Methodenartikel

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forward genetics screens worden routinematig gebruikt om duizenden genetische elementen op een gezamenlijk plan te verstoren met als doel grootschalige genotype-tot-fenotype kaarten te produceren. Hoewel vaak uitgevoerd in celkweeksystemen, ondersteunt het verzamelde bewijs dat in vivo-screens de kracht hebben om nieuwe biologie te onthullen die niet in vitro kan worden herhaald. De brede toepassing van deze aanpak is echter beperkt door twee grote uitdagingen: een overheersende focus op functieverlies in plaats van genactivatie en de aanzienlijke technische obstakels van het leveren van complexe genetische bibliotheken aan specifieke weefsels in vivo. Om deze uitdagingen te overwinnen, beschrijven we een eenvoudige en veelzijdige intraductale injectiestrategie die efficiënte en snelle functionele genomische screening in de muismelkklier mogelijk maakt, door tienduizenden discrete epitheelklonen te genereren. Daarnaast bieden we alle benodigde details voor bibliotheekcreatie, intraductale injectie, schermdeconvolutie en analyse van CRISPR-Knockout- en Activatiebibliotheken voor uitgebreide in vivo screens. Met behulp van deze tools, die we CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay) noemen, hebben we nieuwe tumorsuppressors en oncogenen geïdentificeerd binnen het coderende en niet-coderende genoom in gepoolde bibliotheken variërend van 46 loci tot een vijfde van het genoom. Belangrijk is dat deze benadering en analyse ook op andere organen kan worden toegepast om de biologische functie van elk gen tijdens homeostase of ziekte te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionele genomica-screens bieden een krachtig kader om genfunctie op schaal1 te onderzoeken. De ontwikkeling van CRISPR-Cas genbewerkingstechnologieën heeft systematische verstoring van honderden tot duizenden genen parallel mogelijk gemaakt, en gecombineerde CRISPR-gebaseerde screens in zoogdiercellijnen zijn een hoeksteen geworden van modern kankerbiologisch onderzoek2. Deze in vitro-benaderingen hebben essentiële genen3, tumorsuppressors4 en synthetische dodelijke interacties5 geïdentificeerd in diverse kankercontexten. Een centrale beperking is echter het onvermogen om de complexe biologische kenmerken van tumoren in vivo vast te leggen, waaronder interacties met het immuunsysteem en stroma, nutriëntengradiënten en weefselarchitectuur binnen de micro-omgeving2. In overeenstemming met deze beperking hebben recente studies aangetoond dat veel bona fide kankerdrijvergenen geen meetbare effecten in vitro uitoefenen, vooral wanneer hun functie afhangt van micro-omgevingssignalen die ontbreken in celcultuur 6,7,8,9,10.

De muismelkklier biedt een uniek voordelige weefselcontext voor functionele genomische screening in vivo. Mammaire epitheelcellen zijn zeer regeneratief, ondergaan rondes van klonale expansie tijdens oestrouscyclus en zijn georganiseerd in een vertakt ductaal netwerk dat gemakkelijk toegankelijk en genetisch gemanipuleerdkan worden 11,12,13. Deze kenmerken hebben decennia van mozaïekgenetische analyses en afstammingstraceer-experimenten ondersteund en hebben de melkklier vastgesteld als een hanteerbaar systeem om cel-intrinsieke en micro-omgevingsafhankelijke genfunctie tijdens weefselhomeostase en ziekte te onderzoeken 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Belangrijk is dat genetische verstoringen beperkt kunnen worden tot het epitheelcompartiment, waardoor directe studie van epitheelspecifieke oorzaken van transformatie, celcompetitie, lijntrouw en tumorprogressie in een intact weefselcontext mogelijk is.

Hoewel er verschillende strategieën zijn ontwikkeld om genetische verstoringen direct in situ aan de volwassen melkklier toe te brengen, blijven er aanzienlijke technische obstakels bestaan voor toepassingen met hoge doorvoer. Adenovirus-gemedieerde afgifte van Cre-recombinase is op grote schaal gebruikt om somatische recombinatie van conditionele allelen in de volwassen melkklierte induceren, waardoor het een efficiënte manier biedt om genfunctie te manipuleren zonder de complexe kiemlijnveredeling die vereist is voor traditionele genetisch gemodificeerde muismodellen (GEMM's). Hoewel high-titer adenovirus ook CRISPR-Cas9-componenten aan weefselresidente cellen kan leveren, integreren deze vectoren niet in het gastheergenoom38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dit beperkt de schaal van screenings sterk tot ~10–55 genen, aangezien elke gRNA-doellocatie individueel moet worden gesequenced met moleculaire inversieprobes 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . Bovendien maken de huidige intraductale toedieningsmethoden directe toegang tot het mammariumductale systeem mogelijk, maar vereisen ze ofwel invasieve chirurgische blootstelling van de melkklier50, of vertrouwen ze op het gebruik van relatief grote Hamilton-spuiten die omslachtigzijn. Hoewel effectief voor lokale verspreiding van virussen, zijn deze benaderingen relatief invasief, technisch uitdagend en niet geoptimaliseerd voor schaalbare levering van gepoolde lentivirale bibliotheken. Gezamenlijk tonen deze studies aan dat in situ virale verstoringen haalbaar zijn, maar de huidige instrumenten ondersteunen niet de stabiele, gepoolde, sequentie-herwinbare verstoringen die nodig zijn voor high-throughput in vivo CRISPR-screening.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben wij en anderen ons gewend tot het integreren van lentivirale vectoren, die stabiele en erfelijke genetische modificaties mogelijk maken. In tegenstelling tot celkweeksystemen leggen in vivo weefsels strikte beperkingen op aan het aantal verstoorde cellen dat binnen één orgaan kan worden gegenereerd, waardoor genomenbrede screening onpraktisch wordt. Daarom vereisen in vivo CRISPR-schermen het ontwerp van biologisch geïnformeerde, gerichte bibliotheken die dekking en haalbaarheid in balans brengen. Bovendien hebben de meeste in vivo CRISPR-screens, hierbesproken 2, zich vrijwel uitsluitend gericht op lentivirale functieverliesverstoringen, ondanks toenemend bewijs dat genactivatie complementaire en niet-overlappende biologische inzichten kan onthullen 52,53,54,55. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat het integreren van lentivirale CRISPR-verstoringen in het volwassen melkepitheel stabiele, erfelijke genetische modificatie in situ mogelijk maakt en dat deze kunnen worden teruggewonnen en gekwantificeerd uit genomisch DNA 36,55,56,57,58. Met deze aanpak voerden we gepoolde in vivo CRISPR-screens uit die nieuwe oorzaken van oncogene transformatieidentificeerden, waarmee zowel de haalbaarheid als de biologische relevantie van lentivirale afgifte en CRISPR-screening werden vastgesteld. Deze studies benadrukten echter ook de noodzaak van een eenvoudig, gestandaardiseerd en schaalbaar protocol dat breed kon worden aangenomen en uitgebreid om zowel verlies- als gain-of-function screeningsmodellen binnen dezelfde klier te omvatten.

Hier beschrijven we een eenvoudige en veelzijdige intraductale injectiestrategie die parallelle in vivo screening van CRISPR-knockout- en activatiebibliotheken, CRISPR-KOALA genoemd, in de melkklier van de volwassen muis55 mogelijk maakt. CRISPR-KOALA gebruikt ofwel een conventioneel 20-21 bp 'single-guide' (sg)RNA voor CRISPR-KO-mogelijkheden, of een 14 bp 'dead-guide' (dg)RNA voor CRISPR-A. Het dgRNA leidt Cas9 efficiënt naar zijn doelplaats, maar voorkomt de activiteit van de endonucleasevan Cas9 59,60,61, en maakt het zo mogelijk om een enkele muis te gebruiken die actief Cas9 tot expressie brengt voor zowel knockout- als activatiemodaliteiten. Het introduceren van twee PP7-haarspelden in het dgRNA trcr maakt de rekrutering van een PP7-manteleiwit:P65:HSF1 transactivator62 mogelijk en leidt tot efficiënte overexpressie van genen in vivo55 (Figuur 1). Door gericht gRNA-bibliotheekontwerp te combineren met high-titer lentivirale productie en niet-chirurgische intraductale levering met behulp van glasmicrocapillairen, genereert deze aanpak tienduizenden ruimtelijk discrete epitheelklonen terwijl weefselarchitectuur en micro-omgevingsinteracties behouden blijven. Belangrijk is dat lentivirale integratie in het gastheergenoom het herstel en kwantificeren van gRNA's mogelijk maakt via high-throughput sequencing, waardoor gepoolde functionele genomische screens in vivo mogelijk zijn. Samen maakt dit parallelle of gelijktijdige (in dezelfde cel) CRISPR-KO en CRISPR-A verstoringen mogelijk binnen dezelfde melkklier van een Cas9-expressieve muis.

We presenteren een gedetailleerd stapsgewijs protocol dat gRNA-bibliotheekontwerp, lentivirale productie en concentratie, intraductale toediening, bibliotheekdeconvolutie en data-analyse omvat (Figuur 1). Samen biedt deze methode een praktisch en schaalbaar kader voor in vivo CRISPR-knockout en/of activatiescreening in de muismelkklier en kan worden aangepast om genfunctie te bestuderen tijdens weefselhomeostase, verschillende ziektecontexten, andere weefsels en andere soorten zoals de rat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en goedgekeurd door het Centre for Phenogenomics Animal Care Committee (protocol 26-0272H).

1. CRISPR-bibliotheekkloning

OPMERKING: Deze sectie beschrijft het samengevoegd klonen van CRISPR-knockout- en CRISPR-activatiebibliotheken uit array-gesynthetiseerde oligonucleotiden in lentivirale ruggengraaten. We genereren routinematig bibliotheken met tot 4.000 gRNA's, die kunnen worden gescreend met 400X-1.000X dekking in 8-20 muizen. Het aantal gRNA's en de dekking kunnen indien nodig worden aangepast, wat het aantal muizen beïnvloedt dat nodig is om de statistische kracht te behouden. Wij raden aan een minimale dekking van 400X te hanteren, wat voldoende kan zijn voor sterke gain-of-function fenotypes.

  1. Ontwerp van gids-RNA-bibliotheek
    1. Stel een lijst samen van alle muisgenen die binnen één experiment gescreend moeten worden voor downstream CRISPR-bibliotheekontwerp, waarbij aparte doelenlijsten worden bijgehouden voor CRISPR knockout (CRISPR-KO) en CRISPR activation (CRISPR-A) bibliotheken.
      OPMERKING: CRISPR-KO- en CRISPR-A-bibliotheken worden afzonderlijk gegenereerd en kunnen worden gecombineerd tijdens lentivirale transductie voor gelijktijdige screening.
    2. Voor CRISPR-KO-bibliotheken selecteert u vier tot vijf single guide RNA's (sgRNA's) per gen met behulp van hoogscorende voorspellingsalgoritmen zoals CRISPick62,63, CHOPCHOP64 of VBC Score65.
      OPMERKING: De VBC-score levert een zeer hoge effectiviteit en on-target activiteit66 op. Ongeacht het gereedschap, geef prioriteit aan gidsen met hoge voorspelde on-target activiteit, minimaal off-target potentieel en gerichte coderingsexons.
    3. Voor CRISPR-A-bibliotheken selecteert u acht tot tien gidsen per gen met CRISPick62,63 of CHOPCHOP64. Voor gereedschappen die door de gebruiker opgegeven geleidelengtes toestaan (zoals CHOPCHOP), stel de geleiderlengte in op 14 bp vóór de generatie van de gids. Als een tool wordt gebruikt die slechts 20 bp-gidsen genereert, converteer deze sequenties dan naar dead-guide RNA's (dgRNA's) door de 14 bp-sequentie direct 5' van het protospacer-aangrenzende motief te behouden, dat promotorgebieden van genen aanpakt.
      OPMERKING: dgRNA's zijn afgeknotte gidssequenties die ontworpen zijn om CRISPR-gebaseerde transcriptionele activatie mogelijk te maken met ongeveer 50-85% van de effectiviteit van full-length sgRNAs55 zonder DNA-splitsing te induceren 59,60,61.
    4. Bundel alle sgRNA's of dgRNA's die bij één experiment horen in aparte lijsten om uniforme klonen, virale productie en in vivo screening mogelijk te maken.
      OPMERKING: sgRNA en dgRNA's die samen gescreend worden, worden gebundeld voor postvirale productie.
    5. Genereer gepoolde negatieve controlebibliotheken voor CRISPR-KO en CRISPR-A screens, inclusief niet-targeting55,67 en niet-genetische gRNA-sequenties68, zoals eerder beschreven, om achtergrondeffecten te controleren onafhankelijk van genverstoring of activatie.
      OPMERKING: Indien gewenst kunnen aparte bibliotheken van niet-doel- en niet-genetische gRNA's worden gemaakt om twee onafhankelijke negatieve controlebibliotheken te creëren.
  2. Ontwerp en amplificatie van oligonucleotidepools
    1. Ontwerp gepoolde oligonucleotiden zodanig dat elk gRNA de targetingsequentie bevat, restrictie-enzymoverhangen die compatibel zijn met de bestemmingslentivirale ruggengraat, en bibliotheekspecifieke primersequenties om selectieve amplificatie uit een complex oligonucleotidpool mogelijk te maken (Figuur 1, Tabel 1).
    2. Wijs een uniek primerpaar toe aan elke gRNA-bibliotheek om onafhankelijke amplificatie van individuele bibliotheken uit een gedeelde oligonucleotidepool mogelijk te maken. Unieke primerparen worden vermeld in Tabel 1.
    3. Bestel gepoolde oligonucleotidebibliotheken van een commercieel array-syntheseplatform, zodat de equimolaire representatie van alle gRNA's binnen elke pool wordt gegarandeerd.
    4. Versterk individuele gRNA-bibliotheken uit de gepoolde oligonucleotide template met bibliotheekspecifieke primers in het volgende reactiemengsel. De reactie kan worden aangepast om te voldoen aan de aanbevolen samenstelling van de specifieke polymerase. Bereid drie reacties voor met een gepoolde oligonucleotide template en één negatieve controlereactie zonder template.
      4 ng Pooled oligonucleotide template
      2,5 μL 10 μM Vooraan-bibliotheekspecifieke primer
      2,5 μL 10 μM Reverse-bibliotheekspecifieke primer
      10 μL 5x reactiebuffer
      0,5 μL High-fidelity DNA-polymerase
      X μL Nucleasevrij water
      50 μL Totaal volume
    5. Voer PCR-versterking uit met de volgende cyclische condities, waarbij de annealingtemperatuur wordt aangepast op basis van bibliotheekspecifieke primersmelttemperatuur:
      1 cyclus van 98 °C gedurende 30 seconden
      18 cycli van 98 °C voor 10 seconden, 62–65 °C voor 20 seconden en 72 °C voor 3 seconden
      1 cyclus van 72 °C voor 5 minuten
      OPMERKING: Overschrijd 18–19 amplificatiecycli niet om gelijke gRNA-representatie binnen de bibliotheek te behouden.
    6. Resolve PCR-producten op een 2,5% agarosegel bij 120 V gedurende ongeveer 45 minuten en verwijder de band die overeenkomt met de verwachte gRNA-insertgrootte (ongeveer 100 bp, afhankelijk van primerontwerp; Figuur 2A).
    7. Zuiver PCR-producten met een gelextractiekit en elueer in 20 μL ultrazuiver water tijdens de laatste elueringsstap.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gezuiverde gRNA-inserts kunnen worden opgeslagen bij -20 °C vóór het klonen.
  3. Voorbereiding en vertering van lentivirale ruggengraat
    1. Bereid lentivirale backboneplasmiden voor met een verwijderbare stuffer-sequentie voor het klonen van gRNA-inserts. Voor in vivo CRISPR-KO en CRISPR-A bibliotheken gebruiken respectievelijk pLKO-Cre (Addgene Plasmid #158032 of 256774) en pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plasmid #256776).
    2. Digesteer 5–10 μg lentiviraal ruggengraat-DNA in een totaal reactievolume van 200 μL met het juiste restrictie-enzym en buffer. Gebruik Esp3I voor de pLKO-Cre CRISPR-KO ruggengraat en SapI voor de pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A ruggengraat.
      5–10 μg ruggengraatplasmide
      20 μL 10x enzymbuffer
      5 μL Restrictie-enzym
      X μL Nucleasevrij water
      200 μL Totaal volume
    3. Incubeer digesteringsreacties gedurende 2–3 uur bij 37 °C.
    4. Voeg 2 μL recombinant alkalische fosfatase toe aan elke verteringsreactie en incubeer 1 uur bij 37 °C om de verteerde ruggengraat te defosforyleren.
    5. Verwijder de verteerde producten op een 1% agarosegel en verwijder de band die overeenkomt met de lineaire ruggengraat (Figuur 2B,C)
      OPMERKING: Voor beide ruggengraaten is het stufferfragment zichtbaar als een aparte band bij ongeveer 2000-2500 bp, afhankelijk van de vector.
    6. Zuiver het verwijderde ruggengraat-DNA met een gelextractiekit en elueer in een minimaal volume ultrazuiver water om een hoge DNA-concentratie (meestal 20 μL) te behouden.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gezuiverde verteerde ruggengraat kan worden bewaard bij -20 °C vóór ligatie.
  4. Vertering en ligatie van gRNA-bibliotheken
    1. Stel alles-in-één verterings-ligateringsreacties op met 750 ng gezuiverd lentiviraal ruggengraat-DNA, 43 ng gRNA-bibliotheek-insert-DNA, 3 μL restrictie-enzym, 7,5 μL T4-DNA-ligase, 15 μL 10 mM ATP en de juiste hoeveelheid reactiebuffer en steriel gedestilleerd water om een totaal reactievolume van 150 μL te bereiken.
      OPMERKING: Gebruik hetzelfde restrictie-enzym dat oorspronkelijk werd gebruikt bij de plasmid-ruggengraatdigestiestap. Een verhouding van 750 ng gezuiverde lentivirale ruggengraat tot 43 ng bibliotheek-inzet-DNA levert een benaderende vector-tot-inzetmolaire verhouding van 1:7 op wanneer de aanbevolen ruggengraat wordt gebruikt.
    2. Verdeel elke ligatiemengsel in drie gelijke aliquots om de transformatie-efficiëntie en bibliotheekcomplexiteit te verhogen.
    3. Bereid een enkele negatieve controlereactie voor met backbone-DNA maar geen gRNA-inserts om achtergrondligatie te beoordelen.
    4. Incubeer spijsverterings-ligateringsreacties 's nachts bij 30 °C.
    5. Voeg de volgende ochtend 1 μL van het juiste restrictie-enzym toe aan elke reactie-aliquot en incubeer 1 uur bij 37 °C om de backbone-digestie te voltooien.
    6. Voeg 2 μL 10 mM ATP en 2 μL T4 DNA-ligase toe aan elke reactie en incubeer bij 25 °C gedurende 2–3 uur om de ligatie te voltooien.
    7. Combineer de drie afzonderlijke verterings-ligateringsreacties per bibliotheek, zuiver de reacties met een kolomgebaseerde oligonucleotide reinigingsmethode en elueer elk in 21 μL ultrazuiver steriel gedestilleerd water. Eliut de enkele gezuiverde negatieve controlereactie in 7 μL ultrazuiver steriel gedestilleerd water.
      OPMERKING: Elueer geen ligatieproducten in buffers met zout of EDTA, omdat deze de efficiëntie van de bacteriële elektroporatie aanzienlijk verminderen. (PAUZEPUNT) Gezuiverde ligatieproducten kunnen worden opgeslagen bij -20 °C vóór elektroporatie.
  5. Bibliotheek-elektroporatie en uitbreiding
    1. Pre-koel 0,1 cm elektroporatiecuvetten, microcentrifugebuizen met 2 μL aliquots gezuiverde ligatieproducten, en 14 mL rondbodem polypropyleenkweekbuizen op ijs gedurende minstens 20 minuten vóór elektroporatie.
    2. Ontdooi elektrocompetente bacteriële cellen op ijs en meng voorzichtig 25 μL cellen met 2 μL gezuiverd ligatieproduct in de voorgekoelde microcentrifugebuis door te pipetteren.
    3. Breng het cel-DNA-mengsel over naar een voorgekoelde 0,1 cm elektroporatiecuvet en elektroporate bij 1,8 kV, 25 μF en 200–600 Ω.
      OPMERKING: Een succesvolle elektroporatie levert doorgaans een tijdconstante op tussen 4,6 ms en 4,9 ms.
    4. Voeg onmiddellijk 1 mL voorverwarmd 37 °C herstelmedium met de elektrocompetente cellen toe aan de cuvet, suspendeer de cellen voorzichtig en breng de suspensie over in een 14 mL ronde polypropyleenbuis.
    5. Incubeer de teruggevonden cellen bij 30 °C terwijl je schudt op 180 rpm gedurende 90 minuten.
    6. Plaat 10 μL van de teruggewonnen cellen, verdund in 90 μL LB-bouillon op LB-agarplaten met ampicilline en 's nachts incuberen bij 30 °C om de transformatie-efficiëntie en achtergrondligatie te beoordelen.
      OPMERKING: Succesvol klonen zou moeten resulteren in honderden kolonies op de plaat met insert en enkele (> 30) kolonies op de backbone-only negatieve controleplaat (Figuur 3).
    7. Valideer de bibliotheek verder door ~10 kolonies te kiezen voor miniprep en Sanger sequencing forwards van de U6-promotor. Succesvol gekloonde bibliotheken zullen < 90% van de minipreps bevatten met duidelijke sequencing van een gRNA, zonder herhaalde gidsen over de 10 minipreps. Daarnaast verteert het restrictie-enzym de minipreps en de gepoolde plasmidebibliotheek (stap 1.5.10) en draait op een agarosegel om bandgroottes te controleren en te verzekeren dat de lentivirale constructies geen afwijkende recombinatie hebben ondergaan.
      OPMERKING: De bibliotheekrepresentatie kan worden beoordeeld door het aantal kolonies van verdunningsplaten te vergelijken met het totale aantal gRNA's in de bibliotheek, met een doelwit van een dekking van 1.000 voeten. Meerdere seriële verdunningen kunnen worden gebruikt om deze berekening te ondersteunen.
    8. Als de transformatie-efficiëntie voldoende is, plaats je de resterende teruggevonden cellen op 15 cm LB-agar platen met het juiste antibioticum en breng je het 's nachts uit bij 30 °C om een dicht gazon van kolonies te creëren.
      OPMERKING: Plaat 100 μL van teruggevonden cellen op elk van tien agarplaten van 15 cm lb om voldoende kolonies terug te winnen.
    9. De volgende dag gebruik je een celschraper om bacteriële kolonies te schrapen in 500 mL LB-bouillon met ampicilline om een enkele bacteriële cultuur te genereren die de gekloonde gRNA-bibliotheek vertegenwoordigt.
    10. Breid de verzamelde bacteriële cultuur uit bij 30 °C met schudden gedurende ongeveer 3 uur en isoleer plasmide-DNA met een maxiprep-kit.

2. Lentivirale productie voor in vivo screening

OPMERKING: Voor intraductale levering en in vivo pooled screening moeten lentivirale preparaten geconcentreerd worden om hoge titers te bereiken (idealiter tussen 1 x 108 pfu/mL en 1 x 109 pfu /mL) om een efficiënte transductie van mammaire epitheelcellen te garanderen. Het volgende protocol beschrijft de productie van hoog-titer lentivirale producten die geoptimaliseerd is voor gebruik in vivo .

  1. Bereiding van lentivirale producerende cellen
    1. Houd HEK293TN cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal rundserum, 1% penicilline-streptomycine en kweekcellen bij 37 °C met 5%CO2.
    2. Doorgang van cellen elke 2–3 dagen om de logaritmische groei te behouden en ervoor te zorgen dat cellen niet meer dan 90% confluentie bereiken. Gebruik cellen bij passages <20 voor optimale virale productie.
    3. Een dag voor transfectie bedek 15 cm weefselkweekplaten met poly-L-lysine (0,02 mg/mL) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bereid negen borden voor één batch virale bereiding.
    4. Verwijder de poly-L-lysineoplossing en was platen twee keer met fosfaatgebuffte zoutoplossing.
    5. Zaad 1,1 x 107 HEK293TN cellen op elk van de negen poly-L-lysine-gecoate 15 cm weefselkweekplaten, zodat cellen bij transfectie ~90% confluentie bereiken.
      OPMERKING: Voor toepassingen die geen maximale virale titers vereisen, kan de lentivirale productie worden teruggebracht tot minder platen (bijvoorbeeld drie of zes platen) met proportioneel verminderde opbrengsten. Schaal de reagentia (plasmide-DNA, PEI en DMEM) dienovereenkomstig af voor transfectie.
  2. PEI-gebaseerde lentivirale transfectie
    1. Bereid plasmide-DNA voor lentivirale productie met behulp van een drie-plasmidesysteem bestaande uit 95 μg van het gRNA-bibliotheekplasmide, 95 μg van het verpakkingsplasmide psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) en 65 μg van het VSV-G envelope plasmide pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
    2. Combineer de drie plasmiden voor lentivirale productie in 10,8 mL serumvrije DMEM en meng grondig door vortex gedurende ongeveer 10 seconden.
    3. Voeg 366 μL 1 mg/mL polyethylinamine (PEI) druppelgewijs toe aan de verdunde DNA-oplossing, meng grondig door vortex te laten vartexen gedurende ongeveer 10 seconden, en incubeer de DNA-PEI-complexen bij kamertemperatuur gedurende 10–30 minuten.
    4. Tijdens de complexvorming aspireert u kweekmedium van de HEK293TN platen en voegt u 14 mL serumvrij DMEM toe.
      OPMERKING: Fetaal rundereserum kan de plasmidopname door de cellen remmen.
    5. Verdeel 1,2 mL van het DNA-PEI-complex druppelgewijs over de plaat en het gesteente om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
    6. Incubeer cellen bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 6–8 uur.
    7. Vervang het medium op elke plaat door 20 ml voorverwarmde DMEM, aangevuld met 10% foetaal rundserum (zonder 1% penicilline-streptomycine) en blijf de cellen kweken bij 37 °C met 5%CO-2.
      OPMERKING: Een transfectie van de nacht wordt niet aanbevolen, omdat langdurige blootstelling aan PEI en een gebrek aan serum de virale opbrengst vermindert.
  3. Virale oogst en ultracentrifugatie
    1. Bereid 200 mL van een sucrosekussenoplossing door 40 g sucrose, 11,7 g natriumchloride, 4 mL 1 M HEPES (pH 7,4) en 1 mL 0,5 M EDTA (pH 7,9) te combineren in een passend volume steriel gedestilleerd water en filter-steriliseer via een 0,45 μm laag-eiwitbindende polyethersulfone filtratie-eenheid. Deze oplossing kan enkele maanden op 4 °C worden bewaard.
    2. Verzamel het lentivirale supernatant 48–72 uur na transfectie.
    3. Laat 10 mL DMEM aangevuld met 10% foetaal rundserum door de 0,45 μm laag-eiwitbindende polyethersulfone filtratie-eenheid gaan. Laat de flow erdoorheen vallen. Vul het supernatant op het filter en breng het vacuüm aan.
      OPMERKING: Als concentratie niet direct kan worden uitgevoerd, bewaar dan geklaarde virale supernatant bij 4 °C een nacht.
    4. Voeg 30 mL geklaard viraal supernatant toe aan een ultracentrifugebuis.
    5. Leg langzaam 4 ml sucrosekussenoplossing onder de geklaarde virale supernatant.
    6. Plaats de ultracentrifugebuis in een compatibele adapter voor een schuddende emmerrotor en balanceer de buizen nauwkeurig.
    7. Centrifugeer de buizen op 104.000 × g gedurende minstens 2 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Een zwaaiende emmerrotor, zoals de Beckman JS24.38 rotor, is nodig om het virus correct door het sucrosekussen te pelleten.
    8. Giet het supernatant voorzichtig over zonder de virale pellet te verstoren, die als een zwakke witte of doorschijnende film op de bodem van de buis kan verschijnen.
    9. Laat de buizen minstens 10 minuten aan de lucht drogen en gebruik een laboratoriumdoekje om zoveel mogelijk restvloeistof uit de buis te verwijderen zonder de pellet te verstoren.
      OPMERKING: Een juiste drooglegging van de buis is cruciaal om hoge virale concentraties te bereiken, omdat dit het uiteindelijke herstelvolume vermindert.
    10. Susser virale pellets opnieuw in 20 μL koude, fosfaatgevulde zoutoplossing en pipetteer voorzichtig op en neer, waarbij je luchtbellen vermijdt.
    11. Incubeer de buizen 2 uur op ijs met voorzichtige beweging om de virale pellets volledig te laten ophangen.
    12. Breng het geconcentreerde virus over in een schone microfugebuis en zuiver de oplossing door centrifugatie bij 2.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Deze spin verwijdert vuil en restjes die de injectienaald tijdens de operatie verstoppen.
    13. Aliquot het geconcentreerde virus in eenmalige hoeveelheden om herhaalde vries-ontdooien te voorkomen en op te slaan bij -80 °C.
  4. Lentivirale titratie met behulp van LSL-tdTomatenmuis embryonale fibroblasten (MEF's)
    1. Plaat 100.000 LSL-tdTomaten MEF's (afgeleid van Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) in een 6-well plaat een dag voor infectie in DMEM, aangevuld met 10% foetaal rundserum, 1% penicilline-streptomycine, en kweek de cellen bij 37 °C met 5%CO2. Plaats een extra put voor celtelling.
      OPMERKING: LSL-tdTomato MEFs fungeren als verslaggever voor Cre binnen het lentivirus. Elk geschikt verslaggeversysteem voor virale titering van andere ruggengraat kan worden gebruikt.
    2. Tel de volgende dag het aantal LSL-tdTomato MEFs uit een extra put om het aantal aanwezige cellen op het moment van infectie te kwantificeren.
    3. Bereid seriële verdunningen voor van geconcentreerd lentivirus dat codeert voor Cre-recombinase in totaal 2 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum. Over het algemeen geven 0,4 μL, 0,1 μL en 0,025 μL geconcentreerd virus een schoon dynamisch lineair bereik (Figuur 4A–D).
    4. Voeg 2 ml virale verdunning toe aan elke put LSL-tdTomato MEFs en 2 μL 10 mg/mL polybrene aan elk.
    5. Infecteer MEFs door 90 minuten op 400 × g te draaien bij 37 °C.
    6. Vervang virale media door 2 mL DMEM aangevuld met 10% foetaal rundserum, 1% penicilline-streptomycine, en kweek de cellen bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 48–72 uur.
    7. Kwantificeer de tdTomato-positieve cellen met fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie om het aandeel geïnfecteerde cellen bij elke verdunning te bepalen.
    8. Bereken de functionele titer op basis van het aandeel geïnfecteerde cellen en het aantal aanwezige cellen op het moment van infectie.
      OPMERKING: CRISPR-KO en CRISPR-A virussen worden afzonderlijk geproduceerd, geconcentreerd en getitreerd. Functioneel worden titers bepaald met LSL-tdTomato MEFs gebruikt om CRISPR-KO en CRISPR-A virussen te mengen in een bepaalde verhouding vóór intraductale injectie.
  5. Kwaliteitsbeoordeling van plasmide- en lentivirusbibliotheken
    1. Om te verzekeren dat de gRNA-bibliotheken met voldoende diepte/dekking zijn gekloond en dat alle gRNA's behouden blijven tijdens klonen en virusproductie, wordt sterk aanbevolen om zowel de plasmidpool als de getransduceerde MEF's te sequencen.
    2. Om lentivirale dekking te beoordelen, transfect MEFs met lentivirus op >1000× dekking op basis van berekende virale titer. Het is niet nodig om tijdens deze stap een enkele infectie van cellen te garanderen.
    3. Na 48–72 uur wordt de cellen losgemaakt met trypsine of een celschraper en de cellen gepellet. Extraheer het DNA met een commerciële gDNA-extractiekit.
    4. Sequentie 1 μg plasmide en 3 μg geëxtraheerd MEF-DNA volgens het protocol beschreven in sectie 5. Diepe sequencing van 5 miljoen reads is voldoende voor de meeste custom libraries met <5000 gRNA's.
      OPMERKING: Een sterke correlatie (R2> 0,6) tussen de reads van de plasmidpool en een relatief gelijke representatie van gidsen (>70% van gidsen binnen 1 logtiem decennium) zonder individuele gidsen die het aantal bibliotheken domineren, duidt op goede kwaliteit (Figuur 4E).

3. Intraductale lentivirale injectie in de muismelkklier

  1. Naald- en virusverdunning
    1. Trek glazen microcapillaire naalden met een micropipetnaaldtrekker om fijnpuntige haarvaten te genereren die geschikt zijn voor intraductale injectie van 9–10 μL volumes. Gebruik een paar fijne pincetten om de punt van de naald af te breken.
      OPMERKING: De optimale locatie zorgt voor een naaldmaat die groot genoeg is om met vloeistof geladen te worden, maar dun genoeg om gemakkelijk in de opening van de tepel te passen.
    2. Verdun lentivirale preparaten tot een uiteindelijke concentratie van 1 × 107 pfu/mL in steriele, fosfaatgeborrelde zoutoplossing aangevuld met 0,05% (w/v) Fast Green FCF-kleurstof.
    3. Als CRISPR-KO en CRISPR-A virussen worden gemengd om ze binnen dezelfde complexe pool te screenen, pas dan de twee bibliotheken aan op een gelijke virale titer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing en meng ze in een verhouding om een gelijke representatie van gRNA's in beide bibliotheken te garanderen.
  2. Voorbereiding van muizen voor intraductale injectie
    1. Verdoof een volwassen vrouwelijke muis (8–20 weken oud) onder 4% isofluraan met 1 L/min zuurstof en breng steriel oogvocht aan op beide ogen om het hornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
      OPMERKING: Intraductale injectie is een niet-invasieve procedure en vereist geen analgesie. Gebruik Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 of Rosa-LSL-tdTomatenmuizen voor deze experimenten.
    2. Zet de muis in rugligging vast op een afgedekt verwarmingskussen dat op laag staat om de lichaamstemperatuur te behouden en de anesthesie te behouden met 2% isoflurane en 1 L/min zuurstof via de neuskegel gedurende de procedure.
    3. Verwijder de vacht rond de derde thoracale en vierde buiktepel met onthaaringscrème aangebracht met een steriel wattenstaafje in een cirkelvormig gebied van ongeveer 0,5 cm straal gedurende 10–15 seconden. Verwijder de crème onmiddellijk met steriel gaas en steriel water om huidirritatie te voorkomen.
      OPMERKING: De derde en vierde melkklier zijn routinematig het gemakkelijkst te injecteren. Alternatief kunnen de tweede en vijfde klieren op dezelfde manier worden voorbereid voor injectie.
    4. Desinfecteer de huid rondom elke tepel door sequentieel te swabben met 70% isopropylalcohol en jodium met steriel gaas.
    5. Plaats de muis onder een dissectiemicroscoop in een bioveiligheidskast om de tepels duidelijk zichtbaar te kunnen maken.
    6. Verwijder voorzichtig met fijne pincetten die met 70% ethanol de dode huid bedekt om de ductale opening bloot te leggen.
      OPMERKING: Deze dode keratinise-laag zit losjes vast en kan de naald belemmeren. Verwijdering mag geen levensvatbare huid of onderliggend weefsel beschadigen.
  3. Intraductale injectie
    1. Laad 8 μL van het verdunde virus in een getrokken glazen microcapillair.
    2. Houd het tepelgebied vast met een paar fijne tangen en steek voorzichtig de naaldpunt in de opening van de tepel (Figuur 5A). Een correct geplaatste naald zal met minimale weerstand het kanaal binnenkomen. Geef de virale suspensie langzaam in het melkkanaal gedurende 5–10 seconden.
      OPMERKING: 8 μL van een lentivirus van 1 × 107 pfu/mL levert ongeveer 30% infektiviteit op van de luminale melkepitheelcellen en 5% infectie van de basale mammaire epitheelcellen, met verwaarloosbare infectie (< 0,5%) van het stroma36. De virale titer kan worden aangepast om een hogere of lagere infectiviteit te bereiken.
    3. Monitor de verspreiding van Fast Green-kleurstof tijdens de injectie met de dissectiemicroscoop. Bevestig succesvolle intraductale levering door kleurstofverspreiding te observeren door het ductale netwerk onder de huid (Figuur 5B).
    4. Identificeer mislukte injecties door kleurstof te verzamelen in het borstvetkussen naast de tepel in plaats van langs de ductale boom (Figuur 5C).
    5. Herhaal de injectieprocedure voor de derde thoracale en vierde buikklieren aan beide zijden, waarbij in totaal vier klieren per muis worden geïnjecteerd.
      OPMERKING: Met ervaring wordt succesvolle intraductale toediening bereikt in >95% van de injecties. Mislukte injecties die beperkt zijn tot het vetkussen zijn niet geassocieerd met bijwerkingen, en de resterende klieren kunnen nog steeds worden gebruikt. Verdere validatie van injecties kan worden uitgevoerd via immunohistochemie en flowcytometrie (Figuur 5D,E).
    6. Stop met de narcose en breng de muis naar een schone herstelkooi.
    7. Houd de muis in de gaten totdat deze volledig loopbaar is en breng hem terug naar de aangewezen bioveiligheidsbehuizing zodra normaal gedrag is geobserveerd.
    8. Drie dagen na de injectie voer je een volledige kooiwissel uit, waarbij je alle behuizing en bodembedekking als viraal afval weggooit, en de muis overbreng naar een schone kooi die weer in de standaardbehuizing kan worden teruggebracht.

4. Genomische DNA-isolatie uit melkklieren en tumoren

OPMERKING: Euthanaseer muizen door blootstelling aanCO2 of een overdosis anesthetica, gevolgd door een ontwrichting van de baarmoederhals, in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging. Oogst melkklieren of borsttumoren op de gewenste tijdstippen of op een humaan eindpunt volgens de regelgeving. Geïnfecteerde cellen zijn al geoogst vanaf 48 uur na lentivirale infectie36,55 of zo laat als 5+ maanden na injectie bij wildtypemuizen36, of >24 maanden in oncogene achtergronden55. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een ruimte die schoongemaakt is met DNA Erase en met apparatuur die vrij is van plasmiden die sgRNA/dgRNA-cassettes bevatten. Zelfs sporen van plasmide-DNA zijn voldoende om te leiden tot besmetting van weefselmonsters, en daaropvolgende diepe sequencing PCR's en negatieve (zonder weefsel) controles moeten worden uitgevoerd om een schone voorbereiding te garanderen.

  1. Weefseldissociatie
    1. Voor melkklieren verteert u elke melkklier in 2 mL volledige Epicult-B Medium (muis) aangevuld met 0,2 mL milde collagenase/hyaluronidase in een 15 mL conisch buisje en broeden ze een nacht uit bij 37 °C.
    2. Pellet dissocieerde cellen bij 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Breng voorzichtig de bovenste vetlaag over met een rundserum-gecoate pipetpunt op een nieuwe 15 mL conische buis en gooi de resterende supernatant weg.
      OPMERKING: De bovenste vetlaag in deze stap bevat vaak resterende epitheelorganoïden die niet zijn gescheiden en nog steeds geassocieerd zijn met het vetweefsel. Het verwerken van deze fractie in een aparte buis verhoogt het herstel van epitheelcellen aanzienlijk.
    4. Was zowel de vetfractie als de celpellet één keer met 5 ml fosfaatgebuffte zoutoplossing, centrifugeer op 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en gooi de supernatanten weg.
    5. Combineer de gewassen vetfractie en de celpellet van dezelfde melkklier tot één 15 ml conische buis met 5 ml fosfaatgeborrelde zoutoplossing.
    6. Pellet het gecombineerde materiaal op 450 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    7. Bij borsttumoren snijd je het weefsel in kleine stukjes met een steriele schaar of een scalpel en breng je het direct over in een 2 mL microfugebuis.
  2. Genomische DNA-isolatie
    OPMERKING: Genomische DNA-extractie kan worden uitgevoerd met de Qiagen DNEasy Blood and Tissue kit volgens de instructies van de fabrikant of met het volgende fenol-chloroformprotocol.
    1. Bereid een DNA-lysebuffer voor door 5 mL van 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL EDTA (pH 8,0), 25 mL 5 M NaCl en 50 mL van 10% SDS te combineren, en breng het uiteindelijke volume tot 500 mL met steriel gedestilleerd water.
    2. Voeg 1 mL DNA-lysebuffer en 10 μL Proteinase K (20 mg/mL) toe aan elk monster en meng grondig door inversie.
    3. Incubeer monsters bij 56 °C 's nachts om volledige lysis mogelijk te maken.
    4. Centrifuge-lysaten op 16.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om onoplosbaar afval te pelleteren.
    5. Breng het geklarifiseerde supernatant over in een nieuwe 2 mL microcentrifugebuis.
      VOORZICHTIG: fenol:chloroform:isoamylalcohol is giftig en corrosief. Voer alle stappen uit die organische oplosmiddelen in een chemische dampkap bevatten, terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
    6. Voeg een gelijke hoeveelheid fenol:chloroform:isoamylalcohol toe en meng krachtig door vortex te laten vartexen gedurende ongeveer 15 seconden totdat een homogeen mengsel is gevormd.
    7. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de organische en anorganische fasen te scheiden.
    8. Breng voorzichtig de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis zonder de interfase te verstoren.
      OPMERKING: Vermijd het aspireren van materiaal uit de witte interfase om besmetting van eiwitten en RNA's te minimaliseren.
    9. Voeg 0,7 volumes isopropanol toe aan de teruggewonnen waterige fase en meng krachtig door ongeveer 15 seconden te vortexen.
    10. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    11. Gooi het supernatant voorzichtig weg en spoel de DNA-pellet af met 500 μL 70% ethanol.
    12. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder de ethanol volledig.
    13. Laat de DNA-pellet 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
    14. Suspendeer de DNA-pellet opnieuw in 50 μL steriel gedestilleerd water.
    15. Incubeer monsters bij 37 °C gedurende 1 uur of bij 4 °C 's nachts om de volledige resuspendering van genomisch DNA te vergemakkelijken.
    16. Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met nanodrop- of fluorometrische kwantificatie.

5. Volgende generatie sequencing van CRISPR-bibliotheken


OPMERKING: Genereer een referentiemonster om de berekening van gRNA-vouwveranderingen in de loop van de tijd mogelijk te maken. Getransduceerde MEF's (Sectie 2) of melkklieren (Sectie 4) die 3 dagen na infectie worden geoogst, evenals het oorspronkelijke plasmide maxiprep, kunnen worden gebruikt om de richtlijnrepresentatie in de startbibliotheek en virale voorraad te bepalen.

  1. PCR-amplificatie van gRNA-cassettes uit genomisch DNA
    1. Gebruik primerparen zoals vermeld in Tabel 2 om monsters uniek te indexeren, waardoor multiplexing en demultiplexing van tot 306 monsters na sequencing mogelijk is.
    2. Bereid PCR-reacties voor met 1 μg genomisch DNA als sjabloon in een totaal reactievolume van 50 μL met 25 μL 2x Q5 Master Mix, 2,5 μL 10 μM forward primer en 2,5 μL 10 μM reverse primer.
    3. Voeg parallel een no-template controlereactie toe om te monitoren op verontreiniging.
    4. Voer PCR-versterking uit met de volgende cyclische condities, waarbij de annealingtemperatuur wordt aangepast op basis van bibliotheekspecifieke primersmelttemperatuur:
      1 cyclus van 98 °C gedurende 30 seconden
      5 cycli van 98 °C voor 10 s, 68 °C (-1 °C/cyclus) voor 10 s, en 72 °C voor 15 s
      20 cycli van 98 °C voor 10 s, 63 °C voor 30 s, en 72 °C voor 15 s.
      1 cyclus van 72 °C voor 2 minuten
    5. Verwerk PCR-producten op een 2,5% agarosegel om de juiste amplicongrootte te controleren.
    6. Bevestig de aanwezigheid van banden van ongeveer 306 bp voor pLKO-gebaseerde sgRNA-bibliotheken en 430 bp voor pXPR502-gebaseerde dgRNA-bibliotheken (Figuur 6).
      OPMERKING: Een duidelijke controle zonder sjabloon zorgt voor de zuiverheid van de reagentia en bevestigt dat de assay vrij is van kruisbesmetting.
    7. Zuiver PCR-producten met een geschikte DNA-zuiveringsmethode en kwantificeer de DNA-concentratie met fluorometrische kwantificatie.
  2. Next-generation sequencing
    1. Bepaal de vereiste sequencingdiepte op basis van verwachte bibliotheekcomplexiteit en sample-klonaliteit.
      OPMERKING: Voor tumoren waarvan wordt vermoed dat ze klonaal zijn, is ongeveer 1 miljoen reads per monster voldoende om de guide-representatie nauwkeurig te kwantificeren. Om de sequencingdiepte van melkklieren te berekenen, vermenigvuldig je het aantal gidsen in de bibliotheek met 1.000 keer de dekking, en vermenigvuldig je vervolgens met 6 pg genomisch DNA/cel om de totale massa van genomisch DNA per monster te berekenen dat PCR-amplificeerd moet worden. Het totale aantal leesopdrachten dat nodig is voor het sequencen is gelijk aan het aantal gidsen in de bibliotheek maal 1.000.
    2. Pool gezuiverde bibliotheken uit verschillende monsters bij equimolaire concentraties.
    3. Sequence-pooled libraries met behulp van een short-read Illumina sequencingplatform.
  3. Data-analyse
    1. Demultiplex raw sequencing FASTQ-bestanden met behulp van sample-specifieke indices.
    2. Trim leest naar de gRNA-protospacersequentie met behulp van Trimmomatic69. Voor CRISPR-A monsters leest trim 14 bp, en voor CRISPR-KO leest trim 20 bp vanaf het einde van de voorste primer.
    3. Align trimmed leest naar de bijbehorende gRNA-referentiebibliotheek met behulp van Bowtie70. Gebruik uitlijningsparameters van -v 2 en -m 1 voor CRISPR-KO en -v 2 en -m 2 voor CRISPR-A en gemengde pools.
      OPMERKING: Meestal zijn meer dan 90% van de reads succesvol uitgelijnd. Lage uitlijning is meestal het gevolg van trimfouten, onjuiste opmaak van invoerbestanden of monstercontaminatie tijdens PCR.
    4. Kwantificeer uitgelijnde reads voor elk gRNA met behulp van de telfunctie in MAGeCK72 om definitieve gRNA-teltabellen te genereren voor downstream analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een protocol voor gepoolde in vivo CRISPR-screening in de melkklier van de muis. Deze pijplijn kan end-to-end worden gebruikt om gepoolde gRNA-bibliotheken uit oligonucleotidearrays te ontwerpen en te amplificeren, de gRNA-bibliotheken te klonen tot lentivirale ruggengraaten, high-titer lentivirus te produceren, intraductale levering van gepoolde lentivirale bibliotheken in de volwassen melkklier uit te voeren, en gRNA's terug te winnen voor sequencing-gebaseerde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belangrijke overweging bij gepoolde in vivo CRISPR-screening is het bereiken van voldoende bibliotheekdekking terwijl spaarzame, enkelceltransductie behouden blijft om klonale resolutie2 te behouden. In de muismelkklier bestaat het epitheelcompartiment conservatief uit ongeveer 3,5 × 105 cellen perklier 36. Bij een gemiddelde lentivirale transductiesnelheid van 15%, wat de frequentie van meerdere infecties per cel mi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. is consultant en oprichter van ViVerita Therapeutics, en zijn laboratorium heeft onderzoeks- en serviceovereenkomsten gesponsord met ViVerita Therapeutics.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken alle leden van onze laboratoria voor nuttige opmerkingen en discussies met betrekking tot dit werk. We danken en erkennen ook The Centre for Phenogenomics voor alle hulp en expertise bij het muizenwerk van het Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI), Toronto, Canada. Deze studie werd ondersteund door een projectsubsidie van de Canadian Institutes of Health Research (PJT462506) en een Terry Fox Research Institute Program Projects Grant aan D.S. (TFRI Project #1107), aan D.S. en door de Nicol Family Foundation. E.R.L. werd ondersteund door de Canadian Cancer Society Research Training Award en het Frank Fletcher Memorial Fund. K.N.A. werd ondersteund door een H.L. Holmes Postdoctoral Award en subsidies 1318698 en 26089 van de Cancer Research Society. J.N. werd ondersteund door een Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship – Master's en een Canadian Institutes of Health Research Doctoral Research Award (#193389). Y.L werd ondersteund door de Research Excellence, Diversity, and Independence fellowship van de Canadian Institutes of Health Research (#ED6-190718).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k of 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm celcultuurplatenCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline fosfataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq of Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood en Tissue DNA extractiekitQiagen69506
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura elektrocompetente cellenLucigen60242-1
EpiCult-B Muis Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetaal bovien serumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporatie CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipet pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer voor BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE gezuiverde illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleenimine)Sigma408727-100ML
Penicilline en StreptinomycineWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometrische KwantificeringInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato muizenJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge buizenBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GeneticaEditie 233Editie 233AlleEditieAlleEditieLege waardeEditie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen