Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een in vitro test voor LpxC-afbraak door de membraangebonden protese FTSH en adaptor lapB van Escherichia coli

173 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

22 juni 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Escherichia coli reguleert de biosynthese van lipopolysaccharide (LPS) voornamelijk door de afbraak van LpxC te reguleren, de deacetylase die de eerste vaste stap van de LPS-synthese katalyseert. Het doel van dit protocol is het opzetten van een gevoelige, kwantitatieve in vitro afbraaktest voor LpxC, met gebruik van gereconstitueerde AAA+ protease FtsH en adaptor LapB in proteoliposomen.

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gevoelige, kwantitatieve in vitro afbraaktest van LpxC met behulp van gereconstitueerde AAA+ (ATPase geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten) protease FtsH en adaptor LapB in proteoliposomen. AAA+-proteasen zijn ATP-afhankelijke moleculaire machines die de eiwithomeostase in stand houden en diverse cellulaire processen in het cytoplasma of bij celmembranen reguleren. In vergelijking met hun cytoplasmatische tegenhangers blijven membraangebonden AAA+-proteasen slecht gekarakteriseerd vanwege technische uitdagingen bij het reconstitueren en meten van hun activiteit in vitro. Hier gebruiken we het FtsH–LapB–LpxC-systeem als model om een fluorescentie-gebaseerde afbraaktest in proteoliposomen te ontwikkelen. FtsH en LapB worden gereconstitueerd tot proteoliposomen om het natuurlijke membraanmilieu na te bootsen, en LpxC wordt covalent gelabeld met de fluorescerende kleurstof Atto488. De afbraak wordt gestart door proteoliposomen te combineren met gelabelde LpxC en ATP en wordt beëindigd met trichloorazijnzuur (TCA). Een succesvolle assay wordt gedefinieerd door een tijdsafhankelijke toename van fluorescentie in de oplosbare supernatantfractie na TCA-precipitatie, wat overeenkomt met de afgifte van fluorescerende peptidefragmenten die worden gegenereerd door LpxC-proteolyse. Dit signaal maakt directe kwantificering van de initiële degradatiesnelheden onder gedefinieerde omstandigheden mogelijk. In vergelijking met traditionele natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE)-gebaseerde assays, biedt deze methode aanzienlijk verbeterde gevoeligheid en maakt kwantitatieve kinetische analyse mogelijk. Bovendien maakt het proteoliposoomsysteem systematisch onderzoek mogelijk naar hoe eiwitcomponenten, zoals adapters en anti-adaptoren, evenals de lipidensamenstelling, de afbraak van LpxC beïnvloeden. Hoewel ontwikkeld voor het FtsH–LapB–LpxC-systeem, is deze assay gemakkelijk aanpasbaar aan andere membraangebonden AAA+-proteasen en substraten, en biedt het een algemeen platform voor het bestuderen van membraangebonden proteolyse in vitro.

Inleiding

AAA+ proteasen zijn geconserveerde, ATP-afhankelijke moleculaire machines die centrale rollen spelen in de kwaliteitscontrole van eiwitten en regulatieve proteolyse 1,2. Deze machines bevatten een hexamerische ring van het AAA+ ATPase-domein, die ATP hydrolyseren, herkennen, ontvouwen en de substraten transloceren naar het compartmentele proteasedomein voor degradatie1. Hoewel cytoplasmatische AAA+-proteasen zoals ClpXP3 en Lon4 uitgebreid zijn gekarakteriseerd met goed gevestigde in vitro-assays, blijven membraangebonden AAA+-proteasen relatief slecht begrepen. Deze kloof weerspiegelt grotendeels de technische uitdagingen die gepaard gaan met het reconstitueren van membraaneiwitten tot gedefinieerde lipideomgevingen en het kwantitatief meten van hun proteolytische activiteit in vitro. Het algemene doel van deze methode is het opzetten van gevoelige, kwantitatieve assays om de proteolytische activiteit van membraangebonden proteasen te onderzoeken.

FtsH is de enige essentiële AAA+-protease in Escherichia coli en dient als prototypische membraangebonden AAA+-protease 5,6,7. Verankerd aan het binnenmembraan door N-terminale transmembraanhelixen, breekt FtsH een diverse set cytoplasmatische en membraan-geassocieerde substraten af, waardoor het de kwaliteitscontrole, stressreacties en lipidehomeostase 8,9,10,11 reguleert. Een van de best gekarakteriseerde substraten is LpxC, een oplosbare deacetylase die de eerste toegewijde stap in lipopolysaccharide (LPS) biosynthesekatalyseert 12,13. Efficiënte afbraak van LpxC door FtsH vereist het membraaneiwit LapB, dat fungeert als een adapter om LpxC specifiek te herkennen en af te leveren aan de protease 14,15,16,17,18.

Ondanks het fysiologische belang is de kwantitatieve analyse van FtsH-gemedieerde proteolyse in vitro beperkt, vooral voor cytoplasmatische substraten zoals LpxC. Traditionele in vitro afbraakassays gebruiken FtsH gezuiverd in detergentmicellen13,19, die niet de membraanomgeving bieden voor de membraanverankerde protease. Daarnaast vertrouwen de degradatie-assays vaak op SDS–PAGE-gebaseerde detectie van substraatverdwijning13, wat arbeidsintensief, laagdoorvoer en onvoldoende gevoelig kan zijn voor kinetische analyses. Meer recentelijk is FtsH, gereconstitueerd tot bicellen, gebruikt om de afbraak van membraansubstraten te bestuderen, zoals gepionierd door groep20 van Heedeok Hong; echter, een vergelijkbaar systeem voor het analyseren van cytoplasmatische substraten ontbreekt nog. Hier passen we Heedeok Hongs bicelle-reconstitutie aan aan proteolisoom-reconstitutie om de membrane omgeving na te bootsen. Daarnaast is het wateroplosbare substraat LpxC fluorescentie-gelabeld, wat een gevoelige en kwantitatieve meting van de kinetiek van FtsH/LapB-afhankelijke afbraak van LpxC in vitro mogelijk maakt.

Deze methode moet worden gebruikt wanneer onderzoekers kwantitatief de FtsH-gemedieerde proteolyse van wateroplosbare substraten moeten meten. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande benaderingen. Ten eerste verbetert fluorescentie-gebaseerde detectie van proteolytische producten, in plaats van het verdwijnen van het substraat, de gevoeligheid en het dynamisch bereik aanzienlijk, waardoor kwantitatieve vergelijkingen van proteolytische activiteit mogelijk kunnen worden. Ten tweede behoudt het gebruik van proteoliposomen de membraancontext die nodig is voor de FtsH-functie, terwijl het nauwkeurige controle over de eiwit- en lipidensamenstellingmogelijk maakt 18. Ten slotte, hoewel ontwikkeld met het FtsH–LapB–LpxC-systeem, is dit protocol gemakkelijk aan te passen aan andere membraangebonden AAA+-proteasen en hun cytoplasmatische substraten die membraan-geassocieerde afbraakmechanismen vereisen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Labelen van LpxC met Atto488

