SAM- en SH3-domeinbevattend eiwit 1 (SASH1) is geïdentificeerd als een belangrijke regulator van trofoblastapoptose en inflammatie bij pre-eclampsie (PE). Exosomen afgeleid van de placenta (P-EXOS) verlichten hypoxie-geïnduceerde schade door de expressie van SASH1 te onderdrukken. Deze bevindingen onthullen een nieuw mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van PE en suggereren dat SASH1 een potentieel therapeutisch doelwit is.
Onderzoeksartikel
Placenta-afgeleide exosomen verminderen hypoxie-geïnduceerde apoptose van trofoblasten en inflammatoire progressie via SASH1
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
SASH1 is een signaaladaptoreiwit dat betrokken is bij celgroei, apoptose en immuunregulatie, en dat in toenemende mate wordt bestudeerd in tumor- en immuuncellen. Opkomend bewijs suggereert dat SASH1 een belangrijke rol speelt in inflammatoire responsen en cellulaire homeostase, processen die nauw verbonden zijn met de ontwikkeling van PE. Deze studie had tot doel vast te stellen of SASH1 bijdraagt aan trofoblastapoptose en inflammatoire responsen bij PE en of P-EXOS beschermende effecten uitoefent via de regulatie van SASH1. In deze studie werden drie PE-gerelateerde transcriptomische datasets (GSE75010, GSE10588 en GSE60438) geanalyseerd om gedeelde differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) te identificeren, gevolgd door Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses. Machine learning-algoritmen werden verder toegepast om belangrijke kandidaatgenen te screenen, en single-cell RNA-sequencing data werden gebruikt om de cellulaire heterogeniteit in placentaweefsel te karakteriseren en celtype-specifieke expressiepatronen te bepalen. SASH1 werd geïdentificeerd als een consensuskandidaatgen en was significant opgereguleerd in trofoblastcellen uit PE-monsters. In vitro werd een hypoxie-behandeld HTR-8/SVneo trofoblastcelmodel opgezet, gecombineerd met SASH1-knockdown, SASH1-overexpressie en co-cultuur met P-EXOS. Functionele experimenten toonden aan dat knockdown van SASH1 de door hypoxie geïnduceerde trofoblastapoptose significant onderdrukte en de secretie van pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-6, IL-1β en TNF-α, verminderde, terwijl SASH1-overexpressie apoptose en inflammatoire responsen bevorderde. Daarnaast verminderde P-EXOS-behandeling de SASH1-expressie op zowel mRNA- als eiwitniveau aanzienlijk en verzachtte het de door hypoxie geïnduceerde trofoblastbeschadiging, terwijl SASH1-overexpressie deze beschermende effecten grotendeels ophefde. Gecombineerd wijzen deze bevindingen erop dat SASH1 een kritische rol speelt bij trofoblastapoptose en inflammatoire responsen bij PE. P-EXOS kan door hypoxie geïnduceerde trofoblastische beschadiging verlichten door de SASH1-expressie te onderdrukken, wat nieuwe inzichten biedt in de moleculaire mechanismen en potentiële therapeutische doelwitten voor PE.
Inleiding
PE is een zwangerschapsspecifieke multisysteemstoornis die doorgaans optreedt na 20 weken zwangerschap en klinisch wordt gekenmerkt door hypertensie, proteïnurie en multi-orgaanfalen. Het blijft wereldwijd een belangrijke oorzaak van maternale en perinatale morbiditeit en mortaliteit1. Ondanks voortdurende vorderingen in het klinische beheer is de definitieve behandeling van PE nog steeds de levering van de placenta, wat het onvolledige begrip van de pathogenese en de dringende noodzaak om nieuwe moleculaire en cellulaire mechanismen, alsook potentiële therapeutische doelwitten, te identificeren onderstreept2,3.
Adequate invasie van trofoblasten en de bevordering van een normale placentaire ontwikkeling zijn kritieke mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van PE4. Tijdens een normale zwangerschap invaderen trofoblastcellen de uterine decidua en remodelleren zij de spiraalarteren om een circulatie met lage weerstand en hoge capaciteit te vestigen. Een belemmerde invasie en migratie van trofoblastcellen leidt tot een verminderde placentaire perfusie, wat resulteert in een aanhoudende hypoxische omgeving met oxidatieve stress. Hypoxie heeft een directe impact op cellulaire apoptose, en de aberrante afgifte van pro-inflammatoire mediatoren verstoort de homeostase op de materno-foetale interface, wat de placentaire dysfunctie verder verergert5. Ontsteking is tevens een belangrijke drijfveer van PE. IL-17, IL-6 en TNF-α blijken sterk verhoogd te zijn in de placenta en het perifere bloed van PE-patiënten6. Hypoxie en ontsteking versterken elkaar wederzijds, waardoor een vicieuze cirkel ontstaat die systemische ontsteking amplificeert, endotheelschade veroorzaakt en bijdraagt aan placentaire abnormaliteiten. De onderliggende moleculaire netwerken die de apoptose van trofoblasten en inflammatoire responsen reguleren, blijven grotendeels onbekend.
SASH1 is een lid van de SLy/SASH1-familie van intracellulaire steigerproteïnen die functioneert als een signaleringsadaptor7. SASH1 is primair gekenmerkt als een tumorsuppressor die epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), celmigratie en invasie remt via interacties met signaleringspartners zoals CRKL en het PI3K-Akt-mTOR-pad8,9. Naast deze tumorsuppressieve rollen suggereert opkomend bewijs dat SASH1 deelneemt aan inflammatoire signalering en immuunregulatie7. De expressie en functie van SASH1 in de placenta, in het bijzonder in de context van trofoblastbiologie en PE, zijn echter nog niet onderzocht.
Exosomen zijn naar voren gekomen als belangrijke cellulaire mediatoren en worden in toenemende mate bestudeerd in de context van zwangerschap10. Exosomen transporteren diverse bioactieve ladingen, waaronder eiwitten, lipiden en niet-coderende RNA's, om de functie van de ontvangende cel te moduleren. Toenemend bewijs suggereert dat P-EXOS een cruciale rol spelen bij de immuunregulatie tijdens de zwangerschap, en dat hun activiteit en lading aanzienlijk veranderd zijn bij PE, wat mogelijk de inflammatoire toestand intensiveert11. Exosomen zijn ook betrokken bij de regulatie van oxidatieve stress12 en angiogenese13, waarbij ze potentieel gunstige effecten uitoefenen bij zwangerschapsgerelateerde complicaties. De moleculaire doelwitten en werkingsmechanismen bij PE zijn echter nog niet volledig begrepen.
Er werd gehypothetiseerd dat SASH1 ontregeld is in de placenta bij PE en fungeert als een belangrijke drijver van trofoblastapoptose en ontstekingsreacties, en dat P-EXOS beschermende effecten kan uitoefenen tegen trofoblastbeschadiging door de expressie van SASH1 te moduleren. Om deze hypothese te testen, werden meerdere transcriptomische datasets van PE geïntegreerd en single-cell RNA-sequencinggegevens gecombineerd met machine learning via meerdere algoritmen om belangrijke kandidaatgenen te identificeren. Met behulp van een hypoxie-behandeld HTR-8/SVneo trofoblastcelmodel en exosoom-gebaseerde interventie-experimenten werd de functionele rol van SASH1 bij trofoblastdysfunctie en het therapeutische potentieel van P-EXOS bij PE onderzocht.
Protocol
Ethische verklaring
Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Shijiazhuang Fourth Hospital (goedkeuringsnummer 20200031). Van alle donoren van placentaweefsel is voorafgaand aan de monstername schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Alle procedures met menselijke deelnemers zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Een volledige lijst van reagentia, verbruiksartikelen, apparatuur en software die in dit protocol zijn gebruikt, is opgenomen in de Tabel met Materialen.
Gegevensverzameling
RNA-seq data werden verkregen uit de GEO-database. De datasets omvatten GSE75010, die genexpressiegegevens bevat van 157 PE-placenta's en 173 non-PE-placenta's (N = 330). GSE10588 bevat genexpressiegegevens van 26 normale placenta's en 17 ernstige PE-placenta's (N = 43). GSE60438 bevat transcriptoomprofielgegevens van de decidua basalis van pre-eclamptische patiënten en normotensieve zwangerschappen (N = 125). Single-cell transcriptoomgegevens werden verkregen uit de GEO-dataset GSE183338. Deze bevat single-nucleus monsters van de choriale villi/maternale-foetale interface van PE- en gezonde zwangerschappen.
Analyse van DEG's
DEGs geassocieerd met PE uit de datasets GSE75010, GSE10588 en GSE60438 werden eerst voorbewerkt en genormaliseerd. Vervolgens werd een differentiële analyse uitgevoerd met het R-pakket “limma”14 op basis van de informatie over de monstergroepering. Genen met p < 0,05 en |log2FC| > 0,5 werden geselecteerd. Volcano-plots van de DEGs werden gegenereerd met het R-pakket ggplot2. Heatmaps van de top 20 DEGs werden getekend met het R-pakket pheatmap. Vervolgens werd de intersectie van de DEGs die uit de drie datasets waren geselecteerd bepaald, en er werd een proteïne-proteïne interactie (PPI)-netwerk geconstrueerd voor de kandidaatgenen met behulp van het online platform STRING, met een interactiescore ≥0,15. De top 20 hub-genen werden verder geïdentificeerd uit dit PPI-netwerk op basis van hun connectiviteitsgraad, gerangschikt met de software Cytoscape. De resultaten van het PPI-netwerk werden gevisualiseerd met de software Cytoscape of STRING.
Enrichingsanalyse
Genverrijkingsanalyse werd uitgevoerd met de pakketten ClusterProfiler en DOSE in combinatie met de Metascape-website. De databases werden verkregen uit GO en KEGG. De verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met de functie “EnrichGO”. Pathways met p < 0.05 werden beschouwd als significant verrijkt. De verrijkingsresultaten werden gevisualiseerd met de pakketten “ggplot2” en “ggpubr”.
Machine learning
Om robuuste en biologisch relevante DEGs te identificeren die geassocieerd zijn met PE, is een feature selection-analyse uitgevoerd met behulp van meerdere machine learning-modellen, gebaseerd op de publiek beschikbare transcriptoomdataset GSE60438 (platform: GPL6884). Deze dataset bevat expressieprofielen van decidua basalis-monsters die tijdens een keizersnede zijn verzameld bij zwangerschappen met pre-eclampsie en normotensieve zwangerschappen. De vooraf gefilterde DEGs werden gestandaardiseerd, en de expressiematrix, samen met de bijbehorende klinische groeperingsinformatie, werd gebruikt als input voor vier verschillende machine learning-algoritmen om modelbias te verminderen en de stabiliteit van de feature selection te vergroten.
De vier algoritmen werden gelijktijdig toegepast, zonder specifieke volgorde. LASSO werd uitgevoerd met het “glmnet”-pakket om regressieanalyse te verrichten en belangrijke kenmerkgenen te selecteren. Een L1-regularisatieterm werd toegevoegd aan de verliesfunctie, waardoor de coëfficiënten van minder belangrijke kenmerken naar nul worden gereduceerd en zo kenmerkselectie wordt gerealiseerd. SVM-RFE werd geïmplementeerd met het “e1071”-pakket om een support vector machine met recursieve kenmerkeliminatie te construeren. Eerst werd een classifier getraind met behulp van SVM, waarna de minst informatieve kenmerken iteratief werden verwijderd op basis van kenmerkgewichten, wat resulteerde in een optimale subset van kenmerken. XGBoost werd toegepast via het “xgboost”-pakket om meerdere beslissingsbomen te bouwen. Elke boom paste zich aan de residuen van de vorige boom aan, en de gewogen outputs werden opgeteld om de uiteindelijke voorspelling te verkrijgen. Boruta werd uitgevoerd met het “randomForest”-pakket, waarbij schaduwkenmerken werden gegenereerd die concurreerden met echte kenmerken bij het trainen van een random forest. Kenmerken met belangrijkheidswaarden die significant hoger waren dan willekeurige ruis, werden behouden.
Analyse van transcriptoomgegevens op single-cell niveau
Single-cell transcriptoomgegevens werden verkregen uit de GEO-database, waarbij de ruwe count-matrix werd opgehaald uit GSE183338. De count-matrix werd geïmporteerd met de functie “Read10X” van het Seurat-pakket en omgezet naar een dgCMatrix-formaat. Individuele objecten werden samengevoegd tot één aggregaatobject met de functie “merge”, en cellabels werden uniek gemaakt met “RenameCells”. Cellen van lage kwaliteit werden gefilterd op basis van de volgende criteria: genen die in minder dan drie cellen werden tot expressie gebracht werden verwijderd, en cellen die minder dan 200 genen tot expressie brachten werden uitgesloten. De kwaliteitsgecontroleerde cellen werden genormaliseerd en sterk variabele genen werden geïdentificeerd. Globale schalingsnormalisatie werd toegepast met “LogNormalize” (schaalfactor = 10.000), sterk variabele genen (n = 2.000) werden geselecteerd met “FindVariableFeatures”, en de gegevens werden geschaald met “ScaleData”. Er werd een principale componentenanalyse uitgevoerd op de sterk variabele kenmerken, waarbij de bovenste 30 principale componenten werden behouden. Batch-effecten tussen monsters werden gecorrigeerd met de Harmony-methode. Cellen werden gevisualiseerd en gedownscaled met UMAP. Shared nearest neighbor-grafieken werden geconstrueerd met “FindNeighbors” en “FindClusters” op basis van het Louvain-algoritme. De resolutieparameter in “FindClusters” werd geoptimaliseerd tussen 0,1 en 1. De clusteringboom werd gevisualiseerd met de functie “clustree”, en een resolutie van 0,9 werd gekozen om celclusters te definiëren. Potentiële doubletten werden verwijderd met het Scrublet-algoritme. Celclusters werden geannoteerd door differentieel tot expressie gebrachte markergenen te identificeren met de functie “FindAllMarkers”. De non-parametrische Wilcoxon rank sum test werd toegepast met Bonferroni-correctie. Celidentiteiten werden toegewezen op basis van oppervlaktemarkers, relevante literatuur en de Cell Classification Database15.
Celcultuur
De trofoblastcellijn HTR-8/SVneo-cellen werden gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine. Hypoxische condities werden gecreëerd door de cellen gedurende 24 h te kweken bij 1% O₂, 5% CO₂ en 94% N₂; normoxische controles werden gehouden bij 20% O₂ en 5% CO₂16. Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd in een biosafety cabinet klasse II met gebruik van aseptische technieken. Kweekmedia, transfectiereagentia en celafval moeten worden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor biologische veiligheid.
Celtransfectie
Plasmiden met sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 en OE-NC werden gesynthetiseerd. HTR-8/SVneo-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5 × 105 cellen per putje in zeswellsplaten. De cellen werden vervolgens getransfecteerd met 2 µg sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 of OE-NC plasmide per putje met behulp van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat werdenHet plasmide-DNA en P3000 Reagent verdund in Opti-MEM, gemengd met Lipofectamine 3000 dat afzonderlijk in Opti-MEM was verdund, 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur en toegevoegd aan cellen met een confluentie van 70–80%. Achtenveertig uur na transfectie werd de SASH1-expressie geanalyseerd via RT-qPCR en Western blot. De gebruikte shRNA-doelsequenties voor SASH1-knockdown staan vermeld in Aanvullende Tabel 1.
Real-time kwantitatieve PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit HTR-8/SVneo cellen en via reverse transcriptie omgezet in cDNA met behulp van een reverse transcriptiekit bij 42 °C gedurende 30 min, gevolgd door 85 °C gedurende 5 min. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) werd uitgevoerd met SYBR Green master mix volgens de volgende cycluseigenschappen: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min. De relatieve mRNA-expressie werd berekend met de ΔΔCt-methode, met β-actin als interne referentie. De primersequenties die in dit experiment zijn gebruikt, staan vermeld in Aanvullende Tabel 2.
Western blot-analyse
Totaaleiwit werd geëxtraheerd uit HTR-8/SVneo-cellen met behulp van de lysisbuffer. De cellysaten werden verzameld, op ijs geïncubeerd en gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 30 min bij 4 °C om onoplosbaar residu te verwijderen. De eiwitconcentratie werd bepaald met een spectrofotometer. Gelijke hoeveelheden eiwit (50 µg) werden gescheiden via SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op PVDF-membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% vetarme melk en overnight geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C. Na het wassen werden de membranen geïncubeerd met de corresponderende secundaire antilichamen, waarna de eiwitbanden werden gevisualiseerd met een enhanced chemiluminescence detectiesysteem.
Voor de proteïnedetectie werden primaire antilichamen gebruikt, waaronder anti-SASH1 en β-actin. Hiervoor werden geschikte met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen ingezet: geit anti-konijn en geit anti-muis. β-actin diende als interne ladingscontrole om een gelijke proteïnelading te waarborgen. De intensiteit van de proteïnebanden werd gemeten en gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.
Isolatie van P-EXOS
P-EXOS werden geïsoleerd uit placentaire villusweefsel verkregen uit termijnplacentae van gezonde vrouwen die een electieve keizersnede ondergingen. Het placentaire villusweefsel werd grondig gewassen met steriele PBS, fijngehakt in fragmenten van ongeveer 1 mm3 en gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% exosoom-gedepleteerde FBS bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 48 u. Het geconditioneerde medium werd onderworpen aan differentiële centrifugatie als volgt: 300 × g gedurende 10 min om cellen en weefselresten te verwijderen; 2.000 × g gedurende 20 min om celresten te verwijderen; en 10.000 × g gedurende 30 min om microvesikels te verwijderen, alles bij 4 °C. De resulterende supernatant werd ultracentrifugéerd bij 120.000 × g gedurende 70 min bij 4 °C om de exosomen te pelletteren. De pellet werd eenmaal gewassen met PBS en opnieuw ultracentrifugéerd bij 120.000 × g gedurende 70 min bij 4 °C. De uiteindelijke pellet werd geresuspendeerd in PBS. De geïsoleerde exosomen werden gekarakteriseerd via Western blot-analyse voor exosoommarkers (PLAP, CD63 en TSG101, met GM130 als negatieve controle) en verder onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie voor morfologische observatie.
Experiment voor de cellulaire opname van P-EXOS
Om de cellulaire internalisatie van P-EXOS te bevestigen, werden exosomen fluorescent gelabeld met de lipofiele membraankleurstof PKH67 volgens het protocol van de fabrikant. Kort samengevat werden P-EXOS gedurende 5 min bij kamertemperatuur geïncubeerd met PKH67 (4 µM) in Diluent C, waarna de reactie werd gestopt met een gelijk volume 1% bovien serumalbumine (BSA). Gelabelde exosomen werden opnieuw geïsoleerd door middel van ultracentrifugatie (120,000 × g, 70 min, 4 °C) om ongebonden kleurstof te verwijderen. PKH67-gelabelde P-EXOS (50 µg/mL) werden vervolgens toegevoegd aan HTR-8/SVneo-cellen en gedurende 24 u geco-incubeerd onder normoxische of hypoxische (1% O₂) condities. De cellen werden vervolgens drie keer gewassen met PBS, gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min, en de kernen werden tegengekleurd met DAPI (1 µg/mL). Internalisatie van PKH67-gelabelde exosomen werd gevisualiseerd met confocale laserscanscanmicroscopie (CLSM; excitatie 490 nm, emissie 502 nm). Voor functionele co-cultuurexperimenten werden HTR-8/SVneo-cellen behandeld met P-EXOS in een concentratie van 50 µg/mL (proteïne-equivalent) in volledig RPMI-1640-medium aangevuld met 10% exosoom-gedepleteerd FBS onder hypoxische condities (1% O₂) gedurende 24 u.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Supernatanten van celculturen werden verzameld, en de spiegels van IL-6, IL-1β en TNF-α werden respectievelijk gemeten met een IL-6 ELISA-kit, een IL-1β ELISA-kit en een TNF-α ELISA-kit, volgens de instructies van de fabrikanten. De absorbantie bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer, en de werkelijke concentraties werden berekend op basis van de standaardcurven.
TdT-gemedieerde dUTP nick-end labeling (TUNEL)
Apoptotische cellen werden gedetecteerd met behulp van de TUNEL-assaykit volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat werden de cellen 15 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, 5 min op ijs permeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 in PBS, en 60 min bij 37 °C in het donker geïncubeerd met het TUNEL-reactiemengsel. De kernen werden tegengekleurd met DAPI, en TUNEL-positieve cellen werden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd door het percentage TUNEL-positieve cellen te tellen in ten minste vijf willekeurig gekozen velden per monster.
Statistische analyse
Alle gegevens werden geanalyseerd met R en GraphPad Prism. Continue variabelen worden weergegeven als gemiddelde ±SD. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met de Student's t-toets, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden uitgevoerd met een eenweg-ANOVA gevolgd door de post-hoc toets van Tukey. Statistische significantie voor categorische variabelen werd beoordeeld met de Chi-kwadraattoets of de exacte toets van Fisher. Tenzij anders vermeld, werden correlaties tussen moleculen berekend met behulp van de correlatieanalyse van Spearman. Experimenten voor de karakterisering van exosomen werden uitgevoerd met P-EXOS geïsoleerd van drie onafhankelijke placenta-donoren. Celgebaseerde experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replica's, wat staat voor onafhankelijke experimenten die op verschillende gelegenheden zijn uitgevoerd met HTR-8/SVneo-cellen van verschillende passages, waarbij voor elke replica P-EXOS werden gebruikt die waren geïsoleerd van een andere placentadonoor. Een p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Transcriptomanalyse van gezonde patiënten en patiënten met PE
Voor de verschillen in genexpressie tussen de normale groep (Normal) en PE-patiënten werd de differentiële expressie in de samengevoegde datasets geanalyseerd met het R-pakket limma. In totaal werden 89 DEG's geïdentificeerd (p < 0,05 en |log2FC| > 0,5), waarvan 69 genen upgereguleerd en 20 genen gedownreguleerd waren voor GSE75010 (Figuur 1A). Er zijn 2.097 differentieel tot expressie gebrachte genen, waarvan er 1.121 upgereguleerd en 976 gedownreguleerd zijn (Figuur 1B). Voor de dataset GSE60438 zijn er 7.63 DEG's, met 3.371 upgereguleerde genen en 4.262 gedownreguleerde genen (Figuur 1C). De aanzienlijke verschillen in het aantal DEG's tussen de drie datasets weerspiegelen waarschijnlijk verschillen in steekproefomvang, weefselherkomst (placentavilli versus decidua basalis) en de classificatie van de ernst van PE, wat de waarde van het nemen van de doorsnede over de datasets verder onderstreept om robuuste gemeenschappelijke DEG's te identificeren.
Functionele verrijkingsanalyse van DEGs
Voor de systematische identificatie van belangrijke DEGs geassocieerd met PE werd een Venn-analyse uitgevoerd op de DEGs uit de PE-datasets GSE75010, GSE1058 en GSE60438, waarbij uiteindelijk 56 gemeenschappelijke DEGs werden geïdentificeerd (Figuur 2A). Er werd een PPI-netwerk geconstrueerd voor deze 56 gemeenschappelijke DEGs met behulp van het online platform STRING (interactiescore ≥0,15), en de top 20 hub-genen werden verder geïdentificeerd op basis van hun connectiegraad binnen het netwerk, gerangschikt met Cytoscape-software (Figuur 2B). Op basis van deze genen werd tevens een GO-enrichmentanalyse uitgevoerd om potentiële functionaliteiten in BP, CC en MF te verkennen (Figuur 2C). De DEGs waren hoogstwaarschijnlijk verrijkt in hormoonsecretie en regulatie van transmembrane receptor serine/threonine kinase signalering. Wat betreft de cellen waren de genen hoofdzakelijk gelokaliseerd in focale adhesies, cel-substraatverbindingen en een verscheidenheid aan vesikel- en lysosoom-gerelateerde genen. Bij de moleculaire functies waren de verrijkte termen prolylhydroxylase-activiteit, hormoonactiviteit en membraantransport van lipide-gerelateerde moleculen. Deze resultaten suggereren dat de DEGs belangrijke rollen kunnen spelen in placentaire cel-signalering, cel-matrixinteractie en het behoud van endocriene functies. Tegelijkertijd werd vastgesteld dat KEGG-pathway enrichment resulteerde in DEGs die hoogstwaarschijnlijk verrijkt waren in cytokine-cytokinereceptorinteractie, celadhesiemolecuulinteractie en de TGF-β en HIF-1 signaleringspaden (Figuur 2D). Verrijking van bepaalde virus-gerelateerde termen (bijv. Hepatitisvirussen, Ebolavirus) weerspiegelt waarschijnlijk een aspecifieke overlap met gedeelde immuunregulerende genen in plaats van een directe biologische associatie met PE; de interpretatieve focus blijft daarom liggen op ontstekings-, adhesie- en hypoxie-gerelateerde paden. Deze paden zijn gerelateerd aan de inflammatoire respons, celadhesie-gemedieerde en hypoxie-gerelateerde signalering en kunnen invloed hebben op de progressie van PE door de immuun-inflammatoire status en cel-celcommunicatie in de placentaire micro-omgeving te variëren.
Machine learning identificeert SASH1 als een sleutelgen bij PE
Om belangrijke prognostische genen te identificeren, werden vier machine learning-methoden toegepast voor kenmerkselectie. LASSO-regressie met kruisvalidering toonde aan dat het model de minimale kruisvalideratiefout bereikte bij log(λ.min) = -3.8075. Genen met niet-nulcoëfficiënten bij deze λ-waarde werden geselecteerd als belangrijke kenmerken geïdentificeerd door LASSO (Figuur 3A–B). Het Boruta-algoritme evalueert het belang van kenmerken door vergelijking met schaduwkenmerken. Genen met belangrijkheidswaarden hoger dan shadowMax werden gelabeld als Bevestigd en beschouwd als belangrijke kandidaatgenen, terwijl genen met belangrijkheidswaarden lager dan shadowMin werden gelabeld als Afgewezen en werden beschouwd als zij geen significante bijdrage leverden. Genen tussen deze twee drempelwaarden werden gelabeld als Voorlopig, wat duidt op een potentieel maar onzeker belang (Figuur 3C). SVM-RFE-analyse demonstreerde dat wanneer 40–50 kenmerken werden behouden, de kruisvalideratienauwkeurigheid het hoogste of bijna het hoogste niveau bereikte, wat wijst op een optimale voorspellende prestatie bij deze schaal van kenmerken (Figuur 3D). De matige kruisvalideratienauwkeurigheid (~0,6) geeft aan dat geen enkel enkelvoudig algoritme optimaal presteerde voor deze dataset; daarom werd een multi-algoritme intersectiestrategie gehanteerd om de robuustheid van de kenmerkselectie te vergroten. XGBoost kwantificeerde het relatieve belang van genen met behulp van Gain-waarden, waardoor kenmerken met een hogere bijdrage aan de modelvoorspelling werden geïdentificeerd (Figuur 3E). Venn-intersectieanalyse van de resultaten van de vier methoden identificeerde SASH1 als het enige overlappende gen. Hoewel SASH1 door het Boruta-algoritme als Voorlopig werd geclassificeerd, ondersteunt de consistente selectie in alle drie de andere algoritmen de aanwijzing ervan als een consensus-kandidaatgen (Figuur 3F).
Single-cell-analyse
De cellulaire heterogeniteit en moleculaire processen in placentawefsels bij PE werden onderzocht. Cellen werden kwalitatief gefilterd op basis van het aantal gedetecteerde genen, het aantal RNA-counts en het percentage mitochondriale genexpressie. Cellen van lage kwaliteit (minder dan 20 gedetecteerde genen of met meer dan 20% mitochondriaal gengehalte) werden verwijderd om een hoogwaardige single-cell-steekproef voor downstream-analyse te verkrijgen. De kwaliteitscontrolemetrieken en de identificatie van zeer variabele genen worden getoond in Aanvullende figuur 1A–BNa normalisatie en identificatie van sterk variabele genen werd een hoofdcomponentanalyse (PCA) uitgevoerd met de top 2.0 meest variabele genen, waarbij significante hoofdcomponenten werden bepaald middels JackStraw-analyse en ElbowPlot-analyse (Aanvullende figuur 2A–B).
Op basis van de hoofdcomponenten werd uniform manifold approximation and projection (UMAP) gebruikt om de dimensionaliteit te reduceren en unsupervised clustering uit te voeren, waarbij alle cellen werden geclassificeerd in 2 clusters, wat de hoge cellulaire heterogeniteit in placentawevsel benadrukt (Figuur 4A). Door de expressie van clusterspecifieke markergenen te bestuderen en DEGs in een heatmap te visualiseren (Figuur 4B), werd elk cluster geannoteerd op basis van een canonieke marker en teruggeprojecteerd op de UMAP-embedding (Figuur 4C). Op basis hiervan werden de belangrijkste placentacelpopulaties geïdentificeerd, waaronder B-cellen/plasmacellen, endotheelcellen, fibroblasten/stromale cellen, macrofagen/dendritische cellen, natural killer-cellen, T-cellen en trofoblastcellen. Vergelijkingen tussen de controle- en PE-groepen onthullen dat verschillende celtypen een aanzienlijke relatieve distributie vertonen in PE-placentae, wat wijst op een remodellering van de placentaire micro-omgeving (Figuur 4D).
Weefselherkomst en ziektestatus werden gebruikt om cellen in dezelfde UMAP-embedding te volgen op basis van weefselbron (decidua versus villi) en ziektegroepering (controle versus PE) (Figuur 4E). De distributie van het aantal cellen was gedeeltelijk gescheiden naar weefselherkomst, terwijl cellen uit verschillende ziektegroepen sterk onderling verbonden waren. Dit suggereert dat PE de gehele transcriptomische structuur niet wezenlijk herorganiseert, maar mogelijk effecten heeft op individuele celpopulaties of op specifieke moleculaire kenmerken. De expressie van SASH1 werd op de UMAP geprojecteerd om de distributie ervan binnen placentaire celpopulaties te onderzoeken (Figuur 4F–G). SASH1 vertoont een sterke celtype-specifieke expressie, met opvallende verschillen tussen deciduale en villeuze celpopulaties. Statistische vergelijking van de SASH1-expressie tussen PE- en controlegroepen over verschillende celtypes (Wilcoxon rank-sum test) onthulde significante verschillen in meerdere placentaire celpopulaties, waarbij de meest uitgesproken verhoging werd waargenomen in trofoblastcellen uit PE-monsters (Figuur 4H). Deze bevinding levert bewijs op single-cell-niveau dat de dysregulatie van SASH1 bijzonder uitgesproken is in het trofoblastcompartiment, wat het gebruik van de HTR-8/SVneo trofoblast-cellijn voor daaropvolgende functionele experimenten ondersteunt.
SASH1-knockdown remt hypoxie-geïnduceerde apoptose van trofoblasten en ontstekingsreacties
Om de bioinformatische voorspellingen te valideren, werd een PE-gerelateerd trofoblastcelmodel opgezet onder hypoxische condities (1% O2). qPCR- en Western blot-analyses werden uitgevoerd om de expressie van SASH1 te beoordelen (Figuur 5A–B). Vergeleken met normoxische HTR-8/SVneo-cellen vertoonden hypoxie-behandelde cellen significant verhoogde expressieniveaus van SASH1 mRNA en -eiwit, wat een eerste experimentele validatie van de bioinformatische resultaten leverde. Om het effect van SASH1-knockdown op PE-gerelateerde pathologische processen te evalueren, werd SASH1 gesilenced in hypoxie-behandelde HTR-8/SVneo-cellen. Kwantitatieve PCR- en Western blot-analyses (Figuur 5C–D) toonden aan dat de SASH1-expressie in alle sh-SASH1-groepen significant was verminderd in vergelijking met de sh-NC-groep. Hiervan vertoonde sh-SASH1#3 de hoogste knockdown-efficiëntie en werd deze daarom geselecteerd voor daaropvolgende experimenten. TUNEL-kleuring en ELISA werden uitgevoerd onder drie condities: normoxische controle (Normal), hypoxie met negatieve controle shRNA (Hypoxia + sh-NC), en hypoxie met SASH1-knockdown (Hypoxia + sh-SASH1). Vergeleken met de Normal-groep vertoonde de Hypoxia + sh-NC-groep een significant verhoogde apoptose en een verhoogde secretie van de pro-inflammatoire cytokines IL-1β, IL-6 en TNF-α, wat de hypoxie-geïnduceerde trofoblastbeschadiging bevestigt. SASH1-knockdown verminderde deze effecten aanzienlijk, waarbij apoptose (Figuur 5E) en cytokineniveaus (Figuur 5F) werden teruggebracht naar niveaus die benaderen die van de Normal-groep, wat suggereert dat SASH1-knockdown hypoxie-geïnduceerde trofoblastapoptose en inflammatoire responsen grotendeels kan herstellen. Om de causale rol van SASH1 verder vast te stellen, werden gain-of-function-experimenten uitgevoerd. qPCR en Western blot bevestigden succesvolle SASH1-overexpressie in HTR-8/SVneo-cellen (Figuur 5G–H). Onder normoxische condities verhoogde SASH1-overexpressie (OE-SASH1) de trofoblastapoptose en de secretie van pro-inflammatoire cytokines significant in vergelijking met de OE-NC-groep, waardoor het hypoxie-geïnduceerde fenotype werd gereproduceerd (Figuur 5I–J). Samen stellen de loss- en gain-of-function-gegevens vast dat SASH1 zowel noodzakelijk als voldoende is om trofoblastapoptose en inflammatoire responsen aan te drijven, wat de causale rol ervan in de PE-gerelateerde pathologie bevestigt.
P-EXOS onderdrukt hypoxie-geïnduceerde apoptose van trofoblasten en ontstekingsreacties door SASH1 te moduleren
Er wordt aangenomen dat P-EXOS een potentiële therapeutische waarde heeft bij PE. In deze studie suggereerde bioinformatische analyse dat SASH1 geassocieerd is met exosoom-gerelateerde signaleringspaden (zoals aangegeven door GO- en KEGG-verrijking, Figuur 2C–D), wat ons leidde tot de hypothese dat P-EXOS een beschermend effect bij PE zou kunnen uitoefenen door SASH1 te reguleren. Voorafgaand aan de functionele studies werden de geïsoleerde P-EXOS eerst gekarakteriseerd. Western blot-analyse bevestigde de aanwezigheid van de exosoommarker-eiwitten PLAP, CD63 en TSG101, zonder detecteerbare expressie van de Golgi-marker GM130, wat duidt op een hoge zuiverheid van de geïsoleerde blaasjes. Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde bovendien typische komvormige blaasjesstructuren (Figuur 6A–B). Om te verifiëren of P-EXOS efficiënt geïnternaliseerd konden worden door doelcellen, werd immunofluorescentiekleuring uitgevoerd om de cellulaire opname van P-EXOS te beoordelen. In vergelijking met de controlegroep vertoonden HTR-8/SVneo-cellen behandeld met P-EXOS prominente co-lokalisatiesignalen in de samengevoegde beelden, wat aangeeft dat P-EXOS effectief werden geïnternaliseerd door HTR-8/SVneo-cellen (Figuur 6C).
Vervolgens werden HTR-8/SVneo-cellen gecocultiveerd met P-EXOS onder hypoxische omstandigheden. Zowel kwantitatieve PCR- als Western blot-analyses lieten een uitgesproken afname zien van SASH1 mRNA- en eiwitniveaus in de P-EXOS-behandelde groep in vergelijking met de controles (Figuur 6D–E), wat initieel bewijs leverde voor een regulatoire interactie tussen P-EXOS en SASH1. In overeenstemming met deze moleculaire veranderingen onthulde TUNEL-kleuring een substantiële vermindering van hypoxie-geïnduceerde apoptose in HTR-8/SVneo-cellen na behandeling met P-EXOS (Figuur 6F). Tegelijkertijd toonden ELISA-analyses een merkbaar verlaagde secretie aan van pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-6, IL-1β en TNF-α (Figuur 6G).
Om vast te stellen of de beschermende effecten van P-EXOS mechanistisch afhankelijk zijn van de onderdrukking van SASH1, werd een rescue-experiment uitgevoerd onder hypoxische omstandigheden. Cellen waarin SASH1 werd overgeëxprimeerd (OE-SASH1 + P-EXOS) werden vergeleken met negatieve controlecellen (OE-NC + P-EXOS). SASH1-overexpressie hief de beschermende effecten van P-EXOS significant op, wat werd aangetoond door een toename van apoptose (Figuur 6H>) en een verhoogde secretie van pro-inflammatoire cytokinen (Figuur 6I>) in vergelijking met de OE-NC + P-EXOS-groep. Deze resultaten tonen aan dat het beschermende effect van P-EXOS specifiek wordt gemedieerd via de onderdrukking van SASH1, en niet via parallelle paden, wat het therapeutische potentieel van P-EXOS bij PE onderstreept.
DATAbeschikbaarheid:
De datasets die de resultaten van deze studie ondersteunen, zijn openbaar beschikbaar en zijn verkregen uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), met accessionnummers GSE75010, GSE1058, GSE60438 en GSE18338. De annotatie van celtypen is uitgevoerd met referentie naar de Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Niet-bijgesneden Western blot-afbeeldingen en alle overige ruwe experimentele gegevens die de resultaten van deze studie ondersteunen, zijn te vinden in de map Supplementary Raw Data.
Figuur 1Identificatie van DEGs in placentaweweefsels en deciduaweefsels bij PE over drie onafhankelijke datasets. (A) Volcano plot van DEGs tussen 157 PE-placentaprofielen en 173 niet-PE-placentaprofielen uit de gecombineerde GSE75010-dataset. (B) Volcano plot van DEGs tussen placentaproben met ernstige PE (n = 17) en normale placentaproben (n = 26) uit de GSE1058-dataset. (C) Volcano plot van DEG's tussen PE-decidua-monsters en normotensieve controle-decidua-monsters uit de GSE60438-dataset. DEG's werden geïdentificeerd met behulp van p < 0,05 en |log2FC| > 0.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2Functionele verrijking en PPI-analyse van gemeenschappelijke DEGs geassocieerd met pre-eclampsie. (A) Venn-diagram van DEG's geïdentificeerd uit PE-gerelateerde datasets GSE75010, GSE1058 en GSE60438. (B) PPI-netwerk van de top 20 hub-genen, geselecteerd uit de 56 gemeenschappelijke DEGs op basis van de graad van connectiviteit en gerangschikt met behulp van Cytoscape-software (STRING-interactiescore ≥0,15). (C) GO- en KEGG-verrijkingsanalyses van de gemeenschappelijke DEG's worden weergegeven als staafdiagrammen. (D) GO- en KEGG-verrijkingsanalyses van de gemeenschappelijke DEG's, weergegeven als chord-diagrammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3Machine learning-gebaseerde screening van kandidaat-hubgenen geassocieerd met pre-eclampsie. (A) LASSO-regressieanalyse die de coëfficiëntprofielen van kandidaatgenen laat zien. (B) Selectie van de optimale regularisatieparameter (λ) via LASSO-regressie met behulp van kruisvalidatie. (C) Boruta-algoritme. (D) SVM-RFE-analyse. (E) XGBoost-algoritme. (F) Venn-diagram dat de overlap van kandidaatgenen laat zien die zijn geïdentificeerd door de LASSO-, Boruta-, SVM-RFE- en XGBoost-algoritmen. Afkortingen: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4Single-cell transcriptomische analyse onthult celtype-specifieke SASH1-expressiepatronen bij pre-eclampsie. (A) UMAP-clustering van de single-cell dataset. (B) Top vijf marker-annotatieanalyse van de PE single-cell transcriptoomdataset GSE18338. (C) Annotatie van celsubpopulaties. (D) Staafdiagram dat de verdeling van de celproporties in controle- en PE-monsters weergeeft. (E) UMAP-plot gekleurd naar weefselherkomst (decidua en villi) en ziektestatus (controle en PE). (F) UMAP-plot die de SASH1-expressie in placentacelpopulaties laat zien, gegroepeerd naar weefselherkomst (decidua en villi). (G) UMAP-plot die de SASH1-expressie in placentale celpopulaties laat zien, gegroepeerd naar ziektestatus (controle en PE). (H) Violinplot die de expressieverdeling van SASH1 laat zien over verschillende placenta-celtypen. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.01. Afkortingen: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5SASH1 reguleert hypoxie-geïnduceerde apoptose en inflammatie van trofoblasten. (A) qPCR-analyse van de SASH1 mRNA-expressie en densitometrische kwantificering van de SASH1-proteineniveaus in HTR-8/SVneo-cellen onder normale en hypoxische omstandigheden. (B) Representatieve Western blot-afbeeldingen die overeenkomen met de densitometrische gegevens getoond in (A). (C) qPCR-analyse van de SASH1 mRNA-expressie en densitometrische kwantificering van SASH1-proteïneniveaus in hypoxia-behandelde HTR-8/SVneo-cellen getransfecteerd met sh-NC- of sh-SASH1-constructen (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 en sh-SASH1#3). (DRepresentatieve Western blot-afbeeldingen die overeenkomen met de densitometrische gegevens getoond in (C).E) TUNEL-kleuring van HTR-8/SVneo-cellen in de groepen Normaal, Hypoxie + sh-NC en Hypoxie + sh-SASH1(#3). Schaalbalk = 20 µm. (F) ELISA-analyse van inflammatoire cytokinen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) in de groepen Normal, Hypoxia + sh-NC en Hypoxia + sh-SASH1(#3). (G) qPCR-analyse van de SASH1-mRNA-expressie en densitometrische kwantificering van SASH1-proteïneniveaus in HTR-8/SVneo-cellen getransfecteerd met OE-NC- of OE-SASH1-constructen. (H) Representatieve Western blot-afbeeldingen die overeenkomen met de densitometrische gegevens weergegeven in (G). (I) TUNEL-kleuring van HTR-8/SVneo-cellen in de Normal + OE-NC en Normal + OE-SASH1 groepen. Schaalbalk = 20 µm. (J) ELISA-analyse van inflammatoire cytokinen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) in de groepen Normal + OE-NC en Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.01. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6P-EXOS verlicht door hypoxie geïnduceerde schade aan trofoblasten via suppressie van SASH1. (A) Western blot-analyse van P-EXOS-markerproteïnen PLAP, CD63 en TSG101, waarbij GM130 als negatieve controle dient. (B) Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-analyse van de morfologie van P-EXOS. Schaalbalk = 1.0 µm. (CConfocale laserscanningmicroscopie-beelden die de opname tonen van met PKH67 gelabelde P-EXOS (groen) in HTR-8/SVneo-cellen (rood). Kernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 20 µm. (D) qPCR-analyse van de SASH1-mRNA-expressie en densitometrische kwantificering van SASH1-proteineniveaus in HTR-8/SVneo-cellen in de Controle- en P-EXOS-groepen. (E) Representatieve Western blot-afbeeldingen die overeenkomen met de densitometrische gegevens weergegeven in (D). (F) TUNEL-kleuring van HTR-8/SVneo-cellen in de Control- en P-EXOS-groepen. Schaalbalk = 20 µm. (G) ELISA-analyse van inflammatoire cytokinen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) in hypoxia-behandelde HTR-8/SVneo-cellen in de Controle- en P-EXOS-groepen. (H) TUNEL-kleuring van HTR-8/SVneo-cellen in de OE-NC + P-EXOS- en OE-SASH1 + P-EXOS-groepen. Schaalbalk = 20 µm. (I) ELISA-analyse van inflammatoire cytokinen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) in hypoxia-behandelde HTR-8/SVneo-cellen in de OE-NC + P-EXOS en OE-SASH1 + P-EXOS groepen. Afkortingen: P-EXOS = placenta-afgeleide exosomen; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; PLAP = placentale alkalische fosfatase; TSG101 = tumor susceptibility gene 101. *p < 0.05; **p < 0.01. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Kwaliteitscontrole van single-cell RNA-seq-data. (A) Violinplot van genexpressieniveaus na kwaliteitscontrole. (B) Variabel feature-plot met weergave van sterk variabele genen die na kwaliteitscontrole zijn geïdentificeerd.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Figuur 2: Bepaling van statistisch significante hoofdcomponenten voor single-cell clustering. (A) JackStraw dot plot gebruikt om statistisch significante hoofdcomponenten te identificeren. (B) Elbow-dotplot die de variantie laat zien die wordt verklaard door hoofdcomponenten.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 1: shRNA-doelsequenties gebruikt voor SASH1-knockdown. shRNA-doelsequenties (5′–3′) voor de negatieve controle (sh-NC) en drie SASH1-doelconstructen (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 en sh-SASH1#3) gebruikt voor gene silencing.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 2: Primersequenties gebruikt voor kwantitatieve PCR. Forward- en reverse-primersequenties (5′–3′) voor SASH1 en β-actin (interne referentiecontrole) gebruikt in qPCR-analyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
In deze studie werd SASH1 geïdentificeerd als een belangrijk gen dat ontregeld is bij PE via geïntegreerde transcriptomische analyse, single-cell sequencing en multi-algoritme machine learning, een benadering die bijzonder relevant is aangezien gerichte therapieën voor PE nog niet beschikbaar zijn17. Er werd aangetoond dat SASH1 significant is opgereguleerd in hypoxische trofoblastcellen en specifiek verhoogd is in het trofoblastcompartiment van PE-placenta's op single-cell resolutie. Door middel van loss- en gain-of-function experimenten werd vastgesteld dat SASH1 zowel noodzakelijk als voldoende is om trofoblastapoptose en de secretie van pro-inflammatoire cytokinen aan te sturen. Bovendien verminderde behandeling met P-EXOS de door hypoxie geïnduceerde trofoblastbeschadiging, en dit beschermende effect werd tenietgedaan door SASH1-overexpressie, wat bevestigt dat P-EXOS-gemedieerde cytoprotectie mechanistisch afhankelijk is van SASH1-suppressie.
Daarnaast zijn bij PE veranderingen waargenomen in de proporties van meerdere placentaire celtypen, waaronder B-cellen/plasmacellen, endotheelcellen, fibroblasten/stromale cellen, macrofagen/dendritische cellen, NK-cellen, T-cellen en trofoblastcellen. Deze bevindingen suggereren dat de placentaire micro-omgeving een aanzienlijke remodellering ondergaat tijdens PE. Een dergelijke inflammatoire micro-omgeving verergert niet alleen de trofoblastdysfunctie, maar kan de progressie van de ziekte ook versnellen via interacties tussen het immuunsysteem en de extracellulaire matrix18. Bovendien zijn neutrophil extracellular traps (NETs) recentelijk geïmpliceerd bij het verergeren van placentaire inflammatie bij PE19. Er wordt aangenomen dat SASH1 een significante rol speelt bij de ontwikkeling van PE door betrokkenheid bij inflammatoire signalering, celadhesie en hypoxia-gerelateerde processen. In deze studie werden genexpressieprofielen geëxtraheerd uit placentaproeven van PE-patiënten en normotensieve zwangerschappen met behulp van het limma-pakket, en werden meerdere machine learning-algoritmen gebruikt voor featureselectie: LASSO-regressie, SVM-RFE, XGBoost en Boruta. Over alle algoritmen heen kwam SASH1 consistent naar voren als een consensus-kandidaatgen. Op single-cell niveau vertoonde SASH1 celtype-specifieke expressie over diverse placentaire celpopulaties en behield het een verhoogde expressie in PE-monsters, waarbij het meest uitgesproken verschil werd waargenomen in trofoblastcellen, wat suggereert dat het verschillende functionele effecten kan uitoefenen in verschillende placentaire celcontexten.
SASH1 is een signaleringsadaptoreiwit waarvan is gerapporteerd dat het deelneemt aan diverse biologische processen, waaronder celmigratie en -invasie, epitheliale-mesenchymale transitie en stress-responsieve signaleringsregulatie8,9. Om de functionele rol van SASH1 bij PE-gerelateerde pathologie te onderzoeken, is een door hypoxie geïnduceerd trofoblastmodel opgezet met HTR-8/SVneo-cellen. Onze resultaten toonden aan dat blootstelling aan hypoxie de expressie van SASH1 significant verhoogde, terwijl knockdown van SASH1 de door hypoxie geïnduceerde apoptose aanzienlijk verminderde en de secretie van pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-1β, IL-6 en TNF-α, reduceerde. Omgekeerd was overexpressie van SASH1 onder normoxische omstandigheden voldoende om het door hypoxie geïnduceerde fenotype te reproduceren, wat de causale rol van SASH1 bij het stimuleren van trofoblastbeschadiging vaststelt. Deze bevindingen suggereren dat SASH1 de functionele status van trofoblasten negatief kan reguleren door inflammatoire responsen te moduleren. Gezien het feit dat trofoblasten een belangrijke bron vormen van placentaire inflammatoire mediatoren20, kan een aberrante expressie van SASH1 een kritische moleculaire basis vormen voor de amplificatie van inflammatie bij PE. Opmerkelijk is dat de pro-apoptotische en pro-inflammatoire functies van SASH1 waargenomen in trofoblastcellen contrasteren met de canonieke tumorsuppressieve rol in kankercellen, waar het doorgaans EMT en migratie remt8,9. Deze contextafhankelijke functionele dualiteit kan celtype-specifieke verschillen in SASH1-interactiepartners en downstream signaleringsnetwerken weerspiegelen en rechtvaardigt verder onderzoek.
Exosomen worden erkend als belangrijke mediatoren van intercellulaire communicatie en zijn betrokken bij de pathogenese van PE21. In het bijzonder kunnen P-EXOS een belangrijke rol spelen bij de immuunregulatie tijdens een normale zwangerschap, zoals het handhaven van de materno-foetale immuuntolerantie, wat bescherming tegen PE kan bieden22. In deze studie onthulde bio-informatische analyse een associatie tussen SASH1 en exosoom-gerelateerde signaleringsroutes, wat aanleiding gaf tot verder onderzoek naar de rol van P-EXOS bij de regulatie van de trofoblastfunctie. Co-culture-experimenten toonden aan dat behandeling met P-EXOS de SASH1 mRNA- en eiwitniveaus in met hypoxie behandelde trofoblastcellen significant verlaagde, en de door hypoxie geïnduceerde apoptose en ontstekingsreacties merkbaar attenuationeerde. Belangrijk is dat overexpressie van SASH1 deze beschermende effecten ophief, wat bevestigt dat de door P-EXOS gemedieerde cytoprotectie mechanistisch afhankelijk is van de suppressie van SASH1 en niet via parallelle routes werkt.
De moleculaire mechanismen waarmee P-EXOS de expressie van SASH1 onderdrukt, moeten nog worden opgehelderd. Het is bekend dat P-EXOS diverse bioactieve ladingen transporteren, waaronder microRNA's, eiwitten en lipiden, die de genexpressie in ontvangende cellen kunnen moduleren10. Eén mogelijkheid is dat P-EXOS specifieke miRNA's aflevert die SASH1 direct of indirect targeten. Alternatief kunnen P-EXOS stroomopwaartse signaleringspaden moduleren — zoals NF-κB of PI3K-Akt — die convergeren op de transcriptionele regulatie van SASH1. Gezien het feit dat SASH1 is geïmpliceerd in het PI3K-Akt-mTOR-pad in kankercellen8, is het aannemelijk dat exosoom-gemedieerde modulatie van deze as bijdraagt aan de downregulatie van SASH1 in trofoblastcellen. Toekomstige studies waarbij gebruik wordt gemaakt van sequencing van de exosomale lading en padspecifieke inhibitoren zullen nodig zijn om de precieze moleculaire cascade te ontleden via welke P-EXOS de expressie van SASH1 reguleert.
In deze studie werd transcriptomische profilering geïntegreerd met single-cell RNA-sequencing om de moleculaire veranderingen in placentawefsel bij PE te onderzoeken. Er werd aangetoond dat SASH1 een sleutelrol speelt bij hypoxie-geïnduceerde trofoblastapoptose en inflammatoire reacties, en dat P-EXOS een beschermend effect kan uitoefenen door de expressie van SASH1 te onderdrukken, wat nieuwe inzichten biedt in de moleculaire mechanismen ten grondslag aan PE en een potentiële therapeutische strategie suggereert. Deze studie kent echter enkele beperkingen. Ten eerste waren de functionele bevindingen voornamelijk afgeleid van de HTR-8/SVneo geïmmortaliseerde trofoblastcellijn; validatie in primaire trofoblastcellen is gerechtvaardigd. Ten tweede werd de eiwitexpressie van SASH1 in klinische PE-placentawefsels niet gevalideerd via immunohistochemie, wat de translationele interpretatie van de bevindingen beperkt en in toekomstige studies moet worden aangepakt. Ten derde vertoonde de SVM-RFE-classifier een matige cross-validatienauwkeurigheid (~0,6), wat de inherente heterogeniteit van de dataset weerspiegelt; grotere onafhankelijke cohorten zullen nodig zijn om robuustere diagnostische modellen te ontwikkelen. Ten vierde blijft het precieze moleculaire mechanisme waarmee P-EXOS de expressie van SASH1 onderdrukt onduidelijk. Ten vijfde werden aspecifieke kleurbanden waargenomen bij de SASH1 Western blot-detectie, wat mogelijk te wijten is aan suboptimale antilichaamspecificiteit. Het in dit experiment gebruikte antilichaam is een polyklonaal antilichaam, dat over het algemeen een lagere specificiteit vertoont bij immunodetectie in vergelijking met monoklonale antilichamen. Desondanks hebben deze aspecifieke banden geen invloed op de bevindingen met betrekking tot het SASH1-eiwit of de conclusies van deze studie. Toekomstige studies waarin in vivo experimenten, analyse van klinische monsters en karakterisering van de exosomale lading zijn opgenomen, zijn nodig om de functionele rol van de P-EXOS-SASH1-as bij PE verder te verduidelijken en het translationele potentieel ervan te evalueren.
Openbaarmakingen
Er is geen sprake van een belangenconflict bij deze studie.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door het Medical Science Research Key Program van de Hebei Provincial Health Commission, China (No. 20210075).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875085 | |
| Fetaal runderserum (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| Exosoom-uitgeput FBS | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicilline/streptomycine | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Lipofectamine 3000 transfectiereagens (met P3000-reagens) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Opti-MEM medium met verminderde hoeveelheid serum | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| SASH1 shRNA-plasmide (HuSH) | origene | TL301836 | |
| SASH1 ORF-expressieplasmide | origene | RC218866 | |
| Lege vectorcontrole | origene | PS100001 | |
| Reverse transcriptiekit | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| SASH1-primers | Sangon Biotech | Op maat gesynthetiseerd | |
| β-actine-primers | Sangon Biotech | Op maat gesynthetiseerd | |
| Cellulaire lysisbuffer | Beyotime | P0013B | |
| NanoDrop-spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| PVDF-membraan | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anti-SASH1-antilichaam | ABclonal | A15248 | |
| Anti-β-actine-antilichaam | Abcam | ab6276 | |
| HRP-geconjugeerd geiten-anti-konijn/anti-muis secundair antilichaam | Beyotime | A0208 | |
| ImageJ-software | NIH (publiek domein) | ImageJ | |
| PKH67 groene fluorescente cellinker-kit (incl. verdunner C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Bovien serumalbumine (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Confocale laserscanningsmicroscoop (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Humane IL-6 Quantikine ELISA-kit | R&D Systems | D6050B | |
| Humane IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY201 | |
| Humane TNF-α Quantikine ELISA-kit | R&D Systems | DTA00D | |
| Microplaatlezer | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| In situ celsterfte-detectiekit (TUNEL-assaykit) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus | BX53 | |
| Gekoelde centrifuge (capaciteit 12.000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrifuge (capaciteit 120.000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| R-software | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (R-pakket) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (R-pakket, batchcorrectie) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (Python-pakket, doubletdetectie) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (R-pakket) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (R-pakket, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (R-pakket, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (R-pakket) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (R-pakket, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Gene Expression Omnibus (GEO) database | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| STRING-database | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Cytoscape-software | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (R-pakket) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (R-pakket) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (R-pakket) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (R-pakket) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (R-pakket) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (R-pakket) | Open-source | v0.6.0 |
Referenties
- Malik A, Jee B, Gupta SK. Preeclampsia: Disease biology and burden, its management strategies with reference to India. Pregnancy Hypertens. 2019;15:23-31.
- Vitoratos N, Hassiakos D, Iavazzo C. Molecular mechanisms of preeclampsia. J Pregnancy. 2012;2012:298343.
- Battarbee AN, et al. Chronic hypertension in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(6):532-41.
- Torres-Torres J, et al. A Narrative Review on the Pathophysiology of Preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024;25(14).
- Xu Y, et al. DOCK1 deficiency drives placental trophoblast cell dysfunction by influencing inflammation and oxidative stress, hallmarks of preeclampsia. Hypertens Res. 2024;47(12):3434-46.
- Harmon AC, et al. The role of inflammation in the pathology of preeclampsia. Clin Sci (Lond). 2016;130(6):409-19.
- Jaufmann J, et al. The emerging and diverse roles of the SLy/SASH1-protein family in health and disease: Overview of three multifunctional proteins. Faseb J. 2021;35(4):e21470.
- Li S, et al. The downregulation of SASH1 expression promotes breast cancer occurrence and invasion, accompanied by the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2024;14(1):21914.
- Franke FC, et al. The Tumor Suppressor SASH1 Interacts With the Signal Adaptor CRKL to Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019;7(1):33-53.
- Zhang J, et al. Extracellular vesicles in normal pregnancy and pregnancy-related diseases. J Cell Mol Med. 2020;24(8):4377-88.
- David M, Maharaj N. The immune-modulatory dynamics of exosomes in preeclampsia. Arch Gynecol Obstet. 2025;311(6):1477-87.
- Gu M, et al. Preeclampsia impedes fetal kidney development by delivering placenta-derived exosomes to glomerular endothelial cells. Cell Commun Signal. 2023;21(1):336.
- Jiang X, et al. Downregulated miR-199a-3p in Preeclamptic Placenta-derived Exosomes from Cord Blood Hinders VEGF-induced Fetal Glomerular Dysplasia Through Inhibiting Akt1(S473) Phosphorylation via Targeting PHLPP2. Stem Cell Rev Rep. 2025;21(8):2693-710.
- Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
- Wang X, et al. High expression of THY1 in gallbladder fibroblasts promotes the formation and progression of gallstones. Research Square [Preprint]. 2025. Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-7276422/v1. doi:10.21203/rs.3.rs-7276422/v1.
- Sha M, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic HTR-8/SVneo trophoblast inhibit endothelial cell functions through the miR-150-3p /CHPF pathway. Placenta. 2023;138:21-32.
- Ma'ayeh M, Costantine MM. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med. 2020;25(5):101123.
- Mandalà M. Oxidative Stress and Inflammation in Uterine-Vascular Adaptation During Pregnancy. Antioxidants (Basel). 2025;14(9).
- Lu Y, et al. NETs exacerbate placental inflammation and injury through high mobility group protein B1 during preeclampsia. Placenta. 2025;159:131-9.
- Raghupathy R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia. Med Princ Pract. 2013;22 Suppl 1(Suppl 1):8-19.
- Esfandyari S, et al. Exosomes as Biomarkers for Female Reproductive Diseases Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2021;22(4).
- Pillay P, Moodley K, Moodley J, Mackraj I. Placenta-derived exosomes: potential biomarkers of preeclampsia. Int J Nanomedicine. 2017;12:8009-23.