

De linearized compressed polar coördinates (LCPC) transformatie werd uitgevonden om objectief en kwantitatief complexe morfologieën te beschrijven die in de weefselhistopathologie worden waargenomen, met als doel de grading van colon polypen⁷ te verbeteren. De wens om deze aanpak vervolgens uit te breiden om macroscopische MRI-gebaseerde ruimtelijke kenmerken in hersenpathologieën zoals bipolaire stoornis en de ziekte van Alzheimer vast te leggen, leidde tot augmentaties die het nog verder versterkten. Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol en best practices voor het toepassen van twee versies van de LCPC-transformatie: het parallelle gridsysteem en het radiale gridsysteem, die beide open-source scripts en tutorialvideo's hebben.

Naast traditionele geometrische methoden bestaan er meerdere abstracties die effectief zijn geweest voor het meten van de complexe vormen van cellen en organen. Deze omvatten het meten van excentriciteit, scheefheid, contrast en kurtosis, samen met Zernike-momenten om circulariteit, asymmetrie, randonregelmatigheid en globale contourstructuur ^8,9,10 vast te leggen. Fractale analyse is ook nuttig geweest om complexe contouren te reduceren tot scalaire waarden, zoals Fractale Dimension, die meet hoe onregelmatig de contour is, en lacuniteit, die meet hoe heterogeen onregelmatige gaten in de contour^11,12 voorkomen. Voor het meten van textuur is de Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) methode populair voor het meten van contrast, energie, homogeniteit, correlatie en entropie^13,14. Hoewel al deze methoden nuttig zijn, zijn ze niet ontworpen om ruimtelijke context vast te leggen, zoals de richting van de zwaartekracht, links- versus rechtshandigheid, of de locatie van de centrale steunstructuur die de richting van vormverandering beïnvloedt. Bovendien produceren veel van hen één enkele scalaire waarde of slechts een handvol scalairwaarden om ruimtelijke informatie weer te geven, waardoor de geciteerde studies ze vaak in combinatie gebruiken om complexe vormen te beoordelen.

De LCPC-transformatie is ontworpen om veel kenmerken uit één meting te produceren en om ruimtelijke markeringen toe te voegen die ruimtelijke context in de vorm coderen, zoals de richting van de zwaartekracht. De methode die het dichtst bij de LCPC-transformatie⁷ ligt, werd een jaar later^{gepubliceerd op 15}, met hetzelfde kernidee als uitgangspunt: de Fouriertransformatie toepassen op celcontouren om vorm te meten in de vorm van een frequentiespectrum. De LCPC-transformatie is echter onafhankelijk ontwikkeld om toegepast te worden via verschillende rastersystemen die bedoeld waren om samen met kennis van de ruimtelijke context buiten de gemeten vorm te worden gebruikt. Bovendien legt de uitvinder van de LCPC-transformatie in dit manuscript uit dat het resulterende frequentiespectrum enorme hoeveelheden verborgen ruimtelijke informatie bevat. Aanvullend Dossier 1 bevat een uitgebreide bespreking van ruimtelijke contexten in de biologie die vaak over het hoofd worden gezien bij het gebruik van de geciteerde methoden en hoe de LCPC-transformatie kan worden toegepast om deze context vast te leggen. Voor lezers van wie de vormgegevens geen verschil laten zien tussen controle- en experimentele groepen, of hun ogen nu verschil in de vormen kunnen zien, of van wie de vormgegevens nauwelijks verschil laten zien, ook al vermoeden ze dat er een groter verschil zou moeten zijn, moeten ze de LCPC-transformatie proberen.

De LCPC-transformatie biedt een ongekend niveau van precisie bij het meten van ruimtelijke informatie omdat het vormen in meerdere dimensies weergeeft. In tegenstelling tot traditionele methoden, zoals oppervlakte en volume, die slechts één scalaire waarde per vorm opleveren (d.w.z. 25 cm²), kunnen de resultaten van de LCPC-transformatie meerdere indices opleveren, die elk correleren met een ander morfologisch aspect van een vorm (d.w.z. rondheid versus scherpte van hoeken, gladheid versus scherpte van randen). De LCPC-transformatie beschrijft een 2D-vorm door een raster van rechte lijnen over elkaar te leggen die de contour snijden. Elk roostersysteem heeft een oorsprong (Figuur 1) of een basislijn (Figuur 2) van waaruit lineaire afstand gemeten kan worden. Zie Figuren 1B en 2B voor vereenvoudigde stroomdiagrammen die het algoritme beschrijven. Elk snijpunt tussen de rasterlijnen en de contour van de vorm wordt gedetecteerd. De afstand van elke doorsnede wordt vervolgens berekend ten opzichte van een basislijn of oorsprong. Op deze manier zet de LCPC-transformatie 2D-vormen om in een reeks opeenvolgende x-y coördinatenparen. De x-coördinaat geeft de positie van de rasterlijn van nul tot oneindig aan, terwijl de y-coördinaat de afstand van de snijpunt tot de basislijn of oorsprong weergeeft. In deze vorm, die een discrete sinusoïde golf is, wordt de Fast Fourier-transformatie (FFT) toegepast om de gegevens van het "positiedomein" naar het frequentiedomein om te zetten. Als de x-coördinaat tijd voorstelde, dan zou het "positiedomein" gelijkwaardig zijn aan het "tijddomein" in de standaardtoepassingen van de FFT.

Terwijl het radiale roostersysteem de afstand meet van elke snijpunt tot de oorsprong van het radiale rooster (Figuur 1A), meet het parallelle roostersysteem altijd de afstand van doorsneden met verwijzing naar een denkbeeldige lijn links van de vorm (Figuur 2A). Het open-source script bepaalt de positie van deze denkbeeldige lijn door de meest linkse pixel van de contour te vinden en vervolgens 10 pixels naar links van deze positie te verplaatsen. Hier wordt de x-coördinaat van deze positie de referentielijn waaruit alle doorsneden worden berekend. Deze 10-pixelregel is willekeurig, maar daarom moeten alle contouren die door het open-source script voor het parallelle grid-systeem worden geanalyseerd minstens 15 pixels witte ruimte aan alle vier de zijden bevatten.

Voor 2D-vormen met plooien of meerdere lagen kunnen rasterlijnen de contour meer dan eens snijden. In dit geval worden de afstanden van alle doorsneden langs een rasterlijn opgeteld tot één enkele waarde. Dus elke gridlijn heeft slechts één x-coördinaat en één y-coördinaat. Deze som wordt weergegeven door de term "gecomprimeerd" in de naam LCPC-transformatie. Het renderen van een niet-lineaire 2D-vorm in een discrete sinusgolf wordt weergegeven door de term "linearized" in de naam van het algoritme. Tot slot zit de term "polaire coördinaten" in de naam van het algoritme omdat het eerste gridsysteem dat werd bedacht een 180-graden radiaal raster was met polaire coördinaten⁷. Zelfs nadat men besefte dat polaire en cartesische coördinaten uitwisselbaar zijn, bleef de naam van het algoritme behouden. De sectie dankbetuigingen beschrijft de persoonlijke redenen die de uitvinding en uitbreiding van de LCPC-transformatie hebben gemotiveerd.