  1. LpxC-voorbereiding
    1. Tot expressie en zuivering van LpxC-eiwit zoals eerder gerapporteerd18. Vervang de buffer van gezuiverde LpxC van Tris naar 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) door gelfiltratie met behulp van een hoge-resolutie gelfiltratiekolom (bijv. Superdex 200 Increase 10/300 GL kolom).
    2. Concentreer LpxC met een ultrafiltratiekolom tot een eindconcentratie van minstens 5 mg/mL bij 4 °C.
  2. Labelen van LpxC met Atto488
    1. Verdun 0,5 mg LpxC in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,6, tot een eindvolume van 225 μL. Voeg 25 μL natriumbicarbonaat toe om de pH aan te passen tot ongeveer 8,3.
    2. Los 0,24 mg Atto488 reactieve kleurstof op in 20 μL van een 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer om een bouillonoplossing te bereiden (0,012 mg/μL). Bereid een werkoplossing voor door 2 μL van de voorraadoplossing te verdunnen met 18 μL van 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 0,0012 mg/μL.
    3. Voeg onmiddellijk 4 μL van de Atto488-werkoplossing toe aan de eiwitoplossing (overeenkomend met een molaire verhouding van LpxC: Atto488 van 3:1). Wikkel de buis in aluminiumfolie en incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur met zachte beweging (18 tpm).
      OPMERKING: Zowel het Atto488-materiaal als de werkoplossingen kunnen snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C.
  3. Scheiding van LpxC–Atto488 van vrije kleurstof
    1. Evenwicht een PD-10 ontzoutingskolom met 10 mL ultrazuiver water, gevolgd door 15 mL 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,6.
    2. Breng het labelreactiemengsel aan op de kolom en laat het volledig in de hars komen.
    3. Elut met 5 mL 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,6. Twee verschillende banden die overeenkomen met LpxC–Atto488 (eerste band) en vrije Atto488-kleurstof (tweede band) zouden zichtbaar moeten worden. Verzamel fracties van de eerste band in ~0,5 mL aliquots.
    4. Analyseer geëlueerde fracties met SDS-PAGE. Visualiseer fluorescentie onder UV-verlichting vóór Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring.
    5. Verzamel fracties met LpxC–Atto 488 en concentreer het gelabelde eiwit tot ongeveer 2 mg/mL.
    6. Beoordeel de labelingsefficiëntie door de eiwitconcentratie en Atto488-concentratie te meten met een microvolumespectrofotometer.
      OPMERKING: Een verhouding van Atto488-concentratie (in pmol/μL) tot LpxC-concentratie (in mg/mL) in het bereik van 2–5 geeft een passend labelniveau aan. Dit komt overeen met een molaire verhouding van Atto488 tot LpxC, variërend van 1:15 tot 1:6 na labeling.
    7. Aliquot LpxC–Atto488 in 1,5 mL microcentrifugebuizen, snel bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 °C. Op dit punt kan het protocol tot 3 maanden worden gepauzeerd.
      VOORZICHTIG: Vloeibare stikstof is extreem koud; Behandel het met de juiste beschermingsmiddelen (cryo-handschoenen, oogbescherming).

2. Reconstitutie van FtsH/LAPB tot proteoliposomen

  1. Liposomenvoorbereiding
    1. Breng 100 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) in chloroform over in een glazen reageerbuis. Verdamp het oplosmiddel onder een zachte stroom van N₂, gevolgd door een nacht te drogen onder vacuüm.
      OPMERKING: POPC heeft een faseovergangstemperatuur van ~-2 °C en wordt veel gebruikt in membraanbiofysica, liposoomformuleringen en celmodelsystemen.
      VOORZICHTIG: Chloroform kan de ogen, huid, lever, nieren en zenuwstelsel beschadigen. Goede beschermingsmiddelen (handschoenen, oogbescherming, mondkapje) zijn vereist tijdens het hanteren. Hanteer het in een kap met een glazen spuit.
    2. Voeg 1.315 μL buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) toe aan de gedroogde POPC-film. Herstel de lipiden door 1 minuut waterbadsonicatie af te wisselen met 1 minuut vortexen op maximale snelheid, in totaal ~15 minuten, of tot volledig verspreid. (eind lipideconcentratie: 100 mM).
      OPMERKING: Om de lipidenresuspension te verbeteren, pas je de onderdompelingsdiepte van het glazen reageerbuisje in de waterbadsonicator aan om de beweging te maximaliseren. Resuspendeerde lipiden kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. Op dit punt kan het protocol tot wel 1 maand worden gepauzeerd.
    3. Aliquot de liposoom-suspensie in porties van 200 μL en bewaar bij -20 °C.
  2. Liposomen-extrusie
    1. Ontdooi een 200 μL liposoomaliquot in een waterbad op kamertemperatuur en verdun met 800 μL buffer A tot een eindvolume van 1 mL.
    2. Onderwerp de liposomen aan drie vries-dooicycli door af te wisselen tussen vloeibare stikstof en een waterbad op kamertemperatuur.
    3. Spoel spuiten, twee filtersteunen en een polycarbonaatmembraan van 200 nm met buffer A. Assembleer de mini-extruder en extrudeer de liposomen 20 keer uit.
      OPMERKING: De liposoom-suspensie moet transparant lijken na extrusie.
    4. Verdeel de 1 mL geëxtrudeerde liposoomsuspensie in drie buizen (330 μL per buis) en verdun elk met 600 μL buffer A.
  3. Triton X-100 zwellingtitratie
    OPMERKING: Triton X-100 is een detergent met lage kritische micelleconcentratie (CMC) en is in veel gevallen het meest succesvol gebleken21
    VOORZICHTIG: Triton X-100 is een gevaarlijke chemische stof die voornamelijk ernstige oogschade, huidirritatie en schadelijke effecten veroorzaakt bij inslikken. Goede beschermingsmiddelen (handschoenen, oogbescherming) zijn vereist tijdens het hanteren.
    1. Bereid 10% (v/v) Triton X-100 voor door 100 μL Triton X-100 te mengen met 900 μL ultrazuiver water, en dit in een shaker te becuberen om Triton X-100 volledig op te lossen.
    2. Meet de absorptie van liposomen bij 540 nm (A₅₄₀) met een spectrofotometer.
    3. Voeg 5 μL aliquoten van 10% Triton X-100 achtereenvolgens toe, meng voorzichtig na elke toevoeging, en meet A₅₄₀. Blijf Triton X-100 toevoegen totdat A₅₄₀ een maximum bereikt, en voeg daarna Triton X-100 nog eens 4–5 keer toe totdat de absorptie daalt tot ongeveer 60% van de piekwaarde.
    4. Op basis van de titratiecurve zwellen liposomen door 35 μL van 10% Triton X-100 toe te voegen en 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen met zachte agitatie.
  4. Reconstitutie van FtsH/LapB tot liposomen
    1. Druk FtsH- en LapB-eiwitten tot expressie en zuiver zoals eerder beschreven18.
    2. Was ~2 g van een niet-polair polystyreenadsorbent (bijv. Bio-Beads SM-2) één keer met 10 volumes methanol, één keer met 10 volumes ethanol en tien keer met 10 volumes ultrazuiver water. Bewaar de gewassen adsorbent in buffer A bij 4 °C.
    3. Voeg voor elke buis van Triton X-100–gezwollen liposomen 3 μL 500 mM tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 22,5 μg FtsH en 22,5 μg LapB toe. Stel het totale volume in op 1 mL met buffer A en incubeer 1 uur op RT met zachte roering.
      OPMERKING: Eiwit-tot-lipideverhoudingen van 1:20 tot 1:200 (wt/wt) werden routinematig gebruikt tijdens de reconstitutie van proteoliposomen21. Hier wordt een verhouding van 1:100 gebruikt.
    4. Verwijder het wasmiddel door sequentiële incubatie met niet-polaire polystyreenadsorptie: 40 mg bij RT gedurende 0,5 uur, gevolgd door 40 mg bij RT gedurende 1 uur, daarna 40 mg bij 4 °C 's nachts, en tenslotte 40 mg bij 4 °C gedurende 1 uur.
    5. Centrifugeer kort om het niet-polaire polystyreenadsorbend te pelleten bij 4 °C (400 × g voor 3 seconden). Breng het supernatant over naar ultracentrifugebuizen. Was het niet-polaire polystyreenadsorbend met 1 mL buffer A en combineer de wash met het supernatant. Voeg extra buffer A toe aan een eindvolume van ~6 mL.
      OPMERKING: Voor de veiligheid moeten ultracentrifugebuizen minstens 6 mL vloeistof bevatten.
    6. Balanceer de buizen en ultracentrifuge op 250.000 × g bij 4 °C gedurende 45 minuten in een rotor met vaste hoek (bijv. MLA-80) om proteoliposomen te pelleten.
    7. Verwijder het supernatant en suspendeer de proteolisoompellet opnieuw in 70 μL buffer A, aangevuld met 1 mM TCEP.
      OPMERKING: Het uiteindelijke proteoliposoomvolume is ongeveer 100 μL.
    8. Vries de proteoliposomen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
      OPMERKING: Op dit moment kan het protocol tot 1 maand worden gepauzeerd.
  5. SDS-PAGE-analyse van proteoliposomen
    1. Meng proteoliposomen grondig en combineer 5 μL van het monster met 5 μL van 2× SDS laadbuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5% SDS, 20% glycerol, 0,01% bromofenolblauw, 200 mM DTT).
    2. Laad proteoliposoommonsters samen met 525 ng FtsH (overeenkomend met 0,06 μM FtsH hexamer in 20 μL) op een 4–20% SDS-PAGE gel.
    3. Kleur de gel met CBB.
    4. Scan de gel en kwantificeer de bandintensiteit van FtsH voor elk monster. Bereken het volume proteoliposoom-suspension gelijk aan 525 ng FtsH.

3. In vitro afbraak van LpxC–Atto488

  1. Voer in vitro afbraakassays uit in een 20 μL reactie met FtsH/LapB proteoliposomen (overeenkomend met 0,06 μM FtsH) en 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 in de degradatiebuffer (50 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM Mg-acetaat, 5 mM ATP, 25 μM Zn-acetaat, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-mercaptoethanol).
  2. Voor het meten van elke concentratie substraat bereid je een reactie van 70 μL voor.
    1. Neem een fractie van 20 μL en demp deze door deze direct te mengen met 48 μL 5% tricloorazijnzuur (TCA) in 1,5 mL microcentrifugebuizen (0 min). Neem de tweede en derde fractie en verzacht ze respectievelijk na 10 en 20 minuten.
    2. Bereid parallel overeenkomstige controlereacties voor zonder proteoliposomen voor achtergrondaftrekking.
      OPMERKING: Drie replicatemetingen worden aanbevolen om betrouwbare resultaten te verkrijgen.
      Minimaliseer de lichtblootstelling bij het hanteren van LpxC–Atto488.
      VOORZICHTIG: TCA is een zeer corrosieve chemische stof die ernstige huidbrandwonden, blijvende oogschade en intense ademhalingsirritatie veroorzaakt bij inademing. Behandel het met de juiste beschermingsmiddelen (handschoenen, oogbescherming, mondkapje).
  3. Incubeer monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten om eiwitten neer te slaan, en centrifugeer vervolgens bij 18.800 × g bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  4. Neutraliseer monsters door 50 μL supernatant over te brengen in een buis met 60 μL 500 mM Tris-HCl, pH 8,8. Meng goed en breng 100 μL over op een zwarte 96-put plaat. Meet fluorescentie met een plaatlezer met excitatie bij 498 nm en emissie bij 520 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de gevoeligheid van de in vitro afbraaktest te verbeteren, werd het substraat LpxC gelabeld met de fluorescerende kleurstof Atto488. De succinimidylestergroep van Atto488 reageert efficiënt met primaire aminogroepen van LpxC onder mild alkalische omstandigheden. Omdat de Tris-buffer primaire aminen bevat die deze reactie verstoren, werd LpxC, gezuiverd in de Tris-buffer, door gelfiltratie omgezet in de fosfaatbuffer vóór etikettering. Voor de labelingsreactie werd een molaire...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De eerste kritieke stap van dit protocol is de etikettering van LpxC door Atto488. Een matige etikettering is cruciaal voor het nauwkeurig meten van de afbraakactiviteit in vitro . Op basis van onze optimalisatie-experimenten is een molaire verhouding van LpxC tot Atto488 tussen 9:1 en 3:1 optimaal. Overmatige Atto488 leidt tot overlabeling, wat waarschijnlijk de oorspronkelijke staat van LpxC verstoort. Onder deze omstandigheden is het verschil in degradatie van LpxC–Atto488 al...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Al het onderzoek werd uitgevoerd aan Yale University. W.M. wordt ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences onder toekenningsnummers R01GM137068 en RM1GM149406, en door de Richard and Susan Smith Family Foundation via de Odyssey Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEHome made
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Nonpolar polystyrene adsorbent 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Fixed-angle rotor 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944High-resolution gel filtration column 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Referenties

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FtsH-proteaseLapB-adapterproteoliposoom-reconstitutieAAA+-proteasefluorescentie-assayproteïnehomeostasekinetische analyse

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.