De diagnostische effectiviteit van plasma miR-362-3p gecombineerd met Doppler-echografie bij de diagnose van borstkanker

Samenvatting

De diagnose van borstkanker is relatief laag. De viervoudige tabel methode werd gebruikt om de diagnostische waarde van miR-362-3p gecombineerd met Doppler-echo voor borstkanker te analyseren. De combinatie van Doppler-echo en miR-362-3p verbeterde effectief de diagnostische effectiviteit en bood een veelbelovende methode voor de diagnose van borstkanker.

Samenvatting

Borstkanker is de op één na meest voorkomende kwaadaardige tumor ter wereld, die het leven van vrouwen ernstig bedreigt en een enorme economische last met zich meebrengt. Deze studie heeft als doel de waarde van miR-362-3p in combinatie met Doppler-echo bij de diagnose van borstkanker te onderzoeken. In totaal werden 182 borstkankerpatiënten en 147 patiënten met goedaardige borstziekte in deze studie opgenomen. De plasma miR-362-3p-niveaus van de patiënten werden gemeten met behulp van Real-time fluorescentie quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). De chi-kwadraattest werd gebruikt om de verschillen in de parameters van Doppler-echo tussen de twee groepen patiënten te analyseren. De receiver operator characteristic (ROC) curve werd gebruikt om de diagnostische effectiviteit van miR-362-3p, Resistance Index (RI) en Pulsatility Index (PI) te evalueren. De diagnostische efficiëntie van Doppler-echografie gecombineerd met plasma miR-362-3p bij borstkanker werd geanalyseerd met behulp van de viervoudige tabelmethode. De miR-362-3p-niveaus waren duidelijk verlaagd bij borstkankerpatiënten. Er waren aanzienlijke verschillen in tweedimensionale echoparameters. miR-362-3p, RI en PI hebben diagnostische waarde voor borstkanker. De gecombineerde diagnostische waarde van de drie factoren was hoger. Echografie gecombineerd met miR-362-3p verbeterde significant de gevoeligheid, nauwkeurigheid en negatieve voorspellende waarde bij de diagnose van borstkanker. Doppler-echografie gecombineerd met miR-362-3p kan de diagnostische efficiëntie van borstkanker verbeteren, wat mogelijk een niet-invasief en mogelijk aanvullende diagnostische tool voor borstkanker kan bieden.

Inleiding

Volgens de statistieken van het International Agency for Research on Cancer overtrof het incidentiepercentage van borstkanker in 2020¹. Borstkanker is een kwaadaardige tumor die vaak voorkomt en wereldwijd een belangrijke oorzaak is van kankergerelateerde sterfte bij vrouwen¹. Een tijdige diagnose van borstkanker is gunstig voor de prognose van patiënten. Weefselbiopsie is de gouden standaard voor het diagnosticeren van borstkanker. Dit is echter een type invasieve diagnose en geldt niet voor patiënten met borstkanker in een vroeg stadium².

Doppler-echografie is een veelgebruikte beeldvormingstechniek voor borstkankerscreening en^{aanvullende diagnose.} Doppler-echografie kan nauwkeurig de grootte van knobbels, bloedstroomsignalen en de status van lymfekliermetastasen^{beoordelen 4}. Borstdoppler-echografie is, vanwege voordelen zoals geen ioniserende straling, veiligheid en niet-invasieve eigenschappen, evenals de mogelijkheid tot herhaalbare onderzoeken, een van de meest gebruikte beeldvormingstechnieken geworden bij borstkankerscreening^{en -diagnose}. Doppler-echografie wordt echter gevoelig verstoord door de weefselachtergrond bij het opsporen van borstkanker met een lage dichtheid of klein volume, wat leidt tot een aanzienlijke afname van de diagnostische gevoeligheid en het moeilijk maakt om aan de klinische behoeften voor vroege diagnose^{te voldoen 6}. Daarom is het noodzakelijk plasma-biomarkers te ontwikkelen die de beperkingen van Doppler-ultrageluidstechnologie kunnen overwinnen. Als de combinatie van deze twee methoden de gevoeligheid van de diagnose voor borstkanker kan vergroten, zal dit een aanzienlijke klinische waarde en praktische betekenis hebben.

MicroRNA's (miRNA's) zijn een klasse van niet-coderende RNA-moleculen met een lengte van ongeveer 20 tot 24 nucleotiden ^7,8. Een van de kenmerken van miRNA's is een hoge mate van behoud tijdens het evolutionaire proces. miRNA's hebben een brede weefselverdeling, die niet alleen specifiek tot expressie komt in verschillende menselijke weefselcellen, maar ook stabiel kan voorkomen in meerdere lichaamsvloeistoffen zoals bloed en speeksel⁹. Deze distributiekenmerken bieden voordelen voor de ontwikkeling van niet-invasieve diagnostische markers. Functioneel breken miRNA's mRNA af door complementaire binding aan de 3' Niet-vertaalde Regio's (UTR)^10,11, waarbij ze deelnemen aan een reeks belangrijke pathologische en fysiologische processen zoals cellulaire ontstekingsreacties, oxidatieve stress, apoptose en proliferatie en differentiatie¹². Een groot aantal studies heeft bevestigd dat de abnormale veranderingen in miRNA-expressieprofielen nauw samenhangen met het ontstaan en de ontwikkeling van borstkanker^13,14. De ontregeling van miRNA-expressie kan de kwaadaardige transformatie van de ebstepitheelcellen bevorderen door de expressienetwerken van oncogenen of tumorsuppressorgenen te reguleren. miR-362-3p is een typische factor die tumorprogressie remt. Meerdere rapporten toonden aan dat miR-362-3p de progressie van borstkanker remde 15,16,17. Assiri et al. rapporteerden dat lage expressie van miR-362-3p nauw samenhangt met een slechte prognose en een kortere algehele overleving bij borstkankerpatiënten¹⁵. Mechanistisch had miR-362-3p een anti-tumor effect bij borstkanker door DEAD-box helicase 5 (DDX5) te richten om de proliferatie, invasie en migratie van kankercellen^{te bevorderen 16}. Daarnaast ontdekte het team onder leiding van Kang ook dat miR-362-3p significant werd verlaagd in borstkankerweefsels, en gerichte regulatie van miR-362-3p-expressie kan dienen als een nieuwe potentiële therapeutische strategie voor borstkankerbeheer¹⁷. Er is echter geen melding of miR-362-3p kan dienen als vroege diagnostische marker voor borstkanker.

Deze studie mat het expressieniveau van miR-362-3p in het plasma en analyseerde tegelijkertijd de kernbeeldparameters van Doppler-echografie bij borstkankerpatiënten. De studie onderzocht grondig de gecombineerde toepassingswaarde van plasma miR-362-3p expressieniveaus en Doppler-echobeeldparameters, en toonde duidelijk de effectiviteit aan van deze gecombineerde diagnostische aanpak bij de screening van borstkanker en bij de differentiële diagnose tussen goedaardige en kwaadaardige borstziekten.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Goedkeuring werd verleend door de Ethische Commissie van het Aangesloten Ziekenhuis van de Tweede Medische Universiteit van Shandong, School of Clinical Medicine, Shandong Tweede Medische Universiteit (goedkeuringsnummer: wyfy-2023-ky-124). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken proefpersonen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Experimentele proefpersonen

De steekproefgrootteberekening werd uitgevoerd met G*Power 3.1-software gebaseerd op een onafhankelijke t-test van de steekproef. Er werden een middelmatige effectgrootte (Cohen's d = 0,5, veel gebruikt in klinische observationele studies), tweezijdige test, α = 0,05, en vermogen (1 − β) = 0,95 vastgesteld. De berekening gaf aan dat er per groep minstens 105 deelnemers nodig waren. Ten slotte werden 182 borstkankerpatiënten en 147 patiënten met goedaardige borstlaesies ingeschreven, en de daadwerkelijke steekproefgrootte van beide groepen overschreed ruimschoots de minimaal vereiste steekproefgrootte, wat voldoende statistische kracht garandeerde om de studieconclusies te ondersteunen en het risico op type II-fouten binnen een acceptabel bereik te beheersen. Alle deelnemers werden strikt en achtereenvolgens ingeschreven volgens uniforme inclusie- en exclusiecriteria.

Van 2023 tot 2024 waren alle patiënten ingeschreven in het Affiliated Hospital van de Shandong Second Medical University, School of Clinical Medicine, Shandong Second Medical University. Goedaardige laesies: Niet-maligne laesies werden door pathologie bevestigd. Borstkanker: kwaadaardige tumoren werden door pathologie bevestigd. Veneuze bloedmonsters werden van alle deelnemers na een nacht vasten afgenomen. De veneuze bloedmonsters werden anticoaguleerd en gecentrifugeerd om het plasma te scheiden, strikt volgens de standaardprocedures, en vervolgens overgebracht naar −80 °C voor langdurige opslag, wat vervolgens werd gebruikt voor miRNA-extractie. Alle plasmamonsters waren strikt beperkt tot maximaal twee vries-dooicycli vóór RNA-extractie om miRNA-afbraak te voorkomen. Alle patiënten waren volledig geïnformeerd over het studieprotocol en gaven vrijwillig schriftelijke geïnformeerde toestemming vóór inschrijving.

Inclusiecriteria voor borstkankerpatiënten: (1) Patiënten met pathologisch bevestigde primaire borstkanker. (2) Geen chirurgische behandeling vóór inschrijving. (3) Geen radiotherapie of chemotherapie ontvangen vóór het monsterafname.

Inclusiecriteria voor patiënten met goedaardige borstziekte: (1) Pathologisch bevestigde goedaardige borstlaesies. (2) Zonder andere systemische kwaadaardige tumoren of voorstadia van kanker. (3) Niet-zwanger en niet lacterend. (4) Geen ernstige acute infectie of chronische ontstekingsziekte.

Exclusiecriteria voor patiënten met borstkanker en goedaardige borstlaesie: (1) Ernstige borstinfectie of acute kritieke ziekte. (2) Ernstige lever- of nierfunctiestoornissen, of auto-immuunziekte. (3) Patiënten die binnen 6 maanden hormoontherapie kregen.

2. Doppler-echoonderzoek

De bilaterale borsten van de patiënt werden grondig onderzocht in vier kwadranten met behulp van een Doppler-echo. Tweedimensionale echoscan werd gebruikt om de kenmerken van de laesie vast te leggen, waaronder grenzen, vorm, interne echo, achterste echogolven en beeldverhouding van de laesie zelf. Color Doppler-flowbeeldvorming werd toegepast om de bloedstroomparameters van de laesie te beoordelen, waaronder weerstandsindex (RI), pulsatie-index (PI) en maximale bloedstroomsnelheid (V_max). Bloedstroomsignalen werden beoordeeld volgens een eerder gerapporteerd classificatiesysteem:¹⁸: Graad 0: Geen bloedstroomsignaal; Graad I: minimale bloedstroomsignalen; Graad II: De lengte van het bloedstroomsignaal overschrijdt de helft van de diameter van de laesion; Graad III: Overvloedige bloedstroomsignalen.

3. Positieve definitie voor de echodiagnose van borstkanker

Deze omvatten (1) Dubbelzinnige grenzen; (2) Onregelmatige vorm; (3) Ongelijke interne echo; (4) Verzwakte achterecho; (5) Beeldverhouding >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Maximale bloeddoorstromingssnelheid (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Bloedstroomsignaal ≥ graad II. Elke laesie die aan een van bovenstaande verdachte criteria voldoet, wordt als ultrasoon positief geclassificeerd, terwijl die zonder verdachte kenmerken als ultrasoon negatief worden geclassificeerd.

4. Real-time fluorescentie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

Plasma-miRNA's werden geëxtraheerd met behulp van een gespecialiseerde miRNA-extractiekit. De succesvol geëxtraheerde RNA-monsters werden gebruikt om cDNA te synthetiseren met behulp van gespecialiseerde miRNA reverse transcriptiekits. Omgekeerde transcriptiereactiecondities voor miR-362-3p: Het totale volume van deze reactie was 20 μL. De PCR-reactieprocedure was als volgt: (1) Het mengsel werd 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C, (2) De omgekeerde transcriptie-reactie werd 50 minuten bij 42 °C uitgevoerd, (3) Het enzym werd 5 minuten geïnactiveerd bij 95 °C. Het product werd opgeslagen bij 4 °C. De qPCR-reactiecondities: Het totale volume van het reactiesysteem was 20 μL. De amplificatievoorwaarden werden als volgt uitgevoerd: (1) Het cDNA was pre-denatureerd en de DNA-polymerase werd geactiveerd bij 95 °C gedurende 2 minuten. (2) De DNA-strengen gloeien en verlengen zich 30 seconden bij 60 °C. De bovenstaande twee stappen werden in totaal 40 cycli uitgevoerd. De genrelatieve expressie werd berekend met de formule 2^-(ΔΔCt). De relatieve expressie van miR-362-3p werd gekalibreerd door U6. Om het gebruik van U6 als endogene controle te rechtvaardigen, werd de stabiliteit van U6 geëvalueerd met behulp van het BestKeeper-algoritme in de plasmacohort. De variatiecoëfficiënt (CV) van U6 Ct-waarden over alle steekproeven was minder dan 2%, wat wijst op een hoge expressiestabiliteit. Daarom werd U6 gevalideerd en geselecteerd als referentiegen voor normalisatie van miR-362-3p-expressie in de huidige studie. De downstream-volgorde van de primers werd door de kit geleverd. De primerreeksen waren als volgt:

miR-362-3p: GCCGAGAACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATACT.

5. Receiver Operating Characteristic (ROC) curve

De Youden-index werd gebruikt om de optimale cut-offwaarde voor miR-362-3p bij het diagnosticeren van borstkanker te bepalen door de gevoeligheids- en specificiteitswaarden van de ROC-curve te berekenen. Het gecombineerde diagnostische model werd opgebouwd met behulp van binaire logistische regressie in SPSS, waarbij miR-362-3p, RI en PI als onafhankelijke variabelen werden ingevoerd. Variabelen werden opgenomen met de Enter-methode om de voorspelde kanswaarde van de gecombineerde diagnose voor elke proefpersoon te genereren. De formule voor de voorspellingskans (PRE): . ROC-krommen werden uitgezet op basis van de PRE. De Delong-test werd gebruikt om de verschillen in Area Under Curve (AUC)-waarden tussen verschillende ROC-curves te vergelijken.

6. Definitie van uitkomstparameters

De primaire uitkomstparameter was de algehele diagnostische effectiviteit van het gecombineerde model van plasma miR-362-3p en Doppler-echografie voor borstkanker, met pathologische diagnose als gouden standaard. De secundaire uitkomstparameters omvatten de diagnostische prestaties van alleen Doppler-echografie en plasma miR-362-3p alleen.

7. Datastatistieken

De expressieniveaus van miR-362-3p en de ROC-curves van de twee groepen patiënten werden geanalyseerd met behulp van statistische en grafieksoftware. De t-test werd gebruikt om de verschillen in continue variabelen tussen de twee groepen te vergelijken. De chi-kwadraattest en de viervoudige tabel methode werden geanalyseerd met SPSS 26.0. De chi-kwadraattest werd gebruikt om de statistische verschillen van categorische variabelen te evalueren; de combinatie van twee indexen (miR-362-3p + Doppler-echo) werd beschouwd als de primaire analyse, die een routinematige kwalitatieve diagnostische conclusie in de klinische praktijk vertegenwoordigde; als er verdachte kenmerken waren afgeleid van de Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS) classificatie, werd de laesie als positief gedefinieerd; de methode met vier tabelen werd gebruikt om de specificiteit, positieve voorspellende waarde, negatieve voorspellende waarde en nauwkeurigheid van de gecombineerde diagnose van Doppler-echo en miR-362-3p te berekenen. De diagnostische resultaten tussen Doppler-echo en miR-362-3p omvatten waar-positief (a), vals-positief (b), vals-negatief (c) en echt-negatief (d). Rekenformule: Gevoeligheid = a / (a + c); Specificiteit = d / (d + b); Positieve voorspellende waarde = a / (a + b); Negatieve voorspellende waarde = d / (d + c); Nauwkeurigheid = (a + d) / (a + b + c + d). De drie diagnostische methoden (miR-362-3p, echografie en gecombineerde diagnose) werden uitgevoerd met behulp van de Pearson χ^2-test voor R×C-noodtabellen. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Het niveau van miR-362-3p was significant verlaagd bij borstkankerpatiënten

De klinische basisinformatie en klinische pathologische kenmerken van 182 borstkankerpatiënten en 147 patiënten met goedaardige borstlaesies werden vergeleken. De gedetailleerde gegevens werden samengevat in Tabel 1. De RT-qPCR werd gebruikt om de niveaus van plasma miR-362-3p in twee groepen patiënten te meten. De resultaten toonden aan dat de circule...

Discussie

Borstkanker is een van de meest voorkomende soorten kwaadaardige tumoren en wordt een groot volksgezondheidsprobleem dat de menselijke gezondheid^{bedreigt 19,20}. De hoge incidentie en sterftecijfers veroorzaken niet alleen ernstige psychische trauma's bij de families van de patiënten, maar vormen ook een enorme last op de samenleving en de economie. De meeste borstkankerpatiënten hebben op het moment van diagnose^...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (paarse dop)	USA	367861	Voor veneuze bloedopname en plasmavoorbereiding voor miRNA-analyse.
CFX96 Touch Real-Time PCR-detectiesysteem	Bio-Rad Laboratories	1855195	96-wells 6-kanaals fluorescentie kwantitatieve PCR-instrument, met optische vezelgeleiding en koude CCD-beeldvorming, met synchrone fluorescentiecollectie in elk putje zonder vertraging.Het dynamische bereik bereikt 10 ordes van grootte en het is compatibel met zowel conventionele qPCR als high-resolution melting curve (HRM) analyse.De software ondersteunt RDML-formaat export, is compatibel met zowel onderzoek als klinische testen, en wordt vaak gebruikt in experimenten zoals genexpressie kwantificering, SNP-typering en methylatieanalyse.
Kirgen 0,1 mL PCR-buisjes (of 8-strooks PCR-buisjes), steriele	Shanghai, China	KG0811	Gebaten voor het voorbereiden en uitvoeren van qPCR-reacties.
Kirgen 1,5 mL microcentrifugebuisjes, steriele	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Gebaten voor monsteropslag, reagentiavorbereiding en centrifugatie tijdens miRNA-extractie en reverse transcriptie.
miRcute miRNA-isolatiekit (spinkolom)	Beijing, China	DP501	Voor de isolatie en zuivering van totaal RNA inclusief miRNA uit humane plasmamonsters, met behulp van spinkolom-gebaseerde technologie.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA-kit	Beijing, China	KR211	Voor de reverse transcriptie van gezuiverde miRNA in first-strand cDNA via de poly(A)-tailing methode.
miRcute Plus miRNA qPCR-kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Voor kwantitatieve real-time PCR detectie van miRNA met behulp van SYBR Green I-gebaseerde chemie.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, Wit	Mannheim, Duitsland	4729692001	Gebaten voor kwantitatieve real-time PCR-assays op het Roche LightCycler 480 instrument.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Lineair Array-sonde	Siemens Healthineers	10041226	Hoge frequentie lineaire array-sonde, met een frequentiebereik van 5–14 MHz, speciaal ontworpen voor het onderzoek van oppervlakkige organen zoals de borst en schildklier. Het kenmerkt hoge resolutie en uitstekende weefselcontrast, en ondersteunt elastografie en automatische borstvolumescan.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000-echografiesysteem	Siemens Healthineers	/	Het kleuren Doppler-echografie-diagnosesysteem ondersteunt real-time 3D/4D beeldvorming en elasticiteitsbeeldvorming functies, en wordt veel gebruikt in meerdere afdelingen zoals buik, cardiovasculair, gynaecologie en verloskunde, en borst.
Veriti 96-wells Thermische Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	96-kanaals gradiënt PCR-instrument, ondersteunt gradiënt temperatuuroptimalisatie; heeft hoge temperatuurcontrole nauwkeurigheid; gebruikt voor cDNA-synthese en conventionele PCR-amplificatie.