Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het detecteren en toewijzen van ultrasone vocalisaties aan individuele muizen tijdens sociale interacties

200 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71121

⸱

7 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het opnemen van gesynchroniseerde video- en audiogegevens tijdens sociale interacties met meerdere muisen. De methode gebruikt een microfoonarray en geluidsbronlokalisatie om ultrasone vocalisaties (USV's) toe te wijzen aan individuele muizen, waardoor kwantitatieve analyse van vocaal gedrag tussen dieren en sociale contexten mogelijk is.

Samenvatting

Muizen (Mus musculus) communiceren met ultrasone vocalisaties (USV's) tijdens sociale interacties. Omdat muis-USV's echter niet geassocieerd zijn met duidelijke visuele indicatoren en voorkomen op frequenties buiten het menselijke gehoorbereik, blijft het lastig om individuele vocaliserende muizen binnen een groep te identificeren. Dit protocol beschrijft een methode voor het opnemen van gesynchroniseerde video- en ultrasone audiogegevens tijdens sociale interacties tussen meerdere dieren, waardoor gelijktijdige opname van gedrag en vocale activiteit mogelijk is. Er wordt een computationele pijplijn uiteengezet die multi-animal tracking, vocalisatiedetectie, geluidsbronlokalisatie en toewijzing van vocalisaties aan individuele dieren integreert. De validatieprocedures die worden gebruikt om de nauwkeurigheid van tracking te beoordelen, vocalisatie-extractie, lokalisatieprecisie en toewijzingsvertrouwen in elke fase van de pijplijn te beoordelen, worden verder beschreven. De toepassing van dit protocol op een demonstratiedataset van vier dieren levert individueel opgeloste vocalisatietracking, ruimtelijk precieze geluidsbronschattingen en kwantitatieve metingen van vocale output en akoestische kenmerken. Samen bieden deze benaderingen een robuust kader om vocale communicatie te koppelen aan individueel gedrag en maken ze downstream-analyses mogelijk van sekseverschillen, individuele variabiliteit en sociale communicatie bij vrij interactieve muizen.

Inleiding

Sociale communicatie in het dierenrijk is een essentieel onderdeel van gedragsdynamiek en helpt bij processen zoals overleving en voortplanting 1,2. Bij zoogdieren communiceren muizen akoestisch via USV's, die frequenties beslaan van 35 tot 110 kHz3. USV's vertonen complexe kenmerken en geven informatie over afhankelijk van de gedragscontext4. Vrouwelijke muizen geven een voorkeur voor mannelijke muis USV's 5,6, en mannelijke en vrouwelijke muizen interageren vocaal tijdens baltsgedrag7, wat aangeeft dat USV's belangrijke sociale signalen zijn. Omdat specifieke USV-kenmerken gekoppeld zijn aan verschillende gedragstoestandenvan muis 8, is het nauwkeurig toewijzen van vocalisaties aan individuen essentieel om sociale interacties te begrijpen.

Ondanks uitgebreide inspanningen om de functies van USV's en hun relatie met sociaal gedrag te verduidelijken8, is een voortdurende uitdaging in het veld het toewijzen van USV's aan individuele muizen tijdens groepsinteracties. Problemen ontstaan door zowel het gebrek aan zichtbare mondbewegingen tijdens de productie van USV4 als het frequentiebereik van USV's dat voor het menselijk ooronhoorbaar is. Als gevolg hiervan zijn eerdere studies naar de relatie tussen USV's en sociaal gedrag beperkt gebleven tot vereenvoudigde assays of beperkte omgevingen die het bereik van waarneembare groepsgedragingenbeperken 9, en slechts gedeeltelijk inzicht geven in hoe vocaal gedrag zich ontvouwt bij vrij interacterende dieren.

Om het begrip van de relatie tussen auditieve communicatie en sociaal gedrag te verfijnen, is het noodzakelijk een volledig scala aan muisgedrag vast te leggen en vocalisaties toe te wijzen aan individuen binnen een groep. Het onderscheiden van vocalizeridentiteiten is essentieel voor het bepalen van geslachts- en contextafhankelijke vocale bereiken tussen individuen8, het testen van causale hypothesen over hoe specifieke vocale kenmerken conspecifiek gedrag aansturen 10,11,12, en, waar van toepassing, het correleren van vocale output met gelijktijdig gemeten hersensignalen (bijv. elektrofysiologie)13. Historisch gezien werd aangenomen dat mannelijke muizen de enige vocalizers waren; echter, geluidsbronlokalisatie toonde aan dat vrouwelijke muizen ook USV's produceren in groepsopzet7 of wanneer ze worden gekoppeld aan een mannelijke14. Zonder te bepalen welk dier een USV heeft uitgezonden, blijft het koppelen van vocale kenmerken aan individueel gedrag en sociale uitkomsten in vrij interactieve groepen beperkt. Daarom is het essentieel om een lokalisatiesysteem te gebruiken dat vocalisaties aan individuele dieren toewijst, terwijl natuurlijke interactiedynamiek behouden blijft.

Het hier beschreven microfoon-array geluidsbronlokalisatiesysteem, dat eerder werd gepubliceerdin 7,15, schat de ruimtelijke oorsprong van USV's binnen een arena en volgt de posities van alle dieren die aanwezig zijn op het moment van vocalisatie, waardoor vocalisaties aan de emitter kunnen worden toegewezen. Geluidsbronschattingen en gevolgde dierposities worden vervolgens geïntegreerd met behulp van een op kansrekening gebaseerde metriek om de toewijzing van USV's aan individuele dieren te ondersteunen. Vocalisatietoewijzing zet eerder dubbelzinnige groepsvocalen om in gelabelde dierlijke vocale data 7,15, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn die vocalisatietype en timing koppelen aan gedrag en daaropvolgende conspecifische actie. Het doel van het huidige werk is om een gedetailleerd protocol te bieden voor de implementatie van deze methode, dat eerder gekwantificeerd en gevalideerdwas 15. Het volgende protocol beschrijft de opstelling, kalibratie en implementatie van dit systeem, inclusief microfoon-arraygeometrie, audio-video synchronisatie, geautomatiseerde geluidsdetectie en probabilistische bronschatting, multi-animal positietracking en de toewijzingsprocedure die wordt gebruikt om USV's toe te wijzen aan het uitzendende dier 7,15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle protocollen met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door de University of Delaware Animal Care and Use Committee (protocolnummer: 1275) en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het construeren van de geluidsbronlokalisatie-rig

  1. Maak de opnamekamer klaar.
    1. Stel een kubusframe samen (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm; breedte × lengte × hoogte), dat dient als opnameruimte, en plaats deze in een geluiddempende behuizing.
    2. Gebruik nylon gaas om de muren te maken en bekleed de buitenkant van de behuizing met akoestisch schuim om geluidsreflecties te verminderen.
    3. Plaats een thermometer buiten, maar dicht bij de opnamekamer van de behuizing om de omgevingstemperatuur tijdens opnames te monitoren.
    4. Voer alle opnames uit onder donkere omstandigheden.
      OPMERKING: Houd stabiele omgevingsomstandigheden gedurende opnamesessies en neem omgevingsparameters op.
  2. Configureer de video- en audio-opnamesystemen.
    1. Installeer infraroodverlichting boven de arena om video-opname in het donker mogelijk te maken.
    2. Plaats een videocamera boven de arena en configureer deze om continu op 30 Hz op te nemen.
    3. Configureer het audio-acquisitiesysteem om ultrasone signalen op te nemen van een achtkanaals microfoonarray met een bemonsteringsfrequentie van 250 kHz.
      OPMERKING: Er werden acht microfoons gebruikt in dit systeem, maar het aantal microfoons kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele behoeften.
    4. Synchroniseer de video- en audio-opnames met een gedeelde externe trigger om temporele uitlijning te waarborgen.
    5. Bevestig dat video- en audiogegevens gelijktijdig worden opgenomen en opgeslagen voor elke sessie.
      OPMERKING: Hardware en acquisitiesoftware worden respectievelijk vermeld in de Materiaaltabel en Tabel 1.
  3. Organiseer de microfoons en de arena.
    1. Verdeel microfoons gelijkmatig langs de muren van de arena (twee per muur).
    2. Plaats de microfooncentra 38,1 cm uit elkaar, 19,05 cm vanaf elke hoek en 10,8 cm boven de arenavloer.
    3. Markeer microfoonlocaties visueel om latere kalibratie en validatie te vergemakkelijken.
      OPMERKING: LED's kunnen worden gebruikt om microfoonposities aan te geven.

2. Voorbereidingen voor het vastleggen van sociaal gedrag

  1. Zet de proefdieren op.
    1. Selecteer de muizen die opgenomen moeten worden. Hier werden groepen van 2 mannelijke en 2 vrouwelijke C57BL/6J muizen tussen 8 en 12 weken oud op het moment van opname gebruikt.
      OPMERKING: De stam, geslachtsverhouding, leeftijdscategorie van muizen en het aantal opnamedagen in het huidige experimentele paradigma zijn aanpasbaar voor verschillende experimentele doelen. Voor de demonstratie van deze methode werd een subset experimentele muizen hergebruikt gedurende twee opnamedagen. C57BL/6J-muizen ouder dan 12 weken kunnen een verminderde gevoeligheid vertonen voor hoogfrequente geluiden16.
  2. Huisvest de dieren.
    1. Plaats elke muis afzonderlijk gedurende 14 dagen voordat je opneemt.
      OPMERKING: Individuele huisvesting minimaliseert de invloed van eerdere sociale ervaring op groepsinteracties.
    2. Geef elke kooi bodembedekking, verrijking en ad libitum toegang tot voedsel en water.
  3. Markeer de dieren voor visuele identificatie.
    1. Twee dagen voor opname doof je elke muis met 2,5% isofluraan in zuurstof bij een debiet van 1 L/min via een precisieverdamper in een afgesloten kamer. Zodra elke muis is verdoofd, breng je hem uit de kamer, ligt plat met de rug toegankelijk en ontvangt je de narcose via een neuskegel gedurende de markeringsprocedure.
      OPMERKING: Het anesthesieprotocol zoals beschreven in het huidige experimentele paradigma is goedgekeurd in ons dierprotocol en werd toegepast op elke muis in serie, maar is aanpasbaar voor verschillende dieren of experimentele doelen.
    2. Terwijl elke muis onder narcose is, breng je een uniek patroon aan op de rug met niet-giftige haarverf om visuele herkenning tijdens het volgen mogelijk te maken.
    3. Houd elk dier continu in de gaten terwijl de kleurstof uithardt, houd ongeveer 15 minuten onder narcose en registreer de duur van de narcose.
    4. Spoel elke muis af en plaats ze in een verwarmde herstelkooi totdat ze volledig lopen zijn.
    5. Breng elke muis terug naar een eigen schone kooi met bodembelage, verrijking en toegang tot voedsel en water.
      OPMERKING: Breng markeringen aan op vrouwelijke muizen vóór mannetjes om de overdracht van mannelijke geursignalen die het latere gedrag kunnen beïnvloeden te minimaliseren.
  4. Voer aan aan verschillende geslachten.
    1. Bereid een dag voor de opname schone kooien voor zonder beddengoed.
    2. Voor elke experimentele muis plaats je het dier in een kooi, gevolgd door een nieuwe muis van het andere geslacht.
    3. Laat dieren 10 minuten met elkaar omgaan.
    4. Observeer interacties en registreer gedragsgebeurtenissen handmatig.
    5. Na blootstelling brengt u proefdieren terug naar individuele huisvesting na de blootstelling.
      OPMERKING: Blootstelling aan verschillend geslacht is specifiek voor het huidige experimentele paradigma, omdat het de kans op vocaal gedrag tijdens latere groepsopnamesverhoogt 17; het is echter geen verplicht onderdeel van de beschreven methoden. Scheid dieren als er copulatorisch gedrag wordt waargenomen.
  5. Bepaal de oestroustoestand van vrouwelijke muizen.
    1. Ongeveer 2 uur voor opname beoordeel je de oestroustoestand van elke vrouwelijke muis (bij gebruik van vrouwelijke proefpersonen).
    2. Voer vaginale lavage uit met 30 μL fosfaatgebuffte zoutoplossing.
    3. Breng het lavagemonster over op een schoon microscoopglaasje en verdeel het gelijkmatig.
    4. Laat de glaasjes volledig drogen.
    5. Breng kristalviolet beits aan op elke dia, en spoel met een pipet voorzichtig af met water.
    6. Bekijk preparaten onder een lichtmicroscoop.
    7. Classificeer de oestroustoestand op basis van de relatieve verhoudingen van genucleeerde epitheelcellen, cornified epitheelcellen en leukocyten18.
    8. Noteer de oestrustoestand van elke vrouw.
      OPMERKING: Aangezien USV's de vrouwelijke ontvankelijkheid tijdens oestrus19,20 kunnen beïnvloeden, is het bepalen van de oestroustoestand specifiek voor het huidige experimentele paradigma. het is echter geen verplicht onderdeel van de beschreven methoden.

3. Opnames van sociale interactie

  1. Maak de opname-arena klaar.
    1. Voeg op de vloer van wit papier toe aan de arenavloer tot een uniforme diepte van ongeveer 1,25 cm.
    2. Zorg ervoor dat het beddengoed alle hoeken gelijkmatig bedekt.
    3. Controleer of alle microfoons uitgelijnd, niet geblokkeerd en gericht zijn op de arena.
    4. Plaats vóór experimentele opnames een liniaal en een hoogcontrast object in het midden van de arena om de camerafocus te controleren en ruimtelijke schaal vast te stellen.
    5. Verwijder de kalibratieobjecten voordat gedragsopnames beginnen.
      OPMERKING: Het op wit papier gebaseerde beddengoed zorgt voor contrast voor donkerder vachtige dieren, waardoor het volgen wordt vergemakkelijkt. Als lichtere vacht dieren worden gebruikt, zou een op zwart papier gebaseerd beddengoed helpen bij het volgen. Als de opnameduur wordt verlengd, voeg dan voedsel en water toe aan de arena. Het toevoegen van Noord/Zuid- en Oost/West-richtingsmarkeringen aan de liniaal vergemakkelijkt de identificatie van de acht microfoons.
  2. Voer pre-gedragsopnames uit voor het systeem.
    1. Direct voor gedragsopnames neem je 15 seconden achtergrondgeluid op met infraroodlampen aan.
    2. Neem 15 seconden op van een microfoonlokalisatietest met infraroodlampen uit en microfoonindicatorlampjes aan.
    3. Bewaar alle pre-gedragsopnames voor latere verificatie van de systeemprestaties.
      OPMERKING: Deze opnames worden gebruikt om microfoonfunctie en basisgeluidsniveaus te verifiëren. Scripts die voor opname worden gebruikt, zijn beschikbaar in de bijbehorende coderepository.
  3. Neem het sociale gedrag van de groep op.
    1. Bereid alle opname-instellingen van tevoren voor om de interactie met dieren te minimaliseren voordat de gegevens worden verzameld.
    2. Plaats de vrouwelijke muizen in de arena.
    3. Plaats de mannelijke muizen in de arena.
      OPMERKING: Als je meerdere dieren van hetzelfde geslacht registreert, plaats dan beide dieren tegelijkertijd.
    4. Sluit de behuizing en begin met opnemen.
    5. Neem het sociale gedrag van de groep continu 10 minuten op.
      OPMERKING: De opnameduur is instelbaar.
    6. Controleer of video- en audiobestanden leesbaar zijn en vrij van corruptie voordat je ze voorbewerkt.
    7. Aan het einde van de opname verwijder je alle dieren behalve één.
  4. Neem individuele dieren op.
    1. Neem de resterende muis alleen op in de arena gedurende 10 minuten.
    2. Herhaal individuele opnames voor elk van de overgebleven muizen.
    3. Weeg elke muis direct na de afzonderlijke opnames.
      OPMERKING: Individuele opnames worden gebruikt om multi-animal tracking te trainen en te valideren. Documenteer de temperatuur in de installatie vóór elke opnamesessie, omdat temperatuur de geluidsvoortplanting beïnvloedt. Herhaal de opnamesessie als video- of audiobestanden beschadigd of onvolledig zijn.

4. Video-voorverwerking

  1. Bereid de videobestanden voor.
    1. Controleer of alle video-opnames in één map zijn opgeslagen die aan het experiment is gekoppeld.
  2. Pas de videointensiteit aan voor het volgen.
    1. Indien nodig pas je een uniforme helderheidsaanpassing toe op alle videoframes door een constante waarde (brightness_adjustment x 255) toe te voegen aan elke pixel, waarbij brightness_adjustment een scalair is die doorgaans varieert van 0,1 tot 0,6, afhankelijk van de verlichtingsomstandigheden.
    2. Indien nodig pas je een globale contrastaanpassing toe met intensiteitsremapping (bijvoorbeeld de imadjust-functie van MATLAB) met een gedefinieerd invoerbereik (bijv. [0.2, 0.8]), waarbij pixelintensiteiten van 20% van maximaal naar zwart en 80% van maximale naar wit en lineair schalen tussenliggende waarden worden afgebeeld. Deze stap wordt uitgevoerd om de afstand tussen lichtgekleurde identificatiemarkeringen en de achtergrond te vergroten.
    3. Clippixelintensiteiten tot het geldige bereik voor de videobitdiepte (d.w.z. 0 tot 255 voor 8-bit video).
      OPMERKING: Identieke preprocessingparameters moeten op alle frames binnen een opname en tussen opnames worden toegepast om consistentie te waarborgen. Deze aanpassingen zijn optioneel en hangen af van de opnamevoorwaarden. Voor de hier gepresenteerde representatieve gegevens zijn er geen helderheids- of contrastaanpassingen toegepast. Wanneer aanpassingen nodig zijn, moeten gebruikers het bewerkte eerste frame bekijken om het voldoende contrast tussen dieren en de arena te bevestigen voordat de hele video wordt verwerkt.
  3. Exporteer de voorbewerkte video's.
    1. Bewaar de vooraf bewerkte videobestanden met dezelfde framerate en temporele uitlijning als de originele opnames.
    2. Bewaar de originele videobestanden ter referentie en verificatie.
      OPMERKING: Scripts die worden gebruikt voor video-voorbewerking en de specifieke parameterwaarden die worden toegepast, zijn beschikbaar in de bijbehorende coderepository.

5. Meervoudige dieren volgen

  1. Bereid de trackingsoftware en gegevens voor.
    1. Installeer een volgprogramma voor meerdere dieren en alle benodigde afhankelijkheden. Deze studie gebruikte MOuse TRacker (MoTR; Tabel 1) omdat het uitvoerformaat compatibel is met Muse (Tabel 1), een andere software in onze pijplijn die wordt gebruikt voor geluidsbronlokalisatieberekeningen21.
      OPMERKING: Andere geautomatiseerde trackingsoftware, zoals Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 of DeepLabCut23, kan worden gebruikt om dieren te volgen, zolang de positie van het dier, koersrichting en positie van de neus worden gegenereerd.
    2. Organiseer voorbewerkte videobestanden zodat opnames van één dier en opnames van meerdere dieren duidelijk gescheiden zijn.
    3. Controleer of alle videobestanden consistente framerates en ruimtelijke resoluties hebben.
      OPMERKING: Installatie-instructies en afhankelijkheidsvereisten worden verstrekt in de bijbehorende code-repository.
  2. Train de modellen met één dier.
    1. Selecteer opnames van één dier die overeenkomen met elk proefpersoon.
    2. Train een aparte identiteitsclassifier voor elk dier met behulp van kenmerken die zijn geëxtraheerd uit de opname van dat dier. Tijdens groepsopnames worden deze classifier-outputs per dier gecombineerd met trajectinformatie over frames om de dieridentiteit te behouden.
    3. Controleer of de training succesvol is afgerond voordat je verder gaat.
      OPMERKING: Opnames van één dier worden gebruikt om identiteitsspecifieke tracking te initiëren in sessies met meerdere dieren.
  3. Volg opnames met meerdere dieren.
    1. Pas het getrainde trackingmodel toe op opnames van sociale interactie met meerdere dieren.
    2. Maak frame-voor-frame schattingen van de positie, oriëntatie en lichaamsvorm van het dier voor elk onderwerp.
    3. Bewaar tracking-output voor downstream analyses.

6. Akoestische segmentatie

  1. Bereid de audiogegevens voor.
    1. Controleer of alle audio-opnames van individuele microfoonkanalen aanwezig en toegankelijk zijn.
  2. Detecteer vocalisaties.
    1. Voer de akoestische segmentatiesoftware, Ax (Tabel 1), op elke opname uit om USV's te detecteren.
    2. Configureer tijd-frequentieparameters die zijn gedefinieerd in een invoerbestand dat door Ax wordt overwogen. De microfoonbemonsteringsfrequentie was ingesteld op 250 kHz.
      OPMERKING: Er werden drie venstergroottes voor niet-uniforme Fast Fourier-transformatie overwogen, waaronder 64, 128 en 256 monsters. Er werd een multi-taper tijd-bandbreedteproduct van 3 met 5 tapers toegepast, samen met een significantiedrempel van 0,05. Er werd een minimale duur van 0 samples gebruikt, met een laagfrequente cutoff van 30 kHz en een high-frequency cutoff van 110 kHz. De conploutiegrootte was ingesteld om 1001 Hz bij 0,001 s te dekken. Er werd een vlag toegevoegd om harmonisch gerelateerde signalen samen te voegen. Voor specifieke details, zie Neunuebel et al.7.
    3. Haal kandidaat-USV's uit op basis van deze tijd-frequentie kenmerken.
    4. Sla segmentatie-uitvoeren op als een spreadsheet voor elke opname.
      OPMERKING: Installatie-instructies, scripts en parameterinstellingen voor software worden verstrekt in de bijbehorende coderepository7.
  3. Compileer de segmentatie-outputs.
    1. Genereer een geconsolideerde lijst van gedetecteerde vocalisatiegebeurtenissen met aanvangstijden, offset-tijden en frequentiegrenzen.
    2. Bewaar geconsolideerde vocalisatiebestanden voor downstream lokalisatieanalyses.

7. Geluidsbronlokalisatie

  1. Bereid de invoer voor voor lokalisatie.
    1. Bevestig dat akoestische segmentatie-uitgangen en multi-animal trackingresultaten beschikbaar zijn voor elke opname.
    2. Organiseer lokalisatie-invoer zodat audiodata, trackingdata en arena-geometrie-informatie toegankelijk zijn voor de lokalisatiesoftware.
      OPMERKING: Scripts die worden gebruikt om invoerbestanden te ordenen, vereiste directorystructuren te definiëren en arena-geometrie-informatie te verzamelen, worden geleverd in de bijbehorende coderepository.
  2. Schat de locaties van de geluidsbron.
    1. Pas het geluidsbronlokalisatie-algoritme, MUSE (Tabel 1), toe op elke gedetecteerde vocalisatie7.
    2. Met behulp van microfoonarray-opnames schat je de ruimtelijke oorsprong van elke vocalisatie binnen de arena.
    3. Voor elke vocalisatie schat je de locatie van de geluidsbron met jackknife-resampling door de lokalisatieprocedure acht keer te herhalen, waarbij telkens één microfoon wordt weggelaten zodat elke schatting gebaseerd is op de overige zeven microfoons. Dit levert acht schattingen per vocalisatie op.
      OPMERKING: Verschillen in aankomsttijd tussen microfoons zijn cruciaal voor het schatten van de locatie van de geluidsbron. Jackknife-resampling wordt gebruikt om de betrouwbaarheid van lokalisaties te beoordelen en de gevoeligheid voor individuele microfoonkanalen te verminderen. Scripts die worden gebruikt om de locatie van de geluidsbron te schatten, worden verstrekt in de bijbehorende coderepository7.
  3. Bereken de kansverdelingen tussen geluidsbron en bron.
    1. Voor elke vocalisatie bereken je een covariantiematrix24 en gebruik deze samen met de gemiddelde schattingen van de zakkas om de waarschijnlijkheidsdichtheid over de arenavloer te berekenen.
  4. Integreer lokalisatie met dierposities.
    1. Haal de kop- of neusposities van alle dieren op het moment van elke vocalisatie uit.
    2. Voor elke vocalisatie evalueer je de lokalisatie-waarschijnlijkheidsdichtheid op de locatie van de neus van elk dier.
    3. Voor elke vocalisatie bereken je een toewijzingsbetrouwbaarheidsmaatstaf voor elk dier op basis van de waarschijnlijkheidswaarden. De toewijzingsbetrouwbaarheidsmaatstaf wordt voor elk dier berekend als de dichtheidswaarde bij de neus van dat dier, gedeeld door de som van de dichtheidswaarden van alle dieren. We noemen deze metriek de muis-kansindex (MPI)15.
  5. Wijs vocalisaties toe.
    1. Als de toewijzingsbetrouwbaarheidsmetric voor een enkele muis hoger is dan 0,95, wordt het signaal aan die muistoegewezen 7,15.
    2. Label vocalisaties die niet aan de toewijzingscriteria voldoen als niet-toegewezen.
    3. Sla lokalisatie- en toewijzingsuitkomsten op voor validatie en analyse later in de stroom.
      OPMERKING: Toewijzingsdrempels, betrouwbaarheidscriteria en code worden verstrekt in de bijbehorende analysescripts.

8. Validatie van resultaten

  1. Valideer het volgen van meerdere dieren.
    1. Laad de definitieve trackinguitgangen voor elke opname.
    2. Legde de posities en lichaamsvorm van dieren over de bijbehorende videoframes.
    3. Bekijk de trackingresultaten visueel om de nauwkeurige muispositie en consistente identiteitstoewijzing over frames te bevestigen.
      OPMERKING: Trackingresultaten bevatten kleurgecodeerde ellipsen die de hoofdrichting aangeven over elke muis in elk videoframe. Ellipsgrootte en lichaamsoriëntatie moeten respectievelijk overeenkomen met de grootte en oriëntatie van de muis in elk frame. De kleur van de ellips moet consistent zijn voor elke muis gedurende een opname.
    4. Identificatie en corrigeer trackingfouten.
      Bewaar gecorrigeerde tracking-outputs voor downstream analyses.
      OPMERKING: Veelvoorkomende trackingfouten komen voor tijdens nauwe sociale interacties of nabij de grenzen van de arena. Corrigeer alle gevallen van head-tail flips, identiteitswisselingen en ellipssprongen en -drifts.
      OPMERKING: Programma's voor het bekijken van tracking-output en het corrigeren van fouten zijn beschikbaar in de code-repository.
  2. Valideer de extractie van vocalisatie.
    1. Laad akoestische segmentatie-uitgangen voor elke opname.
    2. Genereer spectrogrammen uit ruwe audiodata voor representatieve tijdsvensters.
    3. Overlay detecteerde vocalisatiegebeurtenissen, inclusief individuele vocalisatietijd en frequentiebereik, op spectrogrammen.
    4. Bevestig visueel de correspondentie tussen gedetecteerde gebeurtenissen en vocalisaties die in de spectrogrammen zijn waargenomen.
    5. Als systematische fouten worden waargenomen, pas dan segmentatieparameters aan voordat extractie- en lokalisatiestappen worden herhaald, of pas handmatig elk geval van segmentatiefouten aan (d.w.z. verkeerde identificatie van vocalisatietijd of frequentiebereik).
  3. Valideer de toewijzing van de vocalisatie.
    1. Laad geluidsbron-lokalisatie en toewijzingsuitgangen.
    2. Visualiseer voor elke vocalisatie lokalisatieschattingen, ruimtelijke kansverdelingen en dierposities die over videoframes zijn gelegd.
    3. Bevestig dat de dichtheid van de lokalisatiekans gecentreerd is nabij het hoofd van het toegewezen dier en duidelijk gescheiden is van andere dieren.
    4. Controleer dat vocalisaties die niet voldoen aan de toewijzingscriteria als niet-toegewezen worden gelabeld.
      OPMERKING: Controles op toewijzingsoutput omvatten het controleren of alle verwachte uitgangen zijn gegenereerd en dat de waarschijnlijkheidskaart voor elke vocalisatie zich binnen de arenagrenzen bevindt en rondom de muis die de vocalisatie heeft toegewezen.
    5. Bewaar de gevalideerde opdrachtresultaten voor downstream analyses.
      OPMERKING: Toewijzingsbetrouwbaarheidsdrempels en validatiecriteria zijn gedefinieerd in de bijbehorende analysescripts.

9. Data-analyses

  1. Visualiseer de geluidsbronlokalisatie.
    1. Voor opnamesessies met één of meerdere dieren selecteer je videoframes waarin vocalisaties werden gedetecteerd.
    2. Genereer geschematiseerde representaties van de geselecteerde videoframes.
    3. Genereer een ruimtelijk schema van de MUSE-uitgang door de posities van alle microfoons, de individuele schattingen van geluidsbronpunten, de geschatte locatie van de geluidsbron, de ruimtelijke kansverdeling, de muispositie(s), de afgeleide vocalizeridentiteit en een schaalbalk uit te zetten.
    4. Genereer spectrogrammen van de bijbehorende vocalisatie zoals opgenomen door elk microfoonkanaal.
      OPMERKING: Deze visualisaties zijn nuttig om de prestaties van lokalisatie kwalitatief te beoordelen in zowel individuele als groepscontexten.
  2. Kwantificeer de lokalisatiefout en precisie.
    1. Bereken de afstand tussen de geschatte locatie van de geluidsbron en de positie van het opgenomen dier om de lokalisatiefout te kwantificeren. Gebruik voor deze berekeningen enkele muisopnames, omdat er slechts één emitter is en de bron bekend is.
    2. Om de nauwkeurigheid van de opdracht te beoordelen, transformeer je geluidsbronschattingen en bijbehorende dierposities in een referentiekader dat gecentreerd is op het vokaliserend dier.
    3. Visualiseer de ruimtelijke verdeling van geluidsbronschattingen ten opzichte van de positie van het gecentreerde dier.
  3. Maak spectrogrammen om vocalisaties te visualiseren.
    1. Identificeer de vocalisatie-uitbarstingen van interesse met behulp van vocalisatie-extractie-uitgangen die vocalizeridentiteit, vocalisatie-start- en offsettijden, en hoge en lage frequentiegrenzen bevatten.
    2. Selecteer tijdsvensters die lopen van vóór het begin van de eerste vocalisatie tot na de verplaatsing van de laatste vocalisatie in elke sessie.
    3. Haal spanningssporen uit de audiokanaalbestanden voor de geselecteerde tijdsvensters.
    4. Genereer spectrogrammen door de geëxtraheerde spanningssporen van het tijdsdomein naar het frequentiedomein te transformeren.
    5. Markeer tijdspunten die overeenkomen met toegewezen en niet-toegewezen vocalisaties met verschillende kleuren op het spectrogram.
    6. Voor sociale interactiesessies identificeer je vocalisatie-uitbarstingen die door verschillende individuen worden geproduceerd en genereer je spectrogrammen met vocalizeridentiteiten die worden aangegeven met identiteitsspecifieke kleuren.
  4. Kwantificeer de vocale output per individu.
    1. Gebruik de output van de geluidsbron-lokalisatiecode om elke vocalisatie een identiteitslabel toe te kennen, zodat niet-gelokaliseerde, gelokaliseerde maar niet-toegewezen en individuele dieridentiteiten numeriek worden gecodeerd.
    2. Tel het aantal vocalisaties op dat elk individueel dier produceert.
    3. Vergelijk het aantal vocalisaties tussen individuen en tussen geslachten.
  5. Analyseer de vocale kenmerken.
    1. Haal frequentiecontouren uit voor elke vocalisatie.
    2. Kwantificeer vocale parameters zoals maximale frequentie, minimale frequentie, gemiddelde frequentie, bandbreedte en vocalisatieduur.
    3. Vergelijk vocale parameters tussen geslachten.
    4. Voer passende statistische analyses uit op basis van de verdelingskenmerken van de gegevens.
      OPMERKING: Selecteer statistische methoden die aansluiten bij de parametrische eigenschappen van de gemeten variabelen. Hier is het aantal proefpersonen te laag voor statistische vergelijkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn afkomstig van opnames die over 2 dagen zijn gemaakt en zijn bedoeld om de output van het protocol te illustreren, oorspronkelijk gepubliceerd in Warren et al.15. Deze gegevens zijn niet bedoeld ter ondersteuning van statistische inferentie of algemene conclusies.

Extractie en toewijzing van USV's
USV's werden opgenomen tijdens zowel individuele als groepsses...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Betrouwbare toeschrijving van USV's aan individuele dieren tijdens groepsinteracties is een belangrijke technische beperking geweest in de studie van muizencommunicatie. Hoewel muizen veel worden gebruikt om sociale communicatie te bestuderen, heeft het onvermogen om vocalisaties aan specifieke individuen toe te wijzen beperkte kwantitatieve analyse van vocaal gedrag in naturalistische sociale omgevingen veroorzaakt. Een methode die dierspecifieke vocalisatietracking tijdens sociale inte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken het personeel van de University of Delaware Life and Science Research Facility voor de dierenverzorging, Jim Farmer en Jamie Quesenberry voor de hulp bij de bouw van laboratoriumapparatuur, en de University of Delaware High-Performance Computing Group voor de ondersteuning bij het onderhouden van het computercluster. Wij danken Andre Yichong Ma voor de hulp bij het verzamelen van gegevens. Het werk werd gefinancierd door NIH, subsidienummers R01MH122752 en T32GM142603.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-driNodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Aluminium Extrusie8020Op maat gemaakt om te passen bij de opnamearenaNodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
BNC-2110National Instruments777643-01Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Doorzichtige Acryl PlaatHome DepotMC-24Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
ComputerHewlett–PackardZ620Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-CNodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
IR-verlichtingGANZIR-LT30Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
NI PXIe-1073National Instruments781161-01Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
NI PXIe-6356National Instruments781053-01Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Nylon gaas voor kooiwandMcMaster-Carr9318T25Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
StroomkabelNational Instruments763000-01Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem
Sonex schuimPinta AcousticVLW-35Nodig voor geluidsbron lokalisatiesysteem

Referenties

  1. Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
  2. Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
  3. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
  4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  5. Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
  6. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  7. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
  8. Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
  9. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
  10. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  11. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  12. Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
  13. Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
  14. Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
  15. Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
  16. Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
  17. Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
  18. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  19. Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
  20. McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
  21. Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
  22. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  23. Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  24. Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
  25. Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
  26. Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GedragNummer 233Nummer 233Deze maand in JoVENummersociaal gedraglokalisatie van geluidsbronnenmicrofoonarraytoewijzing van vocalisatiessekseverschillenakoestische parametersmulti animal tracking
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.