ZeLan-extract verbeterde de endocriene en metabole fenotypes bij DHEA-geïnduceerde PCOS-ratten. Geïntegreerde 16S rRNA-sequencing en serummetabolomics toonden een gedeeltelijk herstel van de alpha-diversiteit van de darmmicrobiota, een veranderde microbiële samenstelling en veranderingen in metabolieten met betrekking tot steroïdhormonen, galzuren en korteketenige vetzuren.
Onderzoeksartikel
Lycopus lucidus-extract verbetert experimenteel polycystisch ovariumsyndroom door remodellering van de darmmicrobiota en het metaboloom
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie onderzocht de therapeutische effecten van ZeLan-extract op het polycystair ovariumsyndroom (PCOS) en evalueerde de associatie hiervan met de remodellering van het darmmicrobiota-metaboloom. Vierentwintig vrouwelijke Sprague-Dawley ratten werden willekeurig verdeeld in een controlegroep, een PCOS-modelgroep geïnduceerd door dehydroepiandrosteron (DHEA) en een ZeLan-behandelingsgroep (n = 8 per groep). Na 28 dagen interventie werden de serumhormoonspiegels gemeten via ELISA; de samenstelling van het darmmicrobiota werd geanalyseerd met 16S rRNA-gensequencing en de serummetabole profielen werden gekarakteriseerd met UHPLC-Q-TOF-MS. Er werd een Spearman-correlatieanalyse met controle voor meervoudig testen uitgevoerd om associaties tussen het microbiota en het metaboloom te verkennen. ZeLan verbeterde de met PCOS geassocieerde fenotypes significant, waarbij het lichaamsgewicht, testosteron (0,92 vs. 1,85 ng/mL, P < 0,05), de LH/FSH-ratio en de insulinespiegels werden verlaagd in vergelijking met de modelgroep. Sequencing toonde aan dat ZeLan de microbiële alfa-diversiteit gedeeltelijk herstelde (Shannon-index: 5,79 vs. 4,19) en de Firmicutes-Bacteroidetes-ratio verlaagde. ZeLan was geassocieerd met een verrijking van Lactobacillus en Ruminococcus en een lagere abundantie van Bacteroides, Prevotella en Escherichia. Metabolomics identificeerde 52 gewijzigde metabolietkenmerken, waarbij de belangrijkste veranderingen betrekking hadden op steroidhormonen, galzuren zoals lithocholzuur en kortketenige vetzuren zoals boterzuur. Deze bevindingen suggereren dat ZeLan PCOS-gerelateerde endocriene en metabole stoornissen verbetert en geassocieerd is met de remodellering van darmmicrobiële en serummetabole profielen.
Inleiding
Het polycystair ovariumsyndroom (PCOS) is een van de meest voorkomende endocriene stoornissen bij vrouwen in de reproductieve leeftijd, met een wereldwijde prevalentie die wordt geschat tussen 6% en 20%, afhankelijk van de gehanteerde diagnostische criteria1. Deze complexe metabole en reproductieve stoornis wordt gekenmerkt door een geheel van klinische manifestaties, waaronder hyperandrogenisme, ovulatiestoornissen en polycystaire ovariummorfologie, die gezamenlijk bijdragen aan aanzienlijke reproductieve, metabole en psychologische gevolgen2. Naast de directe impact op de vruchtbaarheid wordt PCOS in toenemende mate erkend als een systemische aandoening die geassocieerd is met langetermijngezondheidscomplicaties, waaronder diabetes mellitus type 2, cardiovasculaire ziekten en endometriumcarcinoom, waardoor er een aanzienlijke belasting ontstaat voor zowel individuele patiënten als zorgsystemen wereldwijd3. De pathofysiologie van PCOS is nog niet volledig begrepen, hoewel algemeen wordt aanvaard dat het complexe interacties omvat tussen genetische aanleg, omgevingsfactoren en leefstijlbepalende factoren, die culmineren in de karakteristieke hormonale en metabole verstoringen die bij getroffen personen worden waargenomen4.
Hedendaagse therapeutische benaderingen voor PCOS richten zich primair op symptomatisch management via farmacologische interventies, waaronder orale contraceptiva voor menstruratieregulatie, metformine voor insulinesensibilisatie en antiandrogenen voor de beheersing van hirsutisme5. Deze conventionele behandelingen bieden echter vaak onvolledige symptoomverlichting en zijn frequent geassocieerd met bijwerkingen die hun toepasbaarheid op lange termijn beperken, in het bijzonder bij vrouwen met een kinderwens6. Bijgevolg is er een groeiende belangstelling voor het onderzoeken van complementaire en alternatieve geneeskundige benaderingen, in het bijzonder de traditionele Chinese geneeskunde (TCM), die eeuwen aan empirische ervaring heeft opgebouwd in de behandeling van gynaecologische aandoeningen via holistische regulatiemechanismen7. Onder de talrijke botanische geneesmiddelen die zijn onderzocht voor het management van PCOS, heeft Lycopus lucidus Turcz. (in de Chinese geneeskunde algemeen bekend als ZeLan) aanzienlijke aandacht getrokken vanwege de traditionele toepassingen bij het bevorderen van de bloedsomloop, het oplossen van stase en het reguleren van de menstruatie8. Gepubliceerde fytochemische studies wijzen uit dat L. lucidus polyfenolen en flavonoïdenrijke fracties bevat met antioxidatieve en anti-inflammatoire activiteit8,9. Daarom werd het gestandaardiseerde totale flavonoïdengehalte gebruikt als de chemische kwaliteitscontrole-index voor het extract in de huidige studie, hoewel de identificatie van de specifieke actieve monomeren die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van microbiota en metabolisme in de toekomst gerichte fytochemische analyse vereist.
Het darmmicrobioom is naar voren gekomen als een kritieke regulator van het metabolisme en de endocriene functie van de gastheer, waarbij steeds meer bewijs de betrokkenheid ervan ondersteunt bij de pathogenese van diverse metabole aandoeningen, waaronder PCOS10. Het concept van de darm-ovarium-as is voorgesteld om de bidirectionele communicatie tussen intestinale micro-organismen en de ovariële functie te beschrijven, gemedieerd door microbiële metabolieten, immuunsignalering en neuroendocriene paden11. Bij vrouwen met PCOS is consistent aangetoond dat er sprake is van dysbiose in de darmen, gekenmerkt door een verminderde microbiële diversiteit, veranderde ratio's tussen Firmicutes en Bacteroidetes, en een afgenomen abundantie van gunstige bacteriën zoals Lactobacillus- en Bifidobacterium-soorten12. Men denkt dat deze microbiële verstoringen bijdragen aan de pathofysiologie van PCOS via meerdere mechanismen, waaronder een verhoogde intestinale permeabiliteit, systemische laaggradige ontsteking en een veranderd metabolisme van galzuren en kortketenige vetzuren (SCFA), die vervolgens de insulinegevoeligheid en androgeensynthese beïnvloeden13. Belangrijk is dat interventies gericht op het darmmicrobioom, waaronder probiotica, prebiotica en dieetwijzigingen, veelbelovende resultaten hebben laten zien bij het verlichten van PCOS-symptomen, wat de darm-ovarium-as ondersteunt als therapeutisch doelwit14.
