Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
SAM- en SH3-domeinbevattend eiwit 1 (SASH1) is geïdentificeerd als een belangrijke regulator van trofoblastapoptose en inflammatie bij pre-eclampsie (PE). Exosomen afgeleid van de placenta (P-EXOS) verlichten hypoxie-geïnduceerde schade door de expressie van SASH1 te onderdrukken. Deze bevindingen onthullen een nieuw mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van PE en suggereren dat SASH1 een potentieel therapeutisch doelwit is.
SASH1 is een signaaladaptoreiwit dat betrokken is bij celgroei, apoptose en immuunregulatie, en dat in toenemende mate wordt bestudeerd in tumor- en immuuncellen. Opkomend bewijs suggereert dat SASH1 een belangrijke rol speelt in inflammatoire responsen en cellulaire homeostase, processen die nauw verbonden zijn met de ontwikkeling van PE. Deze studie had tot doel vast te stellen of SASH1 bijdraagt aan trofoblastapoptose en inflammatoire responsen bij PE en of P-EXOS beschermende effecten uitoefent via de regulatie van SASH1. In deze studie werden drie PE-gerelateerde transcriptomische datasets (GSE75010, GSE10588 en GSE60438) geanalyseerd om gedeelde differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) te identificeren, gevolgd door Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses. Machine learning-algoritmen werden verder toegepast om belangrijke kandidaatgenen te screenen, en single-cell RNA-sequencing data werden gebruikt om de cellulaire heterogeniteit in placentaweefsel te karakteriseren en celtype-specifieke expressiepatronen te bepalen. SASH1 werd geïdentificeerd als een consensuskandidaatgen en was significant opgereguleerd in trofoblastcellen uit PE-monsters. In vitro werd een hypoxie-behandeld HTR-8/SVneo trofoblastcelmodel opgezet, gecombineerd met SASH1-knockdown, SASH1-overexpressie en co-cultuur met P-EXOS. Functionele experimenten toonden aan dat knockdown van SASH1 de door hypoxie geïnduceerde trofoblastapoptose significant onderdrukte en de secretie van pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-6, IL-1β en TNF-α, verminderde, terwijl SASH1-overexpressie apoptose en inflammatoire responsen bevorderde. Daarnaast verminderde P-EXOS-behandeling de SASH1-expressie op zowel mRNA- als eiwitniveau aanzienlijk en verzachtte het de door hypoxie geïnduceerde trofoblastbeschadiging, terwijl SASH1-overexpressie deze beschermende effecten grotendeels ophefde. Gecombineerd wijzen deze bevindingen erop dat SASH1 een kritische rol speelt bij trofoblastapoptose en inflammatoire responsen bij PE. P-EXOS kan door hypoxie geïnduceerde trofoblastische beschadiging verlichten door de SASH1-expressie te onderdrukken, wat nieuwe inzichten biedt in de moleculaire mechanismen en potentiële therapeutische doelwitten voor PE.
PE is een zwangerschapsspecifieke multisysteemstoornis die doorgaans optreedt na 20 weken zwangerschap en klinisch wordt gekenmerkt door hypertensie, proteïnurie en multi-orgaanfalen. Het blijft wereldwijd een belangrijke oorzaak van maternale en perinatale morbiditeit en mortaliteit1. Ondanks voortdurende vorderingen in het klinische beheer is de definitieve behandeling van PE nog steeds de levering van de placenta, wat het onvolledige begrip van de pathogenese en de dringende noodzaak om nieuwe moleculaire en cellulaire mechanismen, alsook potentiële therapeutische doelwitten, te identificeren onderstreept2,3.
Adequate invasie van trofoblasten en de bevordering van een normale placentaire ontwikkeling zijn kritieke mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van PE4. Tijdens een normale zwangerschap invaderen trofoblastcellen de uterine decidua en remodelleren zij de spiraalarteren om een circulatie met lage weerstand en hoge capaciteit te vestigen. Een belemmerde invasie en migratie van trofoblastcellen leidt tot een verminderde placentaire perfusie, wat resulteert in een aanhoudende hypoxische omgeving met oxidatieve stress. Hypoxie heeft een directe impact op cellulaire apoptose, en de aberrante afgifte van pro-inflammatoire mediatoren verstoort de homeostase op de materno-foetale interface, wat de placentaire dysfunctie verder verergert5. Ontsteking is tevens een belangrijke drijfveer van PE. IL-17, IL-6 en TNF-α blijken sterk verhoogd te zijn in de placenta en het perifere bloed van PE-patiënten6. Hypoxie en ontsteking versterken elkaar wederzijds, waardoor een vicieuze cirkel ontstaat die systemische ontsteking amplificeert, endotheelschade veroorzaakt en bijdraagt aan placentaire abnormaliteiten. De onderliggende moleculaire netwerken die de apoptose van trofoblasten en inflammatoire responsen reguleren, blijven grotendeels onbekend.
SASH1 is een lid van de SLy/SASH1-familie van intracellulaire steigerproteïnen die functioneert als een signaleringsadaptor7. SASH1 is primair gekenmerkt als een tumorsuppressor die epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), celmigratie en invasie remt via interacties met signaleringspartners zoals CRKL en het PI3K-Akt-mTOR-pad8,9. Naast deze tumorsuppressieve rollen suggereert opkomend bewijs dat SASH1 deelneemt aan inflammatoire signalering en immuunregulatie7. De expressie en functie van SASH1 in de placenta, in het bijzonder in de context van trofoblastbiologie en PE, zijn echter nog niet onderzocht.
Exosomen zijn naar voren gekomen als belangrijke cellulaire mediatoren en worden in toenemende mate bestudeerd in de context van zwangerschap10. Exosomen transporteren diverse bioactieve ladingen, waaronder eiwitten, lipiden en niet-coderende RNA's, om de functie van de ontvangende cel te moduleren. Toenemend bewijs suggereert dat P-EXOS een cruciale rol spelen bij de immuunregulatie tijdens de zwangerschap, en dat hun activiteit en lading aanzienlijk veranderd zijn bij PE, wat mogelijk de inflammatoire toestand intensiveert11. Exosomen zijn ook betrokken bij de regulatie van oxidatieve stress12 en angiogenese13, waarbij ze potentieel gunstige effecten uitoefenen bij zwangerschapsgerelateerde complicaties. De moleculaire doelwitten en werkingsmechanismen bij PE zijn echter nog niet volledig begrepen.
Er werd gehypothetiseerd dat SASH1 ontregeld is in de placenta bij PE en fungeert als een belangrijke drijver van trofoblastapoptose en ontstekingsreacties, en dat P-EXOS beschermende effecten kan uitoefenen tegen trofoblastbeschadiging door de expressie van SASH1 te moduleren. Om deze hypothese te testen, werden meerdere transcriptomische datasets van PE geïntegreerd en single-cell RNA-sequencinggegevens gecombineerd met machine learning via meerdere algoritmen om belangrijke kandidaatgenen te identificeren. Met behulp van een hypoxie-behandeld HTR-8/SVneo trofoblastcelmodel en exosoom-gebaseerde interventie-experimenten werd de functionele rol van SASH1 bij trofoblastdysfunctie en het therapeutische potentieel van P-EXOS bij PE onderzocht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ethische verklaring
Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Shijiazhuang Fourth Hospital (goedkeuringsnummer 20200031). Van alle donoren van placentaweefsel is voorafgaand aan de monstername schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Alle procedures met menselijke deelnemers zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Een volledige lijst van reagentia, verbruiksartikelen, apparatuur en software die in dit protocol zijn gebruikt, is opgenomen in de Tabel met Materialen.
Gegevensverzameling
RNA-seq data werden verkregen uit de GEO-database. De datasets omvatten GSE75010, die genexpressiegegevens bevat van 157 PE-placenta's en 173 non-PE-placenta's (N = 330). GSE10588 bevat genexpressiegegevens van 26 normale placenta's en 17 ernstige PE-placenta's (N = 43). GSE60438 bevat transcriptoomprofielgegevens van de decidua basalis van pre-eclamptische patiënten en normotensieve zwangerschappen (N = 125). Single-cell transcriptoomgegevens werden verkregen uit de GEO-dataset GSE183338. Deze bevat single-nucleus monsters van de choriale villi/maternale-foetale interface van PE- en gezonde zwangerschappen.
Analyse van DEG's
DEGs geassocieerd met PE uit de datasets GSE75010, GSE10588 en GSE60438 werden eerst voorbewerkt en genormaliseerd. Vervolgens werd een differentiële analyse uitgevoerd met het R-pakket “limma”14 op basis van de informatie over de monstergroepering. Genen met p < 0,05 en |log2FC| > 0,5 werden geselecteerd. Volcano-plots van de DEGs werden gegenereerd met het R-pakket ggplot2. Heatmaps van de top 20 DEGs werden getekend met het R-pakket pheatmap. Vervolgens werd de intersectie van de DEGs die uit de drie datasets waren geselecteerd bepaald, en er werd een proteïne-proteïne interactie (PPI)-netwerk geconstrueerd voor de kandidaatgenen met behulp van het online platform STRING, met een interactiescore ≥0,15. De top 20 hub-genen werden verder geïdentificeerd uit dit PPI-netwerk op basis van hun connectiviteitsgraad, gerangschikt met de software Cytoscape. De resultaten van het PPI-netwerk werden gevisualiseerd met de software Cytoscape of STRING.
Enrichingsanalyse
Genverrijkingsanalyse werd uitgevoerd met de pakketten ClusterProfiler en DOSE in combinatie met de Metascape-website. De databases werden verkregen uit GO en KEGG. De verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met de functie “EnrichGO”. Pathways met p < 0.05 werden beschouwd als significant verrijkt. De verrijkingsresultaten werden gevisualiseerd met de pakketten “ggplot2” en “ggpubr”.
Machine learning
Om robuuste en biologisch relevante DEGs te identificeren die geassocieerd zijn met PE, is een feature selection-analyse uitgevoerd met behulp van meerdere machine learning-modellen, gebaseerd op de publiek beschikbare transcriptoomdataset GSE60438 (platform: GPL6884). Deze dataset bevat expressieprofielen van decidua basalis-monsters die tijdens een keizersnede zijn verzameld bij zwangerschappen met pre-eclampsie en normotensieve zwangerschappen. De vooraf gefilterde DEGs werden gestandaardiseerd, en de expressiematrix, samen met de bijbehorende klinische groeperingsinformatie, werd gebruikt als input voor vier verschillende machine learning-algoritmen om modelbias te verminderen en de stabiliteit van de feature selection te vergroten.
De vier algoritmen werden gelijktijdig toegepast, zonder specifieke volgorde. LASSO werd uitgevoerd met het “glmnet”-pakket om regressieanalyse te verrichten en belangrijke kenmerkgenen te selecteren. Een L1-regularisatieterm werd toegevoegd aan de verliesfunctie, waardoor de coëfficiënten van minder belangrijke kenmerken naar nul worden gereduceerd en zo kenmerkselectie wordt gerealiseerd. SVM-RFE werd geïmplementeerd met het “e1071”-pakket om een support vector machine met recursieve kenmerkeliminatie te construeren. Eerst werd een classifier getraind met behulp van SVM, waarna de minst informatieve kenmerken iteratief werden verwijderd op basis van kenmerkgewichten, wat resulteerde in een optimale subset van kenmerken. XGBoost werd toegepast via het “xgboost”-pakket om meerdere beslissingsbomen te bouwen. Elke boom paste zich aan de residuen van de vorige boom aan, en de gewogen outputs werden opgeteld om de uiteindelijke voorspelling te verkrijgen. Boruta werd uitgevoerd met het “randomForest”-pakket, waarbij schaduwkenmerken werden gegenereerd die concurreerden met echte kenmerken bij het trainen van een random forest. Kenmerken met belangrijkheidswaarden die significant hoger waren dan willekeurige ruis, werden behouden.
Analyse van transcriptoomgegevens op single-cell niveau
Single-cell transcriptoomgegevens werden verkregen uit de GEO-database, waarbij de ruwe count-matrix werd opgehaald uit GSE183338. De count-matrix werd geïmporteerd met de functie “Read10X” van het Seurat-pakket en omgezet naar een dgCMatrix-formaat. Individuele objecten werden samengevoegd tot één aggregaatobject met de functie “merge”, en cellabels werden uniek gemaakt met “RenameCells”. Cellen van lage kwaliteit werden gefilterd op basis van de volgende criteria: genen die in minder dan drie cellen werden tot expressie gebracht werden verwijderd, en cellen die minder dan 200 genen tot expressie brachten werden uitgesloten. De kwaliteitsgecontroleerde cellen werden genormaliseerd en sterk variabele genen werden geïdentificeerd. Globale schalingsnormalisatie werd toegepast met “LogNormalize” (schaalfactor = 10.000), sterk variabele genen (n = 2.000) werden geselecteerd met “FindVariableFeatures”, en de gegevens werden geschaald met “ScaleData”. Er werd een principale componentenanalyse uitgevoerd op de sterk variabele kenmerken, waarbij de bovenste 30 principale componenten werden behouden. Batch-effecten tussen monsters werden gecorrigeerd met de Harmony-methode. Cellen werden gevisualiseerd en gedownscaled met UMAP. Shared nearest neighbor-grafieken werden geconstrueerd met “FindNeighbors” en “FindClusters” op basis van het Louvain-algoritme. De resolutieparameter in “FindClusters” werd geoptimaliseerd tussen 0,1 en 1. De clusteringboom werd gevisualiseerd met de functie “clustree”, en een resolutie van 0,9 werd gekozen om celclusters te definiëren. Potentiële doubletten werden verwijderd met het Scrublet-algoritme. Celclusters werden geannoteerd door differentieel tot expressie gebrachte markergenen te identificeren met de functie “FindAllMarkers”. De non-parametrische Wilcoxon rank sum test werd toegepast met Bonferroni-correctie. Celidentiteiten werden toegewezen op basis van oppervlaktemarkers, relevante literatuur en de Cell Classification Database15.
Celcultuur
De trofoblastcellijn HTR-8/SVneo-cellen werden gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine. Hypoxische condities werden gecreëerd door de cellen gedurende 24 h te kweken bij 1% O₂, 5% CO₂ en 94% N₂; normoxische controles werden gehouden bij 20% O₂ en 5% CO₂16. Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd in een biosafety cabinet klasse II met gebruik van aseptische technieken. Kweekmedia, transfectiereagentia en celafval moeten worden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor biologische veiligheid.
Celtransfectie
Plasmiden met sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 en OE-NC werden gesynthetiseerd. HTR-8/SVneo-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5 × 105 cellen per putje in zeswellsplaten. De cellen werden vervolgens getransfecteerd met 2 µg sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 of OE-NC plasmide per putje met behulp van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat werdenHet plasmide-DNA en P3000 Reagent verdund in Opti-MEM, gemengd met Lipofectamine 3000 dat afzonderlijk in Opti-MEM was verdund, 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur en toegevoegd aan cellen met een confluentie van 70–80%. Achtenveertig uur na transfectie werd de SASH1-expressie geanalyseerd via RT-qPCR en Western blot. De gebruikte shRNA-doelsequenties voor SASH1-knockdown staan vermeld in Aanvullende Tabel 1.
Real-time kwantitatieve PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit HTR-8/SVneo cellen en via reverse transcriptie omgezet in cDNA met behulp van een reverse transcriptiekit bij 42 °C gedurende 30 min, gevolgd door 85 °C gedurende 5 min. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) werd uitgevoerd met SYBR Green master mix volgens de volgende cycluseigenschappen: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min. De relatieve mRNA-expressie werd berekend met de ΔΔCt-methode, met β-actin als interne referentie. De primersequenties die in dit experiment zijn gebruikt, staan vermeld in Aanvullende Tabel 2.
Western blot-analyse
Totaaleiwit werd geëxtraheerd uit HTR-8/SVneo-cellen met behulp van de lysisbuffer. De cellysaten werden verzameld, op ijs geïncubeerd en gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 30 min bij 4 °C om onoplosbaar residu te verwijderen. De eiwitconcentratie werd bepaald met een spectrofotometer. Gelijke hoeveelheden eiwit (50 µg) werden gescheiden via SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op PVDF-membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% vetarme melk en overnight geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C. Na het wassen werden de membranen geïncubeerd met de corresponderende secundaire antilichamen, waarna de eiwitbanden werden gevisualiseerd met een enhanced chemiluminescence detectiesysteem.
Voor de proteïnedetectie werden primaire antilichamen gebruikt, waaronder anti-SASH1 en β-actin. Hiervoor werden geschikte met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen ingezet: geit anti-konijn en geit anti-muis. β-actin diende als interne ladingscontrole om een gelijke proteïnelading te waarborgen. De intensiteit van de proteïnebanden werd gemeten en gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.
Isolatie van P-EXOS
P-EXOS werden geïsoleerd uit placentaire villusweefsel verkregen uit termijnplacentae van gezonde vrouwen die een electieve keizersnede ondergingen. Het placentaire villusweefsel werd grondig gewassen met steriele PBS, fijngehakt in fragmenten van ongeveer 1 mm3 en gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% exosoom-gedepleteerde FBS bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 48 u. Het geconditioneerde medium werd onderworpen aan differentiële centrifugatie als volgt: 300 × g gedurende 10 min om cellen en weefselresten te verwijderen; 2.000 × g gedurende 20 min om celresten te verwijderen; en 10.000 × g gedurende 30 min om microvesikels te verwijderen, alles bij 4 °C. De resulterende supernatant werd ultracentrifugéerd bij 120.000 × g gedurende 70 min bij 4 °C om de exosomen te pelletteren. De pellet werd eenmaal gewassen met PBS en opnieuw ultracentrifugéerd bij 120.000 × g gedurende 70 min bij 4 °C. De uiteindelijke pellet werd geresuspendeerd in PBS. De geïsoleerde exosomen werden gekarakteriseerd via Western blot-analyse voor exosoommarkers (PLAP, CD63 en TSG101, met GM130 als negatieve controle) en verder onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie voor morfologische observatie.
Experiment voor de cellulaire opname van P-EXOS
Om de cellulaire internalisatie van P-EXOS te bevestigen, werden exosomen fluorescent gelabeld met de lipofiele membraankleurstof PKH67 volgens het protocol van de fabrikant. Kort samengevat werden P-EXOS gedurende 5 min bij kamertemperatuur geïncubeerd met PKH67 (4 µM) in Diluent C, waarna de reactie werd gestopt met een gelijk volume 1% bovien serumalbumine (BSA). Gelabelde exosomen werden opnieuw geïsoleerd door middel van ultracentrifugatie (120,000 × g, 70 min, 4 °C) om ongebonden kleurstof te verwijderen. PKH67-gelabelde P-EXOS (50 µg/mL) werden vervolgens toegevoegd aan HTR-8/SVneo-cellen en gedurende 24 u geco-incubeerd onder normoxische of hypoxische (1% O₂) condities. De cellen werden vervolgens drie keer gewassen met PBS, gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min, en de kernen werden tegengekleurd met DAPI (1 µg/mL). Internalisatie van PKH67-gelabelde exosomen werd gevisualiseerd met confocale laserscanscanmicroscopie (CLSM; excitatie 490 nm, emissie 502 nm). Voor functionele co-cultuurexperimenten werden HTR-8/SVneo-cellen behandeld met P-EXOS in een concentratie van 50 µg/mL (proteïne-equivalent) in volledig RPMI-1640-medium aangevuld met 10% exosoom-gedepleteerd FBS onder hypoxische condities (1% O₂) gedurende 24 u.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Supernatanten van celculturen werden verzameld, en de spiegels van IL-6, IL-1β en TNF-α werden respectievelijk gemeten met een IL-6 ELISA-kit, een IL-1β ELISA-kit en een TNF-α ELISA-kit, volgens de instructies van de fabrikanten. De absorbantie bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer, en de werkelijke concentraties werden berekend op basis van de standaardcurven.
TdT-gemedieerde dUTP nick-end labeling (TUNEL)
Apoptotische cellen werden gedetecteerd met behulp van de TUNEL-assaykit volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat werden de cellen 15 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, 5 min op ijs permeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 in PBS, en 60 min bij 37 °C in het donker geïncubeerd met het TUNEL-reactiemengsel. De kernen werden tegengekleurd met DAPI, en TUNEL-positieve cellen werden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd door het percentage TUNEL-positieve cellen te tellen in ten minste vijf willekeurig gekozen velden per monster.
Statistische analyse
Alle gegevens werden geanalyseerd met R en GraphPad Prism. Continue variabelen worden weergegeven als gemiddelde ±SD. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met de Student's t-toets, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden uitgevoerd met een eenweg-ANOVA gevolgd door de post-hoc toets van Tukey. Statistische significantie voor categorische variabelen werd beoordeeld met de Chi-kwadraattoets of de exacte toets van Fisher. Tenzij anders vermeld, werden correlaties tussen moleculen berekend met behulp van de correlatieanalyse van Spearman. Experimenten voor de karakterisering van exosomen werden uitgevoerd met P-EXOS geïsoleerd van drie onafhankelijke placenta-donoren. Celgebaseerde experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replica's, wat staat voor onafhankelijke experimenten die op verschillende gelegenheden zijn uitgevoerd met HTR-8/SVneo-cellen van verschillende passages, waarbij voor elke replica P-EXOS werden gebruikt die waren geïsoleerd van een andere placentadonoor. Een p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Transcriptomanalyse van gezonde patiënten en patiënten met PE
Voor de verschillen in genexpressie tussen de normale groep (Normal) en PE-patiënten werd de differentiële expressie in de samengevoegde datasets geanalyseerd met het R-pakket limma. In totaal werden 89 DEG's geïdentificeerd (p < 0,05 en |log2FC| > 0,5), waarvan 69 genen upgereguleerd en 20 genen gedownreguleerd waren voor GSE75010 (Figuur 1A). Er zijn 2.097 di...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
In deze studie werd SASH1 geïdentificeerd als een belangrijk gen dat ontregeld is bij PE via geïntegreerde transcriptomische analyse, single-cell sequencing en multi-algoritme machine learning, een benadering die bijzonder relevant is aangezien gerichte therapieën voor PE nog niet beschikbaar zijn17. Er werd aangetoond dat SASH1 significant is opgereguleerd in hypoxische trofoblastcellen en specifiek verhoogd is in het trofoblastcompartiment van PE-placenta's op single-cell resolutie. Door middel ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Er is geen sprake van een belangenconflict bij deze studie.
Deze studie werd gefinancierd door het Medical Science Research Key Program van de Hebei Provincial Health Commission, China (No. 20210075).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875085 | |
| Fetaal runderserum (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| Exosoom-uitgeput FBS | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicilline/streptomycine | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Lipofectamine 3000 transfectiereagens (met P3000-reagens) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Opti-MEM medium met verminderde hoeveelheid serum | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| SASH1 shRNA-plasmide (HuSH) | origene | TL301836 | |
| SASH1 ORF-expressieplasmide | origene | RC218866 | |
| Lege vectorcontrole | origene | PS100001 | |
| Reverse transcriptiekit | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| SASH1-primers | Sangon Biotech | Op maat gesynthetiseerd | |
| β-actine-primers | Sangon Biotech | Op maat gesynthetiseerd | |
| Cellulaire lysisbuffer | Beyotime | P0013B | |
| NanoDrop-spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| PVDF-membraan | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anti-SASH1-antilichaam | ABclonal | A15248 | |
| Anti-β-actine-antilichaam | Abcam | ab6276 | |
| HRP-geconjugeerd geiten-anti-konijn/anti-muis secundair antilichaam | Beyotime | A0208 | |
| ImageJ-software | NIH (publiek domein) | ImageJ | |
| PKH67 groene fluorescente cellinker-kit (incl. verdunner C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Bovien serumalbumine (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Confocale laserscanningsmicroscoop (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Humane IL-6 Quantikine ELISA-kit | R&D Systems | D6050B | |
| Humane IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY201 | |
| Humane TNF-α Quantikine ELISA-kit | R&D Systems | DTA00D | |
| Microplaatlezer | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| In situ celsterfte-detectiekit (TUNEL-assaykit) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus | BX53 | |
| Gekoelde centrifuge (capaciteit 12.000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrifuge (capaciteit 120.000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| R-software | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (R-pakket) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (R-pakket, batchcorrectie) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (Python-pakket, doubletdetectie) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (R-pakket) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (R-pakket, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (R-pakket, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (R-pakket) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (R-pakket, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Gene Expression Omnibus (GEO) database | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| STRING-database | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Cytoscape-software | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (R-pakket) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (R-pakket) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (R-pakket) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (R-pakket) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (R-pakket) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (R-pakket) | Open-source | v0.6.0 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.