Immunofluorescentie-gebaseerde assay voor detectie van nucleaire RAD51-foci als marker van homologe recombinatieherstel in eierstokkankercellen

Samenvatting

RAD51 nucleaire brandpunten zijn een marker van homologe recombinatie (HR) activiteit. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige immunofluorescentiemethode om deze foci in kankercellen te detecteren, waardoor de HR-functie kan worden beoordeeld en preklinisch onderzoek naar responsen op DNA-schadelijke middelen wordt ondersteund.

Samenvatting

RAD51 is een centraal eiwit in de homologe recombinatie (HR) route en is essentieel voor de nauwkeurige reparatie van DNA-dubbelstrengbreuken (DSB's). Na de vorming van DSB genereert DNA-eindresectie enkelstrengige DNA-substraten die de rekrutering en assemblage van RAD51-nucleoproteïnefilamenten op beschadigingsplaatsen vergemakkelijken. Dit proces resulteert in de vorming van discrete nucleaire RAD51-foci, die dienen als een algemeen geaccepteerde functionele weergave van HR-activiteit en als surrogaatmarker voor HR-vaardigheid. Omdat defecten in HR vaak voorkomen bij verschillende maligniteiten, met name eierstok- en borstkanker, is de beoordeling van de vorming van RAD51-foci een belangrijke benadering geworden voor het evalueren van DNA-reparatiecapaciteit en het voorspellen van de respons op DNA-schadelijke therapieën, waaronder platinaverbindingen en poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmers, waarvan de werkzaamheid sterk wordt beïnvloed door de HR-herstelstatus. Dit manuscript beschrijft een eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar immunofluorescentie-gebaseerd protocol voor de detectie en kwantificering van RAD51-nucleaire foci in gekweekte eierstokkankercellen. De methode omvat het inductie van DNA-schade door ioniserende straling (IR), gevolgd door fixatie, immunokleuring met antilichamen tegen RAD51 en γH2AX, confocale microscopie en handmatige kwantitatieve analyse van RAD51/γH2AX co-gelokaliseerde brandpunten. Het protocol kan worden toegepast onder basale omstandigheden of na genetische en farmacologische verstoringen om hun effecten op de HR-functie te bepalen. Representatieve resultaten tonen een robuuste inductie van RAD51-foci in HR-vaardige eierstokkankercellen na DNA-schade, terwijl RAD51-depletie de focivorming aanzienlijk vermindert ondanks vergelijkbare niveaus van DSB's, wat de assayspecificiteit bevestigt. Al met al biedt dit protocol een robuuste en reproduceerbare functionele assay voor het beoordelen van HR-competentie, met brede toepassingen in preklinisch en mogelijk translationeel kankeronderzoek.

Inleiding

DNA-dubbelstrengbreuken (DSB's) behoren tot de ernstigste vormen van DNA-schade omdat onnauwkeurige reparatie de genoomstabiliteit kan aantasten en kan bijdragen aan tumorontwikkeling of celdood ^1,2,3. Om deze bedreigingen tegen te gaan, maken cellen gebruik van verschillende DNA-reparatieroutes, waaronder homologe recombinatie (HR), die wordt beschouwd als het meest nauwkeurige mechanisme voor het herstellen van DSB's ^2,4,5. In tegenstelling tot foutgevoelige herstelroutes gebruikt HR een homologe DNA-sequentie als sjabloon om genetische informatie op de beschadigde plaats te herstellen. Daardoor functioneert HR voornamelijk tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus, wanneer zusterchromatiden beschikbaar zijn om als reparatietemplates ^2,5 te dienen. Opmerkelijk is HR essentieel voor de nauwkeurige reparatie van DSB's die voortkomen uit endogene bronnen zoals replicatiestress, evenals exogene beledigingen zoals ioniserende straling (IR) en DNA-schadelijke chemotherapeutische middelen^2,5.