Metabolomics, de uitgebreide analyse van metabolieten van kleine moleculen in biologische systemen, biedt een krachtige benadering voor het karakteriseren van metabole verstoringen die geassocieerd zijn met ziektebeelden en voor het evalueren van de biochemische effecten van therapeutische interventies15. De integratie van 16S rRNA-gensequencing voor microbiome-profilering met untargeted metabolomics maakt systematisch onderzoek mogelijk naar de relaties tussen darmmicrobiële gemeenschappen en het metabolisme van de gastheer, wat inzicht biedt in microbiota-metaboloom-interacties die zowel de pathogenese van ziekten als behandelingsresponsen kunnen begeleiden. Ondanks de theoretische rationale voor het targeten van de darm-ovarium-as bij de behandeling van PCOS en de traditionele indicaties van ZeLan voor gynaecologische aandoeningen, zijn er tot nu toe geen studies die systematisch hebben onderzocht of ZeLan-extract de interface tussen het darmmicrobiota en het metaboloom bij PCOS moduleert. Deze lacune in de kennis beperkt ons begrip van de met ZeLan geassocieerde biologische responsen en belemmert de rationele optimalisatie van deze botanische interventie voor de behandeling van PCOS.
De huidige studie is ontworpen om de therapeutische werkzaamheid van ZeLan-extract te onderzoeken in een DHEA-geïnduceerd ratmodel van PCOS en om geassocieerde veranderingen in het darmmicrobiota-metaboloom te evalueren via geïntegreerde 16S rRNA-sequencing en ongerichte metabolomics-analyse. Specifiek hebben we de effecten van ZeLan-extract op PCOS-gerelateerde fenotypes geëvalueerd, waaronder lichaamsgewicht, serumtestosteron, de ratio luteïniserend hormoon ten opzichte van follikelstimulerend hormoon (LH/FSH) en insulinespiegels; we hebben veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobiota en de alpha-diversiteit na ZeLan-behandeling gekarakteriseerd; we hebben differentiële serummetabolietkenmerken en verrijkte metabole paden geïdentificeerd die geassocieerd zijn met de ZeLan-interventie; en we hebben correlaties onderzocht tussen specifieke darmmicrobiële taxa en sleutelmetabolieten. Door deze doelstellingen aan te pakken, streefden we ernaar om associatieve multi-omics bewijslast te leveren voor de ZeLan-gerelateerde modulatie van de darm-ovariumas bij PCOS.
Protocol
Alle experimentele procedures in de huidige studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (Goedkeuringsnr. IACUC-2023-0156).
Dieren
Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (n = 24, 6 weken oud, lichaamsgewicht 180–200 g) werden verkregen uit het Laboratory Animal Center van de gelieerde instelling en gehuisvest onder gecontroleerde omgevingscondities (temperatuur 22 ± 2°C, luchtvochtigheid 50 ± 10%, 12-uurs licht/donkercyclus) met ad libitum toegang tot standaard knaagdiervoer en gezuiverd water. Na een acclimatisatieperiode van één week werden de dieren willekeurig toegewezen aan drie experimentele groepen (n = 8 per groep): Controle, PCOS-model en ZeLan-behandeling. De steekproefomvang werd bepaald op basis van eerdere studies naar veranderingen in het darmmicrobioom in PCOS-modellen, waarbij een poweranalyse uitwees dat 8 dieren per groep 80% power zouden bieden om een 1,5-voudig verschil in alpha-diversiteitsindices aan te tonen bij α = 0,05.
Vestiging van het PCOS-model en behandelingsprotocol
Het PCOS-model werd opgezet via een goed gevalideerd protocol waarbij dehydroepiandrosteron (DHEA; Sigma-Aldrich, USA), opgelost in sesamolie, dagelijks gedurende 21 opeenvolgende dagen in een dosis van 6 mg/100 g lichaamsgewicht subcutaan in de dorsale nekkegio werd geïnjecteerd. Controledieren ontvingen equivalente volumes van de sesamolie-drager. De volledige experimentele tijdlijn bestond uit 7 dagen acclimatisatie, 21 dagen modelinductie en 28 dagen interventie, met eindpuntbemonstering op protocoldag 56, inclusief de acclimatisatieperiode (Figuur 1). Het ZeLan-extract werd bereid uit geauthenticeerd Lycopus lucidus Turcz. kruid via waterige extractie en was gestandaardiseerd om een gehalte aan totale flavonoïden van niet minder dan 2,5% te bevatten via high-performance liquid chromatography, wat diende als het chemische kwaliteitscontrole-criterium voor het botanische extract. Na voltooiing van de DHEA-geïnduceerde modelopzet kregen ratten in de ZeLan-groep dagelijks gedurende 28 opeenvolgende dagen 200 mg/kg lichaamsgewicht ZeLan-extract via orale gavage, terwijl de Controle- en Modelgroepen equivalente volumes gedestilleerd water ontvingen. De dosis van 200 mg/kg werd gekozen als een verkennende farmacologische dosis op basis van eerdere ervaringen met botanische extracten in diermodellen en voorlopige overwegingen omtrent de verdraagzaamheid; een formele dosis-responsevaluatie maakte geen deel uit van het huidige ontwerp. Het lichaamsgewicht werd wekelijks geregistreerd gedurende de experimentele periode. In dit experimentele ontwerp werd de succesvolle vestiging van het PCOS-model geëvalueerd aan de hand van het DHEA-inductieprotocol samen met de endocriene en metabole eindpuntfenotypes, waaronder lichaamsgewicht, serumtestosteron, de LH/FSH-ratio en nuchtere insuline. Ovariële histopathologische examinatie, follicultelling, kwantificering van het corpus luteum en seriële monitoring van de oestruscyclus werden niet opgenomen als eindpunten voor modelbevestiging; de interpretatie van de ovariële dysfunctie was daarom gebaseerd op endocriene en metabole meetwaarden in plaats van directe beoordeling op weefselniveau.
Monsterverzameling en verwerking
Monsters (serum en feces) werden verzameld bij alle drie de groepen (n = 8 per groep) voor daaropvolgende biochemische analyses, microbiota-analyses en metabolomics-analyses. Eindpuntcollecties werden in de ochtend uitgevoerd na een nacht vasten om circadiane en voedingsgerelateerde variabiliteit te verminderen. Bloedmonsters werden onder anesthesie verzameld uit de abdominale aorta en gecentrifugeerd bij 3.000 × g gedurende 15 minuten bij 4°C om serum te verkrijgen, dat in aliquoten werd verdeeld en bewaard bij -80°C tot de hormoon- en metabolomics-analyses. Verse fecesmonsters werden onder aseptische omstandigheden direct uit het caecum verzameld in steriele cryotubes, tijdens transport op droogijs bewaard, binnen 10 minuten na collectie snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C tot de 16S rRNA-gensequencing.
Metingen van serumhormonen
Serumconcentraties van testosteron, luteïniserend hormoon (LH), follikelstimulerend hormoon (FSH) en insuline werden gekwantificeerd met behulp van commercieel verkrijgbare enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Cusabio Biotech, Wuhan, China) volgens de instructies van de fabrikant. De LH/FSH-ratio werd berekend als een samengestelde index voor de gonadotropine-onbalans die kenmerkend is voor PCOS. Alle monsters werden in dubbeltoets geanalyseerd, en metingen met een variatiecoëfficiënt voor de dubbeltoets van meer dan 15% werden herhaald. De intra-assay en inter-assay variatiecoëfficiënten moesten respectievelijk onder de 10% en 15% blijven. Potentiële uitschieters werden gescreend aan de hand van brongegevens en informatie over de assay-prestaties, en geen enkele waarde werd uitsluitend op statistische gronden uitgesloten zonder een gedocumenteerde technische reden.
16S rRNA-gensequencing en bio-informatische analyse
Totaal bacterieel genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de inhoud van het caecum met behulp van de QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. De DNA-kwaliteit en -kwantiteit werden beoordeeld via NanoDrop spectrophotometrie en agarosegelelektroforese, en de DNA-extracten werden bewaard bij -80°C voorafgaand aan de constructie van de bibliotheek. De V3-V4 hypervariabele regio's van het 16S rRNA-gen werden geamplificeerd met behulp van de universele primers 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') en 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') met Illumina-adaptersequenties. Amplicon-bibliotheken werden geconstrueerd, gezuiverd, gekwantificeerd, samengevoegd in equimolaire concentraties en gesequenced op het Illumina NovaSeq 6000-platform (Novogene, Peking, China) met paired-end 250 bp reads.
Ruwe sequencingreads werden verwerkt met de QIIME2-pipeline (versie 2022.2). Paired-end reads werden gedemultiplexed, samengevoegd, kwaliteitsgefilterd met een Phred-score drempelwaarde van ten minste 20 en verwerkt met DADA2 om chimeer sequencing te verwijderen en amplicon sequence variants (ASVs) te genereren. De taxonomische classificatie werd uitgevoerd tegen de SILVA 138 referentiedatabase met behulp van een naive Bayes-classifier. Alpha-diversiteitsmetrieken, waaronder de Shannon-index, Simpson-index en Chao1-estimator, werden berekend om de diversiteit en rijkdom binnen de monsters te beoordelen. De output van de sequencingdiepte, inclusief read-samenvattingen, ASV-abundantietabellen, Good's coverage en rarefactiecurve-bestanden, werden behandeld als onderdeel van de microbiome-dataset zoals beschreven in de sectie Gegevensbeschikbaarheid. Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) werd gebruikt om ziekte-geassocieerde taxa te identificeren in de vergelijking tussen de Controlegroep en de Modelgroep, met een LDA-score drempelwaarde groter dan 2.0 en P < 0.05; de ZeLan-geassocieerde omkeer werd geëvalueerd door de richting van de verschuivingen in taxonomische abundantie in de ZeLan-groep te vergelijken met die in de Modelgroep.
Niet-gerichte metabolomics-analyse
Serummetabolomische profilering werd uitgevoerd met ultra-high-performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan quadrupole time-of-flight massaspectrometrie (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA). Serummonsters (100 μL) werden gemengd met 400 μL koude methanol:acetonitril (1:1, v/v) met interne standaarden, gevortexed en 1 uur bij -20°C geïncubeerd om eiwitten te laten neerslaan. Na centrifugatie bij 14.000 × g gedurende 15 minuten werden de supernatanten gedroogd onder een stroom stikstof en gereconstitueerd in 100 μL acetonitril:water (1:1, v/v) voor analyse. Chromatografische scheiding werd bereikt op een ACQUITY UPLC HSS T3-kolom (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) bij een temperatuur van 40°C, met water houdende 0,1% mierenzuur als mobiele fase A en acetonitril houdende 0,1% mierenzuur als mobiele fase B bij een stroomsnelheid van 0,30 mL/min. Voor de scheiding van metabolieten werd een gradiëntprogramma gebruikt waarbij de organische fase werd verhoogd van 5% naar 95%, gevolgd door het wassen en her-equilibreren van de kolom. Massaspectrometrische gegevens werden verzameld in zowel positieve als negatieve electrospray-ionisatiemodi met een scanbereik van m/z 50–1200; de bronparameters omvatten een capillairspanning van 3,5 kV, een drooggasstroom van 10 L/min, een drooggastemperatuur van 325°C, een nebulizerdruk van 35 psi en een fragmentorspanning van 120 V.
Ruwe databestanden werden geconverteerd naar het mzXML-formaat en verwerkt met het XCMS-pakket in R voor piekdetectie, uitlijning van retentietijden en integratie van piekgebieden. Kwaliteitscontrolemonsters, bereid door het poolen van gelijke aliquoten van alle serumextracten, werden gedurende de analytische sequentie ingevoegd om de stabiliteit van het instrument te bewaken. Kenmerken met een overmatige hoeveelheid ontbrekende waarden of een instabiele reproduceerbaarheid van de kwaliteitscontrole werden verwijderd vóór de statistische modellering. De identificatie van metabolieten werd uitgevoerd door het matchen van de exacte massa, retentietijd en MS/MS-fragmentatiepatronen met de Human Metabolome Database (HMDB), METLIN en interne spectrale bibliotheken. Multivariate statistische analyses werden uitgevoerd met MetaboAnalyst 5.0. Metabolietkenmerken die werden behouden voor verdere rapportage werden geprioriteerd op basis van een gecombineerd criterium dat de multivariate discriminerende bijdrage, de richting van de fold-change en statistisch bewijs incorporeerde; P-waarden werden gecorrigeerd met de Benjamini-Hochberg-methode om rekening te houden met meervoudig testen. De volledige geannoteerde rapportagetabel, met 52 metabolietkenmerken, is opgenomen als Supplementary Table 1. Pathway-enrichmentanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-database.
Statistische analyse
Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met SPSS versie 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) en R-software (versie 4.2.1). Continue gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en zijn voorafgaand aan de inferentiële toetsing op normaliteit getoetst met de Shapiro-Wilk-test. Voor normaal verdeelde gegevens is een éénweg variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de post hoc-test van Tukey, gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen; voor niet-normaal verdeelde gegevens is de Kruskal-Wallis-test met de post hoc-test van Dunn gebruikt. Correlaties tussen darmmicrobiële taxa en serummetabolieten zijn geëvalueerd met de rangcorrelatiecoëfficiënt van Spearman en gevisualiseerd als hiërarchisch geclusterde heatmaps. P-waarden van correlaties zijn gecorrigeerd voor meervoudig testen met de Benjamini-Hochberg-methode voor de false-discovery rate, en alleen correlaties die consistent waren in richting en statistisch significant waren, zijn geïnterpreteerd. Een tweezijdige P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd, tenzij een aangepaste drempelwaarde voor de P-waarde was gespecificeerd.
Resultaten
Effecten van ZeLan-extract op klinische PCOS-fenotypes
Toediening van DHEA induceerde PCOS-achtige endocriene en metabole fenotypes bij ratten, wat werd aangetoond door significante stijgingen in het lichaamsgewicht, de serumtestosteronconcentratie, de LH/FSH-ratio en de nuchtere insulinewaarden in vergelijking met de controlegroep (alle P < 0,05). Distributionele beoordeling met de Shapiro-Wilk-test ondersteunde parametrische analyse voor de belangrijkste eindpunten betreffende lichaamsgewicht en hormonen, zoals samengevat in Tabel 1. Behandeling met ZeLan-extract gedurende 28 dagen verbeterde deze metabole en hormonale verstoringen significant. Het lichaamsgewicht werd vastgelegd aan het einde van de behandelperiode op protocoldag 56, inclusief de acclimatisatieperiode van 7 dagen. Zoals gepresenteerd in Tabel 1, was het lichaamsgewicht in de modelgroep (291,12 ± 15,35 g) aanzienlijk hoger dan in de controlegroep (27,45 ± 10,12 g, P < 0,05), terwijl ZeLan-behandeling het lichaamsgewicht significant reduceerde tot 245,25 ± 10,21 g (P < 0,05 ten opzichte van model). Serumtestosteronspiegels waren sterk verhoogd bij de PCOS-modelratten (1,85 ± 0,21 ng/mL) vergeleken met de controles (0,51 ± 0,05 ng/mL), en de ZeLan-interventie verlaagde het testosteron naar 0,92 ± 0,12 ng/mL. De LH/FSH-ratio was significant verhoogd in de modelgroep (3,28 ± 0,25) ten opzichte van de controle (1,25 ± 0,1) en werd gedeeltelijk genormaliseerd door de ZeLan-behandeling (1,85 ± 0,15). Nuchtere insulinewaarden waren verhoogd bij de modeldieren (28,95 ± 2,35 mIU/L tegenover 12,5 ± 1,12 mIU/L bij controles) en werden significant verlaagd na toediening van ZeLan (18,82 ± 1,5 mIU/L) (Figuur 2). Deze bevindingen bevestigden de succesvolle vestiging van een endocrien-metabool PCOS-achtig fenotype; echter, eierstokhistopathologie, follikeltellingen, analyse van het corpus luteum en monitoring van de oestruscyclus werden in deze studie niet uitgevoerd.
ZeLan-extract herstelde de alfa-diversiteit van de darmmicrobiota
Analyse van de alpha-diversiteitsindices onthulde aanzienlijke veranderingen in de structuur van de darmmicrobiële gemeenschap geassocieerd met PCOS en de behandeling daarvan. Zoals getoond in Tabel 2 en Figuur 3, was de Shannon-diversiteitsindex significant lager bij PCOS-modelratten (4,19 ± 0,35) dan bij gezonde controles (6,51 ± 0,28; P < 0,05), wat wijst op een afname van de microbiële alpha-diversiteit in de ziektestaat. Behandeling met ZeLan herstelde de microbiële diversiteit gedeeltelijk, waarbij de Shannon-index toenam tot 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 ten opzichte van Model). Consistente resultaten werden waargenomen voor de Simpson-index, die afnam van 0,98 ± 0,01 bij controles naar 0,82 ± 0,03 bij modeldieren en herstelde tot 0,93 ± 0,02 na interventie met ZeLan. De Chao1-estimator, die de soortenrijkdom weerspiegelt, vertoonde een vergelijkbaar patroon: PCOS-inductie reduceerde Chao1 aanzienlijk van 1215,3 ± 45,4 naar 65,8 ± 52,1, terwijl behandeling met ZeLan de rijkdom verhoogde tot 963,5 ± 38,6. Deze bevindingen geven gezamenlijk aan dat PCOS geassocieerd is met darmmicrobiële dysbiose, gekenmerkt door een verminderde alpha-diversiteit en rijkdom, en dat ZeLan-extract de structuur van de microbiële gemeenschap gedeeltelijk kan herstellen richting het profiel van de controlegroep.
Veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobioom
Taxonomische profilering op fylum-niveau onthulde duidelijke compositionele verschillen tussen de experimentele groepen. Zoals geïllustreerd in Figuur 4, waren Firmicutes en Bacteroidetes de dominante phyla in alle groepen, die samen verantwoordelijk waren voor meer dan 85% van de totale bacteriële gemeenschap. De Modelgroep vertoonde een aanzienlijk verhoogde abundantie van Firmicutes (ongeveer 75%) gekoppeld aan een verminderd aandeel Bacteroidetes (ongeveer 15%) in vergelijking met de Controlegroep (Firmicutes ongeveer 40%, Bacteroidetes ongeveer 45%), wat resulteerde in een merkbaar verhoogde Firmicutes-to-Bacteroidetes (F/B) ratio, kenmerkend voor metabole dysbiose. De behandeling met ZeLan moduleerde deze onbalans, waarbij de abundantie van Firmicutes werd verminderd tot ongeveer 52% terwijl Bacteroidetes toenam tot ongeveer 35%, waardoor de F/B ratio gedeeltelijk werd genormaliseerd richting de controleniveaus.
LEfSe-analyse werd gebruikt om bacteriële taxa te identificeren die de Controle- en Modelgroepen onderscheidden en daarmee de ziekte-geassocieerde microbiële signatuur definieerden. Zoals getoond in Figuur 5, vertoonde de PCOS Modelgroep op genusniveau significant verhoogde abundanties van Bacteroides (LDA-score > 3.5), Prevotella (LDA-score > 3.0) en Escherichia (LDA-score > 2.5), welke over het algemeen eerder geassocieerd zijn met metabole dysfunctie en inflammatie. Omgekeerd vertoonde de Controlegroep een verrijking van gunstige genera, waaronder Lactobacillus (LDA-score > 3.0) and Ruminococcus (LDA-score > 2.5), beide erkend om hun rol bij het behoud van de integriteit van de darmbarrière en het produceren van gunstige metabolieten zoals kortketenige vetzuren. De ZeLan-groep werd niet als aparte LEfSe-klasse weergegeven in Figuur 5 omdat deze analyse zich richtte op taxa die ziekte van gezondheid onderscheiden; ZeLan-gerelateerde effecten werden geïnterpreteerd op basis van verschuivingen in abundantie richting het Controleprofiel en vanuit microbiome-metaboloomcorrelaties.
Metabolomische profilering en identificatie van differentiële metabolieten
Niet-gerichte metabolomische analyse identificeerde aanzienlijke metabole verstoringen in verband met PCOS en de behandeling hiervan met ZeLan-extract. De volcano plot in Figuur 6 toont de distributie van metabolietkenmerken tussen de Model- en Controlegroepen, waarbij upgereguleerde en downgereguleerde kenmerken zijn gemarkeerd op basis van de richting van de fold-change en statistische significantie. In totaal werden 52 geannoteerde metabolietkenmerken behouden in de volledige metabolomics-rapportagetabel voor de vergelijking tussen Model en Controle. De volledige lijst, inclusief metabolietnaam, HMDB-identificatie, biochemische klasse, log2 fold change, P-waarde en regulatierichting, is beschikbaar als Aanvullende tabel 1. Tabel 3 presenteert representatieve geannoteerde metabolieten met een hoge biologische relevantie voor PCOS.
Tabel 3 vat de representatieve belangrijkste differentiële metabolieten samen met hoge VIP-scores en biologische relevantie voor de pathofysiologie van PCOS. Steroïdhormonen, waaronder testosteron (VIP = 2,56, P < 0,001) en androstenedion (VIP = 2,34, P < 0,01), waren significant verhoogd in PCOS-modeldieren, wat consistent is met de hyperandrogene status die kenmerkend is voor deze aandoening. Het vetzuurmetabolisme was eveneens verstoord, waarbij palmitinezuur (VIP = 2,12) en arachidonzuur (VIP = 1,89) significante stijgingen vertoonden, terwijl de pro-inflammatoire lipide-mediator prostaglandine E2 op soortgelijke wijze was upgereguleerd (VIP = 2,05). Omgekeerd waren metabolieten die geassocieerd worden met gunstige microbiële activiteit in de darm verminderd bij PCOS-dieren: lithocholzuur, een secundair galzuur geproduceerd door microbiële biotransformatie, nam substantieel af (VIP = 2,45), evenals het korteketenvetzuur boterzuur (VIP = 2,21). Daarnaast vertoonden barnsteenzuur en het essentiële aminozuur L-tryptofaan reducties in de Modelgroep, wat wijst op een verminderde microbiële fermentatie en een veranderd aminozuurmetabolisme.
KEGG-pad-verrijkingsanalyse
Pathway-enrichingsanalyse met behulp van de KEGG-database onthulde verschillende serum-metabole pathways die significant verstoord waren bij PCOS en werden gemoduleerd door de ZeLan-behandeling. Zoals afgebeeld in Figuur 7, bleek de biosynthese van steroïdhormonen de meest significant verrijkte pathway (Rich Factor = 0.80, P < 0.01), wat consistent is met het hyperandrogene fenotype van PCOS. De pathway voor ovariële steroidogenese was vergelijkbaar sterk verrijkt (Rich Factor = 0.75, P < 0.01), wat de betrokkenheid van een veranderde androgeensynthese bij ovariële dysfunctie weerspiegelt. De biosynthese van primaire galzuren vertoonde een significante verrijking (Rich Factor = 0.62, P < 0.02), wat wijst op een verstoorde enterohepatische galzuurcirculatie die mogelijk gerelateerd is aan veranderingen in de darmmicrobiota. Het arachidonzuurmetabolisme (Rich Factor = 0.56, P < 0.03) en de pathway voor insulineresistentie (Rich Factor = 0.40, P < 0.04) waren eveneens significant verrijkt, wat de aanwezigheid van inflammatoire en metabole verstoringen ondersteunt die kenmerkend zijn voor PCOS. De pathway voor vetzuurbiosynthese vertoonde een bescheiden verrijking (Rich Factor = 0.30), wat suggereert dat er sprake is van een ontregeling van het lipidenmetabolisme.
Correlatieanalyse van het microbioom en metaboloom
Om functionele relaties tussen de samenstelling van het darmmicrobiota en metabole veranderingen te evalueren, werd een Spearman-correlatieanalyse met controle voor de false-discovery rate uitgevoerd tussen differentieel abundante bacteriële genera en sleutelmetabolieten. De hiërarchisch geclusterde correlatie-heatmap in Figuur 8 onthult duidelijke patronen van associaties tussen het microbiota en het metaboloom. Gunstige bacteriën, waaronder Lactobacillus en Ruminococcus, vertoonden sterke positieve correlaties met lithocholzuur (r = 0,72 en 0,68, respectievelijk) en boterzuur (r = 0,65 en 0,60, respectievelijk), terwijl ze negatieve correlaties vertoonden met testosteron (r = -0,75 en -0,80) en androstenedion (r = -0,68 en -0,72). Deze bevindingen suggereren dat de gunstige bacteriën die in de taxonomische analyse zijn geïdentificeerd, geassocieerd waren met androgeen-gerelateerde metabolieten en SCFA-gerelateerde metabole activiteit.
Omgekeerd vertoonden de met PCOS geassocieerde genera Bacteroides, Prevotella en Escherichia tegenovergestelde correlatiepatronen. Deze bacteriën waren positief gecorreleerd met testosteron (r = 0,85, 0,82 en 0,60, respectievelijk), androstenedion (r = 0,78, 0,75 en 0,55) en palmitinezuur (r = 0,65, 0,60 en 0,45), terwijl ze negatieve correlaties vertoonden met gunstige metabolieten, waaronder lithocholzuur en boterzuur. Deze correlatiepatronen ondersteunen functionele associaties tussen specifieke darmmicrobiële taxa en de metabole verstoringen die kenmerkend zijn voor PCOS, maar ze bewijzen geen direct causaal verband.
Beschikbaarheid van gegevens:
De datasets die tijdens deze studie zijn gegenereerd en geanalyseerd omvatten metadata van monsters, brondata van fenotypes, 16S alfa-diversiteitsindices, samenvattingen van abundantie op fylum-niveau, resultaten van differentiële bacteriële taxa, tabellen van de differentiële analyse van de metabolomics, representatieve metabolietresultaten, KEGG-pathway verrijkingsresultaten en de correlatiematrix tussen microbiota en metabolieten. Deze onderliggende brondata worden verstrekt als het bijbehorende Supplementary File 1. De bewerkte dataset van differentiële metabolieten wordt verstrekt als Supplementary Table 1.
Figuur 1Experimenteel ontwerp en tijdlijn van de behandeling. Schematische weergave van de experimentele workflow, met weergave van de acclimatisatieperiode van 7 dagen, de injectieperiode van DHEA of vehikel van 21 dagen, de behandeling met ZeLan-extract of vehikel van 28 dagen en de eindmeting waarbij serum- en fecesmonsters werden verzameld op protocoldag 56. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2Effecten van ZeLan-extract op endocriene en metabole parameters. Boxplots die (A) serumtestosteronconcentratie, (B) LH/FSH-ratio, en (C) lichaamsgewicht in de controle-, model- en ZeLan-behandelingsgroepen na de interventieperiode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3Alfadiversiteit van het darmmicrobioom. Vergelijking van de Shannon-diversiteitsindex tussen de controle-, model- en ZeLan-behandelingsgroepen, ter illustratie van de verschillen in de alfa-diversiteit van het darmmicrobioom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4Samenstelling van het darmmicrobiota op fylumniveau. Gestapeld staafdiagram dat de relatieve abundantie van de dominante bacteriële phyla in de darmmicrobiota van de Controle-, Model- en ZeLan-behandelingsgroepen weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5Differentiële bacteriële taxa geïdentificeerd door LEfSe-analyse. Lineaire discriminantanalyse-effectgrootte (LEfSe) voor het identificeren van bacteriële genera die onderscheid maken tussen de controlegroep en de modelgroep. LDA-scores geven de effectgrootte aan van taxa met een differentieel abundantiepatroon. ZeLan-gerelateerde veranderingen worden in de resultaten beschreven op basis van verschuivingen in de abundantie ten opzichte van de modelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6Differentieel metabolietprofiel. Volcano plot die de differentiële metabolietkenmerken tussen de Model- en Controlegroepen toont. De rode en blauwe punten vertegenwoordigen respectievelijk significant opgereguleerde en neergereguleerde metabolietkenmerken, gebaseerd op de fold change en statistische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7KEGG-padway-verrijkingsanalyse. Bubble plot die significant verrijkte metabole routes weergeeft, geïdentificeerd op basis van differentiële metabolieten. De grootte van de bubbel representeert het aantal toegewezen metabolieten en de kleur van de bubbel geeft de statistische significantie (P-waarde) van de verrijking van de route aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8Correlatie tussen darmmicrobiota en serummetabolieten. Hiërarchisch geclusterde heatmap die de Spearman-correlatiecoëfficiënten weergeeft tussen differentieel abundante bacteriële genera en representatieve serummetabolieten. Rood geeft positieve correlaties aan, terwijl blauw negatieve correlaties aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groep | N | Lichaamsgewicht (g) | Testosteron (ng/mL) | LH/FSH-ratio | Insuline (mIU/L) |
| Controle | 8 | 227.45 ± 10.12 | 0.51 ± 0.05 | 1.25 ± 0.11 | 12.55 ± 1.12 |
| Model | 8 | 291.12 ± 15.35a | 1.85 ± 0.21a | 3.28 ± 0.25a | 28.95 ± 2.35a |
| ZeLan | 8 | 245.25 ± 10.21b | 0.92 ± 0.12b | 1.85 ± 0.15b | 18.82 ± 1.55b |
| Opmerking: Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. a = p < 0,05 vergeleken met de controlegroep; b = p < 0,05 vergeleken met de Modelgroep. | |||||
Tabel 1: Endocriene en metabole parameters in PCOS-ratten. Lichaamsgewicht, serumtestosteron, LH/FSH-ratio en nuchtere insulinestanden werden gemeten in de Controle-, Model- en ZeLan-behandelingsgroepen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.
| Groep | Shannon-index | Simpson-index | Chao1-schatter |
| Controle | 6.51 ± 0.28 | 0.98 ± 0.01 | 1215.3 ± 45.4 |
| Model | 4.19 ± 0.35a | 0.82 ± 0.03a | 665.8 ± 52.1a |
| ZeLan | 5.79 ± 0.26b | 0.93 ± 0.02b | 963.5 ± 38.6b |
| Opmerking: Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. a = p < 0,05 vergeleken met de controlegroep; b = p < 0,05 vergeleken met de Modelgroep. | |||
Tabel 2: Alpha-diversiteitsindices van het darmmicrobioom.Vergelijking van de Shannon-index, Simpson-index en Chao1-schatter tussen de Controle-, Model- en ZeLan-behandelingsgroepen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.
| Naam metaboliet | HMDB ID | Klasse | Trend (Model vs Controle) | p-waarde | VIP-score |
| Testosteron | HMDB0286 | Steroid | Omhoog ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstenedion | HMDB005 | Steroid | Omhoog ↑ | < 0.01 | 2.34 |
| Palmitinezuur | HMDB020 | Vetzuur | Omhoog ↑ | < 0.01 | 2.12 |
| Arachidonzuur | HMDB01043 | Vetzuur | Omhoog ↑ | 0.03 | 1.89 |
| Prostaglandine E2 | HMDB01036 | Lipide | Omhoog ↑ | < 0.01 | 2.05 |
| Lithocholzuur | HMDB0752 | Galzuur | Omlaag ↓ | < 0.01 | 2.45 |
| Boterzuur | HMDB0039 | SCFA | Omlaag ↓ | < 0.01 | 2.21 |
| Bernsteenzuur | HMDB0254 | Organisch zuur | Omlaag ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Tryptofaan | HMDB0929 | Aminozuur | Omlaag ↓ | 0.015 | 1.58 |
| Opmerking: VIP = Variable Importance in Projection (VIP > 1 wordt als significant beschouwd). | |||||
Tabel 3: Representatieve differentiële serummetabolieten. Representatieve geannoteerde metabolieten geassocieerd met PCOS en gereguleerd door ZeLan-extract, inclusief HMDB-identificatoren, metabolietenklasse, regulatietrend, P-waarde en VIP-score. De volledige lijst van 52 geannoteerde metabolietkenmerken is opgenomen in Aanvullende Tabel 1.
Aanvullende Tabel 1: Volledige geannoteerde metabolietdataset. Volledige lijst van de 52 geannoteerde metabolietkenmerken behouden voor metabolomics-rapportage, inclusief metabolietnaam, HMDB-identificatie, biochemische klasse, fold change, P-waarde en regulatierichting.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Brondata ter ondersteuning van de experimentele, microbiome- en metabolomics-analyses. Dit werkboek bevat de monsterinformatie, klinische fenotype-metingen, diversiteitsindices van 16S rRNA-sequencing, relatieve abundantie van microben op phylum-niveau, LEfSe differentiële taxa-analyse, differentiële metabolomics-analyse, representatieve metabolieten, KEGG pathway-verrijkingsanalyse, correlatiematrixgegevens en de samenvatting van de gegevensverificatie die zijn gebruikt om de figuren en tabellen in het manuscript te genereren.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De huidige studie levert bewijs dat ZeLan-extract de PCOS-gerelateerde endocriene en metabole fenotypes verbetert in een DHEA-geïnduceerd ratmodel en dat deze effecten geassocieerd zijn met gunstige veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobioom en de serummetabole profielen. De geïntegreerde multi-omics benadering toonde aan dat behandeling met ZeLan hyperandrogenemie, een verhoogde LH/FSH-ratio en insulineresistentie verbeterde, terwijl de alfa-diversiteit van het darmmicrobioom gedeeltelijk werd hersteld, de microbiële samenstelling werd hersteld en verschillende metabole paden die betrokken zijn bij de PCOS-pathofysiologie werden genormaliseerd. Deze bevindingen breiden het huidige begrip van biologische reacties op traditionele Chinese botanische geneesmiddelen uit en ondersteunen verder onderzoek naar de darm-ovarium-as als een potentieel doelwit voor PCOS-interventie.
De afname van het serumtestosteron en de LH/FSH-ratio na behandeling met ZeLan komt overeen met eerdere onderzoeken waarin de anti-androgene eigenschappen van botanische extracten die flavonoïden en fenolische verbindingen bevatten, werden aangetoond16. Een uitgebreid overzicht van klinische studies naar kruidengeneeskunde bij PCOS heeft endocriene en metabole verbeteringen door verschillende botanische interventies samengevat17. Het mechanisme waarmee ZeLan de biosynthese van androgenen moduleert, kan betrekking hebben op directe effecten op ovariële steroidogene routes, systemische ontstekingsremmende en insuline-sensitiserende effecten, of indirecte effecten geassocieerd met metabolieten van darmmicrobiota; het huidige ontwerp kan deze mogelijkheden niet volledig van elkaar scheiden. De verbetering van de LH/FSH-ratio wijst op een gedeeltig herstel van de functie van de hypothalamus-hypofyse-gonadenas, die gewoonlijk ontregeld is bij PCOS18. Systematische reviews van dierproeven met traditionele Chinese geneesmiddelformules voor PCOS hebben eveneens verbeteringen in reproductieve en endocriene indices gerapporteerd19. De gelijktijdige verbetering van insuline-gerelateerde indices suggereert dat ZeLan metabole voordelen kan bieden die verder gaan dan endocriene regulatie, mogelijk via verbeterde perifere insulinensignalering of verminderde inflammatoire mediatoren die de functie van de insulinereceptor belemmeren20.
Het herstel van de alfa-diversiteit van de darmmicrobiota na behandeling met ZeLan is consistent met een respons geassocieerd met het microbioom. De verminderde alfa-diversiteit die werd waargenomen bij PCOS-modelratten is consistent met de groeiende hoeveelheid literatuur die dysbiose van de darmen documenteert in zowel experimentele PCOS-modellen als klinische populaties21. Insenser et al. rapporteerden bovendien dat profielen van de darmmicrobiota bij PCOS worden beïnvloed door geslacht, geslachtshormonen en obesitas22. Onze observatie dat behandeling met ZeLan de Shannon-index gedeeltelijk herstelde van 4,19 naar 5,79 suggereert dat dit botanische extract de structuur van de microbiële gemeenschap kan ondersteunen. Vergelijkbare effecten op het herstel van de diversiteit zijn gerapporteerd voor andere polyfenolrijke plantextracten, die selectief gunstige bacteriële populaties kunnen bevorderen terwijl potentieel pathogene taxa worden onderdrukt23. De taxonomische verschuivingen die werden waargenomen op fylumniveau, in het bijzonder de verminderde Firmicutes-to-Bacteroidetes-ratio na behandeling met ZeLan, zijn relevant gezien de vastgestelde associatie tussen verhoogde F/B-ratio's en metabole disfunctie, waaronder obesitas en insulineresistentie24. Aanvullende studies, waaronder het werk van Jobira et al. bij adolescenten met PCOS, hebben een veranderde microbiële biodiversiteit in het maag-darmstelsel gerapporteerd, wat de biologische relevantie van de microbiële samenstelling voor het metabolisme van de gastheer ondersteunt25.
De identificatie van specifieke bacteriële genera die differentieel geassocieerd zijn met PCOS en de ZeLan-behandeling biedt een biologische context voor de associaties tussen het microbiota-metaboloom die in deze studie zijn waargenomen. De verrijking van Lactobacillus en Ruminococcus bij gezonde controles en hun afname bij PCOS-dieren is consistent met eerdere rapporten waarin de beschermende rollen van deze genera worden benadrukt26. Lactobacillus-soorten staan bekend om hun productie van melkzuur en antimicrobiële peptiden die de integriteit van de darmbarrière behouden en pathogene bacteriën onderdrukken, terwijl Ruminococcus-soorten belangrijke producenten zijn van korteketenvetzuren door fermentatie van voedingsvezels27. Het herstel van deze gunstige genera na ZeLan-behandeling kan de darmbarriefunctie verbeteren en de SCFA-gerelateerde metabole activiteit verhogen, zoals weerspiegeld door de verhoogde butyraatspiegels die in de metabolomische analyse zijn waargenomen. Omgekeerd stemt de verhoogde abundantie van Bacteroides, Prevotella en Escherichia bij PCOS-dieren overeen met studies die deze genera impliceren bij inflammatoire en metabole stoornissen28. Escherichia-soorten, in het bijzonder Escherichia coli, kunnen lipopolysachariden produceren, die systemische inflammatie en insulineresistentie kunnen triggeren via Toll-like receptor 4-signalering, wat een plausibele link vormt tussen dysbiose in de darmen en PCOS-geassocieerde metabole dysfunctie29.
De metabolomische bevindingen leveren bewijs voor metabole associaties tussen de darmmicrobiota en de gastheer die gepaard gaan met de ZeLan-behandeling. Veranderingen in secundaire galzuren, zoals lithocholzuur, zijn biologisch relevant omdat deze metabolieten worden gegenereerd door bacteriële enzymatische activiteit30. Galzuren functioneren niet alleen bij de absorptie van lipiden, maar dienen ook als signaalmoleculen die de glucose- en lipidenmetabolisme reguleren via de farnesoïde X-receptor en de Takeda G-eiwitgekoppelde receptor 5, wat suggereert dat normalisatie van galzuurprofielen kan bijdragen aan een verbeterde metabole homeostase. Op soortgelijke wijze is het herstel van de butyraatspiegels relevant gezien de meerdere gunstige effecten ervan, waaronder de verbetering van de darmbarrièrefunctie, ontstekingsremmende eigenschappen en de bevordering van de insulinegevoeligheid. De geobserveerde correlaties tussen gunstige bacteriën en beschermende metabolieten, in contrast met associaties tussen pathogene bacteriën en schadelijke metabolieten, bieden associatieve ondersteuning voor de hypothese van de darm-ovarium-as, terwijl ze de noodzaak voor directe mechanistische validatie onderstrepen.
De klinische implicaties van deze bevindingen moeten worden geïnterpreteerd binnen de beperkingen van een preklinisch exploratief ontwerp. De resultaten ondersteunen verdere evaluatie van ZeLan-extract als een complementaire benadering voor het beheer van PCOS, met name in de context van botanische interventies die zowel endocriene-metabole indices als de intestinale micro-omgeving kunnen beïnvloeden. De identificatie van microbiële en metabole biomarkers die geassocieerd zijn met de behandelrespons kan helpen bij het sturen van toekomstige mechanistische en translationele studies. Bovendien kan de darm-ovarium-as uiteindelijk combinatiestrategieën ondersteunen waarbij ZeLan wordt geïntegreerd met probiotica of dieetwijzigingen, maar dergelijke strategieën vereisen gecontroleerde validatie vóór klinische toepassing.
Verschillende beperkingen van de huidige studie dienen te worden erkend. Ten eerste, hoewel het DHEA-geïnduceerde ratmodel verschillende kenmerken van humane PCOS recapituleert, legt het de heterogeniteit van menselijke PCOS-fenotypes niet volledig vast, waaronder slanke, obese, insulineresistente en inflammatoire subtypes; daarom is klinische translatie afhankelijk van validatie in goed gekarakteriseerde patiëntenpopulaties. Ten tweede maakte de studie gebruik van een enkele ZeLan-dosis zonder dosis-responsgradiënt of een positieve drugcontrole zoals metformine, waardoor het effectieve dosisbereik, de relatieve werkzaamheid en de optimale toedieningscyclus nog moeten worden bepaald. Ten derde vond de bemonstering slechts plaats aan het eindpunt, wat de interpretatie van dynamische temporele veranderingen in microbiota, metabolieten en hormoonprofielen tijdens de interventieperiode beperkt. Ten vierde waren ovariale histopathologie, follikel tellingen, kwantificering van het corpus luteum en seriële monitoring van de oestruscyclus niet opgenomen in dit experimentele ontwerp; derhalve werd het functionele herstel van de eierstokken afgeleid uit endocriene en metabolische indices in plaats van uit directe beoordelingen op weefsel- en cyclusniveau. Ten vijfde identificeerde de studie correlaties tussen microbiële taxa en metabolieten, maar omvatte deze geen fecale microbiota-transplantatie, experimenten met kiemvrije dieren, gerichte supplementatie van metabolieten, assays voor inflammatoire markers of metingen van ovariale steroidogene enzymen zoals CYP17A1, CYP19A1 en StAR; bijgevolg kunnen causale mechanismen op basis van de huidige gegevens niet worden bevestigd. Ten zesde biedt untargeted metabolomics bewijs op ontdekkingsniveau, en is gerichte kwantitatieve validatie van sleutelmetabolieten zoals lithocholzuur, boterzuur en testosteron vereist in toekomstig werk. Ten zevende waren visualisatie van bèta-diversiteit, microbiële functionele voorspelling en geïntegreerde microbiota-metaboliet-gen-padmodellering niet beschikbaar voor de huidige indiening, wat het vermogen om een volledig regulatoir netwerk te construeren beperkt. Ten slotte werd het ZeLan-extract gestandaardiseerd op basis van het totale flavonoïdengehalte, maar een uitgebreide kwalitatieve en kwantitatieve fytochemische karakterisering van actieve monomeren blijft noodzakelijk.
Concluderend heeft ZeLan-extract de PCOS-gerelateerde endocriene en metabole fenotypes in een ratmodel verbeterd en was het geassocieerd met een gedeeltelijk herstel van de alfa-diversiteit van de darmmicrobiota, een veranderde microbiële samenstelling en modulatie van serummetabole routes, waaronder de biosynthese van steroïdhormonen, galzuurmetabolisme en metabolisme gerelateerd aan kortketenige vetzuren. De waargenomen correlaties tussen gunstige bacteriën en beschermende metabolieten, in contrast met associaties tussen PCOS-verrijkte bacteriën en schadelijke metabolieten, ondersteunen een biologisch plausibele associatie via de darm-ovarium-as. Deze bevindingen bieden een basis voor toekomstig mechanistisch en translationeel onderzoek naar ZeLan-extract bij de behandeling van PCOS, terwijl ze de noodzaak benadrukken van causale validatie en een bredere fytochemische karakterisering.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door het Hebei Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Scientific Research Planning Project (Subsidienummer 2021316).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetonitril | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Optima LC-MS-kwaliteit, 4 L; mobiele fase en monsterreconstitutie |
| ACQUITY UPLC HSS T3-kolom | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm; UHPLC-scheiding |
| Agarosegelelektroforese-systeem | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Mini-Sub Cell GT horizontaal elektroforese-systeem; DNA-kwaliteitsbeoordeling |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | 1290 Infinity II UHPLC-module set gekoppeld aan 6550 iFunnel Q-TOF MS; platform voor niet-gerichte metabolomics van serum |
| DADA2-algoritme | Bioconductor | Versie 1.24.0 | ASV-generatie en chimeraverwijdering; versie afgestemd op de workflow van R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Dehydroepiandrosteron (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Inductie van PCOS-model; 6 mg/100 g lichaamsgewicht; CAS 53-43-0 |
| Gedestilleerd water | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | UltraPure DNase/RNase-vrij gedestilleerd water; vehikel voor orale gavage in de Controle- en Modelgroepen |
| Mierenzuur | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Optima LC-MS-kwaliteit, 50 mL; 0,1% additief voor LC-MS mobiele fasen |
| Human Metabolome Database | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Metaboliet-annotatiedatabase |
| Illumina NovaSeq 6000-platform | Illumina | 20012850 | Sequencing-systeem gebruikt door de sequencing-dienstverlener voor paired-end 250 bp 16S rRNA-sequencing |
| Lycopus lucidus Turcz. kruid | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Batch ZL-20230315 | Geauthenticeerd botanisch grondmateriaal voor ZeLan-waterextract |
| Methanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Optima LC-MS grade, 4 L; eiwitprecipitatie voor serummetabolomics |
| METLIN-database | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Database voor massaspectrale annotatie van metabolieten |
| NanoDrop-spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | NanoDrop One microvolume UV-Vis spectrofotometer; bepaling van DNA-kwantiteit en -zuiverheid |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | DNA-extractie uit caecuminhoud; 50-prep feces-DNA-kit |
| QIIME2 | QIIME2-ontwikkelteam | Versie 2022.2 | Verwerking van 16S rRNA-sequenties |
| R-software | R Foundation | Versie 4.2.1 | Statistische analyse en XCMS-verwerking |
| Serum-ELISA-kits voor testosteron, LH, FSH en insuline | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Rat testosteron-, LH-, FSH- en insuline-ELISA-kits voor kwantificering van hormonen en insuline in serum |
| Sesamolie | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Draagmiddel voor DHEA-injectie |
| Natriumpentobarbital | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anesthesie; 50 mg/kg intraperitoneaal |
| SPSS-software | IBM Corporation | Versie 26.0 | Statistische analyse |
| Universele 16S rRNA-primers 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Maatsynthese: 338F/806R | Amplificatie van de V3-V4-regio's; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| XCMS-pakket | Bioconductor / R | Versie 3.18.0 | Piekndetectie, uitlijning van retentietijden en integratie |
| ZeLan-extract | In-house waterig extract | Batch ZLE-20230402 | Behandeling via orale gavage; gestandaardiseerde totale flavonoïden ≥2.5% |
Referenties
- Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
- Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
- Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
- Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
- Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
- Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
- Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
- Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
- Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
- Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
- He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
- Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
- Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
- Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
- Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
- Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
- Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
- McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
- Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
- Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
- Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
- Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
- Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
- Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
- Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
- Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
- Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
- He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
- Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
- Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen