Een kosteneffectieve workflow voor mono- en multiplex immunofluorescentie in adherente tweedimensionale celculturen op glazen dekglasjes

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve workflow voor mono- en multiplex immunofluorescentie (IF) van adherente tweedimensionale celculturen, waarbij de experimentele kosten worden verlaagd door het gebruik van goedkope glazen dekglasjes, standaard 24-wells platen en kleurcondities met een laag volume die het antilichamenverbruik minimaliseren, terwijl een representatieve benadering voor eiwitlokalisatie met standaard fluorescentiemicroscopie wordt geboden.

Samenvatting

Immunofluorescentie (IF) microscopie is een veelgebruikte techniek voor het visualiseren van de lokalisatie en co-distributie van eiwitten op resolutie van individuele cellen, terwijl de cellulaire morfologie en subcellulaire organisatie behouden blijven. Het doel van dit protocol is om een praktische en kosteneffectieve workflow te presenteren voor mono- en multiplex immunofluorescentiekleuring van adherente 2D-celculturen met behulp van standaard laboratoriummaterialen. De methode is gebaseerd op het kweken van cellen op goedkope glazen dekglasjes geplaatst in conventionele 24-well platen en implementeert multiplexing via scheiding van gastspecies van primaire antilichamen, spectraal verschillende fluoroforen en robuuste controlecondities, waaronder controles zonder primair antilichaam, zonder antilichaam, enkelvoudige kleuring en crosstalk-controles om de interpreteerbaarheid van multiplex IF te waarborgen. Er worden kleuringsstappen met een klein volume gebruikt om het verbruik van reagentia en antilichamen te verminderen zonder de signaalkwaliteit aan te tasten. Deze workflow voorkomt de noodzaak van gespecialiseerde imaging-platen of kamers en is compatibel met routinematige widefield- of confocale fluorescentiemicroscopie. In het algemeen biedt dit protocol een toegankelijke en praktische immunofluorescentie-workflow voor de representatieve beoordeling van eiwitlokalisatie en co-distributie in adherente celculturen. Aanpassing aan andere celtypen of antilichaampanels vereist doelspecifieke optimalisatie, waaronder validatie van antilichamen, fixatie- en permeabilisatiecondities, selectie van fluoroforen en compatibiliteit met de microscoop en filtersets.

Inleiding

Immunofluorescentie (IF)-microscopie wordt op grote schaal gebruikt om de subcellulaire lokalisatie, relatieve overvloed en colokalisatie van eiwitten in gefixeerde cellen te visualiseren, waardoor moleculaire markers kunnen worden gekoppeld aan de cellulaire morfologie en de subcellulaire context^1,2. In tegenstelling tot bulk-readouts (bijv. immunoblotting) of dissociatieve single-cell assays (bijv. flowcytometrie), behoudt IF de cellulaire ruimtelijke organisatie en is het bijzonder nuttig voor het beoordelen van fenotypische heterogeniteit tussen cellen en veranderingen in de subcellulaire eiwitdistributie met single-cell resolutie^3,4,5. Omdat experimentele vragen steeds vaker de gelijktijdige beoordeling van meerdere markers vereisen, maakt multiplex IF de concurrente detectie van twee of meer targets binnen hetzelfde specimen mogelijk, meestal door primaire antilichamen opgewekt in verschillende gastheersoorten te combineren met spectraal onderscheidende fluoroforen⁶ (Figuur 1), gebruikmakend van directe en/of indirecte detectiestrategieën (Figuur 2). Multiplexing introduceert echter belangrijke technische uitdagingen, in het bijzonder antilichaam-kruisreactiviteit en spectrale crosstalk, die de interpreteerbaarheid kunnen compromitteren tenzij deze worden aangepakt via een zorgvuldig panelontwerp en strikte controlecondities^7,8.

Het algemene doel van deze methode is het bieden van een praktische, kosteneffectieve workflow die breed toepasbaar is op immunofluorescentie-gevalideerde antilichamen en is geoptimaliseerd voor routine-imaging van adherente 2D-culturen. Multiplexing wordt geïmplementeerd via scheiding van gastsoorten, spectraal verschillende fluoroforen en controlegroepen die achtergrondniveaus en kleuringsprestaties verifiëren^9,10. Door gebruik te maken van glazen dekglasjes van 12 mm in standaard 24-wells platen in plaats van gespecialiseerde kamertestplaatjes, vermijdt deze workflow een specifiek, duurder verbruiksartikel ten gunste van materialen die in de meeste celcultuurlaboratoria standaard op voorraad zijn. De workflow gebruikt bovendien aanzienlijk minder kleuringsoplossing per eenheid groeioppervlak (150 µL voor ≈1,13 cm², oftewel ≈133 µL/cm²) dan vergelijkbare kamerdekglas-formaten^11,12, die doorgaans 300–500 µL/cm² vereisen, wat overeenkomt met een reductie van ongeveer 2 tot 4 keer in het verbruik van antilichamen en reagentia per oppervlakte. Bijgevolg ondersteunt het protocol kwalitatieve multi-target beoordeling van markerlokalisatie en co-distributie met behulp van standaard breedveld- of confocale microscopen, samen met cytoskelet- en nucleus-tegenkleuringen. Deze workflow is bedoeld voor conventionele multiplex IF van gefixeerde cellen op basis van scheiding van gastsoorten en spectraal onderscheid, en is niet ontworpen voor iteratieve of hoogdimensionale multiplex-benaderingen.

Protocol

Deze studie omvatte geen menselijke deelnemers of proefdieren. Alle experimenten werden uitgevoerd met de D17 canine osteosarcoma-cellijn, een gevestigde cellijn verkregen uit een openbare cellenbank (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). Er was daarom geen ethische goedkeuring vereist.

1. Onderhoud van cellijnen

1. Houd adherente cellen onder standaard kweekcondities (37 °C, 5% CO₂, bevochtigde incubator) met gebruik van het passende complete medium voor de gebruikte cellijn.
   OPMERKING: Als representatief voorbeeld worden D17 canine osteosarcoomcellen (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276) onderhouden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum, gesubcultiveerd bij 70–80% confluentie met gebruik van trypsine-EDTA (ethylendiaminetetraazijnzuur), en gebruikt binnen een gevalideerd passagebereik (bijv. passages 5–20).
2. Bevestig de mycoplasma-negatieve status vóór de experimenten met behulp van een gevalideerde mycoplasma-detectieassay.

2. Voorbereiding van de 24-wellplaat en glazen dekglasjes

OPMERKING: Dekglasoppervlakken moeten worden gereinigd door onderdompeling in 70% ethanol (5 min, 3× herhaald) vóór sterilisatie met een van de hieronder beschreven methoden; na sterilisatie moeten de dekglasjes in een gesloten container bij kamertemperatuur worden bewaard tot gebruik.

1. Plaats schone ronde glazen dekglasjes van 12 mm in een glazen Petrischaal (of dekglashouder) en autoclaveer deze. Autoclaveer daarnaast een pincet met fijne metalen punten.
2. Alternatief: Reinig dekglasjes en pincetten met 70% ethanol, laat ze aan de lucht drogen en ontsmet het oppervlak door blootstelling aan ultraviolet (UV) licht (30 min) in een veiligheidskast voordat ze worden gebruikt. Bewaar gesteriliseerde dekglasjes in een gesloten container bij kamertemperatuur tot gebruik.
3. Breng in een veiligheidskast voor biologische agentia met een steriele pincet één steriel dekglas over in elke put die is bestemd voor de experimentele groepen in een 24-wells tissuekweekplaat.
4. Optioneel: coat de dekglasjes met adhesiebevorderende coatings volgens de instructies van de fabrikant of vastgestelde laboratoriumrichtlijnen, indien vereist voor het gebruikte celtype.
   OPMERKING: Coatingopties (poly-L-lysine, collageen I of fibronectine) en hun werkconcentraties zijn vermeld in de Tabel met materialenVoor de meeste adherente cellijnen die op glas worden gekweekt, zijn ongecoate, gesteriliseerde dekglasjes voldoende; coatingcomponenten kunnen antigenisch zijn, dus de gekozen coating mag niet kruisreageren met enige antilichamen in het panel.
5. Indien de dekglasjes zijn gecoat, zuig dan de overtollige coatingoplossing af, spoel één keer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat de dekglasjes aan de lucht drogen in de veiligheidskast voordat de cellen worden uitgezaaid.

3. Experimentele groepen

1. Voeg een paneel van controles toe die passend zijn voor het multiplex-ontwerp.
   OPMERKING: Een controle zonder antilichamen (noch primair noch secundair antilichaam) brengt intrinsieke autofluorescentie aan het licht, en een controle zonder primair antilichaam (een cocktail van secundaire antilichamen zonder enig primair antilichaam) beoordeelt aspecifieke secundaire binding en achtergrond in alle kanalen tegelijkertijd; aangezien dit protocol strikt spectraal verschillende secundaire antilichamen gebruikt, evalueert deze enkele controle elk secundair antilichaam onafhankelijk binnen het respectievelijke kanaal, wat hetzelfde doel dient als een secundaire-alleen-controle per fluorofoor. Enkelvoudige kleuringscontroles, waarbij elk primair-secundair paar individueel wordt toegepast, valideren de prestaties van elk antilichaam vóór de multiplex-combinatie en maken, door vergelijking met de multiplex-conditie, een beoordeling mogelijk van spectrale overlap (crosstalk) voor elk fluorofoorpaar. Indien mogelijk wordt een positieve controle gebruikt die het doellantigeen tot expressie brengt om de prestaties van de assay te bevestigen.

4. Uitplaten van cellen op dekglasjes

1. Los de cellen in een biosafety cabinet los met trypsine (of een andere geschikte dissociatiemethode), neutraliseer deze en resuspendeer ze in volledig kweekmedium.
2. Tel de cellen met behulp van een automatische celsteller of een hemocytometer.
3. Verdun de cellen tot 6 × 10⁴–1 × 10⁵ cellen/mL.
4. Voeg 0,5 mL celсусpensie per well toe (eindconcentratie: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ cellen/well).
   OPMERKING: Indien nodig kan een steriele pipetpunt worden gebruikt om voorzichtig te controleren of het dekglas plat op de bodem van de well ligt, waarbij krassen moeten worden vermeden.
5. Incubeer de cellen onder standaardcondities (37 °C, 5% CO₂) totdat de cellen zijn gehecht en de gewenste confluentie hebben bereikt of het experimentele tijdstip is aangebroken.

5. Celbehandeling (Optioneel)

1. Selecteer het tijdstip van de behandeling volgens het experimentele ontwerp. De behandeling kan bestaan uit farmacologische therapie, cytokinestimulatie, genetische manipulatie om de expressie van het doelgen te induceren of te reduceren, of andere experimentele interventies, indien van toepassing.
2. Label de wells om controle- en behandelde groepen te identificeren.
3. Incubeer gedurende de vereiste tijdspunten; voorkom overconfluentie, aangezien overgroei de achtergrond verhoogt en de morfologie beïnvloedt.
   OPMERKING: Cellen moeten aan het dekglas gehecht zijn vóór fixatie, tenzij het ontwerp vereist dat de fixatie onmiddellijk na het uitplaten plaatsvindt.
4. Voeg voor snel gesecreteerde doelen (bijv. cytokinen) brefeldine A (BFA) toe aan het cultuurmedium tot een eindconcentratie van 1–10 µg/mL (meestal 5 µg/mL) en incubeer 4–6 h bij 37 °C, 5% CO₂ vóór fixatie.
5. Verwijder het medium dat BFA bevat en ga onmiddellijk over tot de Fixatie.

6. Immunofluorescentiekleuring

OPMERKING: Vanaf de fixatie is een steriele techniek niet vereist; de kleuring mag op de werkbank worden uitgevoerd, waarbij een chemische zuurkast wordt gebruikt telkens wanneer er een reagent met een WAARSCHUWING wordt gehanteerd. Monsters mogen op geen enkel moment uitdrogen; bij het aspireren wordt een dunne bufferfilm achtergelaten en de volgende oplossing wordt onmiddellijk toegevoegd.

1. Fixatie (kies er één):
   OPMERKING: Het fixatief wordt gekozen op basis van de lokalisatie van het doelwit en de sensitiviteit van het epitoop (zie Discussie): Paraformaldehyde (PFA) (formaldehyde bereid uit paraformaldehyde) is geschikt voor de meeste doelwitten en is compatibel met phalloidine; methanol kan helpen bij bepaalde nucleaire/fosfo-epitopen, maar bemmert de F-actine kleuring.
   1. PFA-fixatie (aanbevolen voor de meeste doelwitten):
      1. Zuig het medium af en spoel voorzichtig één keer met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (0,5 mL/well).
      2. Voeg 4% PFA in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) toe (0,5 mL/well) en incubeer 10 min bij kamertemperatuur (≈25 °C).
      3. Zuig PFA af en was 3× met TBS (zuig direct af; laat de wells niet uitdrogen).
         OPMERKING: VOORZICHTIG: PFA is toxisch en een potentieel carcinogeen. Hanteer PFA-oplossingen in een gecertificeerde chemische zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, handschoenen en oogbescherming). Vermijd inademing en contact met de huid, en voer afval af in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
2. Alternatief, methanolfixatie (nuttig voor sommige nucleaire antigenen en bepaalde fosfo-epitopen):
   1. Koel 100% methanol voor tot −20 °C.
   2. Voeg ijskoude methanol direct toe aan de cellen (0,5 mL/well) en incubeer 5 min bij −20 °C.
   3. Was 3× met TBS (zuig direct af; laat de wells niet uitdrogen).
      OPMERKING: Na methanolfixatie kan aanvullende permeabilisatie overbodig zijn en moet dit per antilichaam/epitoop worden geoptimaliseerd. Methanolfixatie kan membraanepitopen beschadigen en fluorofoor-geconjugeerde phalloidine/F-actine kleuring belemmeren. VOORZICHTIG: Methanol is toxisch, vluchtig en zeer brandbaar. Hanteer in een goed geventileerde ruimte of chemische zuurkast; draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen; en houd weg van open vlammen en hittebronnen. OPTIONEEL STOPPUNT: Bewaar monsters na fixatie tot één week bij 4 °C in PBS met een lage concentratie fixatief (bijv. PBS + 0,1% PFA); valideer de bewaartijd voor elk antigeen.
3. Aldehyden quenching (Optioneel)
   1. Incubeer met 50 mM glycine in TBS (0,5 mL/well) gedurende 5 min bij kamertemperatuur (≈25 °C).
   2. Was 3× met TBS + 0,05% polysorbaat 20.
      OPMERKING: Glycine neutraliseert vrije aldehydegroepen die na PFA-fixatie overblijven, waardoor fixatie-gerelateerde autofluorescentie wordt verminderd en de specificiteit van de antilichaamkleuring verbetert.
4. Permeabilisatie
   1. Als membraaneiwitten het doelwit zijn, sla de permeabilisatie over en ga naar stap 6.5.1.
   2. Als intracellulaire of nucleaire eiwitten het doelwit zijn, permeabiliseer dan met 0,1–0,3% niet-ionisch detergent in TBS (0,5 mL/well) gedurende 5–10 min bij kamertemperatuur (≈25 °C).
   3. Was 3× met TBS + 0,05% polysorbaat 20 (TBST).
      OPMERKING: De concentratie en tijd van het niet-ionische detergent octylfenolethoxylaat worden geoptimaliseerd voor het doelwit; de adequaatheid wordt beoordeeld op basis van het signaal in het juiste compartiment, behouden morfologie, goed gedefinieerd F-actine en een lage achtergrond (zie Discussie). Als saponine wordt gebruikt, blijft dit aanwezig in alle daaropvolgende antilichaam- en wasbuffers. VOORZICHTIG: Niet-ionisch detergent octylfenolethoxylaat is schadelijk bij inademing of contact met de huid en kan oogirritatie veroorzaken. Hanteer met handschoenen en vermijd aerosolvorming.
5. Blocking
   1. Voeg 0,5 mL/well blockingsoplossing toe (5% runder serumalbumine (BSA) in TBS) en incubeer 30 min bij kamertemperatuur (≈25 °C).
   2. Zuig de blockingbuffer af.
   3. Ga direct over tot incubatie met het primaire antilichaam (niet wassen).
6. Incubatie met primair antilichaam
   OPMERKING: Verdunningen van primaire en secundaire antilichamen worden empirisch vastgesteld door titratie (zie Discussie).
   1. Bereid enkelvoudige of multiplex primaire antilichaampanels in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% polysorbaat 20 en 1% BSA (TBST-BSA 1%), met gebruik van vooraf geoptimaliseerde antilichaamconcentraties voor elk doelwit.
   2. Combineer voor multiplex immunofluorescentie alle niet-geconjugeerde primaire antilichamen gericht tegen verschillende antigenen uit verschillende gastdiersoorten (bijv. muis anti-interferon-β (IFN-β) + konijn anti-p14ARF + geit anti-actine) in één enkele antilichaamcocktail.
   3. Voeg 150 µL per well toe, waarbij wordt gewaarborgd dat het volledige dekglas volledig bedekt is door de antilichaamoplossing.
      OPMERKING: Om verdamping bij een laag volume te voorkomen, wordt de plaat geïncubeerd in een bevochtigingskamer (bijv. een afgesloten doos met vochtig weefsel).
   4. Incubeer 1,5 u bij kamertemperatuur (≈25 °C) of 12–16 u bij 4 °C.
   5. Was 3× met TBST gedurende telkens 3 min bij kamertemperatuur (≈25 °C), zuig direct af na elke wasbeurt.
7. Incubatie met secundair antilichaam (en direct geconjugeerde primaire antilichamen, indien van toepassing)
   OPMERKING: Vanaf deze stap worden monsters beschermd tegen licht om fotobleking te voorkomen. Spectralmente verschillende fluoroforen worden gebruikt voor secundaire antilichamen en eventuele direct geconjugeerde primaire antilichamen om crosstalk te minimaliseren, en soortspecifieke, sterk cross-geadsorbeerde secundaire antilichamen worden gebruikt om binding aan niet-cognate primaire antilichamen te minimaliseren. Het ontwerp van het fluorofoorpanel, inclusief nucleaire en cytoskeletmarkers, en de compatibiliteit met de excitatie/emissie van de microscoop worden behandeld in de Discussie.
   1. Verdun secundaire antilichamen in TBST-BSA 1% oplossing met gebruik van vooraf geoptimaliseerde concentraties. Combineer voor multiplex detectie alle secundaire antilichamen die corresponderen met de gastdiersoorten van de gebruikte primaire antilichamen (één secundair per gastdiersoort) in één enkele cocktail.
   2. Voeg 150 µL per well toe, waarbij wordt gewaarborgd dat het volledige dekglas volledig bedekt is.
   3. Incubeer 1 u bij kamertemperatuur (≈25 °C).
      OPMERKING: Als het panel één of meer direct geconjugeerde primaire antilichamen bevat, voeg deze dan samen met de secundaire antilichaamcocktail toe en verleng de incubatie tot 1,5 u bij kamertemperatuur (ongeveer 25 °C).
   4. Was 3× met TBST gedurende telkens 3 min bij kamertemperatuur (≈25 °C), zuig direct af na elke wasbeurt.

7. Nucleaire tegenkleuring en f-actine kleuring

1. Voeg de nucleaire tegenkleuring Hoechst 33342 (1:5000), verdund in TBS, toe en incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur (≈25 °C), beschermd tegen licht. Indien F-actine moet worden gelabeld met phalloïdine in plaats van een anti-actine antilichaam, voeg dan phalloïdine (1:400) toe aan dezelfde oplossing.
2. Was 3× met TBST en aspireer direct na elke wasbeurt (laat de putjes niet uitdrogen).
3. Voeg 0,5 mL TBS toe aan elk putje om de dekglasjes ondergedompeld te houden tot aan het terugwinnen/monteren.

8. Terugwinning van het dekglas en monteren op objectglas

1. Terwijl de dekglasjes ondergedompeld blijven in TBS, steekt u de punt van een fijne naald of scalpel onder de rand van het dekglasje en wipt u dit voorzichtig omhoog tot één zijde gedeeltelijk is opgetild. Pak het dekglasje met een fijne pincet vast en verwijder het uit de well.
   OPMERKING: Het verwijderen van een dekglasje wanneer het niet is ondergedompeld, kan ertoe leiden dat het door oppervlaktespanning stevig aan de bodem van de well kleeft, waardoor het risico op breuk toeneemt.
2. Houd het dekglasje met de pincet vast en zuig het overtollige TBS voorzichtig van de randen af met een vacuümaspirator of absorbeerpapier. Vermijd contact met het oppervlak waar de cellen zich bevinden.
   OPMERKING: Overtollige restvloeistof moet worden vermeden, omdat dit het monteermedium kan verdunnen en de beeldhelderheid en het contrast kan beïnvloeden.
3. Plaats het dekglasje met de celzijde naar beneden op een schoon objectglas dat een kleine druppel (≈3 µL) monteermedium bevat.
   OPMERKING: Er kan een commercieel zelfuithardend antifade-medium of een zelfgemaakt medium op basis van 80% glycerol/fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) worden gebruikt; glycerolgebaseerde preparaten worden afgesloten met transparante nagellak, en media zonder kernkleuring worden geselecteerd na tegenkleuring. Richtlijnen voor bewaartermijnen en de stabiliteit van fluoroforen worden gegeven in de Discussie.
4. Laat de preparaten horizontaal ≈24 u uitharden, beschermd tegen licht, voordat de beeldacquisitie plaatsvindt.

Resultaten

Dit protocol ondersteunt mono- en multiplex immunofluorescentiekleuring van adherente canine tumorcellen die zijn gekweekt op glazen dekglasjes, waardoor gelijktijdige visualisatie van nucleaire, cytoplasmatische en cytoskeletale markers mogelijk is terwijl de cellulaire morfologie behouden blijft. Representatieve resultaten zijn geïllustreerd in Figuur 3.

In succesvolle experimenten vertoonden D17 canine osteosarcoomcellen, die via genetische manipulatie (Sectie 5.1) waren aangepast om canine p14ARF en canine IFN-β te tot expressie te brengen, sterke, ruimtelijk correcte fluorescentiesignalen met een lage achtergrond en minimale aspecifieke kleuring. Voor p14ARF-expresserende cellen (Figuur 3A) onthulde immunofluorescentie een overwegend nucleaire lokalisatie, wat consistent is met de bekende subcellulaire distributie van p14ARF. Het gebruik van permeabilisatie met 0,3% octylfenolethoxylaat niet-ionisch detergent maakte een efficiënte antilichaamtoegang tot nucleaire epitopen mogelijk, terwijl de nucleaire morfologie en de integriteit van het cytoskelet behouden bleven, zoals bevestigd door duidelijke nucleaire tegenkleuring en actinestructuren gevisualiseerd met een anti-actine antilichaam (oranje-emitterende fluorofoor).

Voor IFN-β-expresserende cellen (Figuur 3A) werd een cytoplasmatisch signaal waargenomen na incubatie met BFA om de eiwitsecretie te blokkeren, waardoor intracellulaire accumulatie en detectie van dit oplosbare cytokine mogelijk werden. Onder deze omstandigheden was een mildere permeabilisatie voldoende om antilichaampenetratie toe te staan zonder overmatige extractie van cytoplasmatische inhoud. Succesvolle kleuring werd gekenmerkt door punctate tot diffuse cytoplasmatische fluorescentie, minimale nucleaire crosstalk en behouden actin-architectuur.

Suboptimale resultaten werden waargenomen wanneer belangrijke parameters niet correct waren geoptimaliseerd. Onvoldoende permeabilisatie leidde tot een zwak of afwezig nucleair p14ARF-signaal, zoals aangetoond voor de niet-gepermeabiliseerde conditie (0% octylfenolethoxylaat niet-ionisch detergent; Figuur 3B en Suppletaire Figuur 1). Omgekeerd kan overmatige permeabilisatie (≥0,5% octylfenolethoxylaat niet-ionisch detergent of verlengde incubatietijden) leiden tot gedeeltelijk verlies van cytoskeletkleuring, verhoogde achtergrondfluorescentie en een aangetaste cellulaire morfologie. In experimenten met snel gesecreteerde eiwitten (bijv. IFN-β) leidde het weglaten van BFA vaak tot een zwakker intracellulair signaal, wat een weerspiegeling was van de snelle secretie in plaats van een fout in het protocol.

Controles met enkele kleuringen (Supplementary Figure 2) vertoonden enkel signaal in het kanaal dat correspondeerde met elk doelwit, wat de specificiteit van de waargenomen immunofluorescentiekleuring ondersteunt. Negatieve controlecondities, waaronder controles zonder primair antilichaam en zonder antilichaam (Supplementary Figure 2), vertoonden de verwachte kernkleuring, met verwaarloosbaar signaal in de antilichaam-afhankelijke kanalen, wat wijst op een lage autofluorescentie en minimale aspecifieke binding van het secundaire antilichaam.

Samen tonen deze representatieve resultaten aan dat het protocol de detectie van eiwitten met verschillende subcellulaire lokalisaties ondersteunt wanneer fixatie, permeabilisatiekracht en specifieke doelgerichte strategieën (bijv. blokkeren van secretie) zijn afgestemd op de biologie van het doeleiwit. Een juiste optimalisatie resulteert in een sterke, specifieke fluorescentie met een lage achtergrond en behouden cellulaire morfologie, terwijl niet-optimale condities leiden tot zwakkere of ruisgevoelige signalen en een veranderde cellulaire structuur.

Figuur 1: Overzichtschema van de mono- en multiplex immunofluorescentie-workflow. Belangrijkste stappen vanaf het onderhoud van de celkweek tot aan de beeldacquisitie, inclusief de twee beslismomenten waarbij een doelwitafhankelijke selectie vereist is: fixatiemethode (PFA versus methanol) en permeabilisatie (gebaseerd op de subcellulaire lokalisatie van het doelwit). Een optionele experimentele behandeling, waaronder een voorbehandeling met brefeldine A (BFA) voor snel gesecreteerde doelwitten, is aangegeven als een vertakking vóór de fixatie. Optionele stappen die omwille van de duidelijkheid niet worden getoond (bijv. aldehyde-quenching) worden beschreven in het volledige Protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematische weergave van antilichaamgebaseerde fluorescentiedetectiestrategieën. Directe detectie maakt gebruik van fluorofoor-geconjugeerde primaire antilichamen, terwijl indirecte detectie gebruikmaakt van niet-geconjugeerde primaire antilichamen in combinatie met fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen; dit is de strategie die in dit protocol wordt gehanteerd. Voor multiplex-toepassingen vereist indirecte detectie niet-geconjugeerde primaire antilichamen die zijn opgewekt in verschillende gastdiersoorten, zodat elk secundair antilichaam selectief het bijbehorende primaire antilichaam herkent zonder kruisreactiviteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Multiplex immunofluorescentie van D17 canine osteosarcoomcellen. D17-cellen (5 × 10⁴) werden gezaaid op glazen dekglasjes in 24-wellplaten en gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 min bij 25 °C. De cellen werden onderworpen aan multiplex immunofluorescentie met primaire antilichamen tegen p14ARF (1:200; groen emitterende fluoroforen), actine (1:200; oranje emitterende fluoroforen) en interferon-β (IFN-β) (1:200; ver-rood emitterende fluoroforen), met overeenkomstige secundaire antilichamen bij 1:500. Kernen werden tegengekleurd. Voorafgaand aan de IFN-β-detectie werden de cellen behandeld met BFA (5 µg/mL, 4 u) om eiwitsecretie te blokkeren. (A) Cellen werden gepermeabiliseerd met 0,3% niet-ionisch detergent gedurende 10 min bij 25 °C. (B) Cellen verwerkt zonder permeabilisatie (0% niet-ionisch detergent). Representatieve beelden van 2 onafhankelijke biologische replica's, telkens uitgevoerd in 2 technische replica's. In deze figuur worden alleen de gecombineerde kanalen getoond; individuele kanalen zijn beschikbaar in Aanvullende Figuur 1. Verschillen in labeling zijn waarneembaar tussen de condities, in het bijzonder voor p14ARF (A; pijlen), een intranucleair doelwit, waarvan het signaal afwezig was in de niet-gepermeabiliseerde groep (B). Panelen A en B zijn verkregen en verwerkt met identieke instellingen (Aanvullende Tabel 1). Negatieve en enkelvoudige kleuringscontroles behorend bij dit paneel worden getoond in Aanvullende Figuur 2. Schaalbalk: 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Individuele fluorescentiekanalen behorend bij figuur 3, georganiseerd per marker met permeabiliseerde (linkerkolom) en niet-permeabiliseerde (rechterkolom) cellen. Naast elkaar getoonde condities: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; groen-emitterende fluoroforen), actine (E, F; oranje-emitterende fluorofoor) en IFN-β (G, H; ver-rood-emitterende fluoroforen), samen met de overeenkomstige samengevoegde panels (I, J), die respectievelijk overeenkomen met figuur 3A en 3B. Pijlen geven representatieve p14ARF-kernkleuring aan; ellipsen geven respectievelijk representatieve actine- (E) en IFN-β-kleuring (G) aan. Verlies van het p14ARF-kernsignaal, samen met suboptimale labeling van IFN-β en actine, is duidelijk zichtbaar onder niet-permeabiliseerde condities. Het residuele signaal waargenomen in (D; asterisk) weerspiegelt spectrale crosstalk van co-aanwezige fluoroforen, bevestigd door de afwezigheid hiervan in de overeenkomstige enkelvoudige kleuringen en controles met enkel secundaire antilichamen (Aanvullende figuur 2). Schaalbalk: 100 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Gecombineerde immunofluorescentiecontroles behorend bij het multiplexpanel in figuur 3. Voor elke controlegroep worden de individuele kanalen (Hoechst 33342, groen emitterende fluoroforen, oranje emitterende fluorofoor en ver-rood emitterende fluoroforen) getoond naast de merge (vijfde kolom). (A–E) Controle zonder antilichamen: cellen verwerkt zonder primaire of secundaire antilichamen. (F–J) Alleen-secundaire controle: cellen geïncubeerd met de secundaire antilichaamcocktail in afwezigheid van primaire antilichamen. (K–O) p14ARF enkelvoudige kleuringscontrole (groen emitterende fluoroforen). (P–T) Actine enkelvoudige kleuringscontrole (oranje emitterende fluorofoor). (U–Y) IFN-β enkelvoudige kleuringscontrole (ver-rood emitterende fluoroforen). De acquisitie- en verwerkingsinstellingen waren identiek aan die gebruikt in figuur 3 (Aanvullende tabel 1). Schaalbalk: 100 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Specificaties van fluorescentiefilterkubussen en acquisitievolgorde. Beelden werden sequentieel vastgelegd op een inverted widefield fluorescentiemicroscoop (40×/0.80 objectief) met behulp van de hieronder vermelde filterkubussen, in de getoonde volgorde, voor elk beeldveld in Figuur 3, Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2. Beelden werden vastgelegd als enkele optische vlakken (geen z-stacking). De excitatie-intensiteit werd ingesteld via de fluorescentie-intensiteitsregeling op de aangegeven niveaus, waarbij het velddiafragma van het invallende licht voor alle kanalen op positie 6 werd gehouden. Camera-instellingen (8-bit digitalisering, 3072×2048 formaat, gamma 1.0) en een vaste digitale verscherpingsinstelling waren identiek voor alle kanalen en panelen, inclusief de controlebeelden in Aanvullende Figuur 2. Een enkele lineaire helderheid/contrastcorrectie is identiek toegepast op alle kanalen en panelen voor weergave. Beelden werden geëxporteerd als TIFF. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Gids voor het oplossen van problemen bij veelvoorkomende technische complicaties in de immunofluorescentie-workflow. Veelvoorkomende problemen, waarschijnlijke oorzaken en corrigerende maatregelen gedurende het protocol.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Verschillende stappen zijn cruciaal voor de consistente uitvoering van deze op dekglas gebaseerde immunofluorescentieworkflow. Alle procedures worden uitgevoerd binnen de beperkte omgeving van een kweekputje in een 24-wells plaat, wat de hantering vereenvoudigt, monsterbehandeling beperkt en volledige bedekking van het dekglas mogelijk maakt met lage reagensvolumes, waardoor het antibody-verbruik per experiment wordt verminderd. Omdat deze oplossingen met een laag volume gevoelig zijn voor verdamping, worden incubaties bij voorkeur uitgevoerd in een bevochtigingskamer en mogen monsters nooit uitdrogen: zelfs kortstondige uitdroging verhoogt de achtergrondfluorescentie en verslechtert de cellulaire morfologie. Bij het aspireren wordt een dunne laag buffer op het dekglas achtergelaten en wordt de volgende oplossing onmiddellijk toegevoegd.

Een juiste zaaidichtheid van cellen en een gecontroleerde confluentie op het moment van fixatie zijn essentieel om achtergrondruis te beperken en de morfologie te behouden, aangezien overgroei de achtergrondruis verhoogt en de cellulaire architectuur aantast. Evenzo is een nauwkeurige controle van de incubatietijd en -temperatuur gedurende het gehele proces vereist, aangezien beide de fixatie-efficiëntie, antilichaambinding en het achtergrondsignaal beïnvloeden^5,13. Wanneer de omgevingscondities fluctueren, verbetert een temperatuurgecontroleerde incubator of droogoven ingesteld op 25 °C, in combinatie met een consistente incubatietijd over alle replica's heen, de reproduceerbaarheid.

Fixatie is de eerste cruciale stap, aangezien deze de preservering van antigenen en de cellulaire architectuur bepaalt⁵, en het fixatief wordt gekozen op basis van de lokalisatie van het doelwit en de gevoeligheid van het epitope. PFA wordt aanbevolen voor de meeste membraangeassocieerde, cytoplasmatische, nucleaire en cytoskeletale doelwitten, omdat het de architectuur behoudt, de antigeenverdeling handhaaft en compatibel is met phalloïdine-gebaseerde F-actine kleuring. Methanol kan worden verkozen voor bepaalde nucleaire antigenen die slecht worden gedetecteerd na cross-linking fixatie, in het bijzonder fosfo-epitopen of aldehydegevoelige epitopen, maar het verstoort de membraanintegriteit, extraheert oplosbare eiwitten en belemmert de phalloïdine/F-actine kleuring; de compatibiliteit dient voor elk doelwit te worden gevalideerd ^13,14,15,16. Voor oplosbare cytokinen en andere snel gesecreteerde eiwitten zorgt PFA-fixatie in combinatie met BFA-voorbehandeling ervoor dat het intracellulaire signaal vóór fixatie behouden blijft: BFA blokkeert het eiwittransport van het endoplasmatisch reticulum naar het Golgi-apparaat, wat de intracellulaire accumulatie van gesecreteerde eiwitten bevordert en detectie via immunofluorescentie mogelijk maakt. Wanneer doelwitten met tegenstrijdige fixatie-eisen gelijktijdig gedetecteerd moeten worden, is empirische optimalisatie vereist. Glyoxaal, een klein dialdehyde, is beschreven als een alternatief voor PFA, met snellere cross-linking, verbeterde antigeenpreservering en compatibiliteit met immunofluorescentie en super-resolutie microscopie; wij hebben geen directe ervaring met glyoxaal-fixatie en presenteren dit als een in de literatuur ondersteunde optie^17,18.

Na de fixatie maakt een passende permeabilisatie toegang van antilichamen tot intracellulaire en nucleaire epitopen mogelijk, terwijl de structurele integriteit behouden blijft⁵. Onvoldoende permeabilisatie resulteert doorgaans in een zwak of afwezig signaal ondanks een intacte morfologie, wat wijst op een beperkte toegang van antilichamen, terwijl overmatige permeabilisatie oplosbare eiwitten extraheert, membranen verstoort, tot verlies van cytoskeletale kleuring leidt en de achtergrondruis verhoogt. Het type detergent, de concentratie en de incubatietijd worden daarom geoptimaliseerd voor het doelewit. Adequate permeabilisatie kan worden beoordeeld aan de hand van vier criteria: (i) specifiek signaal in het verwachte subcellular compartiment; (ii) behouden morfologie, met intacte nucleaire en cytoplasmatische grenzen die respectievelijk door Hoechst 33342 en phalloïdine zijn gevisualiseerd; (iii) goed gedefinieerde F-actine kleuring, aangezien een diffuus of verloren cytoskeletaal signaal wijst op over-permeabilisatie; en (iv) een lage achtergrond in negatieve controles. Als aan deze criteria niet wordt voldaan, worden de concentratie van het niet-ionische detergent octylfenolethoxylaat en/of de incubatietijd empirisch aangepast. Wanneer membraangeassocieerde en intracellulaire antigenen in één enkel panel worden gecombineerd, behouden mildere condities (lagere detergentconcentratie, kortere incubatie) de membraanepitopen terwijl intracellulaire toegang mogelijk blijft; een tijdreeks beginnend bij 5 min en stapsgewijs toenemend is hierbij nuttig. Indien er in plaats daarvan saponine wordt gebruikt, moet dit in alle daaropvolgende antilichaam- en wasbuffers worden gehandhaafd, aangezien het permeabiliserende effect ervan reversibel is.

Antilichaamconcentraties worden empirisch vastgesteld door titratie in plaats van overgenomen uit algemene aanbevelingen. Een praktische aanpak is een seriële verdunningsreeks die ten minste 3–4 concentraties boven en onder de door de fabrikant gesuggereerde verdunning omvat (bijv. 1:50, 1:100, 1:200 en 1:400 bij een aanbevolen verdunning van 1:200), toegepast op replica-dekglaasjes onder identieke omstandigheden. Elke verdunning wordt geëvalueerd op specifieke signaalintensiteit in het verwachte compartiment; de signaal-ruisverhouding, waarbij gekleurde monsters worden vergeleken met de overeenkomstige controle zonder primair antilichaam en de secundaire achtergrond met de controle zonder antilichaam; en het behoud van de morfologie. De laagste concentratie die een sterk, specifiek signaal met minimale achtergrond geeft, wordt geselecteerd. Een aanhoudende hoge achtergrond wordt doorgaans verminderd door verdere titratie, verlengde blokkering of verhoogde wasstrengentie, terwijl een zwak signaal kan wijzen op overmatige fixatie, een suboptimale antilichaamconcentratie, het onvermogen van het primaire antilichaam om het doelepitoop te herkennen, een mismatch tussen het secundaire antilichaam en de gastsoort van het primaire antilichaam (bijv. een anti-konijn secundair antilichaam toegepast op een primair antilichaam met muis als gastheer), of verlies van het fluorofoor-signaal door degradatie van het secundaire antilichaam als gevolg van verval of onjuiste opslag, met name herhaalde blootstelling aan licht. Als er bij alle verdunningen geen signaal aanwezig is, is het raadzaam om de incubatie van het primaire antilichaam te verlengen of over te gaan op incubatie gedurende de nacht bij 4 °C, de antigene expressie in de cellijn te bevestigen, de compatibiliteit van het antilichaam met de fixatie- en permeabilisatiecondities te verifiëren, het lot, de opslag en de vervaldatum van de primaire en secundaire antilichamen te controleren, te bevestigen dat de microscoop beschikt over de juiste excitatie- en emissiefilters voor het fluorofoor, en, indien het probleem aanhoudt, een alternatieve kloon te testen. Bij het bereiden van werkoplossingen is het benodigde cocktailvolume het aantal putjes vermenigvuldigd met 150 µL plus ongeveer 10% extra om pipetteerverlies te compenseren; het stockvolume van elk antilichaam is gelijk aan dit totaal gedeeld door de verdunningsfactor (bijv. 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL voor een 1:200 verdunning), waarbij de rest wordt aangevuld met TBST–BSA 1%. Dezelfde berekening is van toepassing op de secundaire cocktail, waarbij de overeenkomstige verdunningsfactor wordt ingevuld.

De prestaties van multiplexing hangen uiteindelijk af van het ontwerp van het fluorofoorpanel. De fluoroforen die zijn toegewezen aan de primaire targets, de nucleaire tegenkleuring en de cytoskeletmarker moeten worden gecoördineerd om spectrale overlap of signaalduplicatie te voorkomen, en het imaging-systeem moet de excitatie en detectie van elke geselecteerde fluorofoor ondersteunen^9,10; de excitatie- en emissiebereiken voor elke filterkubus zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1, waardoor een directe vergelijking van de spectrale compatibiliteit over het hele panel mogelijk is. Gebruikers die dit panel aanpassen aan andere fluoroforen, wordt geadviseerd om waar mogelijk combinaties te kiezen met minimale overlap van aangrenzende kanalen en om de afwezigheid van crosstalk te verifiëren in enkelvoudige kleuringscontroles voordat targets worden gecombineerd, zoals hier is gedaan. Residu-signaal dat toegeschreven kan worden aan co-aanwezige fluoroforen werd waargenomen in alle verworven kanalen in het multiplex-panel (Aanvullende Figuur 1), maar was afwezig in de overeenkomstige enkelvoudige kleuringscontroles en controles met alleen secundaire antilichamen (Aanvullende Figuur 2), wat wijst op spectrale crosstalk door de breedbandige filtersets die zijn gebruikt bij widefield-acquisitie (mogelijk reduceerbaar met confocale, lasergebaseerde excitatie). Gegeven de ruimtelijke scheiding tussen de nucleolaire lokalisatie van p14ARF en de filamenteuze/cytoplasmatische distributie van actine en IFN-β, compromitteert deze crosstalk de interpretatie van de p14ARF-lokalisatie in het multiplex-panel niet. Deze workflow is gebaseerd op conventionele fluorofoor-gebaseerde multiplexing, waarbij het aantal gelijktijdig oplosbare targets wordt beperkt door de beschikbare gastsoorten van antilichamen en spectraal onderscheidbare fluoroforen. Hogere-orde multiplexing kan worden bereikt via cyclische immunofluorescentie of spectrale imaging, die respectievelijk iteratieve kleuring/bleken of lineaire unmixing van overlappende fluoroforen mogelijk maken, maar hiervoor is gespecialiseerde apparatuur en software nodig die hier niet worden behandeld^19,20.

Het ejctiemedium beïnvloedt zowel de beeldkwaliteit als de duurzaamheid van het signaal. Er kan gebruik worden gemaakt van een commercieel zelfuithardend antifade-medium of, als zelfgemaakt alternatief, 80% glycerol in PBS (zonder antifade, niet zelfuithardend); zelfgemaakte glycerolgebaseerde montages worden afgesloten met transparante nagellak om uitdroging en verschuiving van het dekglas te voorkomen, en media zonder kernkleuringen worden gekozen zodra de tegenkleuring van de kernen is voltooid. Beelden worden bij voorkeur direct na het uitharden vastgelegd. Wanneer onmiddellijke beeldvorming niet mogelijk is, kunnen uitgeharde preparaten 2–4 weken in een donkere doos bij 4 °C of tot 6 maanden bij −20 °C worden bewaard, waarbij moet worden rekening gehouden met het feit dat zeer fotolabiele fluoroforen (bijv. groen emitterende fluoroforen) na verloop van tijd signaal verliezen, zelfs onder optimale bewaarcondities. Commerciële antifade-media verlengen de stabiliteit van fluoroforen aanzienlijk in vergelijking met zelfgemaakte glycerolgebaseerde media; wanneer dat laatste wordt gebruikt, wordt acquisitie binnen 24–48 h sterk aanbevolen. Transparante nagellak is compatibel met de meeste fluoroforen en heeft geen merkbare invloed op het behoud van het signaal, mits er minstens 30 min donkere uithardingstijd wordt toegestaan vóór bewaring.

Vanaf de fixatiestap is een steriele techniek niet langer vereist en kan de kleuring op de werkbank worden uitgevoerd, waarbij een gecertificeerde chemische zuurkast wordt gereserveerd voor reagentia die zijn gelabeld met VOORZICHTIG. D17 en andere tumor-afgeleide cellijnen worden behandeld in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor biologische veiligheid voor materialen uit risicogroep 1 of 2, indien van toepassing. Alle materialen die in contact komen met gekweekte cellen, dekglasjes, tips, medium en vloeibaar afval worden gedecontamineerd vóór verwijdering: vloeibaar afval wordt geïnactiveerd met bleekmiddel tot een eindconcentratie van 10% gedurende ten minste 30 min, en vast afval wordt weggegooid in geschikte containers voor biologisch afval. Chemisch afval dat PFA, methanol of octylfenolethoxylaat niet-ionisch detergent bevat, wordt gescheiden en afgevoerd in overeenstemming met de institutionele voorschriften voor chemische veiligheid.

Hoewel deze workflow is ontworpen om breed bruikbaar te zijn, dient deze primair te worden beschouwd als aanpasbaar aan het specifieke target in plaats van als een rigide, universele procedure; een succesvolle toepassing hangt af van het inzicht van de onderzoeker in de lokalisatie, oplosbaarheid, epitopen-toegankelijkheid en gevoeligheid voor fixatie en permeabilisatie van elk antigeen. Twee beperkingen moeten worden benadrukt. Ten eerste is de beoordeling van de kleuring hier kwalitatief, gebaseerd op vergelijking met negatieve controles en de verwachte subcellulaire lokalisatie, in plaats van op een formele kwantificering van de signaal-ruisverhouding; bijgevolg weerspiegelt de hier gerapporteerde consistentie reproduceerbare kwalitatieve kleuring over verschillende replicate dekglasjes en controlecondities, en niet een kwantitatief gevalideerde prestatie. In Aanvullende Tabel 2 wordt een geconsolideerde gids voor probleemoplossing gegeven, waarin veelvoorkomende problemen, waarschijnlijke oorzaken en correctieve maatregelen worden samengevat. Laboratoria die kwantitatieve resultaten vereisen, kunnen open-source beeldanalyse-software gebruiken voor het meten van de gemiddelde intensiteit, achtergrondcorrectie, kwantificering op basis van Region of Interest (ROI) en intensiteitsprofielen²¹. Ten tweede zijn de representatieve gegevens afkomstig van één enkele adherente canine tumorlijn (D17), waardoor uitbreiding naar andere celtypen, soorten of antigeencombinaties een target-specifieke re-optimalisatie van fixatie, permeabilisatie en antilichaamomstandigheden zal vereisen.

Samenvattend biedt dit protocol een flexibele, kostenefficiënte workflow voor mono- en multiplex immunofluorescentie in adherente 2D-culturen, waarbij een laag reagensverbruik wordt gecombineerd met consistente kleurprestaties op standaard laboratoriumapparatuur, terwijl ruimte blijft voor geïnformeerde, doelgerichte aanpassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
weefselkweekplaten met 24 putjes	Corning	3524	Uitzaaien en kleuren van dekglasjes
Antibioticum-antimycoticum	Gibco	15240062	Wordt gebruikt om bacteriële en schimmelcontaminatie in celkweek te voorkomen.
Antilichaam-verdunningsoplossing (TBST-BSA 1%)	In-house bereid	—	Voor 10 mL: 2 mL van de 5% BSA-blokkeringsoplossing + 5 µL Tween-20 + 7,995 mL TBS 1x (werkoplossing) tot een eindvolume van 10 mL (eindconcentratie: 1% BSA, 0,05% Tween-20 in TBS; pH 7,6). Vers bereiden; indien bewaard, bewaren bij 4 °C bescherm tegen contaminatie en gebruik binnen 1 week.
Blokkingsoplossing	In-house bereid	—	Voor 10 mL: 0,5 g BSA opgelost in 10 mL 1x TBS (1 mL 10x TBS-stockoplossing + 9 mL gedestilleerd water); pH 7,6. 30 min incubatie bij 25 °C; vers bereiden.
(5% BSA in TBS)
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; 4 uur voorbehandeling om eiwitsecretie te blokkeren voorafgaand aan de cytokinedetectie.
BSA (bovien serumalbumine)	Sigma-Aldrich	A7906	5% in TBS voor blokkering; 1% in TBS + 0,05% Tween-20 als antilichaamverdunner.
Op collageen gebaseerd reagens (coating van dekglasje, optioneel)	Corning	354231	Type I collageen afgeleid van runderdermis; verdund tot 50 µg/mL in 0,01 N HCl; aangebracht bij 5–10 µg/cm² (≈100 µL/well); incubeer 1 uur bij kamertemperatuur (≈25°C); aspireer en spoel met PBS voordat de cellen worden gezaaid.
Dekglasjes, glas, 12 mm rond	Knittel-glaswerk	100013	Substraat voor adherente celkweek en kleuring.
D17 canine osteosarcoom-cellijn	Banco de céinktvissen uit Rio de Janeiro	276	Representatief celmodel; onderhouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en antibioticum-antimycoticum; bewaren bij 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
Gedeïoniseerd/gedestilleerd water	In-house bereid	—	Bufferbereiding.
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12100-046	Compleet medium voor celkweek.
Ethanol	Supelco	1.00983	Decontaminatie van dekglasjes/pincetten.
Foetaal runderserum	Sigma-Aldrich	F7524	Supplement in celkweekmedium.
(fetaal kalfsserum)
Fibronectine	Gibco	33016015	Extracellulair matrixglycoproteïne; verdund tot 0,0125 mg/mL in celcultuurmedium; toegepast bij 100 µL/well en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd (≈25°C) vóór het zaaien van de cellen.
Fijngepunthe metalen pincet	Diversen	—	Hantering van dekglasjes.
Fluorescentiemicroscoop	Leica Microsystems	DMi8	DMi8 widefield fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems), HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY-objectief; compatibel met de fluorforen in het panel (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Glazen microscoopglaasjes	Bioslide	—	Het monteren van gekleurde dekglasjes voor beeldvorming.
Glazen Petrischaal of dekglashouder	Diversen	—	Autoclaveren/bewaren van dekglasjes.
Glycine	Sigma-Aldrich	8,16E+09	Voor 10 mL van een 50 mM oplossing: 37,5 mg glycine opgelost in 10 mL TBS 1x; pH 7,6. 5 min op 25 °C; optionele stap voor het neutraliseren van aldehyden na fixatie, voorafgaand aan permeabilisatie; vers bereiden.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Voor 10 mL werkoplossing: verdun de stamoplossing 1:5000 in TBS. Nucleaire tegenkleuring; incubeer beschermd tegen licht; vers bereiden.
Bevochtingskamer	Diverse/In-house bereid	—	Voor antilichaaminkubatie; alternatief samengesteld uit een afgesloten plastic doos met bevochtigd absorberend papier.
ImageJ	Open source (NIH)	—	Wordt gebruikt voor beeldanalyse na acquisitie.
Software voor beeldacquisitie	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Gebruikt voor beeldacquisitie op een Leica DMi8.
Methanol	Merck	1.06009	Alternatieve fixatie (nucleaire antigenen/fosfo-epitopen); vooraf gekoeld tot −20 °C, 5 min incubatie; kan de phalloidine/F-actine-kleuring beïnvloeden.
Montagemedium	Sigma-Aldrich	G2289	Voor 10 mL: 8 mL glycerol + 2 mL PBS, pH 7,6, grondig mengen. Geen antifade-eigenschappen en hardt niet uit. Verzegel de randen van het dekglas met nagellak om uitdroging/drift te voorkomen, bewaar de preparaten bij 4 °C bescherm tegen licht en beeldvorm direct om fotobleken te minimaliseren.
(Op glycerolbasis)
Inbeddingsmedium (ProLongTM Glas)	Invitrogen	P36984	Bevat antifade-reagentia en hardt zelf uit binnen ~24 u bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, waardoor een permanent preparaat wordt gevormd (geen verzegeling met nagellak vereist). Bewaar de preparaten bij 2–8 °C, lichtafgeschermd bewaren tot aan de beeldvorming.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Ionische component van TBS-buffer; handhaaft de fysiologische osmolariteit om de morfologie van cellen en weefsels te behouden tijdens de wasstappen en antibody-incubatiestappen.
Naald (fijne maat, bijv. 25–27G)	Diversen	—	Wordt gebruikt als hefboom om het dekglas voorzichtig op te tillen/los te maken van de bodem van de put zonder de cellaag te beschadigen.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Voor 10 mL: 0,4 g paraformaldehyde-poeder opgelost in 8 mL PBS, verhit tot 60–65 °C met een paar druppels 1N NaOH tot het helder is, afgekoeld, de pH is bijgesteld naar 7,4 en aangevuld tot 10 mL met PBS; filter door een 0.2 µm filter voor gebruik. Bereid vers voor of verdeel in aliquoten en bewaar bij −20 °Cvermijd herhaalde vries-dooi-cycli.
Phalloïdine, fluorofoor-geconjugeerd.	Invitrogen	Afhankelijk van de gekozen fluorescentie.	Voor 10 mL werkoplossing: verdun de stockoplossing 1:400 in TBS, pH 7,6, volgens de instructies van de fabrikant. Alternatieve label voor het cytoskelet/F-actine; vers bereiden, beschermd tegen licht.
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Isotone fosfaatbuffer (pH 7,4); handhaaft de fysiologische osmolariteit om de cellulaire morfologie te behouden tijdens de fixatie- en wasstappen.
(PBS)
Poly-L-lysine (coating van het dekglasje, optioneel)	Sigma-Aldrich	P8920	Synthetisch polykationisch coatingreagens dat de elektrostatische celadhesie verbetert; gebruikt in een concentratie van 0,1 mg/ml in gedestilleerd water; voldoende volume om het oppervlak van het dekglas te bedekken; 30 min incuberen bij 25 °C vóór het uitzaaien van de cellen.
Primair antilichaam, anti-actine (geit host)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anti-actine-antilichaam; polyclonaal, niet-geconjugeerd, gedetecteerd met een anti-geiten secundair antilichaam. Gebruikt in een werkverdunning van 1:200.
Primair antilichaam, anti-IFN-β (muisgastheer)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anti-IFN-β antilichaam; polyclonaal, niet-geconjugeerd, gedetecteerd met een anti-muis secundair antilichaam. Gebruikt in een werkverdunning van 1:200.
Primair antilichaam, anti-p14ARF (konijn host)	Calbiochem	PC409	Anti-p14ARF-antilichaam; polyclonaal, niet-geconjugeerd, gedetecteerd met een anti-konijn secundair antilichaam. Dit product is uit de assortiment gegaan; er zal een nieuw antilichaam gevalideerd moeten worden als er werkzaamheden aan dit target gepland zijn. Gebruikt in een werkverdunning van 1:200.
Secundair antilichaam, anti-konijn, Alexa Fluor 488-geconjugeerd	Thermo Fisher Scientific	A32731TR	Anti-konijnen AF488-geconjugeerd antilichaam. Gebruikt in een werkverdunning van 1:500.
Secundair antilichaam, anti-geit, Alexa Fluor 555-geconjugeerd	Thermo Fisher Scientific	A-21432	Anti-geiten AF555-geconjugeerd antilichaam. Gebruikt in een werkverdunning van 1:500.
Secundair antilichaam, anti-muis, Alexa Fluor 647-geconjugeerd	Thermo Fisher Scientific	A-21235	Anti-muis AF647-geconjugeerd antilichaam. Gebruikt in een werkverdunning van 1:500.
Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 10x stockoplossing	In-house bereid	—	Voor 100 mL: los 6,06 g Tris-base en 8,77 g NaCl op in 80 mL gedestilleerd water; stel de pH bij naar 7,6 met geconcentreerd HCl; vul aan tot een eindvolume van 100 mL; autoclaveer. Verdun 1:10 in gedestilleerd water voor de werkopleossing (TBS 1x) (eindconcentratie: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6); bewaar bij kamertemperatuur of 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
TBST (TBS + 0,05% Tween-20)	In-house bereid	—	Voor 10 mL: 1 mL TBS 10x voorraadoplossing + 8,995 mL gedestilleerd water + 5 µL Tween-20 (0,05% v/v); pH 7,6. Wasbuffer tussen de kleuringsstappen; vers bereiden, binnen ~1 week gebruiken bij 4 °C.
Tris-basis	Sigma-Aldrich	252859	Bufferingsmiddel gebruikt voor het bereiden van de TBS-stoomoplossing; handhaaft de pH-stabiliteit in het fysiologische bereik (pH 7,6) voor immunofluorescentie-was- en verdunningsbuffers.
Triton X-100 (octylfenolethoxylaat non-ionisch detergent)	Sigma-Aldrich	X100	Voor 10 mL: 10 µL Triton X-100 in 9,99 ml 1x TBS voor 0,1% TX100; 30 µL in 9,97 mL TBS 1x met 0,3% TX100 (doelwitafhankelijk; nucleaire doelwitten vereisen hogere concentraties).
Trypsine-EDTA	Gibco	25200056	Gebruikt voor celdetachering.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Gebruikt in TBS voor wasbuffer (TBST) en antilichaamverdunner (TBST-BSA 1%).