Protocol 1 was de volgorde voor het verkrijgen van de gegevens in Figuur 3B, terwijl Protocol 2 de volgorde was voor het verkrijgen van de gegevens in Figuur 3C–D. De stappen in deze protocollen zijn geïmplementeerd in individuele Python-scripts die beschikbaar zijn in de GitHub-repository "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. Protocol 1 is een voorbeeld van de pre-processing stappen om "pure vorm" af te leiden ter voorbereiding op de LCPC-transformatie. Protocol 2 is een voorbeeld van pre-processing stappen om vormen "op schaal" te meten, wat betekent op hun oorspronkelijke schalen ten opzichte van elkaar.

Segmentatie kan handmatig worden uitgevoerd in beeldverwerkingssoftware, zoals Mac's Preview of Microsoft's Paint, of met behulp van drempelgebaseerde methoden. Als het handmatig wordt gedaan, moet een van de volgende vier kleuren worden gekozen: blauw, groen, roze/magenta of rood. De GitHub-repository genaamd "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ bevat een map genaamd "color extraction scripts". Deze map bevat vier Jupyter Notebook-bestanden met Python-code die de vier eerder genoemde kleuren extraheren en omzetten in blauwe maskers op een witte achtergrond. Dit proces kan ook worden uitgevoerd door de omtrekkleur te drempelen in beeldverwerkingssoftware zoals Fiji/ImageJ. Voor afbeeldingen die contouren bevatten met aanrakende randen of overlappende randen (bijvoorbeeld een Venn-diagram), moeten ze worden gescheiden met behulp van beeldverwerkingssoftware, zodat ze onafhankelijke objecten worden in het samengestelde maskerbeeld met meerdere organoïde contouren. Dit geldt niet voor afbeeldingen die slechts één organoïde bevatten of meerdere organoïden die elkaar niet raken.

Protocol

Primaire menselijke cellen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen en gekweekt onder ethische goedkeuringen en procedures voor geïnformeerde toestemming, eerder gerapporteerd¹⁷. De hier gepresenteerde beelden zijn gegenereerd uit die goedgekeurde celculturen en worden voor het eerst gepubliceerd. Weefselmonsters werden verzameld in het Brigham and Women's Hospital en de University of California, San Francisco onder door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen van patiënten die geïnformeerde toestemming gaven voor onderzoeksgebruik van hun weefsels, zoals eerder beschreven¹⁷. Er werd geen aanvullende menselijke monsterverzameling uitgevoerd voor deze studie.

1. Het extraheren van de pure vorm van 2D-organoïde contouren voor de LCPC-transformatie

1. Segmenteer de buitenrand van elke organoïde met behulp van elke beeldverwerkingssoftware, zoals Microsoft's Paint, MacOS' Preview of Fiji/ImageJ.
2. Haal de contouren van de organoïden uit als open maskers die blauwe lijnen zijn op een witte achtergrond.
3. Isoleer elke blauwe contour op een eigen wit canvas.
   OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als een afbeelding meer dan één contour bevat.
4. Snijd elke contour bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object ontstaat.
5. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren.
6. Draai de objecten zodanig dat de langste interne lengte horizontaal is.
   OPMERKING: Deze stap verandert de langste interne lijn binnen elk object in de breedte van het object. Er zijn twee scripts beschikbaar voor dit doel. Voor gesloten vormen gebruik je het Jupyter Notebook genaamd "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Voor open vormen of vormen met meerdere componenten, gebruik het Jupyter Notebook genaamd "Rotate Green Line_v3.ipynb". De Rotate Green Line-tool heeft een videotutorial die gekoppeld is in het ReadMe-bestand dat zich in dezelfde map bevindt als het .ipynb-bestand.
7. Snijd elke afbeelding bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object is.
   OPMERKING: Dit is hetzelfde als Stap 1.4. Het doel van het bijsnijden deze keer is echter dat de volgende stap in het formaat het hele canvas verkleint, niet alleen het blauwe object erin. Door het blauwe object bijna dezelfde breedte en hoogte te maken als het canvas zelf, wordt het canvas ook vergroot tot 400 pixels breed, waardoor het object bijna 400 pixels breed wordt. Er is een Jupyter Notebook genaamd "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Verander de canvasbreedte van elke afbeelding naar 400 pixels breed terwijl je ook de beeldverhouding beperkt.
   OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat elk object dezelfde breedte heeft. Het beperken van de beeldverhouding voorkomt scheeftrekken van het object tijdens het verkleinen van grootte. Er is een Jupyter Notebook genaamd "Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb".
9. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren.
10. Draai elke afbeelding 90 graden met de klok mee of tegen de klok in om de langste interne lengte verticaal te maken, consistent met de keuze voor alle beelden.
    OPMERKING: In bovenstaande volgorde wordt pure vorm verkregen door sequentieel de stappen 1.6, 1.7, 1.8 en 1.9 te implementeren. Het toevoegen van marginruimte in Stap 1.9 is nodig om fouten in de LCPC-transformatiescripts te voorkomen die als volgende worden uitgevoerd, maar die niet betrokken zijn bij het extraheren van de pure vorm. Gebruikers die vormen "op schaal" willen meten, hoeven de stappen 1.6, 1.7 en 1.8 in bovenstaande reeks niet uit te voeren, hoewel ze hun maskerafbeeldingen nog steeds moeten voorverwerken om optimale oriëntatie te bereiken voordat ze de LCPC-transformatie toepassen.
11. Voer de LCPC-transformatie uit op elke contour. Gebruik Python-scripts die zijn geleverd voor de radiale roostermethode¹⁸ of de parallelle roostermethode¹⁹.

2. Het extraheren van de schaalgrootte van 2D-organoïde contouren voor de LCPC-transformatie

OPMERKING: De stapsgewijze methode om de schaalvorm van objecten op schaal te extraheren lijkt op die voor het extraheren van pure vorm in Protocol 1 hierboven. De stappen zijn in beide protocollen identiek genoemd voor het gemak van matchen. Raadpleeg de aantekeningen in Protocol 1 voor elke stap. Het belangrijkste verschil tussen pure vorm en schaalgrootte vorm is dat schaalgrootte niet vereist stappen 1.6, 1.7 en 1.8, die de schaalaanpassingsstappen zijn.

1. Segmenteer de buitenrand van elk organoïde. Gebruik een computationele aanpak of doe dit handmatig via een eenvoudige beeldbewerkingssoftware, zoals Microsoft's Paint, MacOS' Preview of Fiji/ImageJ.
2. Haal de contouren van de organoïden eruit als open maskers die blauwe lijnen zijn op een wit doek. Gebruik Fiji/ImageJ om maskers te extraheren of het Python-script dat¹⁶ scripts heeft geleverd.
3. Isoleer elke blauwe contour op een eigen wit canvas. Gebruik Fiji/ImageJ om maskers te extraheren of het Python-script dat¹⁶ scripts heeft geleverd.
4. Snijd elke contour bij zodat er een marge van één pixel aan alle vier de zijden van het blauwe object ontstaat. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
5. Voeg 100 pixels witte ruimte toe aan alle vier de zijden om nieuwe marges te creëren. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
6. Draai elke contour zo dat de langste interne lijn verticaal is. Gebruik Fiji/ImageJ of het Python-script^{dat 16} heeft.
7. Voer de LCPC-transformatie uit op elke contour. Gebruik Python-scripts die zijn geleverd voor de radiale roostermethode¹⁸ of de parallelle roostermethode¹⁹.

Results

De radiale grid LCPC-transformatie toegepast op borstkankerorganoïden

3D-organoïden en tumoren kunnen verschillende vormen aannemen, waarvan sommige duidelijk verschillen voor het menselijk oog, hoewel traditionele meetmethoden statistisch onbeduidende verschillen opleveren. Organoïden daarentegen kunnen ook vormen vertonen die heterogeen lijken en dus onbeduidend voor het menselijk oog, waardoor terugkerende subtiele morfologieën worden gemaskeerd die verschillende subtypen vertegenwoordigen. Menselijke primaire borstorganoïden werden uit patiënten gehaald en in 3D gekweekt volgens een eerder gepubliceerd protocol 17,20,21. Figuur 3A toont drie morfologische categorieën die toegankelijk zijn op basis van visuele inspectie: een cystisch fenotype, een polycysteus fenotype en een dicht polycysteus fenotype. Figuur 3B toont dat de buitencontouren van deze organoïden handmatig zijn gesegmenteerd en hun pure vorm is geëxtraheerd, wat het effect van grootte op hun vormen wegneemt. Omdat de contouren cirkelvormig van aard waren, werd de radiale grid LCPC-transformatie toegepast op de pure vormen, gevolgd door PCA. Let op dat de contouren die op figuur 3B zijn gelegd, zo zijn gedraaid dat de langste interne lijn verticaal is, wat betekent dat hun oriëntaties niet hetzelfde zijn als in de bronafbeeldingen. Figuur 3B toont een dotplot van de eerste twee hoofdcomponenten (PC's), en K-means clustering identificeerde drie clusters: 0, 1 en 2. Silhouette Scores (SS) bevestigden het waarschijnlijke bestaan van twee afzonderlijke clusters tussen Clusters 0 versus 1 (SS = 0,68) en Clusters 1 vs. 2 (SS = 0,69), terwijl ze een zwakke scheiding tussen Clusters 0 en 2 (SS = 0,27) aangeven. Ondanks de zwakke Silhouette Score tussen Cluster 0 en 2, rechtvaardigt het labelen van de datapunten met de pure vorm van elk datapunt dat Cluster 2 het meest onderscheidende fenotype vertegenwoordigt: sterk asymmetrische, niet-cirkelvormige contouren (de dikte van de contouren doet in dit geval niet uit).

Hoewel pure vorm het effect van grootte op vorm wegneemt, wat onmogelijk is bij het meten van oppervlakte en volume, onthult het meten van de organoïde contouren op schaal ook interessante inzichten. Figuur 3C toont een 3D-dotplot van de eerste drie PC's, voortkomend uit de radiale grid LCPC-transformatie uitgevoerd op contouren terwijl ze uit de beelden werden gesegmenteerd zonder enige groottewijziging. Deze benadering betekent dat de LCPC-transformatie zowel de vorm als de grootte van de organoïden gelijktijdig meet. Figuur 3C toont dat de polycystische en dichte polycysteuze organoïden minder dicht gepakt zijn dan de cystische organoïden. Om deze uitbreiding te kwantificeren, toont Figuur 3D de verstrooiing van elk fenotype in zijn gedeelde PCA-ruimte. De gemiddelde K-dichtstbijzijnde buurafstand (KNND) wordt berekend voor elk fenotype, wat de visuele beoordeling ondersteunt van de afnemende dichtheid van de stippen van cystische organoïden (KNND = 1,061) naar polycysteuze organoïden (KNND = 1,575) naar dichte polycysteuze organoïden (KNND = 2,247); Deze verminderde dichtheid van stippen kan ook worden geïnterpreteerd als een toename van morfologische heterogeniteit van de buitencontouren. Tot slot, voor een vergelijking van de LCPC-transformatie met de traditionele meetwaarde van oppervlakte, toont Figuur 3E dat hoewel er een statistische significantie is tussen het oppervlak van cystische organoïden en dichte polycysteuze organoïden (p = 0,016, Wilcoxon Rank-Sum Test), er op basis van oppervlakte geen aanwijzing is dat er drie verschillende morfologische groepen zijn over de fenotypen zoals geïdentificeerd door K-means Clustering na pure shape LCPC-analyse (Figuur 3B) of dat er toenemende morfologische heterogeniteit is, zoals aangetoond door LCPC-analyse op schaal (Figuur 3C–D). Figuur 3E toont een afnemende verspreiding van de datapunten die overgaan van cystische naar polycystische tot dichte polycysteuze organoïden, wat het tegenovergestelde is van wat wordt waargenomen door de LCPC-analyse op schaal (Figuur 3C), waarbij wordt benadrukt dat de ruimtelijke informatie die door de LCPC-transformatie wordt vastgelegd verschilt van wat het gebied vastlegt.

Dezelfde benadering werd toegepast op individuele 2D-vormen in Figuur 3, en Aanvullende Figuur 1 geldt ook voor de contour van cellen in 2D-celkweek: enkele cellen (zoals rode bloedcellen) of clusters van cellen (zoals bij cervicale uitstrijkjes). Pilotstudies voor elk van deze gevallen worden beschreven in video's: vormanalyse van hersenorganoïden die verschillende graden van plooiing in hun buitencontour vertonen²²; vormanalyse van longalveoli in situ, dezelfde principes kunnen worden toegepast op de analyse van 2D-celkweek²³; vormanalyse van cervixweefsel uit uitstrijkjes waarbij zowel de contour van de kern als van het celmembraan gelijktijdig worden gekwantificeerd via de radiale grid LCPC-transformatie²⁴; vormanalyse van rode bloedcellen die geïnfecteerd zijn met malaria en cellen die aan geïnfecteerde cellen grenzen, maar zelf niet geïnfecteerd zijn²⁵; vormanalyse van rode bloedcellen die zijn aangetast door sikkelcelziekte²⁶.

Het parallelle rastersysteem voor het meten van dichtheid of textuur als index van ruimtelijke informatie

Ruimtelijke informatie omvat meer dan de gebruikelijke begrippen vorm, zoals vierkantheid, rondheid en kromming, omdat het concepten omvat zoals textuur en dichtheid. Complexe buisvormige netwerken, zoals bloedvaten, of vertakkende netwerken, zoals cytoskeletfilamenten, passen niet in het begrip vorm in dezelfde zin als onze geometrie-gebaseerde intuïtie van vormen, zoals cirkels en veelhoeken. Dichtheid en textuur zijn echter zeer nuttige begrippen van ruimtelijke informatie om de structuur en functie van cellen, organoïden en tumoren te begrijpen. Bij het kwantificeren van complexe netwerken in fluorescentiebeeldvorming meten celbiologen kenmerken zoals de gemiddelde signaalintensiteit binnen een beeld of het percentage van het totale oppervlak van een beeld dat een signaal bevat. Deze benaderingen erkennen dat ruimtelijke informatie meer is dan wat wordt beschreven in termen van geometrische motieven.

Het patroon van vaatnetwerken binnen weefsels, tumoren en organen op een chip is niet eenvoudig te definiëren door traditionele geometriemotieven, maar profiteert van de interpretatie als textuur en dichtheid. Vasculaire remodellering bij tumorontwikkeling en behandelingsresistentie is een goed vastgesteld kenmerk van kanker (besproken in²⁷). Histopathologische secties van 458 primaire neuroblastische tumoren werden geanalyseerd,²⁸ waarbij de dichtheid, grootte en vorm van totale bloedvaten en vaatsegmenten werden gekarakteriseerd. Zij ontdekten dat bloedvaten groter, overvloediger en onregelmatiger gevormd waren in tumoren van patiënten met slechte prognostische factoren in vergelijking met de tumoren van de gunstige cohort. Interessant genoeg werd een term genaamd "vaten die tumorclusters inkapselden" (VETC)²⁹ bedacht om een patroon van bloedvaten te beschrijven die clusters van kleine tumoren binnen een groter hepatocellulair carcinoom omringen en geassocieerd zijn met hogere percentages metastasen en recidive. Dezelfde groep die de term bedacht later ontdekte dat VETC-positief hepatocellulair carcinoom correleerde met een positieve respons op behandeling met de kinaseremmer Sorafenib³⁰. Daarom is het vermogen om vasculaire patronen te kwantificeren cruciaal voor de prognose en het begrijpen van de mechanismen van resistentie.

Voor het kwantificeren van dichte netwerken van buizen, eilanden en takken is het parallelle roostersysteem van de LCPC-transformatie nuttig voor het meten van wat men textuurdichtheid kan noemen, in plaats van vorm. Als voorbeeld van hoe de parallelle grid LCPC-transformatie dit kan doen, toont Figuur 4A patronen van hart-microvasculatuur uit een studie van hartvaaten³¹: voor het blote oog is het objectief en kwantitatief onderscheiden van de patronen tussen de geïnfecteerde gebieden en de gebieden in een gebied ver van de plaats van de letselplaats. Door het masker van de bloedvaten te extraheren (Figuur 4A Stap 1) en de parallelle grid LCPC-transformatie toe te passen, kunnen kwantitatieve verschillen worden waargenomen. Ten eerste, om de netheid van de data te verbeteren, werd elke afbeelding bijgesneden met een cirkel van uniforme diameter, die in het midden van de vierkante afbeelding is gecentreerd (Figuur 4A Stap 2), wat ervoor zorgt dat elke afbeelding dezelfde hoogte en breedte heeft ongeacht de rotaties. Vervolgens worden de bijgesneden afbeeldingen zo gedraaid dat de hoofdas van de vaten (rode dubbele pijlen in Figuur 4A Stap 1) verticaal staat (Figuur 4A Stap 3). Vervolgens wordt een blauwe lijn aangebracht op de omtrek van het beeld om ervoor te zorgen dat zelfs beelden met schaarse vaatpatronen dezelfde diameter hebben qua blauwe pixels (Figuur 4A Stap 4). Stappen 3 en 4 werden uitgevoerd met de Fiji/ImageJ-software (v2.14.0). Ten slotte wordt de parallelle grid LCPC-transformatie toegepast (Figuur 4A Stap 5). Het analyseren van de resultaten via PCA en het uitzetten van de eerste drie PC's laat zien dat de geïnfarceerde gebieden zich apart clusteren van de afgelegen gebieden (Figuur 4B). Berekeningen van de afschuiningsafstand (CD) kwantificeren de visuele patronen die door de grafieken worden vertoond. Op 1 dag na de verwonding vertoont de geïnfarceerde plaats een vaatpatroon dat verder afstaat van de basale toestand (basaal versus 1Day_infarct: CD = 83,89) dan de niet-gewonde plaats (basaal versus 1Day_remote: CD = 53,95). Op 1 dag na het letsel ligt de niet-gewonde externe locatie dichter bij de gewonde locatie (1Day_remote versus 1Day_infarcxt: CD = 34,48) dan bij de basale conditie. Drie dagen na de verwonding vertonen de vasculaire patronen van de beschadigde locatie en de bijbehorende niet-gewonde afgelegen locatie een drastische afwijking van de basale toestand en van elkaar (Basale vs. 3Days_Infarct: CD = 240,63; Basale vs. 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote vs. 3Days_Infarct: CD = 168,35). Heel interessant is dat 7 dagen na het letsel de vaatpatronen van de gewonde plek en de niet-gewonde externe locatie een 3D-ruimte innemen die ongeveer orthogonaal is op de basale conditie, terwijl ze op een afstand dichter bij elkaar liggen dan op 1 dag na het letsel (CD = 24,76 voor dag 7 tegenover 34,48 voor dag 1). De gegevens suggereren twee dingen: (1) naarmate het herstel vordert, neemt het vaatpatroon van de beschadigde locatie en de niet-gewonde afgelegen locatie patronen aan die verschillen van de basale conditie; (2) het reconstructieprogramma dat op de beschadigde locatie wordt geactiveerd, veroorzaakt ook vergelijkbare morfologische veranderingen op hun bijbehorende niet-gewonde afgelegen locaties.

Als referentie voor de veelzijdigheid van de LCPC-transformatie werden de traditionele metrieken van het percentage oppervlakte (Figuur 5A) en de totale omtrek (Figuur 5B) van bloedvaten berekend. Hoewel oppervlakte en omtrek veranderingen tussen punten in de tijdsloop tonen, bieden ze geen samenhangende kwantificering van verschillende ruimtelijke indelingen van vaartuigen. Oppervlakte en omtrek zijn abstracties die veel verschillende vasculaire ordeningen kunnen vertegenwoordigen en daarom niet informatief zijn over hoe de ruimtelijke ordening van vaten verandert gedurende de behandelomstandigheden en het tijdsverloop. Met een n = 3 voor elke groep zijn de t-test en de Wilcoxon-test onbetrouwbaar. Cliff's Delta is niet-parametrisch en werkt goed om een verschuiving in de effectgrootte te tonen. Het belangrijkste verschil dat blijkt uit het meten van het percentage oppervlakte van bloedvaten is tussen de basale conditie en de 7-daagse tijdspunten; Voor de totale omtrek van bloedvaten zijn de verschillen tussen de basale conditie versus 1-dag conditie en basale conditie versus 7-daagse conditie. Echter, gebied en perimeter geven geen aanwijzing dat er verschillen zijn tussen de geïnfarceerde locaties en hun niet-gewonde afgelegen locaties, wat zeer verrassend is aangezien de geïnfarceerde locatie opzettelijk is gewond. Hier komt de veelzijdigheid van de LCPC-transformatie naar voren in vergelijking met traditionele metrics. Voor elke steekproef leveren de resultaten van de FFT als onderdeel van de LCPC-transformatie een set magnitudes op die geassocieerd zijn met een set frequenties. De groottes van elke frequentieband kunnen worden gemiddeld en vervolgens vergeleken tussen de behandelgroepen (aanvullende figuur 1). Dit maakt een eenvoudige beoordeling mogelijk welke frequentiebakken de grootste verschillen tussen behandelgroepen vertonen. Figuur 5C toont zes bins die duidelijke verschillen in effectgrootte vertonen tussen verschillende behandelgroepen, vooral tussen de geïnfecteerde locaties en hun bijbehorende niet-gewonde afgelegen locaties, waarbij het gebied en de omtrek die werden aangeduid geen verschil vertoonden. De onafhankelijke waarden in deze zes bins leveren meerdere indices op die kwantitatieve verschillen tussen behandelingsaandoeningen tonen. Interessant is dat het patroon tussen de groepen voor Bin 1 van de LCPC-transformatieresultaten vergelijkbaar is met het resultaat verkregen door het meten van de totale omtrek. De andere indices tonen echter kwantitatieve verschillen die zowel in het gebied als in de omtrek verborgen liggen. Indices uniek voor de basale conditie: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Indices die uniek zijn tussen de dag 1-groepen: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Indices uniek voor de groep van dag 3: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Indices uniek voor de dag 7-groepen: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Deze gegevens benadrukken de veelzijdigheid en precisie van de LCPC-transformatie ten opzichte van de traditionele benaderingen van gebied en perimeter.

Figuur 1: Beschrijving van het radiale roostersysteem van de LCPC-transformatie. (A) Stap 1: De vorm van interesse wordt gesegmenteerd en als een blauw masker verwijderd. Stap 2: Een begrenzingsbox (ook wel de kleinste rechthoek genoemd die het object aan alle vier de zijden omsluit en raakt) wordt bepaald voor het masker. Een systeem van radiale rasterlijnen die uitkomen in het midden van de begrenzende doos wordt over het masker gelegd. De beslissing om het midden van de begrenzende doos te kiezen in plaats van het zwaartepunt van het object als oorsprong was willekeurig. Stap 3: De afstand van elke snijpunt tussen een rasterlijn en de vorm wordt berekend ten opzichte van de oorsprong. Rasterlijnen die meer dan één snijpunt hebben, tellen al die snijafstanden op tot één waarde voor die rasterlijn. Stap 4: De FFT wordt toegepast om de gegevens van Stap 3 om te zetten in een frequentieplot, een statische multidimensionale representatie (Stap 5) van de vorm in Stap 1. Stap 6: Een scalaire waarde kan worden gecreëerd uit stap 5 via een index. Zie Figuur 10 voor een bespreking van typen indices om te berekenen. (B) Een stroomdiagram dat een vereenvoudigde beschrijving toont van de stappen van de LCPC-transformatie voor het radiale roostersysteem. (C) Voorbeeldvormen waarvoor het radiale rastersysteem optimaal is. De vormen zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Beschrijving van het parallelle roostersysteem van de LCPC-transformatie. (A) Stap 1: De vorm van interesse wordt handmatig gesegmenteerd en als binair masker extraherd. Stap 2: Een parallel rastersysteem wordt over de vorm gelegd, die wordt gedraaid zodat de basis horizontaal is. Stap 3: De afstand van elke snijpunt tussen een rasterlijn en de vorm wordt berekend ten opzichte van de basislijn. Rasterlijnen die meer dan één snijpunt hebben, tellen al die snijafstanden op tot één waarde voor die rasterlijn. Stap 4: De FFT wordt toegepast om de gegevens van Stap 3 om te zetten in een frequentieplot, een statische multidimensionale weergave van de vorm in Stap 1. Stap 6: Een scalaire waarde kan worden gecreëerd uit stap 5 via een index. Zie Figuur 10 voor een bespreking van typen indices om te berekenen. (B) Een stroomdiagram dat een vereenvoudigde beschrijving geeft van de LCPC-transformatiestappen voor het parallelle gridsysteem. (C) Voorbeelden vormen thema's waarvoor het parallelle roostersysteem optimaal is. De vormen zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De LCPC-transformatie identificeert objectief morfologische subtypen van borstkankerorganoïden. (A) Primaire menselijke borstorganoïden werden afgeleid zoals eerder gerapporteerd 17,20,21 en zoals beschreven in Aanvullend Dossier 1. Drie fenotypen konden worden waargenomen en geclassificeerd op basis van visuele inspectie: cystisch, polycystisch en dicht polycysteus. Schaalbalk = 50 μm. (B) De buitencontouren van de organoïden werden handmatig gesegmenteerd (Aanvullende Figuur 2; criteria beschreven in Aanvullend Dossier 1), en de zuivere vorm van deze contouren werd verkregen. Let op dat de contouren in het diagram allemaal zo zijn gedraaid dat de langste interne lijn verticaal is; daardoor komen ze niet overeen met hun oorspronkelijke oriëntatie. De radiale grid LCPC-transformatie werd vervolgens toegepast en de resultaten werden geanalyseerd via PCA. K-means Clustering identificeerde drie clusters (0, 1 en 2), en Silhouette Scores (SS) werden berekend om hun bestaan te bevestigen. Cluster 0 vs 1, SS: 0,68; Cluster 0 versus 2, SS: 0,27; Cluster 1 vs 2, SS: 0,69. (C) De buitencontouren van de organoïden werden ook gemeten met behulp van de radiale grid LCPC-transformatie op hun schaalvormen, dat wil zeggen de vormen zoals ze in de beelden ten opzichte van elkaar verschijnen, zonder enige aanpassing. Het inset is vergroot om de lossere verpakking van polycysteuze en dichte polycysteuze organoïden te tonen vergeleken met de cystische organoïden. Voor B en C: Groen = cystisch, Paars = polycystisch, Geel = dicht polycystisch. (D) De eerste drie PC-waarden worden voor elk fenotype afzonderlijk uitgezet, en de gemiddelde KNND wordt berekend om aan te tonen dat het cystische fenotype het dichtst gepakt is, terwijl de polycystische en dichte polycystische fenotypes een lagere dichtheid vertonen (wat betekent meer heterogeniteit). Hoewel afzonderlijk uitgezet, delen alle drie de fenotypen dezelfde PCA-ruimte. Voor het cystisch fenotype werd het gemiddelde KNND berekend vanaf het inset, omdat uitschieters die alleen in dit fenotype aanwezig zijn, de berekening vertekenen. Gemiddelde KNND's: Cystisch, 1,061; Polycysteus, 1,575; Dichte Polycyste, 2,247. (E) Boxplots van het gebied van de organoïden tonen een afnemende verspreiding van de datapunten van cystische naar polycystische tot dichte polycysteuze organoïden, wat het tegenovergestelde is van wat wordt waargenomen in de LCPC-analyse op schaal (Figuur 3C), en benadrukt dat de ruimtelijke informatie die door de LCPC-transformatie wordt vastgelegd verschilt van wat het gebied vastlegt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Meting van textuurdichtheid met de parallelle grid LCPC-transformatie. (A) Fotomicrografieën van microvasculatuur in hartweefsel zijn eerder in een andere studie^31,32 verkregen. De beelden zijn niet als zodanig uit deze studies gereproduceerd; in plaats daarvan vertegenwoordigen ze nieuwe weergaven die zijn gegenereerd uit dezelfde oorspronkelijke 3D-beelddataset die³¹ werd gerapporteerd en door Gkontra werd geleverd. Hoewel de dataset eerder is gepubliceerd, worden de specifieke afbeeldingen hier voor het eerst gepubliceerd. Beelden van de afgelegen locaties die op elk tijdstip niet gewond raakten, worden niet getoond. Stap 1: Er wordt een 2D-masker gegenereerd en de algemene as van uitlijning van de vaten wordt bepaald (rode dubbele pijl). Stap 2: Er wordt een cirkelvormig gebied gecentreerd rond het midden van de afbeelding verkregen om elke afbeelding dezelfde hoogte te laten hebben nadat de beelden in de volgende stap in verschillende mate zijn gedraaid (het roteren van vierkante afbeeldingen in verschillende mate verandert de hoogte van de afbeelding afhankelijk van de mate van rotatie). Stap 3: Elke afbeelding wordt zo gedraaid dat de algemene as van uitlijning die in stap 1 wordt bepaald, verticaal is. Stap 4: Rond elke afbeelding wordt een uniforme blauwe rand aangebracht om ervoor te zorgen dat elke afbeelding dezelfde diameter heeft, omdat afbeeldingen met minder dichtheden korter kunnen zijn (voorbeeld: zie "7 dagen na een myocardinfarct" in stap 3). Stap 5: De parallelle grid LCPC-transformatie wordt toegepast. (B) Puntgrafieken van de eerste drie PC's van de output van de parallelle grid LCPC-transformatie (Paars: basale conditie, Groen: geïnfarceerde locatie, Geel: niet-gewonde locatie ver van de geïnfarceerde locatie). Zie de sectie resultaten voor berekeningen van de afschuiningsafstand op elk tijdstip tussen de drie voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De LCPC-transformatie meet kenmerken die verborgen zijn in het gebied en de omtrek. Ter vergelijking met traditionele vormmetrieken werden (A) het percentage oppervlakte en (B) de totale omtrek van de vaatnetwerken gemeten. (C) Om de precisie te tonen die kan worden verkregen uit het resultaat van de LCPC-transformatie, werd de waarde van individuele frequentiebins die uit de FFT voortkomen vergeleken (Aanvullende Figuur 1). Zes frequentiebins werden gekozen als indices om objectief verschillen tussen behandelgroepen te kwantificeren. Voor alle panelen, vanwege de beperkte steekproefgrootte van elke groep (n = 3), werd de niet-parametrische Cliff's Delta voor effectgrootte berekend in plaats van een p-waarde uit de Wilcoxon Rank-Sum Test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Het belang van het systematisch oriënteren van vormen voor het extraheren van schone data. (A) Een voorbeeld van identieke vormen die elkaars spiegelbeeld zijn, en hoe het parallelle rastersysteem hun verschillende oriëntatie bepaalt en dus verschillende resultaten oplevert. (B) Een voorbeeld van hoe Vorm 2 horizontaal omgedraaid kan worden, zodat de oriëntatie nu overeenkomt met Vorm 1 en een eerlijkere vergelijking wordt met Vorm 1. In deze configuratie levert de parallelle grid LCPC-transformatie dezelfde resultaten op voor zowel Vorm 1 als Vorm 2. Deze oriëntatieverandering moet alleen worden gedaan als er geen ruimtelijke context is die suggereert dat Shape 2 niet aangepast zou moeten worden. (C) Een voorbeeld van vier variaties van objecten die eruitzien als het getal "3", waarvan sommige in de verkeerde richting wijzen. (D) Een voorbeeld van hoe elk object zo georiënteerd kan worden dat de netheid van de data die voortkomt uit de parallelle grid LCPC-transformatie wordt gemaximaliseerd. (E) Een voorbeeld van het meten van de bredere bobbel van de items in Paneel C op basis van dezelfde oriëntatieregels als voor Paneel D. (F) Een voorbeeld van het meten van de grote bollen van de items in Paneel C, maar met behoud van hun uitlijningscontext zoals in Paneel D. De motivatie om de uitlijningsregels in Paneel D te behouden is om de bijdrage van de ruimtelijke informatie in de bredere bobbel te ontleden ten opzichte van de bijdrage van de smallere uitstulping binnen deze regels. Zie aanvullende figuur 3 voor de FFT-spectra die geassocieerd zijn met C–F. De afbeeldingen in A–B zijn pictogrammen uit Microsoft PowerPoint. De vormen in C-F zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Het onvermogen van traditionele vormmetrieken om duidelijke context te registreren. (A) De reeks vinkjes heeft dezelfde vorm, maar neemt toe van links naar rechts. In deze serie is het gebied van elk vinkje verschillend, terwijl het vormconcept hetzelfde blijft: dat wil zeggen, ze blijven dezelfde stijl vinkjes. (B) Een vierkant wordt 45 graden rond het midden gedraaid totdat het vormconcept wordt wat mensen een diamant noemen. Hoewel het vormconcept van een vierkant heel anders is dan dat van een diamant, worden de tussenliggende rotaties subjectief geïnterpreteerd als ofwel "gekantelde vierkanten" of "gekantelde diamanten". De LCPC-transformatie kan het verschil objectief en precies meten in elke stap in deze reeks. De vormen zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Uitleg van pure vorm versus schaalvorm. Objecten "op schaal" meten betekent dat je de vorm van objecten meet op basis van hun oorspronkelijke grootte ten opzichte van elkaar. "Pure Vorm" betekent daarentegen het meten van de vorm van verschillende objecten op een vergelijkbare schaal, waardoor het effect van grootte op de vorm wordt weggenomen. Het is belangrijk een objectieve manier te vinden om de objecten die worden vergeleken te verkleinen. De langste interne lijn is vaak een optimale keuze (Stap 1). Beide objecten worden zo gedraaid dat de langste interne lijn horizontaal is (Stap 2). In dit geval worden de twee objecten ook zo gedraaid dat de ingesprongen zijde naar beneden wijst. Vervolgens wordt de breedte van elk object, die nu dezelfde grootte heeft als de langste interne lijn van elk object, verkleind tot 400 pixels breed, terwijl ook de beeldverhouding wordt beperkt om scheeftrekken van de objecten te voorkomen (Stap 3). Tot slot is het optioneel om de verkleinde objecten 90 graden te draaien (stap 4) (in dit geval tegen de klok in) voordat de LCPC-transformatie wordt toegepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Voorbeeld van ruimtelijke markers voor kankeronderzoek. (A) Een hypothetisch voorbeeld van cellen die migreren in 2D-cultuur door hun lamellipodia uit te breiden in de migratierichting. In de context van migratiemorfologie van epitheelcellen is het het meest logisch om de contour van elke cel zo te oriënteren dat de langste interne lijn die uitlijnt met de migratieas verticaal is om de ruimtelijke context vast te leggen. (B) Hypothetische voorbeelden van tumoren of voorstadia van kanker die groeien binnen een omhulsel dat niet van vorm verandert. De laesie groeit uit een steel, die de centrale steunstructuur is. Naarmate de laesie groeit of verschrompelt, beweegt de contour naar of van de binnenwand van de omhulsel. De stippellijnen vormen een rationele en objectieve manier om te bepalen hoeveel van de omhulling moet worden overgetrokken (oranje lijn), zodat er niet te weinig of te veel extra informatie wordt toegevoegd. (C) Optie 1 toont de parallelle grid LCPC-transformatie toegepast op de contour van de laesies zonder context van waar de omhulling zich bevindt. Optie 2 toont hetzelfde, maar inclusief de ruimtelijke context van waar de omhulling zich bevindt. Als voorbeeld stellen de rode stippen de kruispunten voor tussen de rasterlijn (zwarte pijl, groene lijn) en de contour. Optie 2 resulteert erin dat elke rasterlijn een vierde kruising vormt die niet bestaat in Optie 1, wat kwantitatief ruimtelijke context toevoegt aan het resultaat in Optie 2 die volledig ontbreekt in Optie 1. De vormen zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Hypothetische FFT-resultaten en veelvoorkomende indices die daaruit kunnen worden afgeleid. (A) De frequentieplot die voortkomt uit de FFT van twee hypothetische vormen wordt weergegeven. Aangezien de groottes in Bin 3 en Bin 4 de tegenovergestelde trend vertonen, zal een verhouding tussen deze twee bins een goede index zijn die het verschil tussen deze twee vormen weergeeft. De rode en groene stippellijnen vertegenwoordigen andere frequentiebins die gebruikt kunnen worden om goede indices af te leiden. (B) Een histogram van twee hypothetische vormen waarvan de FFT-profielen een stapsgewijs dalende trend vertonen als representatie van hun morfologische verschillen. (C) Een histogram van twee hypothetische vormen waarvan de FFT-profielen het meest verschillen in het centrale gebied langs de frequentie-bins. (D) Voorbeelden van hypothetische morfologische kenmerken die indices kunnen opleveren die correleren met hun aanwezigheid. De vormen zijn getekend in Microsoft PowerPoint. Deze afbeeldingen zijn gemaakt door auteurs en vereisen geen publicatielicentie of auteursrechten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Box-whisker plots die de groottes van verschillende frequentiebins vergelijken over de LCPC-transformatieresultaten van vasculaire netwerken. De LCPC-transformatie van de vasculaire netwerken zoals weergegeven in Figuren 4 en 5 levert een set frequentiebins en hun groottes op die elk beeld vertegenwoordigen. Box-whisker plots van de groottes in elke bin worden gebruikt om alle behandelingsgroepen te vergelijken en te identificeren welke bin het beste dient als index voor het stratificeren van textuurdichtheid gemeten via de LCPC-transformatie. Elke box-whisker plot bestaat uit n = 3 onafhankelijke afbeeldingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Voorbeeld van gesegmenteerde borsttumororganoïden. Organoïden werden handmatig gesegmenteerd door een expert die ze routinematig kweekt en onder microscopie bekijkt. Deze figuur toont voorbeelden van gesegmenteerde organoïde contouren. De schaalbalk voor alle microscopische beelden is 50 μm. Primaire menselijke cellen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen en gekweekt onder ethische goedkeuringen en procedures voor geïnformeerde toestemming, gerapporteerd²¹. De hier getoonde beelden zijn afkomstig van die goedgekeurde celculturen en worden voor het eerst gepubliceerd. Er werd geen aanvullende menselijke monsterverzameling uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: FFT-spectra voor vormen in Figuur 6. De resultaten van de FFT's voor de vormen in Figuur 6 worden hier gegeven, zodat lezers het effect van het veranderen van de vormoriëntatie op hun ruimtelijke informatie kunnen begrijpen. De linkerkolom van grafen heeft ongewijzigde y-assen, terwijl de rechterkolom afgeknotte assen heeft zodat de kleinere binwaarden zichtbaar zijn. (A) Spectra van de parallelle grid LCPC-transformatie van de vier vormen in Figuur 6C zoals ze worden weergegeven, wat betekent dat er geen heroriëntatie nodig is. (B) Spectra van de parallelle grid LCPC-transformatie van de vormen in Figuur 6D, die zijn heroriënterd zoals beschreven in de tekst. (C) Spectra van de parallelle grid LCPC-transformatie van vormen in Figuur 6E. (D) Spectra van de parallelle grid LCPC-transformatie van vormen in Figuur 6F ter vergelijking met die in Figuur 6E. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Uitgebreide details over best practices voor de LCPC-transformatie. Dit aanvullende dossier biedt uitgebreide bespreking van best practices en verdere methodologische opmerkingen. De samenvatting van het document is als volgt: Sectie 1 - Ruimtelijke context die gebied, volume, omtrek en ruwheid niet kunnen vastleggen. Sectie 2 - Best practices voor het gebruik van de LCPC-transformatie en het interpreteren van resultaten. Sectie 3 - Begrijp de inherente polariteit van de natuur om de LCPC-transformatie te maximaliseren. Sectie 4 - Interpretatie van FFT-spectra die voortkomen uit de LCPC-transformatie. Sectie 5 - Hoe vormen te oriënteren voordat je ze meet met de LCPC-transformatie. Sectie 6 - Wat is "Pure Shape" versus "At Scale Shape"? Sectie 7 - Methodologische notities over statistische methoden. Sectie 8 - Methodologische notities over celkweek en segmentatie van organoïden. Sectie 9 - Parameters van de FFT voor degenen die hun eigen LCPC-transformatie coderen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Zoals bij elk computationeel hulpmiddel hangt de kwaliteit van de output af van het feit of de input voldoet aan de verwachte regels waarop het gereedschap is ontworpen. De volgende regels moeten worden gevolgd en gebruikt worden als kwaliteitscontroles bij gebruik van de meegeleverde Python-scripts. Zorg er eerst voor dat de open maskers blauwe lijnen op een witte achtergrond zijn. Blue was een willekeurige beslissing en heeft geen betekenis, maar de scripts die de LCPC-transformatie uitvoeren zijn geschreven om te zoeken naar blauwe pixels op een witte achtergrond. Ten tweede, voer de LCPC-transformatiescripts niet uit op afbeeldingen die minder dan 10 pixels witruimte aan alle vier de zijden hebben. Bekijk deze video voor een uitleg waarom: "The Margin Thickness Parameter - How to Prepare Shape Outlines"³³. Ten derde gaat dit script ervan uit dat de omtrekken van je object blauwe pixels zijn op een witte achtergrond. De dikte van de lijn moet tussen de 5 en 10 pixels liggen. Bekijk deze video voor een uitleg waarom: "The Line Thickness Parameter - How to Prepare Shape Outlines"³⁴. Ten vierde, voer de LCPC-transformatiescripts niet uit op lege afbeeldingen. Dit veroorzaakt een fout in het script. Ten vijfde, voer de LCPC-transformatiescripts niet uit op afbeeldingen die alleen uit een stipje puin bestaan. Dit veroorzaakt een fout omdat het gridsysteem het stipje mogelijk niet detecteert en dus probeert een blanco afbeelding te analyseren. Ten zesde, voer de LCPC-transformatiescripts niet uit op afbeeldingen die deeltjes ongewenst afval bevatten. Het puin verandert de hoogte en breedte van het open maskerobject en veroorzaakt daardoor onnauwkeurige resultaten. Ten zevende, bekijk deze video om te begrijpen waarom het belangrijk is om de schaal van je objecten te begrijpen voordat je ze analyseert met de LCPC-transformatie: "The Scale Parameter - How to Prepare Shape Outlines"³⁵.

Een van de meest indrukwekkende aspecten van de LCPC-transformatie is het vermogen om ruimtelijke context vast te leggen. Biologie zit vol ruimtelijke context die cruciaal is voor het begrijpen van de natuur. Epitheelcellen hebben bijvoorbeeld een apicale-basale polariteit^van 36,37,38,39. Bovendien heeft de richting van de zwaartekracht, die veranderd is onder microzwaartekracht, aanzienlijke effecten op zowel de fysiologie^van astronauten ^40,41 als de morfologie van kankercellen 42,43,44. Tot slot kunnen in situ preneoplasie en neoplasie via een steel die dient als centrale steunstructuur en toegang tot de bloedtoevoer bieden, uitgroeien tot lumen. Dus wanneer deze laesies terugtrekken, gaan ze zowel weg van de luminale holte als richting de steel^45,46. Omdat het hiervoor ontworpen is, is de LCPC-transformatie zeer gevoelig voor ruimtelijke context en kan daardoor extra heterogeniteit veroorzaken als de gebruiker niet voorzichtig is. Figuur 6 beschrijft hoe je structuren systematisch kunt oriënteren voordat de LCPC-transformatie wordt toegepast. Figuur 7 beschrijft hoe traditionele meetkunde geen vormconcepten kan meten die voor mensen duidelijk zijn. Figuur 8 geeft een diagram dat het verschil visualiseert tussen het meten van pure vorm en schaalvorm op schaal. Figuur 9 beschrijft dat ruimtelijke context vaak over het hoofd wordt gezien bij het kwantificeren van vormen in 2D-cultuur, histologie en 2D-sneden uit 3D-beeldvorming. Let op dat vanwege ruimtebeperkingen Aanvullend Dossier 1 een uitgebreide bespreking bevat van Figuur 6 en Figuur 7 in Sectie 5, en Figuur 8 en Figuur 9 in Sectie 6.

Omdat de FFT multidimensionale spectrale data produceert, is het belangrijk dat de gebruiker zich comfortabel voelt met het afleiden van indices uit terugkerende patronen in de spectra. Hoewel dit manuscript de LCPC-transformatie omvat als inclusief de stap van het toepassen van de FFT, vindt de daadwerkelijke LCPC-transformatie plaats vóór de FFT-stap (Figuur 1A–B Stap 4, Figuur 2A–B Stap 3). Het toepassen van de FFT levert echter objectieve, systematische inzichten op uit het frequentiedomein van de output van de LCPC-transformatie. De LCPC-transformatie zou dus niet zo effectief zijn zonder de FFT als laatste stap te betrekken. In de LCPC-transformatie resulteert de FFT in een reeks bins en hun groottes, die allemaal een statische multidimensionale representatie zijn van de contourinvoer in Stap 1. Een analogie van een statische multidimensionale representatie van informatie is het negencijferige telefoonnummer dat het telefoonkanaal van een persoon in de Verenigde Staten vertegenwoordigt. Hoewel het omslachtig is in vergelijking met scalaire waarderepresentaties van vormen (zoals 85 cm lang, 56 graden breed, enz.), bevat multidimensionale data veel meer informatie om inzichten te extraheren. Figuur 10 toont verschillende spectrale patronen die zijn waargenomen bij het toepassen van de LCPC-transformatie en hoe indexen daaruit afgeleid kunnen worden. Sectie 4 van Aanvullend Dossier 1 bespreekt Figuur 10 uitgebreider.

Het frequentiedomein van de LCPC-transformatie onthult objectieve en kwantitatieve kenmerken van een 2D-vorm die het blote oog niet gemakkelijk kan waarnemen. Zeer subtiele verschillen in kromming, scherpte en kronkeling kunnen robuust worden gekwantificeerd. Echter, zodra morfologische subtypes via deze methode zijn geïdentificeerd, kunnen er visueel verschillende thema's worden waargenomen die correlleren met de kwantitatieve verschillen. Deze eigenschap maakt de LCPC-transformatie interpreteerbaar als een methode om ruimtelijke informatie te extraheren voor machine learning (ML) modellen en maakt de resulterende ML-modellen zelf beter interpreteerbaar. Hoewel neurale netwerken een krachtige ML-methode zijn, zijn hun resultaten vaak niet interpreteerbaar voor mensen, wat een groot probleem is voor het vakgebied van medische kunstmatige intelligentie (AI). Artsen zijn terughoudend om een ML-model te gebruiken voor klinische beslissingen als ze niet begrijpen waarom het model slechte beslissingen neemt. Bovendien, als geen mens begrijpt waarom of hoe een model een bevooroordeelde beslissing heeft genomen, wordt het oplossen hiervan onoplosbaar.

Het is de moeite waard om toe te voegen aan de discussie over het meten van textuurdichtheid (Figuren 4 en 5) dat het menselijk oog gemakkelijk wordt verward door optische illusies of wanordelijke patronen. Willekeurige ordening van complexe patronen wordt vaak geïnterpreteerd als willekeurig, niet meetbaar of niet de moeite waard om te meten. De LCPC-transformatie kan reproduceerbare, objectieve, kwantitatieve verschillen meten in schijnbaar willekeurige patronen. Echter, tenzij de gebruiker getraind is om niet misleid te worden door chaotische, wanordelijke patronen in de natuur die zich voordoen als willekeur, zal er geen poging worden gedaan om de wanorde te meten om voorspelbare patronen te ontdekken. Voorspelbare patronen geven duidelijk aan dat het systeem niet volledig willekeurig is. De LCPC-transformatie is uitgevonden met het doel vormen te meten die subtiel verschillen of onvoorstelbaar verschillen voor het blote oog. Omdat veel morfologieën in de natuur kleine verschillen vertonen die meer lijken op zinloze chaotische heterogeniteit dan op voorspelbare subtypen van wanorde – die elk correleren met verschillende biologische functies – is het volgende "Vierstappen"-conceptuele kader ontwikkeld om samen met de LCPC-transformatie te worden gebruikt. Ten eerste, verzet je tegen het idee dat een ingewikkeld uitziend systeem willekeurig is. Noem de chaotische heterogeniteit "wanorde" en zoek vervolgens een type orde dat als rationele referentievoorwaarde kan dienen. Stel dat de stoornis afwijkt van de referentie. Ten derde, vind een manier om objectief het patroon dat de referentie is te meten, zoals de LCPC-transformatie. Ten vierde, pas dezezelfde objectieve methode toe op het meten van wat als de wanorde in het systeem wordt beschouwd.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Gebruikt de NearestNeighbors functie binnen het sklearn.neighbors pakket
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Gebruikt cKDTree functie binnen scipy.spatial pakket
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Gemaakt een implementatie van Cliff's Delta via de Python taal
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Werd vermeld als een potentieel nuttig hulpmiddel voor handmatige segmentatie, maar niet gebruikt in deze studie
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Gebruikt de PCA functie met het sklearn.decomposition pakket
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook