Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Het doel van deze studie was het identificeren van de belangrijkste actieve componenten van Coptis chinensis en het verduidelijken van de werking ervan bij de interventie van cerebrale parese (CP) door middel van affiniteitsultrafiltratie en experimentele verificatie.
Het doel van deze studie was het identificeren van de belangrijkste actieve componenten van Coptis chinensis en het verduidelijken van de werkingsmechanismen bij de interventie van cerebrale parese (CP) via affiniteitsultrafiltratie. Met acetylcholinesterase (AChE) als doelwit werd coptisine uit het extract van C. chinensis gescreend als het bestanddeel met de sterkste bindingscapaciteit, met een bindingspercentage van 21,9% en significante in-vitro remmende activiteit (IC₅₀ = 3,24 μg/mL). Moleculaire koppeling en moleculaire dynamica-simulaties toonden aan dat coptisine stabiel kon binden aan de actieve pocket van AChE. Vervolgens werden verificatie-experimenten uitgevoerd op een neonatale rattenmodel van hypoxisch-ischemische hersenschade (HIBD). De resultaten toonden aan dat interventie met coptisine (10 mg/kg) het ruimtelijk leren en geheugentekorten bij de modeldieren significant verbeterde, de cerebrale bloedstroom in de beschadigde hersenhelft verhoogde, pathologische schade aan hersenweefsel verzachtte en de abnormale activatie van AChE in de hersenen remde. Samenvattend combineerde deze studie affiniteitsultrafiltratietechnologie en bevestigde dat coptisine, geïdentificeerd uit C. chinensis-extract, AChE kan remmen en neuroprotectieve effecten en cerebrale bloedstroomverbetering kan uitoefenen. Het dient als de belangrijkste materiële basis voor C. chinensis om CP-achtige neurologische tekorten te verlichten, waardoor kandidaatmoleculen en wetenschappelijk bewijs worden geleverd voor de ontwikkeling van verwante geneesmiddelen.
Cerebrale parese (CP) is een permanent syndroom veroorzaakt door niet-progressieve schade aan de zich ontwikkelende hersenen van foetussen of zuigelingen, voornamelijk gekenmerkt door motorische disfunctie en houdingsafwijkingen. Hoewel er momenteel meerdere klinische behandelmethoden beschikbaar zijn voor CP, blijft er een gebrek aan ideale geneesmiddelen die neurologische tekorten fundamenteel kunnen herstellen met minimale bijwerkingen. In tegenstelling tot chemisch gesynthetiseerde geneesmiddelen, die meestal op enkele doelen werken en relatief hoge potentiële toxiciteit hebben, bieden traditionele Chinese medicijnen (TCM's), met hun voordelen van multicomponenten, multi-target en holistische regulatie, evenals de gunstige veiligheidsprofielen die in de langetermijnklinische praktijk zijn aangetoond, nieuwe inzichten en een reservoir aan geneesmiddelkandidaten voor de behandeling van complexe hersenaandoeningen1, 2,3,4,5,6. Daarom heeft het onderzoeken van zeer effectieve en laag-toxiciteit chemische componenten uit TCM's een grote wetenschappelijke betekenis en klinische waarde7.
Onder de complexe pathologische mechanismen van cerebrale parese speelt de dysfunctie van het cholinerge zenuwstelsel een cruciale rol 8,9. Acetylcholinesterase (AChE) is een belangrijk enzym dat de neurotransmitter acetylcholine (ACh) hydrolyseert. Een te hoge activiteit van dit enzym leidt tot ACh-depletie, verstoort de cholinerge signaaloverdracht en verergert daardoor de motorische controle en cognitieve disfuncties. Daarom is AChE uitgegroeid tot een belangrijk en goed gevestigd doelwit voor de ontwikkeling van neuroprotectieve middelen. Het remmen van AChE-activiteit om de ACh-niveaus in de synaptische spleet te verhogen wordt erkend als een van de effectieve strategieën om CP-gerelateerde neurologische tekorten te verlichten. In de context van hypoxisch-ischemisch hersenletsel kan verstoring van cholinerge neurotransmissie de neuronale disfunctie verder verergeren, waardoor motorische en cognitieve stoornissen die relevant zijn voor CP worden veroorzaakt. Daarom werd AChE in deze studie niet alleen geselecteerd als een klassiek neurofunctioneel doelwit, maar ook als een mechanistisch relevant instappunt voor het screenen van bioactieve verbindingen met mogelijke anti-CP-effecten.
Modern onderzoek heeft aangetoond dat medicinale planten een breed scala aan farmacologische activiteitswaarden hebben. Als een klassieke traditionele Chinese medicijn om hitte te verwijderen en vocht te drogen, vormt Coptis chinensis een complex systeem dat rijk is aan diverse isoquinolienalkaloïden. Naast de bekende berberine bevat het ook een reeks componenten met vergelijkbare structuren en diverse farmacologische activiteiten, zoals coptisine, epiberrine, palmatine en jatrorrhizine10. Deze alkaloïden vormen samen de materiële basis voor de farmacologische effecten van C. chinensis. Eerdere studies hebben aangetoond dat C. chinensis en zijn alkaloïden ontstekingsremmende, antioxiderende en potentiële neuroprotectieve eigenschappen bezitten. Echter, gezien zo'n complex componentensysteem zijn traditionele onderzoeksmethoden moeilijk om snel en nauwkeurig de belangrijkste actieve componenten te identificeren die direct AChE aanpakken, wat de diepgaande opheldering van de mechanismen achter de effecten van C. chinensis op hersenletsel11 sterk beperkt.
In vergelijking met conventionele activiteitsgeleide isolatie, die meestal herhaalde fractionering, bioactiviteitstesten en zuivering vereist en kan leiden tot verlies of verwaarlozing van verbindingen met een lage abundantie maar hoge affiniteit, maakt affiniteitsultrafiltratie snelle screening van doelbindende liganden direct uit complexe mengsels mogelijk. Deze techniek maakt het mogelijk om actief en snel te "vissen" van actieve liganden die aan specifieke doelen binden (bijv. AChE) direct uit de meercomponentige ruwe extracten van TCM's. Het is bijzonder geschikt voor systemen met meerdere alkaloïdecomponenten, zoals C. chinensis, waardoor effectieve componenten die direct met het doel interageren uit het complexe mengsel12 nauwkeurig kunnen worden geïdentificeerd. In combinatie met computationele benaderingen zoals moleculaire koppeling en moleculaire dynamica-simulaties, kan het intuïtief de bindingsmodus, interactietypen en complexe stabiliteit tussen componenten en doeleiwitten op atomair niveau voorspellen, waardoor robuust theoretisch bewijs en mechanistische verklaringen worden geleverd voor de resultaten van experimentele screening13.
Op basis van bovenstaande achtergrond stelt deze studie de volgende wetenschappelijke hypothese voor: onder de verschillende alkaloïden in C. chinensis bestaan actieve componenten die specifiek AChE kunnen remmen, en deze componenten vormen de materiële basis voor de mogelijke anticerebrale parese-effecten. Om deze hypothese te verifiëren, integreerden we moderne screeningstechnieken met farmacologische validatiemethoden: ten eerste, met AChE als doelwit, werd affiniteitsultrafiltratietechnologie gebruikt om potentiële remmers uit het multi-alkaloïde extract van C. chinensis snel te screenen; Verder werden moleculaire koppelings- en moleculaire dynamica-simulaties gebruikt om het bindingsmechanisme op atomair niveau te verduidelijken; ten slotte werden in vivo dierproeven uitgevoerd om de verbeterende effecten van de gescreende componenten op het gedrag, de hersenweefselpathologie en AChE-activiteit van ratten met CP te verifiëren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierenwelzijns- en experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Ethics Committee voor Dierenwelzijn van het First People's Hospital of Zunyi (Ethiek nr. 2025-2-362). Tijdens de modellerings- en behandelingsperiode werden dagelijks de toestand en overleving van het dierlijk lichaam geregistreerd.
Bereiding van C. chinensis-extract
In deze studie werd een versnelde oplosmiddelextractor gebruikt voor de versnelde extractie van de n-butanolfractie uit medicinale materialen van C. chinensis . In totaal werd 1 g gedroogd poeder C . chinensis nauwkeurig gewogen en respectievelijk in extractiecellen van 40 mL geplaatst. Metalen pakkingen en glasvezelfiltermembranen werden achtereenvolgens boven en onder de extractiecel geplaatst om het monster te filteren, en het monster werd omwikkeld met kwartszand. Tijdens het extractieproces werden de temperatuur en druk respectievelijk ingesteld op 90 °C en 100 bar. Het versnelde extract werd opgevangen en het extractieoplosmiddel werd met een roterende verdamper tot droogte verdampt om gedroogde extracten van verschillende polaire fracties te verkrijgen. Methanol: water (50:50, v/v) werd geselecteerd als het reconstitutie-oplosmiddel. Het extract werd gefilterd door een microporeus membraan van 0,45 μm en opgeslagen bij 4 °C. Voor de detectie van het monster werd de remmende activiteit van het blanke reconstitutie-oplosmiddel op AChE onderzocht. De resultaten toonden aan dat het remmende effect verwaarloosbaar was, wat aangeeft dat de selectie van het reconstitutie-oplosmiddel in dit experiment geen invloed zou hebben op de experimentele resultaten.
Acetylcholinesterase-remmingstest
Het experiment werd uitgevoerd in een 96-put plaat. Eerst werd PBS toegevoegd, gevolgd door AChE (0,1 U/mL) en C. chinensis-monsters achtereenvolgend. Na incubatie bij 37 °C gedurende 10 minuten werden 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) chromogene oplossing (2,5 mmol/mL) en een ATChI-substraat (10 mmol/mL) toegevoegd. Het mengsel werd nog eens 10 minuten geïncubeerd bij 37 °C, waarna de reactie werd beëindigd door 60 μL 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe te voegen. De absorptie werd gemeten op 405 nm. Elk C. chinensis-monster werd opgesteld met 4 groepen: Controlegroep a: PBS (120 μL), AChE-oplossing (20 μL), DTNB-oplossing (40 μL), ATChI-oplossing (40 μL) en SDS-oplossing (60 μL) werden sequentieel toegevoegd; Blanke controlegroep b: PBS (120 μL), DTNB-oplossing (40 μL), ATChI-oplossing (40 μL) en SDS-oplossing (80 μL); Monstergroep c: PBS (80 μL), C. chinensis-extract (20 μL), AChE-oplossing (20 μL), DTNB-oplossing (40 μL), ATChI-oplossing (40 μL) en SDS-oplossing (60 μL); Voorbeeld blanke groep d: PBS (100 μL), C. chinensis-extract (20 μL), DTNB-oplossing (40 μL), ATChI-oplossing (40 μL) en SDS-oplossing (60 μL). Huperzine A werd gebruikt als positieve controle met een initiële concentratie van ongeveer 2,5 mg/mL. De initiële concentratie van het n-butanolfractie-extract was ongeveer 1 mg/mL. Zowel huperzine A als de monsters werden verdund met een gradiënt van 60%. De remmingsgraad werd berekend met de volgende formule: Remmingsgraad (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, waarbij a, b, c en d respectievelijk de absorptiewaarden van controlegroep a, blanco controlegroep b, steekproefgroep c en monster blanco groep d vertegenwoordigen.
De remmende snelheid bij elke geteste concentratie werd berekend met behulp van de hierboven beschreven formule. Concentratie-inhibitiecurves werden vervolgens geconstrueerd door de remmeringssnelheid uit te zetten tegen de logaritme van de samenstellingsconcentratie. IC20-, IC50- en IC80-waarden werden berekend door niet-lineaire regressiefitting met behulp van GraphPad Prism-software op basis van de aangepaste concentratie-responscurves, en werden gedefinieerd als de concentraties die nodig zijn om respectievelijk 20%, 50% en 80% inhibitie van AChE-activiteit te produceren.
Affiniteitsultrafiltratie-assay
Affiniteitsultrafiltratie werd uitgevoerd om AChE-bindende verbindingen uit het C. chinensis-extract te screenen. Kort gezegd werd AChE-oplossing (0,1 U/mL in PBS, pH 7,4) gebruikt als actief enzym. De geïnactiveerde enzymcontrole werd voorbereid door dezelfde AChE-oplossing 10 minuten in een kokend water te verhitten. Voor elke reactie werd 200 μL C. chinensis-extractoplossing gemengd met 200 μL actieve of geïnactiveerde AChE-oplossing en 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Na de incubatie werd het mengsel overgebracht naar een 30 kDa ultrafiltratiebuis en gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het vastgehouden enzym-ligandencomplex werd drie keer gewassen met 200 μL PBS onder dezelfde centrifugatieomstandigheden om ongebonden componenten te verwijderen. Vervolgens werd 200 μL 90% methanol toegevoegd om de liganden die aan AChE gebonden zijn te dissociëren en te elueren, gevolgd door 10 minuten incubatie en centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 10 minuten. Het eluaat werd verzameld, gefilterd en geanalyseerd met high-performance liquid chromatography (HPLC). Verbindingen verrijkt in de actieve enzymgroep ten opzichte van de geïnactiveerde enzymcontrole, werden beschouwd als potentiële AChE-bindende componenten14.
HPLC-analyse van belangrijke alkaloïdenmetabolieten
Chromatografische analyse werd uitgevoerd met een HPLC-systeem uitgerust met een quaternaire pomp, een autosampler, een kolomoven en een ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) detector. Scheiding werd bereikt op een C18-chromatografische kolom (250 × 4,6 mm, 5 μm) die op 25 °C werd gehouden. De mobiele fase bestond uit acetonitril (A) en 30 mmol/L ammoniumbicarbonaatoplossing met 0,7% ammoniak en 0,25% triethylamine (B), toegediend met een debiet van 1,0 mL/min. Het gradiënt-elusjonsprogramma was als volgt: 0–15 min, 90%–75% B; 15–25 min, 75%–70% B; 25–50 min, 70%–55% B. Het injectievolume was 5 μL en UV-detectie werd uitgevoerd bij 270 nm.
Voor kwantitatieve analyse van de belangrijkste alkaloïden in C. chinensis werd elk monster (0,02 g) nauwkeurig gewogen en ultrasoon geëxtraheerd met 10 mL zoutzuur–methanoloplossing (1:100, v/v) gedurende 30 minuten. Na de filtratie werd het gewichtsverlies gecompenseerd met hetzelfde extractie-oplosmiddel ten opzichte van het oorspronkelijke gewicht, en werd de eindoplossing gefilterd door een membraan van 0,45 μm vóór HPLC-analyse. Acht authentieke referentiestandaarden, waaronder magnoflorine, glaucine, jatrorrhizine, columbamine, epiberberine, coptisine, palmatine en berberine, werden onder dezelfde chromatografische omstandigheden geanalyseerd. Kalibratiecurves werden voor deze analyten geconstrueerd met behulp van referentieoplossingen. Omdat de abundantieniveaus en detectorresponsen van de acht alkaloïden aanzienlijk verschilden, werd het kalibratiebereik voor elke analyte individueel geoptimaliseerd op basis van literatuurrapporten en voorlopige experimenten, in plaats van een identiek vouw-verdunningsschema toe te passen op alle verbindingen. Daarom werd niet verwacht dat de hoge tot lage concentratieverhoudingen van de lineaire bereiken identiek zouden zijn tussen de acht analyten. De detectielimieten (LOD) en kwantificatielimieten (LOQ) werden geschat op signaal-ruisverhoudingen van respectievelijk ongeveer 3 en 10.
Voor de analyse van affiniteits-ultrafiltratie-eluaten werden de liganden die na ultrafiltratie van AChE losgekoppeld zijn verzameld uit herhaalde experimenten en geconcentreerd vóór HPLC-analyse om een adequate signaalintensiteit voor detectie te waarborgen. De geconcentreerde eluaten werden vervolgens geanalyseerd met dezelfde HPLC-condities als hierboven beschreven. De chromatografische pieken in de eluaten werden toegekend door gerichte vergelijking met de acht authentieke referentiestandaarden en met het chromatografisch profiel van het C. chinensis-extract dat onder identieke analytische omstandigheden was verkregen. Daarom was de huidige analyse niet bedoeld voor de novo structurele opheldering van onbekende verbindingen, maar voor gerichte bepaling of de bekende belangrijke alkaloïden in C. chinensis verrijkt waren in het actieve enzym eluaat ten opzichte van de controle van het geïnactiveerde enzym.
Moleculaire koppelingstest
In de huidige studie richtte dockinganalyse zich op coptisine omdat dit werd geïdentificeerd als het hoogst gerangschikte AChE-bindende bestanddeel door affiniteitsultrafiltratie en ook de sterkste in vitro remmende activiteit toonde onder de belangrijkste alkaloïden. Eiwitkristallen werden opgehaald uit de Protein Data Bank (PDB). Eiwitkristallen met co-gekristalliseerde liganden werden geselecteerd als de laatste koppelingsreceptoren, en alle doel-eiwitkristallen werden afgeleid van mensen. Het receptorbestand werd geopend met PyMOL-software, en de receptor- en ligandbestanden werden gescheiden en opgeslagen; de receptor werd geopend met MGLTools-software, gevolgd door het verwijderen van watermoleculen, het toevoegen van waterstofatomen en ladingen, het samenvoegen van niet-polaire waterstofatomen, het berekenen van lokale atomaire ladingen, enzovoort, en vervolgens opgeslagen in PDBQT-formaat; het ligandbestand werd geopend met MGLTools-software, waterstofatomen en ladingen werden toegevoegd en opgeslagen als een pdbqt-formaat bestand; de grid box werd geopend, de afstand werd ingesteld op 1,000, het aantal gridpunten werd ingesteld, de centrale puntcoördinaten van de box werden geselecteerd volgens de co-gekristalliseerde ligand en opgeslagen als een GPF-bestand 15,16.
Chemische componentstructuren werden eerst verzameld uit de SciFinder-database en opgeslagen in cdx-formaat; elke moleculaire driedimensionale structuur werd weergegeven met de ChemBio3D Ultra-module, energieoptimalisatie werd uitgevoerd met het MM2-krachtveld, opgeslagen in mol2-formaat en ladingsparameters werden verwijderd. Met AutoDock werd het mol2-formaat bestand geopend met MGLTools-software, werden waterstofatomen en ladingen aan de ligand toegevoegd, werden roterbare chemische bindingen waargenomen en opgeslagen als een pdbqt-formaat bestand. Het AutoDock Vina (versie 1.2.5) model werd toegepast om moleculaire docking-evaluatie uit te voeren.
Moleculaire dynamica simulatie-assay
Gaussian 16 en GaussView 6 software werden gebruikt voor optimalisatie van ligandenstructuren. Na het importeren van het mol2-bestand van de ligandstructuur in GaussView 6 werd het taaktype op Optimalisatie gezet, de toestand van het doelmolecuul werd geselecteerd als Grondtoestand, de berekeningsmethode was dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT), de spinmultipliciteit werd standaard ingesteld op Default Spin, de gebruikte functionaal was B3LYP, het oplosmiddelmodel was IEFPCM, en het oplosmiddel was water. Na voltooiing van moleculaire structuuroptimalisatie werd Gaussian 16 gebruikt om het gegenereerde chk-bestand om te zetten in een fch-bestand, dat vervolgens werd geïmporteerd in Multiwfn-software om de RESP-lading van de ligand te berekenen.
Na de berekening van de RESP-lading werd het gegenereerde chg-bestand geïmporteerd in sobtop_1.0 (dev5) software om het ligandtopologiebestand te genereren dat nodig is voor moleculaire dynamica-simulatie. De moleculaire dynamica-simulatie werd uitgevoerd met GROMACS 2019.6-software met het AMBER99 krachtveld. De structuurbestanden van het eiwitmolecuul en het kleine molecuul werden geïmporteerd in de software, een triklien doos met een periodieke grens van 1,0 nm werd opgezet, en het TIP3P-watermodel werd gebruikt voor het vullen. De Particle Mesh Ewald (PME) methode werd gebruikt om langeafstands-elektrostatische interacties te berekenen, en het gmx geion-commando werd gebruikt om een passend aantal natriumionen en chloride-ionen in te voeren om de lading van het hele systeem te neutraliseren. De simulatie werd uitgevoerd bij een constante temperatuur van 298 K en een standaard atmosferische druk van 100 kPa. Voor energieminimalisatie werd de steilste afdalingsmethode (steil) toegepast. De gmx grompp en gmx mdrun commando's werden gebruikt om 10.000 stappen NVT (isothermaal-isochor ensemble) evenwicht en NPT (isotherm-isobaar ensemble) evenwicht uit te voeren, waarbij de temperatuurkoppelingsconstante en drukkoppelingsconstante respectievelijk 0,1 ps en 0,5 ps werden gesteld, en de duur van de evenwichtssimulatie was 100 ps. Nadat het systeem evenwicht had bereikt, werd de tijdstap ingesteld op 2 fs en werd een 10 ns moleculaire dynamica-simulatie uitgevoerd op het complex, waarbij trajectgegevens elke 2 ps werden opgeslagen. De productie van 10 ns werd gekozen als een verkennende simulatielengte om een korte, dynamische beoordeling van het gekoppelde coptisine–AChE-complex te bieden, in plaats van uitputtende conformationele bemonstering. Deze instelling werd gebruikt om te evalueren of het gedockte complex een relatief stabiele bindingsmodus over de tijd kon behouden. De commando's gmx rms, gmx rmsf, gmx gyrate en gmx hbonds werden verder gebruikt om de root mean square deviation (RMSD), root mean square fluctuation (RMSF), de radius van de gyratie van het eiwit, waterstofbruggen en het oplosmiddeltoegankelijke oppervlak te berekenen. QTgrace werd gebruikt voor resultaatvisualisatie.
Verificatie van dierproeven
Achttien gezonde neonatale Sprague-Dawley (SD) rattenjongen (7 dagen postnataal) van beide geslachten werden geselecteerd. Alle proefdieren werden gehuisvest in een specifieke, pathogegeervrije (SPF) dierenfaciliteit. Deze faciliteit was uitgerust met een strikt barrièresysteem, dat effectief de invasie van micro-organismen en parasieten kon voorkomen. De omgevingsparameters van de woonruimte werden automatisch gemonitord en geregeld door een centraal regelsysteem: temperatuur 22 ± 2 °C, relatieve luchtvochtigheid 55% ± 10%, en lichtcyclus 12 uur licht/12 uur donkercyclus. Een neonataal rattenmodel van hypoxisch-ischemische hersenschade (HIBD), aangepast door de klassieke Rice-Vannucci-methode, werd gebruikt om de pathologische en gedragskenmerken van CP te simuleren.
Kort gezegd werden postnatale dag 7 rattenjongen verdoofd met 2–3% isoflurane voor inductie en 1–2% voor onderhoud. Na adequate verdoving werd een cervicale incisie in het midden gemaakt, en werd de linker arteria common carotid zorgvuldig geïsoleerd en permanent geligeerd. De incisie werd daarna gehecht en de jongen mochten 1 uur op een verwarmingskussen herstellen. Vervolgens werden de jongen in de model- en coptisinegroepen blootgesteld aan hypoxie in een kamer met 8% O₂, gebalanceerd met 92% N₂, gedurende 2 uur bij 37 °C om hypoxisch-ischemische hersenletsel te induceren. Schijndieren die werden geopereerd, ondergingen dezelfde anesthesie en chirurgische blootstelling zonder halsslagaderligatie of hypoxische behandeling. Na hypoxie werden de jongen teruggebracht naar hun moeders en dagelijks gecontroleerd op algemene toestand, overleving en voedingsgedrag gedurende de experimentele periode.