RAD51 is een centrale effector van het HR-pad en speelt een cruciale rol bij homologiezoektocht en strenginvasie tijdens HR-gemedieerde reparatie van DSB's ^2,5. Na de vorming van DSB ondergaan DNA-uiteinden een resectie, een proces dat wordt geïnitieerd door het MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) complex en bijbehorende factoren die 3′ enkelstrengige DNA-overhangen genereren. Deze enkelstrengige gebieden worden aanvankelijk bedekt met replicatieproteïne A (RPA), dat secundaire structuurvorming voorkomt en het reparatieintermediair ^4,5,6 stabiliseert. HR wordt vervolgens geïnitieerd door de gecoördineerde acties van BRCA1, PALB2 en BRCA2, die de rekrutering en lading van RAD51 op geremd DNA faciliteren, RPA verplaatsen en de vorming van RAD51-bevattende nucleoproteïnefilamenten ^4,5,6 bevorderen. Eenmaal samengesteld, zoeken deze filamenten naar homologe DNA-sequenties binnen de zusterchromatide en katalyseren ze de uitwisseling van strengen, waardoor het beschadigde DNA ^4,5,6 getrouw hersteld is. De ophoping van RAD51 op DSB-locaties verschijnt microscopisch als puntvormige nucleaire foci die kunnen worden gedetecteerd door immunofluorescentie 7,8,9,10. Omdat de vorming van deze brandpunten een succesvolle inzet van de HR-machine weerspiegelt, is RAD51-foci-analyse een veelgebruikte functionele benadering geworden voor het evalueren van de HR-capaciteit en DNA-reparatievaardigheid in cellen 7,8,9,10. Belangrijk is dat deze assay het vermogen van cellen meet om een HR-respons uit te voeren na DNA-schade, in plaats van uitsluitend te vertrouwen op expressieniveaus van HR-geassocieerde genen of eiwitten.

Defecten in HR worden vaak waargenomen bij kanker, met name bij tumoren die veranderingen bevatten in BRCA1, BRCA2, RAD51-paralogen of andere genen die betrokken zijn bij HR, en komen vooral voor bij eierstok- en borstkanker 4,11,12,13,14. HR-tekort heeft belangrijke therapeutische implicaties, omdat het verhoogde gevoeligheid geeft voor DNA-schadelijke middelen zoals platinumtherapie en poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)remmers via het principe van synthetische dodelijkheid 4,11,12,13,14,15 . Daarom zijn betrouwbare functionele assays om HR-activiteit te beoordelen cruciaal voor zowel mechanistische studies als translationeel onderzoek.

Dit protocol beschrijft een immunofluorescentie-gebaseerde test voor de detectie en kwantificering van nucleaire RAD51-foci na DNA-schade in eierstokkankercellen. De workflow omvat de inductie van DNA-DSB's met IR, gevolgd door immunofluorescentiedetectie van RAD51 en γH2AX en kwantificering van co-gelokaliseerde nucleaire foci met confocale microscopie. Het protocol wordt aangetoond met behulp van HR-vaardige OVCAR-8-cellen en verkregen PARP-remmerresistenteABT R2-cellen en biedt een reproduceerbare functionele benadering voor het beoordelen van HR-activiteit na DSB-vorming. Hoewel RAD51-foci-analyse veel wordt gebruikt als functionele maat voor HR-activiteit, richten beschikbare methoden zich vaak op specifieke experimentele settings en ontbreken ze vaak gedetailleerde richtlijnen voor het integreren van gecontroleerde DNA-schade-inductie, bevestiging van DNA-DBS-vorming, assayvalidatiecontroles en gestandaardiseerde beeldgebaseerde kwantificatie. Daarnaast bieden alternatieve benaderingen voor het evalueren van HR-functie, waaronder genomische littekenassays, mutatiesignaturen en gen- of eiwitexpressie-analyses, indirecte metingen van de HR-status en beoordelen ze niet direct de cellulaire capaciteit om RAD51 te rekruteren naar DNA-schadeplaatsen. Rapportagetests zoals DR-GFP bieden directe metingen van de harthartactiviteit, maar vereisen stabiele genetische engineering en zijn niet gemakkelijk toepasbaar op veel experimentele modellen. Daarom combineert de hier beschreven workflow IR-geïnduceerde DNA-schade met dubbele RAD51/γH2AX immunofluorescentiekleuring om tegelijkertijd de vorming van DSB te verifiëren en de rekrutering van RAD51 naar beschadigde chromatine te kwantificeren. Deze aanpak biedt een praktische, biologisch relevante en breed toepasbare methode voor directe functionele beoordeling van HR-competentie in gekweekte kankercellen, waarbij assaycontroles, validatiestappen en gestandaardiseerde foci-kwantificatieprocedures worden geïntegreerd.

Protocol

Alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel, inclusief fabrikantinformatie, catalogusnummers en antistofverdunningen. Een overzicht van het protocol is te zien in Figuur 1.

OPMERKING: De eierstokkankercellijnen OVCAR-8 en ABT^R2 worden in dit protocol gebruikt en zijn eerder beschreven^{als 15,16,17,18,19,20}. OVCAR-8-cellen werden vriendelijk geleverd door Dr. Larry Karnitz (Mayo Clinic), die ze oorspronkelijk ontving van Dr. Dominic Scudiero (National Cancer Institute, NIH). De ABT^R2-cellen werden vriendelijk verstrekt door Dr. Scott Kaufmann (Mayo ^Clinic). ABT^R2 is een PARPi-resistente afgeleide van de BRCA2.-gemuteerde eierstokkankercellijn PEO1 die resistentie verwierf door herstel van BRCA2-expressie. Omdat BRCA2-herstel de laad- en hartslagactiviteit van RAD51 heeft hersteld, dienen ABT^R2-cellen als een representatief HR-bekwaam model. De identiteit van de cellijn werd geverifieerd op basis van bronherkomst en vastgestelde kenmerken die in de literatuur 15,16,17,18,19,20 worden gerapporteerd. Experimenten werden uitgevoerd met cellen met lage doorgang (passages 3–12) die niet langer dan 1 maand na ontdooien in cultuur werden gehouden. Cellijnen werden routinematig elke 6 maanden getest op mycoplasma-besmetting met behulp van een mycoplasma-detectiekit, en alle culturen die in deze studie werden gebruikt, bleken mycoplasmavrij te zijn.

VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en moet worden voorbereid en behandeld met een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Menselijk afgeleide cellijnen moeten worden behandeld volgens institutionele bioveiligheidsprocedures met passende containmentpraktijken. Triton X-100, bevestigingsmateriaal en nagellak moeten worden behandeld volgens de veiligheidsaanbevelingen van de fabrikant. IR moet uitsluitend worden uitgevoerd door getraind personeel en in overeenstemming met institutionele stralingsveiligheidsbeleid. Verwijder chemisch, biologisch en stralingsgerelateerd afval volgens lokale institutionele en regelgevende vereisten.

1. Celkweek en onderhoud

1. Kweekcellen in het groeimedium van het Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 werd aangevuld met 8% foetaal runderenserum in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂.
   OPMERKING: Deze kweekcondities zijn consistent met die gebruikt in onze eerdere studies van OVCAR-8 en ABT^R2 cellen 15,16,17,18,19. Onder deze omstandigheden vertonen beide cellijnen robuuste groei en reproduceerbare DNA-schaderesponsfenotypen.
2. Indien gewenst, voer verstoringen uit (bijv. gen-knockdown/knockout), volgens geoptimaliseerde experimentele voorwaarden ^15,17.
   OPMERKING: In dit protocol wordt siRNA-gemedieerde knockdown van RAD51. gegeven als een representatief voorbeeld van genverstoring voorafgaand aan immunofluorescentieanalyse.
   1. Bereid 5 × 10^{6 cellen} voor in 180 μL RPMI-1640 medium, aangevuld met 8% foetaal rundserum.
   2. Voeg 20 μL 20 μM siRNA-oplossing toe (2 μM siRNA per transfection) en meng voorzichtig.
      OPMERKING: Gebruik de volgende siRNA's: Non-targeting control luciferase siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Alle siRNA's werden gekocht van Horizon Discovery.
   3. Breng de celophanging over op een 4 mm elektroporatiecuvet.
   4. Elektroporaatcellen gebruiken een BTX ECM 830 elektroporator met twee pulsen van 10 ms bij 280 V.
   5. Breng de cellen over naar het volledige groeimedium en incubeer onder standaard kweekomstandigheden in een schaal van 10 cm gedurende 24 uur.
   6. Herhaal de siRNA-elektroporatie onder dezelfde voorwaarden als beschreven in stappen 1.2.1–1.2.4.
   7. Incubeer de cellen onder standaard kweekomstandigheden in een schaal van 15 cm gedurende nog eens 48 uur.
   8. Zaad een deel van de cellen uit voor de immunofluorescentietest zoals beschreven in Stap 2. Reserveer de resterende cellen voor RAD51 knockdownvalidatie door immunoblotting.
   9. Valideer RAD51 knockdown door immunoblotting
      1. Lysecellen in ijskoude lysebuffer met 50 mM HEPES (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM β-glycerofosfaat en protease-remmercocktail (1 tablet per 10 mL lysisbuffer).
      2. Klaren de lysaten door centrifugatie bij 18.800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een verse microcentrifugebuis en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een geschikte eiwitassay.
      3. Meng een geschikte hoeveelheid eiwitlysaat met een 4× Laemmli-monsterbuffer om een uiteindelijke concentratie van 1× te bereiken.
      4. Voeg β-mercaptoethanol toe aan een eindconcentratie van 20%, en verwarm de monsters 12 minuten op 95 °C voorafgaand aan SDS-PAGE.
      5. Scheid gelijke hoeveelheden eiwit met SDS-PAGE en breng eiwitten over naar een geschikt membraan voor immunoblotanalyse.
      6. Blokkeer het membraan 30 minuten bij kamertemperatuur in 5% melk met schudden.
      7. Was het membraan drie keer (5 minuten per stuk) met 1× tris-buffer zoutoplossing met tween 20 (TBST) op kamertemperatuur en schud.
      8. Incubeer het membraan met een konijnenpolyklonaal anti-RAD51-antilichaam (1:1.000 verdunning) of anti-ACTINE-antilichaam (1:1000 verdunning) bij 4 °C gedurende 16–18 uur met schudden.
      9. Was het membraan met 1× TBST (5 minuten per stuk) op kamertemperatuur met schudden.
      10. Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde anti-konijn- of anti-muis IgG-secundaire antistof (1:10.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden.
      11. Was het membraan met 1× TBST (5 minuten elk) bij kamertemperatuur met schudden, detecteer immunoreactieve banden met een geschikte chemiluminescentiedetectiemethode, en bevestig de RAD51-depletie ten opzichte van cellen die zijn getransfecteerd met het niet-doelgerichte controle-siRNA.

2. Celzaaiing

1. Wanneer cellen de logaritmische groeifase bereiken (ongeveer 70–80% confluentie), aspireer dan het kweekmedium en was de cellen voorzichtig één keer met steriele fosfaatgereserveerde zoutoplossing (PBS) om restserum te verwijderen.
2. Voeg voldoende 0,25% trypsine–EDTA-oplossing toe om de celmonolaag te bedekken (bijv. 1–2 mL per T175-kolf) en incubeer bij 37 °C gedurende 2–5 minuten, waarbij celloskoppeling onder een microscoop wordt gemonitord.
3. Zodra de cellen zijn losgelaten, neutraliseer je de trypsine onmiddellijk door een gelijk volume compleet kweekmedium met FBS toe te voegen.
4. Verzamel de celsuspensie in een 15 mL kegelvormige buis
5. Bepaal de levensvatbaarheid en concentratie van cellen met behulp van trypan blue exclusion en een hemocytometer of geautomatiseerde celteller voordat je zaait.
6. Bereid een single-cell suspension voor in complete groeimedium met een concentratie van 4 × 10⁴ cellen/mL.
7. Zaad 200 μL van de cel in elke put van een glaskamerglijbaan met 8 putten om een uiteindelijke dichtheid van 8.000 cellen per put te bereiken.
8. Incubeer de kamerslides 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂ om celhechting mogelijk te maken.
   OPMERKING: Het aantal cellen dat wordt gezaaid kan variëren afhankelijk van het celtype. Bereid een overtollige celsuspensie voor die voldoende is voor ten minste één extra put om rekening te houden met de variabiliteit van pipetteren. Zaad elke conditie in dubbele of meer om reproduceerbaarheid te garanderen. Als farmacologische modulatie van de hartslag gewenst is, moeten cellen worden behandeld na een nachtelijke hechting (12–16 uur na het zaaien). De zaaidichtheid moet indien nodig worden aangepast om ervoor te zorgen dat cellen de juiste confluentie bereiken op het moment van behandeling en downstream analyse, rekening houdend met de verwachte effecten van het farmacologische middel op celproliferatie of levensvatbaarheid. Omdat HR voornamelijk voorkomt tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus, onderhoud je culturen in logaritmische groei en voorkom overconfluentie. Voor experimenten met behandelingen die de celcyclusprogressie kunnen veranderen, kunnen EdU-opname, DNA-inhoudsanalyse of andere celcyclusmetingen worden uitgevoerd om de interpretatie van RAD51-fociresultaten te vergemakkelijken. Neem onbehandelde (–IR) en bestraalde (+IR) controles op in elk experiment om respectievelijk basale en DNA-schade-geïnduceerde RAD51-focivorming vast te stellen. Bij het uitvoeren van siRNA-gemedieerde verstoringen moet niet-doelgericht controle-siRNA (bijv. siLUC) en doelspecifieke siRNA-condities (bijv. siRAD51) worden opgenomen. Controles zonder primaire antistoffen en zonder secundaire antistoffen worden aanbevolen tijdens antistofoptimalisatie om niet-specifieke kleuring en achtergrondfluorescentie te beoordelen.

3. Inductie van DNA-schade door IR

1. Cellen op de kamerglijden worden blootgesteld aan IR bij een dosis van 6 Gy²¹ om DNA-DSB's op te wekken.
2. Plaats de glaasjes onmiddellijk terug in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂.
3. Incubeer de cellen 6 uur na de IR.
   OPMERKING: IR werd geleverd met een RS-2000 Biological Irradiator die werkte op 160 kV en 25,0 mA (plankpositie 5). Cellen werden bij kamertemperatuur bestraald met een enkele dosis van 6 Gy (ongeveer 4,8 Gy/min) en direct teruggebracht naar een incubator van 37 °C met 5% CO₂ voor herstel. De bestraler werd routinematig gekalibreerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant en alle procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor stralingsveiligheid. De 6 uur post-IR incubatie is eerder vastgesteld^als 15,17,22. De optimale timing kan variëren per celtype en moet voor elke cellijn worden geoptimaliseerd.

4. Fixatie en permeabilisatie

1. Aspireer voorzichtig het kweekmedium uit de wells zonder de cellen te verstoren.
2. Fixeer de cellen met vers bereide 3% paraformaldehyde in 1× PBS gedurende 12 minuten op kamertemperatuur.
3. Aspireer voorzichtig het fixatiemiddel en was de putten drie keer met 500 μL van 1× PBS per put.
4. Permeabiliseer cellen met 0,2% Triton X-100 in 1× PBS gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was de putten drie keer met 1× PBS.
   OPMERKING: Voer fixatie-, permeabilisatie- en wasstappen voorzichtig uit door oplossingen langs de wand van elke put toe te voegen en te verwijderen om celloslating te minimaliseren. Tenzij anders aangegeven, gebruik 500 μL 1× PBS per was.

5. Blokkeren

1. Maak een blokkerende oplossing door 5% (w/v) rundse serumalbumine (BSA) op te lossen in 1× PBS.
2. Incubeer de cellen in blokkerende oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur om de binding van niet-specifieke antistoffen te verminderen.

6. Primaire antilichaamincubatie

1. Verwijder de blokkerende oplossing en was de cellen drie keer met 1× PBS.
2. Bereid primaire antilichamen voor met passende verdunning in blokkerende oplossing. Konijn polyklonale anti-RAD51 (1:1000) en muis monoklonale antifosfo-histon H2AX (γH2AX) (1:1000) antilichamen worden gebruikt, waarbij γH2AX dient als marker voor DSB's^23,24.
3. Voeg 100 μL verdunde primaire antilichaamoplossing toe aan elke put.
4. Incubeer de glaasjes op kamertemperatuur gedurende 16–18 uur in een bevochtigde kamer om verdamping te voorkomen.
   OPMERKING: De twee primaire antilichamen kunnen in dezelfde oplossing worden gecombineerd voor gelijktijdige kleuring.

7. Secundaire antistofincubatie

1. Bereid secundaire antilichamen voor bij passende verdunning in blokkerende oplossing. Alexa Fluor 488-geconjugeerde geitenanti-konijn IgG (1:350) wordt gebruikt om RAD51 te detecteren, en Alexa Fluor 594 geconjugeerde geiten-anti-muis IgG (1:350) wordt gebruikt om γH2AX te detecteren.
2. Aspiraat de primaire antistofoplossing en was de cellen drie keer met 1× PBS.
3. Voeg 100 μL verdunde secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put.
4. Incubeer slides 1 uur op kamertemperatuur in het donker.
   OPMERKING: De twee secundaire antilichamen kunnen worden gecombineerd voor gelijktijdige detectie. Vanaf dit gedeelte voert u alle stappen uit in een lichtbeschermde ruimte om fotobleaching te minimaliseren.

8. Nucleaire tegenkleuring en opbouw

1. Bereid Hoechst 33342-oplossing voor met een verdunning van 1:1.000 in 1× PBS om de kernen te kleuren.
2. Aspireer de secundaire antistofoplossing en was cellen één keer met 1× PBS.
3. Incubeer cellen met verdunde Hoechst 33342-oplossing gedurende 90 seconden bij kamertemperatuur.
4. Aspiraat de Hoechst 33342-oplossing en was cellen drie keer met 1× PBS.
5. Verwijder de 1× PBS en haal de bovenste kamer los van de glazen slides, en voeg ongeveer 25 μL antifade montage toe aan elke put.
6. Plaats glazen dekmantels over de gemonteerde cellen, zodat je gelijkmatig contact met de monteur hebt.
7. Verwijder luchtbellen voorzichtig en sluit de randen af met nagellak.
   OPMERKING: Nucleaire tegenkleuring biedt een referentie voor kernen, waardoor nauwkeurige lokalisatie en kwantificering van nucleaire RAD51- en γH2AX-brandpunten mogelijk is.

9. Beeldvorming en kwantificatie van RAD51-brandpunten bij DSB's

1. Beelddia's worden direct getoond of opgeslagen bij 4 °C in een diadoos in het donker tot analyse.
   OPMERKING: Om mogelijke signaalverslechtering en fotobleaching te minimaliseren, maak beelden zo snel mogelijk, bij voorkeur binnen een week na montage.
2. Maakt beelden met een confocale microscoop met geschikte laserlijnen en filtersets: Hoechst 33342 (405 nm) voor kernen, Alexa Fluor 488 (488 nm) voor RAD51, en Alexa Fluor 594 (561/594 nm) voor γH2AX.
3. Voer confocale beeldvorming uit met een objectief met hoge vergroting dat geschikt is voor het oplossen van subcellulaire structuren.
4. Kwantificeer handmatig RAD51-brandpunten door discrete nucleaire brandpunten te tellen die co-lokaliseren met γH2AX; sluit brandpunten uit die niet co-gelokaliseerd zijn met γH2AX.
   OPMERKING: Valideer de antilichaamprestaties vóór kwantitatieve analyse door IR-geïnduceerde RAD51- en γH2AX-nucleaire foci in controlecellen en het verminderde RAD51-signaal na RAD51 siRNA-behandeling te bevestigen. Kwantificeer alleen discrete nucleaire RAD51-foci die co-lokaliseren met γH2AX in kernen met intacte morfologie en duidelijke kleurpatronen; sluit diffuse of niet-nucleaire kleuring, niet-colokaliseerde RAD51-signalen, overlappende of multinucleaire cellen, mitotische cellen en apoptotische cellen uit. Houd identieke beeldvormingsinstellingen binnen elk experiment en pas consistente handmatige scorecriteria toe voor alle omstandigheden. Analyseer ~50 kernen per conditie vanuit meerdere gezichtsvelden voor elke biologische replicatie en voer minstens drie onafhankelijke biologische replicaties uit. Rapporteer het aantal RAD51/γH2AX co-gelokaliseerde brandpunten per kern met behulp van een passende statistische analyse.

10. Statistische analyse

1. Kwantificeer RAD51/γH2AX co-gelokaliseerde brandpunten uit ongeveer 50 kernen per conditie.
2. Presenteer gegevens als gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke biologische replicata.
3. Voer statistische vergelijkingen uit met een geschikte statistische test (bijvoorbeeld een ongepaarde tweezijdige Student's t-test voor tweegroepsvergelijkingen of een eenrichtings-ANOVA voor meervoudige groepenvergelijkingen)
4. Beschouw p. < 0,05 als statistisch significant.
5. Voer statistische analyses uit en genereer grafieken met behulp van GraphPad Prism (versie 10.6.1).

Resultaten

IR induceert de vorming van RAD51-foci bij DNA-DSB's in OVCAR-8-cellen
Om de HR-activiteit functioneel te evalueren, werd de vorming van RAD51-foci onderzocht in HR-vaardige OVCAR-8 eierstokkankercellen na inductie van DNA DSB's door IR. Om assayspecificiteit vast te stellen en te bevestigen dat waargenomen foci bona fide RAD51-afhankelijke HR-gebeurtenissen vertegenwoordigen, werden cellen getransfecteerd met ofwel niet-doelgericht controle-luciferase siRNA ...

Discussie

De immunofluorescentie-gebaseerde detectie van nucleaire RAD51-foci zoals hier beschreven biedt een betrouwbare en functionele benadering om de HR-activiteit te beoordelen in gekweekte eierstokkankercellen. In tegenstelling tot genomische of transcriptomische analyses die HR-status indirect afleiden, weerspiegelt de vorming van RAD51-foci direct het vermogen van de cel om de kern-HR-machinerie te rekruteren en samen te stellen op locaties van DNA-DSB's. Als zodanig dient deze assay als e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Resolveerende gel voor SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Stacking gel voor SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Wordt gebruikt om aderente cellen los te maken tijdens routinepassagering en vóór het zaaien van cellen.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Verdund tot 1× en gebruikt voor wasstappen, blokkeeroplossing, antilichaamverdunningen, fixatie en permeabilisatie.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Lopen naar eiwitmonster in de gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Overdracht van het eiwit van de gel naar de membraan
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Voor SDS-PAGE
ABTR2 cellen	Mayo Clinic	NA	Gekochte PARPi-resistente ovariële kankercellijnen
AKT Lysis Buffer Recept (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerofosfaat, 10 μg/mL leupeptine, 5 μg/mL aprotinine, 5 μg/mL pepstatine en 20 mM microcystine-LR.	Home-made	NA	Cellysis buffer
Ammonium Persulfaat	Bio-Rad	16107000	Molecuulaire biologie als polymerisatie voor gels en oxidatiemiddel gebruikt als vrij-radikale initiator
Anti-phospho-Histon H2A.X (Ser139) Antilichaam, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Primair antilichaam gebruikt om γH2AX foci te detecteren. Gebruikt bij een verdunning van 1:1000
Anti-Rad51 (Ab-1) Konijn pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Primair antilichaam gebruikt om RAD51 nucleaire foci te detecteren als marker voor homologe recombinatieactiviteit. Gebruikt bij een verdunning van 1:1000
Bovine serum albumine Protease vrij	GoldBio	A-420-250	Wordt gebruikt om blokkeeroplossing (5% BSA in PBS) te bereiden om niet-specifieke antilichaambrenging tijdens immunofluorescentiekleuring te verminderen.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Beeldvormingssysteem
Confocale Laser Scanning Microscoop	ZEISS	Zeiss LSM 780	Immunovoluminescentiebeeldvorming, γH2AX foci-analyse, RAD51 foci-kwantificering, eiwitco-lokalisatie en 3D-beeldacquisitie
Countess II FL Geautomatiseerde Celteller	Life Technologies	AMQAF1000	Geautomatiseerde celteller
Dekglasjes	Cardinal Health	M6045-10A	Geplaatst over gemonteerde monsters om gekleurde cellen te beschermen en hoge resolutie beeldvorming mogelijk te maken.
ECM 830 Square Wave Elektroporatiesysteem	Hbio-BTX	45-2052	Elektroporatiesysteem geschikt voor toepassingen voor genoverdracht in zoogdiercellen
Foetaal bovien serum	Corning	35-010-CV	Toegevoegd aan RPMI-1640 (als 8%) om celgroei en levensvatbaarheid te ondersteunen.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Geit anti-Muis IgG (H+L) Zeer Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secundair antilichaam gebruikt om γH2AX primair antilichaam te detecteren. Gebruikt bij een verdunning van 1:350
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Zeer Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Secundair antilichaam gebruikt om RAD51 primair antilichaam te detecteren. Gebruikt bij een verdunning van 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	versie 10.6.1	Statistische analyse, grafiekgeneratie en gegevensvisualisatie.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	PH-beheerbuffer in het pH 7.2-7.6 bereik
Hoechst 33342 oplossing (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	Werd gebruikt voor nucleaire kleuring
Horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-muis immunoglobuline G	Cell Signaling Technology	7076S	Secundair antilichaam gebruikt voor detectie van muis (β-actine) primair antilichaam in Western blotting.
Horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-konijn immunoglobuline G	Cell Signaling Technology	7074S	Secundair antilichaam gebruikt voor detectie van konijn primair antilichaam (RAD51) in Western blotting.
Instant non-fat droge melk	Hyvee	G461A323	Blokkader
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Sample Buffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detectie Assays	Lo