Ontwikkeling van een celvrij COPII vesikelreconstitutieprotocol voor het onderzoeken van STING Sorting in een HEK-293 celgebaseerd systeem

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd celvrij systeem voor het reconstitueren van STING-incorporatie in COPII-vesikels, waardoor gecontroleerde biochemische analyse van het sorteren van lading tijdens de export van ER mogelijk wordt.

Samenvatting

Het cGAS–STING-pad is een centraal onderdeel van de aangeboren immuniteit. Bij activatie wordt het endoplasmatisch reticulum (ER)-resident eiwit STING verpakt in COPII-blaasjes en naar het Golgi-apparaat getransporteerd om downstream signalering te initiëren. Ondanks het belang van dit proces blijven de moleculaire mechanismen die STING-sortering in COPII-blaasjes bepalen onvolledig begrepen. Hier wordt een geoptimaliseerde workflow gepresenteerd voor de in vitro reconstitutie van COPII-vesikels om gecontroleerde analyse van vrachtkeuze te vergemakkelijken. Er wordt een schaalbare methode beschreven voor het bereiden van hooggeconcentreerd cytosol (30–40 mg/mL) uit HEK-293F suspensiecellen, gecombineerd met een eenvoudige procedure voor het genereren van semi-permeabiliseerde HEK-293T-cellen als gedefinieerde membraanbron. In vergelijking met traditionele adherent cel-gebaseerde systemen verbetert deze aanpak de schaalbaarheid, verlaagt de kosten en verhoogt de reproduceerbaarheid. Met STING als modellading worden COPII-vesikelknoppen en ladingincorporatie gevalideerd door Western blot-analyse, met een basale verpakkingsefficiëntie van ongeveer 20% onder gedefinieerde omstandigheden. Dit systeem maakt gecontroleerde manipulatie van biochemische parameters mogelijk, inclusief nucleotidestimulatie, om hun effecten op de ladingincorporatie te beoordelen. Dit protocol biedt een robuust en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van COPII-gemedieerde ladingsortering en kan worden uitgebreid om extra transmembraaneiwitten en regulerende factoren die betrokken zijn bij ER-export te bestuderen.

Inleiding

De cGAS-STING signaalweg dient als een fundamenteel mechanisme van het aangeboren immuunsysteem, waarbij cytosolisch dubbelstrengs DNA (dsDNA) wordt waargenomen om een antivirale respons te starten. Bij het detecteren van dsDNA produceert het enzym cGAS het cyclische dinucleotide cGAMP, dat fungeert als een tweede boodschapper die bindt aan de STING ^1,2. Cruciaal is dat STING zich bevindt als een inactief dimeer in het endoplasmatisch reticulum (ER) onder stationaire omstandigheden³. De activatie vereist een snelle, sterk gereguleerde translocatie van de ER naar het Golgi-apparaat. Het is bij de Golgi dat STING de downstream kinases TBK1 en IRF3 rekruteert en activeert, wat leidt tot de productie van type I interferonen en pro-inflammatoire cytokines⁴.

Het transport van STING wordt gemedieerd door COPII-gecoate blaasjes, de universele voertuigen voor eiwitexport vanuit de ER⁵. De assemblage van de COPII-mantel—bestaande uit de kleine GTPase Sar1, het binnenmantelcomplex Sec23/24 en het buitenmantelcomplex Sec13/31—is verantwoordelijk voor zowel het vervormen van het ER-membraan tot vesikels als het selectief rekruteren van lading ^6,7. Sec22b wordt gesorteerd in COPII-vesikels via een structureel epitoop dat wordt erkend door het Sec23/24-complex van COPII⁸. Andere ladingen zijn onder meer de p24-familie en de ERGIC-marker ERGIC-53, die beide afhankelijk zijn van een C-terminal dihydrofoob φC-motief voor het sorteren^{van 9}. Daarentegen blijven bepaalde ER-geankerde eiwitten, zoals ribofhorine I (RPN1), beperkt tot de ER en dienen ze als markers van intacte ER-structuren, omdat ze niet via COPII-blaasjes¹⁰ worden getransporteerd. Daarom worden Sec22b en p24 in celvrije COPII-vesikelreconstitutieexperimenten vaak beschouwd als COPII-ladingen, terwijl ribophorine dient als marker om ER-contaminatie in blaaspreparaten te monitoren. Hoewel de algemene machinekamer van COPII-transport goed is gekarakteriseerd, blijven de specifieke moleculaire aanwijzingen die de selectieve opslag van geactiveerde STING in deze blaasjes veroorzaken ongrijpbaar. Het begrijpen van deze sorteermechanismen is van vitaal belang, aangezien de ontregeling van het STING-transport in verband wordt gebracht met diverse auto-immuun- en autoinflammatoire ziekten, zoals STING-geassocieerde vasculopathie met aanvang in de zuigelingentijd (SAVI) en COPA-syndroom¹¹. Het bestuderen van deze vluchtige en zeer dynamische gebeurtenissen in intacte cellen blijft echter technisch uitdagend.

Om deze uitdagingen aan te pakken, werd een geoptimaliseerd celvrij reconstitutiesysteem ontwikkeld om de moleculaire eisen van COPII-gemedieerde ladingsortering te onderzoeken. Hoewel in vitro knopassays al lange tijd een vaste waarde zijn in celbiologie¹², wordt hun brede adoptie vaak beperkt door de hoge kosten en complexiteit van het bereiden van hoogwaardige componenten. In deze studie wordt een gestroomlijnde workflow geïntroduceerd die gebruikmaakt van HEK-293F suspensiecellen als een economische bron van actieve cytosol en semi-permeabiliseerde HEK-293T-cellen als robuuste membraandonor. De algemene workflow van het celvrije COPII-vesikelreconstitutiesysteem wordt geïllustreerd in Figuur 1. In dit systeem werd Sec22b gebruikt als positieve controle om de opname van lading in blaasjes te bevestigen, terwijl RPN1 werd gebruikt als negatieve controle om ER-membraanbesmetting te monitoren en uit te sluiten. Met STING als proof-of-concept-lading toonde deze studie aan dat het systeem essentiële biochemische aspecten van STING-sortering effectief modelleert. Dit platform bood een veelzijdig, schaalbaar hulpmiddel voor het identificeren van cytosolische factoren en membraansignalen die STING-sortering aansturen, met potentiële toepassingen voor het bestuderen van een breed scala aan andere vesiculaire transportroutes.

Protocol

De HEK-293F (RRID: CVCL_6642) en HEK-293T (RRID: CVCL_0063) cellijnen werden verkregen van het Cell Resource Center van het Peking Union Medical College. Beide cellijnen werden geauthenticeerd door short tandem repeat (STR) profilering en bevestigd vrij van mycoplasma-besmetting. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

Er waren geen menselijke deelnemers of gewervelde dieren betrokken bij deze studie. Daarom was ethische goedkeuring niet vereist. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.

1. Bereiding van HEK-293F-celcytosol

1. Zaad HEK-293F-cellen met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen/mL in een gedefinieerd zoogdierkweekmedium van 100 mL, aangevuld met 1% penicilline–streptomycine. Kwek de cellen in een 500 mL kegelvormige kolf.
2. Incubeer de suspensiecultuur bij 37 °C met 5% CO₂ in een schudincubator gedurende 60 uur.
3. Oogst de cellen door centrifugatie op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Bepaal het totale celnummer met behulp van een geautomatiseerde celteller.
4. Was de celpellet met 50 mL ijskoude fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS). Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
5. Sussief de celpellet opnieuw in een gelijk volume ijskoude B88-buffer (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM sorbitol; 150 mM kaliumacetaat; 5 mM magnesiumacetaat).
6. Lyseer de cellen op ijs door de ophanging door een 5 mL spuit te laten lopen die is uitgerust met een 22-gauge naald voor meer dan 100 slagen.
7. Onderzoek cellyse met lichtmicroscopie. Verwijder celresten door centrifugatie bij 20.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
8. Breng het supernatant over naar ultracentrifugebuizen. Centrifugeer op 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C.
   VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat ultracentrifugebuizen goed in balans zijn om schade aan apparatuur en veiligheidsrisico's te voorkomen.
9. Verzamel het geklaarde supernatantum. Concentreer het monster met een 3 kDa moleculair gewichtsafkap (MWCO) ultrafiltratieapparaat bij 4.000 × g bij 4 °C.
10. Meet de eiwitconcentratie met een bicinconininezuur (BCA) assay. Pas de concentratie aan naar 30–40 mg/mL.
    VOORZICHTIG: Behandel vloeibare stikstof met de juiste beschermingsmiddelen om cryogene schade te voorkomen.
11. Aliquot de cytosol. Vries de aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C (Figuur 2A)
    VOORZICHTIG: Vermijd meer dan twee vries-dooicycli. Bewaar aliquots tot 6 maanden op −80 °C.

2. Bereiding van semi-permeabiliseerde HEK-293T-cellen

1. Plaat-HEK-293T-cellen die volledige menselijke STING uitdrukken met een dichtheid van 3 × 10⁶ cellen per 15 cm schotel in 15 mL DMEM, aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline–streptomycine. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
2. Oogst de cellen bij ongeveer 60% confluentie.
3. Aspireer het medium en was de cellen twee keer met 10 mL ijskoude PBS.
4. Voeg 2 ml 0,25% trypsins–EDTA toe. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 2–3 minuten om de cellen los te maken.
5. Voeg 200 μL sojabonen-trypsinsemmer (1 mg/mL) toe om trypsinisatie te stoppen. Sussen de cellen opnieuw in een 10 mL ijskoude KHM-buffer (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM kaliumacetaat; 2 mM magnesiumacetaat).
6. Pellet de cellen door centrifugatie op 250 × g gedurende 3 minuten. Gooi het supernatant weg.
   VOORZICHTIG: Digitonine is giftig. Hanteer het in een dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
7. Suspendeer de cellen opnieuw in een 6 mL ijskoude KHM-buffer. Voeg 6 μL digitonine-bouillon toe (40 mg/mL in DMSO).
8. Meng voorzichtig door omkering. Broed 5 minuten op ijs.
9. Voeg 8 mL KHM-buffer toe om digitonine te verdunnen. Centrifugeer op 250 × g gedurende 3 minuten om permeabiliseerde cellen te verzamelen.
10. Sus de pellet opnieuw in een 14 mL ijskoude HEPES-buffer (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM kaliumacetaat). Broed 10 minuten op ijs.
11. Centrifugeer op 250 × g gedurende 3 minuten. Sus de pellet opnieuw in 1 mL ijskoude KHM· Cl-buffer (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Centrifugeer op 10.000 × g gedurende 15 seconden. Gooi het supernatant weg.
13. Suss de pellet opnieuw in 50 μL KHM· CL-buffer. Meet de eiwitconcentratie met een BCA-assay en pas aan op 5–7 mg/mL.

3. Cell-vrije COPII vesikelreconstitutie-experiment

1. Bereid alle reagentia voor die in de Materiaaltabel staan. Aliquot en bewaren bij −80 °C.
2. Bereid een 50 μL reactiemengsel met 110 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7,2), 2 mM MgCl₂, protease-remmercocktail (1×), 0,2 mM GTP en een ATP-regeneratiesysteem (40 mM creatinefosfaat, 0,2 mg/mL kreatinefosfhokinase, 1 mM ATP).
3. Voeg cGAMP toe aan een eindconcentratie van 10 μM. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
4. Voeg 50 μg semi-permeabiliseerde HEK-293T-cellen toe. Meng voorzichtig.
5. Voeg 80 μg HEK-293F cytosol toe om de vorming van een blaasje te initiëren. Bred 45 minuten uit bij 37 °C.
6. Leg de reactie op ijs om de knoppen te stoppen. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
7. Verzamel het supernatant met blaasjes. Houd de pellet met organellen vast.
8. Ultracentrifugeer het supernatant op 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C. Sussief de blaaspellet opnieuw in een 30 μL eiwitlaadbuffer.
9. Verwarm monsters op 95 °C gedurende 5 minuten. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 5 minuten om precipitaaten te verwijderen.
10. SDS-PAGE uitvoeren en eiwitten overdragen aan PVDF-membranen. Probeer met antistoffen tegen Sec22b, STING en RPN1.

Resultaten

Tijdens de voorbereiding van HEK-293F celcytosol werden twee parameters geëvalueerd om de cytosolkwaliteit te beoordelen. HEK-293F-cellen werden op hoge dichtheid gekweekt, wat cytosolische extracten met hoge eiwitconcentraties opleverde. Daarnaast werd de mate van celverstoring na spuitgebaseerde lyse beoordeeld met lichtmicroscopie, wat efficiënte cellyse onder de toegepaste omstandigheden bevestigde (Figuur 2B).

Voor de generat...

Discussie

De reconstructie van essentiële biochemische reacties in vitro heeft de basis gelegd voor celvrije systemen, die een belangrijke rol hebben gespeeld in talrijke baanbrekende ontdekkingen. Deze omvatten de identificatie van cGAS als cytosolisch DNA-sensor^14,15, de opheldering van de rol van cytochroom c bij apoptose, en de ontdekking van de eerste histondemethylase, JHDM1^16,17

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5 mL steriele spuiten	WEGO	V526273	Gebaten voor mechanische cel lysis
Adenosine 5'-trifosfaat (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM stock in water, pH 7,3, opgeslagen bij −80 °C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Gebaten voor het maken van conceptuele illustraties en schematische diagrammen
ATP regeneratiesysteem (10x)	—	—	Energie-regenererend mengsel met creatinefosfaat, creatinekinase en ATP
BCA-eiwitanalysekit	Thermo Fisher	23227	Colorimetrische eiwitanalyse
BioRender	BioRender	SCR_018361	Gebaten voor het maken van conceptuele illustraties en schematische diagrammen
BSA	Biorigin	BN20815	Blocking reagens
Koolstofdioxide schudende incubator	ZhiChu	ZCZY-CS8	Onderhoudt temperatuur, CO2 en agitatie voor suspensiecultuur
CO2 incubator	Thermo Fisher	3110	Onderhoudt temperatuur en CO2 voor adhesieve cultuur
Conventionele microscoop	Olympus	CX43	Gebaten om cel lysis en morfologie te beoordelen
Creatinekinase	Roche	CKRO	20 mg/mL stock in buffer, opgeslagen bij −80 °C
Creatinefosfaat	Roche	CRPHO-RO	Onderdeel van ATP regeneratiesysteem
Bureaucentrifuge	Eppendorf	5810R	Gebaten voor lage snelheidscentrifugatie
Digitonin	Sigma	D5628	40 mg/mL stock in DMSO, opgeslagen bij −20 °C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Groeimedium voor HEK-293T cellen
D-Sorbitol	Sangon	A100691	1 M stockoplossing in water, opgeslagen bij 4 °C
ECL detectiereagens	Biorigin	BN16009	Chemiluminescerende substraat
Elektroforesetank	Bio-Rad	1658001	Apparatuur voor SDS-PAGE
Foetaal bovien serum (FBS)	Corning	35-015-CV	Serum supplement
Roterende rotor (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotor voor ultracentrifugatie
FreeStyle 293-F cellen	Thermo Fisher	R79007	Gebaten voor cytosol bereiding
Geit anti-muis IgG (H+L)	Invitrogen	31430	HRP-geconjugeerd secundair antilichaam
Geit anti-konijn IgG (H+L)	Invitrogen	31460	HRP-geconjugeerd secundair antilichaam
GraphPad Prism	GraphPad Software	SCR_002798	Gebaten voor het uitvoeren van statistische analyse (one-way ANOVA) en het genereren van de kwantitatieve staafgrafiek in Figuur 4D.
Guanosine 5'-trifosfaat (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM stock in water, pH 7,3, opgeslagen bij −80 °C
HEK-293T cellen die humaan STING tot expressie brengen	—	—	In eigen huis gegenereerd; gebruikt als membraanbron
HEPES buffer (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Buffercomponent voor oplossingsvoorbereiding
Beeldvormingssysteem	Bio-Rad	12003153	Gebaten voor signaaldetectie
Magnesiumacetaat tetrahydraat	Hampton Research	HR2-561	Buffercomponent voor B88 voorbereiding
Magnesiumchloride hexahydraat	Hampton Research	HR2-559	Buffercomponent
Microcentrifuge	Eppendorf	5420R	Gebaten voor middelsnelheidscentrifugatie
Microcentrifuge	Eppendorf	5420	Gebaten voor routine centrifugatie
NanoDrop spectrofotometer	Thermo Fisher	840-317400	Gebaten voor eiwitkwantificering
OPM-CD Trans293 medium	OPM	P82019	Serum-vrij medium voor HEK-293F suspensiecultuur
Penicilline-streptomycine (100x)	Servicebio	G4003	Antibioticumsupplement voor celcultuur
Fenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF)	Sangon	A610425	Proteïne remmer
Fosfatase remmers	Lablead	C0104	Voorkomt eiwit defosforylering
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Servicebio	G4202	Buffer voor celwassing
Kaliumacetaat	Sigma	236497	1 M stockoplossing in water, opgeslagen bij 4 °C
Voeding	Bio-Rad	1645052	Zorgt voor spanning voor elektroforese
Proteïneremmercocktail, EDTA-vrij	Roche	4693132001	Breed-spectrum proteïneremmermengsel
PVDF membraan	Millipore	ISEQ00010	Membraan voor Western blotting
RPN1 antilichaam (konijn mAb)	Abcam	ab197888	ER marker
SDS-PAGE gel (4-20%)	—	—	Gebaten voor eiwitscheiding
SDS-PAGE laadbuffer (5x)	Solarbio	P1040	Eiwitmonstervoorbereidingsbuffer
Sec22b antilichaam (konijn mAb)	Abcam	ab181076	COPII cargo marker
Sojaboon trypsineremmer (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL stock in PBS, opgeslagen bij −20 °C
STING antilichaam (konijn mAb)	CST	13647	Primair antilichaam
TBST buffer	Servicebio	G0004	Wasbuffer voor immunoblotting
Thermische cycler	Bio-Rad	186-1096	Gebaten voor verwarming en incubatie
Thermostaat metaalbad	DLAB	5062102100	Onderhoudt constante temperatuur
Transfer