De experimentele ratten werden willekeurig verdeeld in 3 groepen: Schijngroep: alleen de linker arterie van de algemene halsslagader werd gescheiden zonder ligatie of hypoxiebehandeling, en een gelijke hoeveelheid oplosmiddel werd postoperatief toegediend; Modelgroep: hypoxisch-ischemische hersenschade-modelleringsoperatie werd uitgevoerd, en een gelijke hoeveelheid oplosmiddel werd postoperatief toegediend; Coptisinegroep: na modellering werd coptisine (10 mg/kg) toegediend via gavage. De dosis coptisine (10 mg/kg) werd geselecteerd als een in vivo dosis op basis van eerder gerapporteerde in vivo/farmacokinetische studies van coptisine17. Medicijnen werden eenmaal per dag toegediend op een vast tijdstip gedurende 14 opeenvolgende dagen van interventie.
Detectie van dierlijke indicatoren
De testapparatuur van het Morris waterdoolhof (MWM) bestond uit een groot rond waterbassin (diameter ongeveer 150 cm) met duidelijke visuele aanwijzingen op de zwembadwand. Het zwembadwater werd gelaagd tot ondoorzichtig, melkachtig wit en de watertemperatuur werd gecontroleerd op 23 ± 1 °C. Een transparant platform werd geplaatst in het doelkwadrant, ondergedompeld 1–2 cm onder het wateroppervlak. De training vond vier keer per dag plaats: de dieren werden in het water geplaatst met hun gezicht naar de zwembadwand vanaf vier verschillende toegangspunten op de zwembadwand, en de tijd die nodig was om het verborgen platform te vinden en te klimmen vanaf de wateringang, namelijk de "ontsnappingslatentie", werd geregistreerd. Elke trainingssessie was beperkt tot 60 seconden. Als het dier het platform binnen 60 seconden vond, mocht het er 15 seconden op blijven om geheugen te consolideren. Als het dier niet werd gevonden, werd het voorzichtig naar het platform geleid en mocht het 15 seconden blijven. Na 7 dagen training werd het verborgen platform verwijderd. De dieren werden vanaf het toegangspunt tegenover het oorspronkelijke platform in het water geplaatst en mochten 60 seconden vrij zwemmen, waarbij de zwembaan van de dieren werd vastgelegd door een videosysteem. Via de MWM-test werden indicatoren zoals de gemiddelde ontsnappingslatentie, de tijd die in het doelkwadrant werd doorgebracht en het aantal overgangen over de oorspronkelijke perronpositie geregistreerd.
Voor laser-speckle contrast imaging (LSCI) detectie: Na de narcose werden de ratten vastgezet op een stereotaxisch instrument, en werd de schedel blootgesteld en vochtig gehouden. Een laser-speckle bloedstroombeeldsysteem werd gebruikt om continu ruwe speckle-beelden te verzamelen gedurende 30 seconden direct boven de schedel. Professionele software werd gebruikt om het ruimtelijk temporeel variërende specklecontrast om te zetten in een distributiekaart voor de cerebrale bloedstroomperfusie-eenheid (PU). Voor kwantitatieve analyse werd in elke afbeelding een handmatig afgebakende corticale ROI geselecteerd binnen de blootgestelde ipsilaterale hemisfeer op basis van het laesie-relevante corticale perfusiegebied en zichtbare anatomische herkenningspunten, en de gemiddelde perfusiewaarde binnen deze ROI werd gebruikt voor intergroepvergelijking.
Hersenweefsels werden verzameld en voorgekoelde PBS werd toegevoegd volgens de gewichts-volumeverhouding. Mechanische homogenisatie werd uitgevoerd op ijs, gevolgd door centrifugatie bij 8000 × g bij 4 °C gedurende 10–15 minuten, waarna het supernatant werd verzameld voor tests. Hersenweefsels werden snel in 4% paraformaldehyde geplaatst voor fixatie gedurende meer dan 24 uur om de weefselmorfologie te behouden. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring werd uitgevoerd door middel van operaties zoals dehydratie, clearing en paraffine-inbedding, waarbij de mate van hersenletsel werd waargenomen onder een optische microscoop.
Voor het meten van AChE-activiteit werd de hersenschors van de beschadigde (ipsilaterale) hemisfeer verzameld en gehomogeniseerd volgens de instructies van de fabrikant. Weefselmonsters werden gehomogeniseerd in extractiebuffer en gecentrifugeerd bij 8000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, waarna het supernatant werd verzameld voor analyse. AChE-activiteit werd bepaald met behulp van een commerciële acetylcholinesterase-activiteitstest (microplaat/colorimetrische methode). Deze assay is gebaseerd op de hydrolyse van acetylcholine door AChE, gevolgd door een reactie met DTNB om een chromogeen product te genereren, en de absorptie werd gemeten op 412 nm voor de berekening van enzymactiviteit. Omdat deze kit een op enzymactiviteit gebaseerde colorimetrische assay is in plaats van een conventionele antigen-kwantificerende enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit, bood de fabrikant geen standaard detectiebereik en analytische gevoeligheid aan. In de huidige studie lagen de gemeten AChE-activiteitswaarden in corticaal weefsel ongeveer binnen het bereik van 25–80 nmol/min/mg-eiwit.
Statistische analyse
Alle experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) en geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism-software. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Voor de Morris waterdoolhoftest werden het uiteindelijke trainingsresultaat en de probe-testparameters geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significantbeschouwd 18. De correlatie tussen cerebrale bloedstroomperfusie in de ROI en AChE-activiteit in de ipsilaterale cerebrale cortex werd geanalyseerd met behulp van Pearson-correlatieanalyse. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Analyse van chemische componenten in C. chinensis-extract
Alkaloïden zijn de belangrijkste opgehoopte componenten en ook de belangrijkste actieve bestanddelen van C. chinensis medicinale stoffen. In deze studie werd chromatografische technologie gebruikt om de belangrijkste chemische componenten in C. chinensis te analyseren (Figuur 1A). Zoals weergegeven in Tabel 1, vertoonden alle acht analyte...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Momenteel zijn er verschillende methoden en technologieën ontwikkeld voor de preventie en behandeling van hersenziekten 20,21,22. In deze studie werd een geïntegreerde strategie van in vitro screening, computationele simulatie en in vivo verificatie toegepast om systematisch de materiële basis en het multi-doelmechanisme van C. chinensis te verduidelijken bij het verbe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.
Dit werk werd ondersteund door het Zunyi Science and Technology Plan Project (Zunshi Kehe Support HZ (2020) Nr. 110).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | CATO Research Chemicals Inc. | 416046844 | Acetylcholinesterase inhibitietest |
| Acetylcholinesterase (AChE) | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd | C1682 | Acetylcholinesterase inhibitietest |
| Acetylthiocholinejodide (ATChI) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 1037408 | Acetylcholinesterase inhibitietest |
| Aetonitrile | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162577 | Vloeistofchromatografie mobiele fase |
| AutoDock Vina | AutoDock | Versie 1.2.5 | |
| Berberine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | 110713-201814 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Columbamine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180712 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Coptisine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Chemische samenstellingsanalyse |
| E-916 versnelde oplosmiddel extractor | Büchi Labortechnik AG, Zwitserland | E916-008 | Extractie van n-butanolfractie |
| Epiberberine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Mierenzuur | Thermo Fisher Scientific Inc | 1270563 | Vloeistofchromatografie mobiele fase |
| GaussView 6 | Gaussian | https://gaussian.com/gaussview6/ | |
| Glaucine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180615 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Jatrorrhizine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180607 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Magnoflorine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180205 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162578 | Vloeistofchromatografie mobiele fase |
| Microporeuze membraan | Millipore Filter Company | 2139547 | Filtratie van extracten |
| Palmatine standaard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180226 | Chemische samenstellingsanalyse |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| PyMOL | PyMOL | https://pymol.org/ | |
| Natriumcarbonaat | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 15138805 | Acetylcholinesterase inhibitietest |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 11019349 | Acetylcholinesterase inhibitietest |