Een webplatform voor geautomatiseerde beeldgebaseerde kwantificering van geïsoleerde alvleeskliereilandjes door mensen en knaagdieren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft gestandaardiseerde bemonstering, kleuring, beeldacquisitie en geautomatiseerde webgebaseerde kwantificering van geïsoleerde menselijke en knaagdieren pancreaseilandjes met behulp van deep-learning ondersteunde beeldanalyse en visuele kwaliteitscontrole.

Samenvatting

Het doel van deze publicatie is het bieden van een geschreven en live-action videoprotocol stapsgewijs voor gestandaardiseerd gebruik van IsletNet, een webgebaseerd platform voor geautomatiseerde kwantificering van geïsoleerde pancreaseilandjes in afbeeldingen, beginnend bij bemonstering en beeldverwerving tot beeldupload, visuele validatie en automatische rapportagegeneratie. Het platform is ontwikkeld voor gestandaardiseerde, geautomatiseerde beoordeling van tweedimensionale microscopische beelden van geïsoleerde alvleeskliereilandjes ter ondersteuning van klinische en experimentele isolatieworkflows van eilandjes. Deep-learning-gebaseerde beeldsegmentatie wordt gebruikt om eilandjes en exocrien weefsel te identificeren waaruit contouren worden gehaald voor beeldanalyse. Computationele algoritmen kwantificeren vervolgens het aantal eilandjes, het volume en de zuiverheid. De visuele kwaliteitscontroletool ondersteunt deskundige validatie van automatische beeldanalyses door gebruikers in staat te stellen ongeldige afbeeldingen handmatig te corrigeren of uit te sluiten. De module Clinical Islet Isolation ondersteunt zuiverheids-fractie batchanalyse en genereert automatische PDF-rapporten samen met downloadbare afbeeldings- en tabelgegevens voor het bijhouden en analyseren van gegevens. De Simple Comparison-module vergelijkt geautomatiseerde schattingen met lokaal verkregen referentieresultaten die samen met de bijbehorende voorbeeldafbeeldingen worden geleverd om de geschiktheid van lokaal gestandaardiseerde afbeeldingen voor geautomatiseerde analyse te evalueren. Het protocol beschrijft ook aanbevelingen voor hertraining met lokaal gegenereerde gestandaardiseerde afbeeldingen wanneer nodig. Representatieve gegevens van isolaties van knaagdieren en menselijke eilandjes, inclusief uitdagende voorbeelden, tonen verbeterde geautomatiseerde analyseprestaties aan na passende training.

Inleiding

Transplantatie van geïsoleerde pancreaseilandjes bij diabetische ontvangers vermindert of elimineert de noodzaak van externe insulinetoediening¹. Het proces van isolatie van eilandjes van kadaver- of levende donoren is onderhevig aan biologische en procedurele heterogeniteit, wat zich uitte in variaties in opbrengst en kwaliteit. Het totale eilandjesvolume is de primaire input voor dosisbepaling en klinische besluitvorming met betrekking tot de geschiktheid van transplantaties². Het histogram van de eilandjesgrootte en het eilandjesindexnummer verklaren verschillen in grootte-gerelateerde effectiviteit³. Daarom wordt er aandacht besteed aan individuele eilandjes naast het totale volume, dat momenteel dient als surrogaatmarker voor bètacelinhoud. Geïsoleerde menselijke eilandjes zijn minder dicht dan knaagdiereilandjes en zijn vaak niet goed gescheiden van exocrien weefsel. Daardoor zijn ze moeilijker te onderscheiden tenzij ze gekleurd zijn. Er werd een snelle en eenvoudige zinkkleuringsmethode met dithizone toegepast, waarbij intens rood licht wordt weerkaatst door zinkverrijkte insulinekorrels⁴. Gezien de ondoorzichtigheid van het weefsel wordt alleen licht dat van het oppervlak wordt weerkaatst verzameld, waardoor eenvoudige stereo- of omgekeerde microscopie-instrumenten kunnen worden gebruikt die zijn uitgerust met een lichtbron en een camera.

Er zijn talrijke pogingen gedaan om interlaboratoriumvariatie te verminderen door gebruik te maken van digitale beeldanalysetools 5,6,7,8,9,10,11,12, maar deze benaderingen hebben enkele beperkingen. Bij deze methoden is segmentatie van eilandjes en exocrien weefsel ofwel gebaseerd op handmatige drempelbepaling, wat gevoelig is voor subjectieve fouten 5,6,7,8,9,10, of wordt volledig geautomatiseerde segmentatie benaderingen^11,12 gebruikt. Daarnaast is lokale software-installatie vaak vereist 5,6,7,8,9,10,11 en kan deze beperkt zijn tot specifieke hardware ^10,11, wat de algemene toegankelijkheid en standaardisatie beperkt.

Het algemene doel van deze publicatie is het bieden van een gestandaardiseerde workflow voor geautomatiseerde kwantificering van geïsoleerde alvleeskliereilandjes in beelden via een webgebaseerd deep learning-platform met toezicht van menselijke experts. IsletNet pakt beperkingen aan die zowel betrekking hebben op beschikbaarheid als betrouwbaarheid van de islet-beeldanalyse. In dit artikel presenteren we aanbevolen richtlijnen voor het bemonsteren van eilandjesgrafts, het genereren van geschikte microscopische beelden en het correct gebruiken van de IsletNet-tools . Het protocol introduceert het concept van menselijke supervisie van automatisch gegenereerde resultaten en presenteert workflows voor zowel potentiële als gevestigde gebruikers (Figuur 1). De Simple Comparison-tool stelt potentiële gebruikers in staat om IsletNet-resultaten direct te vergelijken met lokaal verkregen referentiemethoden (Figuur 1A). Omdat lokaal gegenereerde gestandaardiseerde beelden aanzienlijk kunnen verschillen tussen centra, kan IsletNet hertraining vereisen voordat betrouwbare analyse kan worden bereikt (Figuur 1B). Om dit proces te vergemakkelijken, worden aanbevelingen gegeven voor gestandaardiseerde kleurvorming en beeldverwerving. Voor gevestigde gebruikers is de Clinical Islet Isolation-tool ontworpen om de workflow van menselijke eilandisolatie te ondersteunen (Figuur 1C). Downloadbare rapporten samen met aanvullende tabellen en visualisaties die door IsletNet zijn gegenereerd, worden beschreven in Tabel 1, terwijl de belangrijkste berekende parameters worden samengevat in Tabel 2.

Figuur 1: Werkstroom voor potentiële en gevestigde gebruikers van het platform. (A) Lokale validatieworkflow met behulp van de module Eenvoudige Vergelijking. (B) Hertraining vereist een set die lokaal gestandaardiseerde afbeeldingen vertegenwoordigt. (C) Routinematig gebruik workflow met behulp van de Clinical Islet Isolation-module. Belangrijke workflowstappen worden samengevat voor het uploaden van afbeeldingen, analyse, visuele kwaliteitscontrole (vQC) en rapportagegeneratie. Schaalbalken zijn niet van toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Downloadbare resultaatbestanden die door het platform zijn gegenereerd. Lijst van downloadbare uitvoerbestanden gegenereerd door de Clinical Islet Isolation en Simple Comparison tools, gegroepeerd op bestandsformaat en uitvoercategorie. De tabel bevat rapportbestanden, gesegmenteerde beelduitvoer, visualisatiebestanden en spreadsheet-exporten voor het aantal eilandjes, volume, zuiverheid en histogramanalyses. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Belangrijke parameters opgenomen in downloadbare rapporten en spreadsheet-uitvoeren. Gedetailleerde lijst van metadata, door de gebruiker gedefinieerde instellingen en kwantitatieve analyseparameters opgenomen in downloadbare XLSX- en CSV-bestanden die zijn gegenereerd door de tools voor Clinical Islet Isolation en Simple Comparison. Parameters omvatten sessiemetadata, instellingen voor beeldverwerving en kwantificatiemetrics voor eilandjes voor afbeeldingen en individuele eilandjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Protocol

Dierprocedures zijn goedgekeurd door het Ministerie van Volksgezondheid van Tsjechië (goedkeuringsnr. 49/2023) in overeenstemming met Europese Gemeenschappen Richtlijn 86/609/EEG. Procedures voor isolatie en gebruik van menselijke eilandjes zijn goedgekeurd door het State Institute for Drug Control (goedkeuringsnr. sukls111286/2023). Gestandaardiseerde microscopische beelden van rat- en menselijke eilandjespreparaten werden geanalyseerd met behulp van de Simple Comparison en Clinical Islet Isolation-tools om geautomatiseerde analyse te vergelijken met handmatig tellen. De standaard (korte) conversietabel¹³ werd gebruikt voor zowel handmatige als geautomatiseerde eilandequivalente berekeningen.

1. Menselijke supervisie

1. Eerste weergave van primaire resultaten (Figuur 2)
   1. Wacht tot de automatisch gegenereerde waarden voor aantal eilandjes, volume en zuiverheid, samen met de grafische visualisatie van de bijbehorende automatische annotaties (bijv. contouren of segmentaties), verschijnen in het venster Batchresultaten.
   2. Bekijk samengevatte resultaten van de huidige voorbeeldafbeelding in het linker informatiepaneel (Figuur 2A).
   3. Bekijk replicatewaarden (Figuur 2B) en batchgemiddelden (Figuur 2C) in de rechter tabel.
   4. Bekijk de beeldvoorvertoning (Figuur 2D, E) via de links (Figuur 2F). Klik met de rechtermuisknop op de afbeeldingsweergave en volg het pop-upmenu om indien nodig een enkele afbeelding te downloaden.
   5. Blader door voorbeeldafbeeldingen met behulp van de navigatiepijlen (Figuur 2G) of selecteer direct uit de tabel.
   6. Open het inspectievenster door te klikken in het huidige beeldvoorbeeld (Figuur 2D) om de kwaliteit van de automatisch gegenereerde contouren te evalueren en de resultaten te valideren.
2. Visuele kwaliteitscontrole
   1. Beweeg rond het beeld en zoom in (Figuur 3A) om de contouren te inspecteren op mogelijke fouten.
   2. Wissel tussen de contour (alleen geteld eilandjes hebben die), originele afbeelding en extra visualisatieweergaven.
      OPMERKING: De beschikbare weergaven staan in de Legende aan de rechterkant van het venster (Figuur 3B) en zijn toegankelijk via de sneltoetsen of de links in de bovenste navigatiebalk (Figuur 3C; Tabel 3).
   3. Ga door naar de volgende afbeelding door op de pijltjestoets naar beneden te drukken als de contouren acceptabel zijn (Tabel 3).
   4. Corrigeer contourfouten handmatig waar mogelijk. Als er onopgemerkt, gedeeltelijk gedetecteerd of onopvallende eilandjes aanwezig zijn, classificeer dan de afbeelding als ongeldig en sluit deze uit de analyse.
      OPMERKING: Uitgesloten afbeeldingen worden gemarkeerd in het Batch Results-venster (Figuur 2J) en in alle gedownloade bestanden.
3. Correcteerbare fouten: Ongescheiden aangrenzende eilandjes
   1. Splits aangrenzende eilandjes handmatig wanneer nodig.
   2. Klik met de linkermuisknop buiten de eilandjes om een scheidingslijn te starten (Figuur 3D).
   3. Voeg tussenliggende linksklikken toe om de scheidingslijn tussen aangrenzende eilandjes te sturen (Figuur 3E).
   4. Klik met de rechtermuisknop buiten de eilandjes om de scheidingslijn te voltooien (Figuur 3F).
   5. Dien de scheidingslijn in om het resultaat bij te werken (Figuur 3G).
      OPMERKING: Zet de visualisatie van toegevoegde scheidingslijnen aan of uit naar behoefte (Figuur 3H).
4. Correcteerbare fouten: Schijnbare eilandjes
   1. Gebruik het scheidingsgereedschap om een vals eilandje te verdelen in meerdere objecten kleiner dan de grens voor de eilandgrootte.
   2. Vermijd het tellen van kleine eilandfragmenten door de vooraf gedefinieerde minimale eilandjesgrootte drempel in te stellen (conventioneel 50 μm). Pas de drempel indien nodig aan volgens de lokale laboratoriumpraktijk.
   3. Klik met de rechtermuisknop op een punt op de lijn en selecteer de juiste optie in het pop-upmenu om één of alle handmatig toegevoegde scheidingslijnen te verwijderen (Figuur 3I).
5. Oncorrigeerbare fouten: ontbrekende, gedeeltelijk gesegmenteerde of valse eilandjes
   1. Schakel de Segmentatieweergave om te controleren of de eilandjes zijn gedetecteerd.
   2. Sluit uit van batchgemiddelde elke ongeldige afbeelding die onontdekte, gedeeltelijk gedetecteerde of meerdere onopgemerkte eilandjes bevat (Figuur 3J).
6. Oncorrigeerbare fouten: verkeerd geclassificeerde objecten
   1. Sluit de afbeelding uit van de evaluatie als exocriene weefsel, achtergrondartefacten of bellen ten onrechte als eilandjes worden geclassificeerd (Figuur 3J).

Figuur 2. Venster voor batchresultaten. (A) Samenvatting van het huidige voorbeeldresultaat. (B) Resultaten voor replicate voorbeeldafbeeldingen. (C) Batchgemiddelde waarden alleen uit geaccepteerde afbeeldingen. (D, E, F) Grafische resultaatvoorbeelden met links. (G) Voorbeeld navigatiepijlen. (H, I, J) Aangepaste, geaccepteerde en uitgesloten afbeeldingen. (K) IsletNet bovenste navigatiebalk. (L, M) Batchresultatenvensterkop en footer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Inspectievenster voor vQC en handmatige contourcorrectie. (A) Beeldzoomdisplay. (B) Legende en navigatiehints. (C) Bovenste navigatiebalk van het inspectievenster. (D–G) Bouw en indiening van een handmatige scheidingslijn voor aangrenzende eilandjes. (H) Schakelaar voor het weergeven of verbergen van handmatige loskoppelingslijnen. (I) Verwijdering van handmatige scheidingsleidingen. (J) Toggle om een afbeelding uit statistieken te sluiten. Schaalbalken worden niet weergegeven in deze interfaceweergave. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 3: Weergavemodi, sneltoetsen en navigatiebediening beschikbaar in het Inspectievenster. Samenvatting van beeldvisualisatiemodi, sneltoetsen en navigatiefuncties die beschikbaar zijn tijdens vQC en handmatige beoordeling van segmentatieresultaten in het inspectievenster. De tabel bevat contouroverlays, segmentatieweergaven, histogramvisualisatie en beeldnavigatiecontroles die worden gebruikt in de Clinical Islet Isolation- en Simple Comparison-tools. Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Navigeren op het perron

1. Weergaveversie en technische informatie
   1. Bekijk de huidige softwareversie en de meest recente trainingsdatum die in de bovenste navigatiebalk (Figuur 2K) worden weergegeven.
   2. Open het Home-gedeelte om de technische beschrijving en bijbehorende referentiegegevens te bekijken.
2. Voorlopige beoordeling van lokale beelden
   1. Bepaal of lokaal gegenereerde gestandaardiseerde afbeeldingen al correct door het platform kunnen worden geanalyseerd, op basis van de foutcriteria beschreven in stappen 1.2.4 en 1.5.2, of dat hertraining vereist is voor lokale gestandaardiseerde beelden (Figuur 1A en 1B).

3. Eenvoudige vergelijking en externe training met lokale beelden

1. Eenvoudige vergelijking
   OPMERKING: Gebruik de Simple Comparison-tool om geautomatiseerde analyseresultaten te vergelijken met een lokaal vastgestelde referentiemethode, meestal standaard handmatig tellen¹³, alternatieve tabellen ^7,11,18 of modellen ^5,6. Upload lokaal gegenereerde gestandaardiseerde afbeeldingen samen met de bijbehorende referentiewaarden en het type referentiemethode. De output bevat downloadbare tabellen, afbeeldingen en PDF-rapporten (Tabel 1).
   1. Open het dashboard Eenvoudige Vergelijking in de bovenste navigatiebalk (Figuur 4A en 4B).
   2. Bekijk de sectie Hints voor de vereiste afbeeldingseigenschappen (Figuur 4C).
   3. Download de form.xlsx sjabloon (Figuur 4D).
   4. Tel eilandjes in meerdere steekproeven met behulp van een lokaal vastgestelde referentiemethode.
   5. Verkrijg gestandaardiseerde microscopische beelden die overeenkomen met de geteld monsters.
   6. Zorg ervoor dat alle getelde eilandjes volledig in het beeldkader zijn opgenomen.
   7. Voer de exacte bestandsnamen en bijbehorende parameterwaarden in de form.xlsx-template in met Engelse decimale punten (Figuur 4E).
   8. Upload de voltooide spreadsheet en de bijbehorende afbeeldingsbestanden door te slepen en neer te zetten of met de uploadknoppen (Figuur 4F).
   9. Selecteer de conversietabel of model die wordt gebruikt voor het schatten van het eilandjesvolume (Figuur 4G).
   10. Klik op Submit batch om de side-by-side vergelijking te genereren.
   11. Wacht tot de analyseresultaten verschijnen.
   12. Open het inspectievenster om visuele validatie van de contouren uit te voeren.
   13. Sluit beelden uit als de contouren onjuist zijn (Figuur 3J).
       OPMERKING: Handmatige contourbewerking is niet beschikbaar in de Eenvoudige Vergelijkingstool.
   14. Download de resultaten als tabellen, afbeeldingen en PDF-rapporten (Tabel 1).
2. IsletNet-training voor lokaal gestandaardiseerde afbeeldingen
   1. Neem contact op met het ontwikkelingsteam van het Institute for Experimental Medicine (IKEM) op info@isletnet.com.
   2. Deel representatieve afbeeldingen die het bereik van de momenteel lokaal verkregen beeldkwaliteit bestrijken.
   3. Bespreek de eisen voor beeldkwaliteit met het ontwikkelingsteam.
      OPMERKING: Belangrijke beeldkwaliteitsparameters zijn voldoende contrast, volledige opname van eilandjes binnen het beeldkader en minimale overlap tussen aangrenzende eilandjes. De kleur van het eilandje kan variëren van rood tot roze of violet, mits het onderscheid met exocrien weefsel duidelijk blijft.
   4. Maak een trainingsbeeldset die het verwachte bereik van eilandjeszuiverheden, vergrotingen en kleurvariatie bestrijkt.

Figuur 4. Eenvoudige vergelijkingstool, dashboard en workflow. (A) Bovenste navigatiebalk. (B) Eenvoudig Vergelijkingsdashboard. (C) Upload hints en instructies. (D, E) form.xlsx sjabloon downloaden en geüpload parametervisualisatie. (F) Sleep-en-neerzetten uploadgebied voor afbeeldingen en spreadsheets. (G) Het selecteren van de omzetting van eilandgrootte naar volume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Steekproefneming

OPMERKING: Eilandjes sedimenteren snel en verschillend afhankelijk van grootte en vorm, wat de bemonsteringsresultaten kan beïnvloeden.

VOORZICHTIG: Voer alle procedures voor het hanteren van eilandjes uit binnen een laminaire flow kap terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.

1. Gebruik 50 mL of 250 mL buizen voor de islet-ophanging.
2. Bepaal de vereiste bemonsteringsfractie volgens het waargenomen pelletvolume en zuiverheid met behulp van lokale standaardprocedures.
3. Meng de suspensie van het eilandje grondig door de buis vijf keer voorzichtig om te draaien vlak voor het nemen van het monster.
4. Neem het monster onmiddellijk met een grote pipettip om blokkades door exocrien weefsel te voorkomen en schade aan het eilandje te minimaliseren.

5. Optimalisatie van Islet-beeldacquisitie

1. Dithizone-bereiding
   OPMERKING: Consistente dithizonekleuring is vereist om voldoende contrast te garanderen tussen eilandjes en exocrien weefsel. Hieronder worden twee veelgebruikte bereidingsmethoden beschreven.
   VOORZICHTIG: Dithizone wordt vermoed als een voortplantingstoxine. Dimethylsulfoxide (DMSO) is giftig en huidpenetrant. Natriumhydroxide is zeer corrosief en kan ernstige chemische brandwonden veroorzaken. Hanteer alle chemicaliën terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, vermijd huidcontact en voer afval af volgens institutionele procedures voor gevaarlijk afval.
   1. Herophanging in DMSO¹³
      1. Weeg 50 mg dithizonepoeder.
      2. Los de dithizone op in 5 mL DMSO.
      3. Incubeer de oplossing op 37°C en vortex elke 5 minuten krachtig gedurende 1 minuut totdat de oplossing voltooid is.
      4. Verdun 1 ml van de voorraadoplossing met 20 ml Hank's Balanced Salt Solution, dat 2% foetaal runderenserum bevat, om de werkoplossing te bereiden.
      5. Filter de oplossing door een 0,22 μm spuitfilter.
      6. Wikkel de buis in aluminiumfolie om de oplossing te beschermen tegen licht.
         OPMERKING: Gebruik de werkende oplossing binnen ongeveer 12 uur.
   2. Resuspendering in alkalische alcoholische oplossing (alternatief voor Ref. 8)
      1. Weeg 50 mg dithizonepoeder.
         OPMERKING: Bereid aliquots van tevoren voor indien gewenst.
      2. Voeg 800 μL van 70% ethanol toe aan de dithizone.
      3. Voeg 400 μL van 1 M natriumhydroxideoplossing toe en laat het volledig vortexen tot de oplossing voltooid is.
      4. Verdun de oplossing met fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,2 mg/mL humaan albumine tot een eindvolume van 20 mL.
      5. Filter de oplossing door een 0,22 μm spuitfilter.
      6. Wikkel de buis in aluminiumfolie om de oplossing te beschermen tegen licht.
         OPMERKING: Gebruik de werkende oplossing binnen ongeveer 12 uur.
2. Eilandjeskleuring
   1. Voeg 25 μL dithizone-werkoplossing toe aan het midden van een 35 mm schotel.
   2. Voeg 50 μL aan eilandjes toe die zijn opgeskort in Hank's Balanced Salt Solution met albumine, Complete Culture Medium of Transplantation Medium.
      OPMERKING: Het daadwerkelijke monstervolume varieert tussen 20-50 μL, afhankelijk van de zuiverheidsfractiepellet, met een uiteindelijke dithizoneconcentratie van 0,85 mg/mL tot 1,37 mg/mL.
   3. Pipetteer de suspensie drie keer in en uit met de eerste stop om de oplossingen voorzichtig te mengen zonder bellenvorming te voorkomen.
   4. Incubeer het monster bij 20°C–25°C gedurende 1–2 minuten terwijl je de kleuring visueel onder de microscoop monitort totdat de eilandjes felrood lijken. Sommige preparaten kunnen slecht gekleurde eilandjes bevatten, waarvoor IsletNet ook is getraind.
   5. Gebruik een 10 mL spuit om snel 4 mL fosfaatgebuffte zoutoplossing te injecteren, aangevuld met 0,2 mg/mL albumine, direct in het gekleurde monster, terwijl je zowel bellen als spetteren vermijdt.
   6. Draai het gerecht direct krachtig in een cirkelvormige beweging om de oplossingen te mengen, beweeg de eilandjes naar het midden voordat je tot rust komt.
      OPTIE 1: Voeg voorzichtig 4 ml PBS/albumine toe, zodat de eilandjes in dithizone onaangeroerd blijven. Draai vervolgens voorzichtig de schaal in een cirkelvormige beweging om de oplossingen te mengen en de eilandjes in het midden te houden. Wacht tot dithizone in het gerecht is verspreid.
      OPTIE 2 (geschikt voor stereomicroscoop): In plaats van de eilandjes te verdunnen, verdeel de dithizone-eilandjesdruppel in een dunne laag met behulp van een pipetpunt of naald in plaats van te verdunnen om reflecties te verminderen.
   7. Inspecteer het monster onder de microscoop en breng onmiddellijk eventuele verplaatste eilandjes voorzichtig terug naar het cameraveld door de omliggende oplossing met een pipettip te draaien.
   8. Begin onmiddellijk met beeldacquisitie om cytotoxiciteit en veranderingen in het eilandvolume te minimaliseren.
3. Beeldverwerving
   OPMERKING: Gebruik een stereo- of omgekeerde microscoop met een objectief met lage vergroting en een stabiele lichtbron. Bescherm de schotel tegen extra lichtbronnen, zoals kamerverlichting.
   1. Zet de lichtbron aan en laat de halogeenlamp 5 minuten opwarmen.
   2. Stel een gestandaardiseerde lichtintensiteit in om schittering en onderbelichting te voorkomen. Het exacte bereik hangt af van de gebruikte beeldvormingsapparatuur.
      OPMERKING: De optimale lichtintensiteit kan variëren afhankelijk van vergroting en zuiverheid van het monster.
   3. Selecteer de objectief- en zoominstelling die alle eilandjes binnen het cameraveld laat blijven.
   4. Houd dezelfde vergroting voor alle monsters binnen een batch en bij voorkeur voor alle zuiverheidsbatches.
   5. Kalibreer de witbalans indien nodig met een genormaliseerde witte slide. Als de beeldkwaliteit onbevredigend blijft vanwege de unieke kenmerken van de eilandvoorbereiding, pas dan RGB-waarden en/of gamma-instellingen aan.
   6. Pas de belichtingstijd aan en, indien nodig, de lichtintensiteit of versterking met behulp van het kleurenhistogram om overbelichting te voorkomen.
      OPMERKING: Monsters met overvloedig exocrien weefsel kunnen verschillende camera- of verlichtingsinstellingen vereisen vanwege gereflecteerd licht van niet-eilandweefsel. Om reproduceerbaarheid te waarborgen, sla deze parameters op als een apart configuratiebestand voor toekomstige referentie.
   7. Leg de afbeelding vast en sla het bestand op in een ondersteund formaat, waaronder JPG, PNG, TIFF of BMP.
      OPMERKING: Neem de datum, zuiverheidsfractie, vergroting of pixelgrootte en verdunning op in de bestandsnaam om toekomstige heranalyse te vergemakkelijken (bijv. iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Neem een afbeelding van de stage-micrometer met dezelfde vergroting en zoominstellingen als voor monsteropname.

6. Clinical Islet Isolation Tool

OPMERKING: De belangrijkste workflowstappen zijn samengevat in Figuur 1C. Analyseer beelden in zuiverheidsfractiebatches zodra monsters beschikbaar komen.

Resultaten

Pure Rat-eilandjes

In het eerste experiment werden 36 beelden gemaakt die 12 monsters vertegenwoordigen met in totaal 249 gezuiverde ratteneilandjes tijdens vier onafhankelijke beeldsessies. Beelden werden gemaakt met een stereomicroscoop onder drie gestandaardiseerde maar verschillende belichtingsomstandigheden, waarbij halogeen- en lichtdiode (LED) lichtbronnen werden gebruikt, samen met verschillende camera-instellingen. Ground-truth (GT) segmentaties werden handmatig gegenereerd voor drie representatieve beelden door de trainingsexpert van IsletNet .

Wanneer de beelden werden geanalyseerd met de openbaar beschikbare versie van de Simple Comparison-tool, kwam geen van de automatisch gegenereerde contouren door de visuele kwaliteitscontrole (vQC, Figuur 5F). Het platform werd vervolgens opnieuw getraind met behulp van representatieve lokale beelden, en alle contouren die door de hertrainde experimentele versie werden gegenereerd, slaagden voor vQC (Figuur 5C).

De verhouding van geautomatiseerde tot handmatige schattingen van eilandjesvolume toonde consistente prestaties over de drie beeldvormingscondities na hertraining, met mediaanwaarden van respectievelijk 1,03, 0,98 en 0,94 voor de verlichtingscondities A, B en C (Figuur 5A). Deze resultaten vertegenwoordigden een aanzienlijke verbetering ten opzichte van het oorspronkelijke trainingsmodel (Figuur 5B).

Pixel-gewijze vergelijking met GT-segmentaties toonde nauwe overeenstemming aan tussen geautomatiseerde en handmatig gegenereerde contouren na hertraining (Figuur 5D), wat overeenkomt met nauwkeurige contourplaatsing in representatieve beelden (Figuur 5C). Daarentegen toonde het oorspronkelijke trainingsmodel een groter aandeel vals-negatieve pixels (Figuur 5G) en contourverschuiving (Figuur 5F), wat resulteerde in een verschuiving naar kleinere eilandjescategorieën in de bijbehorende eilandgrootte-histogrammen (Figuur 5E versus 5H).

Figuur 5. Beoordeling van platformretraining met behulp van drie beeldvormingsopstellingen en voorbereidingen van ratteneilandjes. (A) Vergelijking van IsletNet- en handmatige eilandjesequivalente (IEQ) schattingen na hertraining met behulp van drie beeldvormingsopstellingen. (B) Vergelijking van IsletNet- en handmatige IEQ-schattingen met behulp van het oorspronkelijke publieke trainingsmodel. (C, F) Representatieve contourplaatsing met behulp van de vQC-tool na en vóór het hertrainen van het model, respectievelijk. Witte pijlpuntjes geven de juiste contourplaatsing aan en magenta pijlpuntjes geven de verkeerde contourplaatsing aan. (D, G) Pixel-gewijze vergelijking met grondwaarheid na hertraining en met het oorspronkelijke trainingsmodel, respectievelijk. Echt positief, vals positief, vals negatief en echt negatief worden in de legende aangegeven. (E, H) Representatieve histogrammen voor eilandgrootte na hertraining en met het oorspronkelijke trainingsmodel, respectievelijk, vergeleken met handmatig tellen. Beeldopstelling 1 = LED-verlichting; beeldopstelling 2 = halogeenverlichting; beeldopstelling 3 = LED-donkerveldverlichting. Schaalbalken = 100 μm. Boxplots worden weergegeven volgens de Tukey-conventie; Whiskers reiken uit tot datapunten binnen 1,5 × interkwartielbereik van het eerste en derde kwartiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Klinische menselijke eilandjespreparaten

In het tweede experiment werden 17 beelden die een enkele isolatieprocedure voor een menselijk eilandje met drie zuiverheidsfractieparen voorstellen, geanalyseerd met behulp van de openbaar beschikbare versie van het platform. Er is één monster verloren gegaan. Na vQC werden alle beelden die middel- en laagzuiverheidsfracties vertegenwoordigden uitgesloten vanwege valse eilanddetectie (gegevens niet getoond). Het platform werd vervolgens opnieuw getraind met behulp van representatieve lokale beelden.

Na hertraining hebben alle beelden de vQC doorstaan na toevoeging van drie handmatige scheidingslijnen. Batch-gewijze vergelijking met handmatig tellen toonde een totale onderschatting van ≤5% voor het totale aantal eilandjes en volumeschattingen. Monsters verdund tussen de 2.000 en 4.000 keer bevatten tussen de 80 en 4 eilandjes afhankelijk van de zuiverheidsfractie. De relatieve bijdrage van individuele zuiverheidsfracties aan de uiteindelijke voorbereiding wordt weergegeven in Figuur 6A. Hoge zuiverheidsfractie 1VC2 droeg voornamelijk kleinere eilandjes bij vergeleken met mediumzuiverheidsfractie 2SC1. Het totale histogram voor eilandgrootte dat automatisch door het platform wordt gegenereerd, wordt weergegeven in Figuur 6B.

Figuur 6. Kwantificering en analyse van menselijke eilandisolatiemonsters. (A) Schattingen van het aantal eilandjes en equivalente volumes met behulp van IsletNet en handmatige telmethoden over zuiverheidsfracties van het volledige graft. (B) Definitieve histogram van eilandgrootte, gegenereerd door IsletNet met batch-gemiddelde waarden. (C) Vergelijking van IsletNet- en handmatige schattingen van aantal en volume over 17 individuele afbeeldingen. (D) Representatief beelddetail uit voorbeeld 3NC1 dat de originele afbeelding en contourplaatsing toont die door hertrainde IsletNet is gegenereerd. (E) Pixel-gewijze vergelijking van IsletNet-segmentatie met de grondwaarheid gegenereerd door de handmatig tellende expert versus IsletNet-trainingsexpert (GT1 vs. GT2). Echt positief, vals positief, vals negatief en echt negatief worden in de legende aangegeven. (F) Representatief histogram voor eilandgrootte voor dezelfde afbeelding, waarbij IsletNet- en handmatige resultaten worden vergeleken. Magenta-pijlpunten geven een verandering in de contour- en eilandjesgrootte aan. Schaalbalken = 100 μm. Boxplots worden weergegeven volgens de Tukey-conventie; Whiskers reiken uit tot datapunten binnen 1,5 × interkwartielbereik van het eerste en derde kwartiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geautomatiseerde en handmatige schattingen werden vervolgens vergeleken voor alle individuele beelden (Figuur 6C). De mediaanverhoudingen tussen geautomatiseerde en handmatige schattingen waren 1,00 voor het aantal eilandjes en 0,93 voor het volume van eilandjes, met verschillende waargenomen uitschieters. In één representatieve lage zuiverheidssteekproef (3NC1) identificeerde het platform hetzelfde aantal eilandjes als handmatig tellen (vijf eilandjes), maar schatte een 29% lager eilandjesvolume. Deze datapunten worden aangegeven door pijlpunten in Figuur 6C.

Het grootste eilandje, gedeeltelijk gevangen in exocrien weefsel, uit deze representatieve afbeelding is weergegeven in Figuur 6D, inclusief de originele afbeelding en de automatisch gegenereerde contouroverlay. Pixel-gewijze vergelijking met GT-segmentaties die onafhankelijk door twee experts zijn gegenereerd, is weergegeven in Figuur 6E. De bijbehorende histogrammen voor eilandjesgrootte toonden een verschuiving in grootteverdeling tussen handmatige en geautomatiseerde segmentaties (Figuur 6F).

Operationele prestaties van geautomatiseerde analyse

De operationele prestaties van de Simple Comparison en Clinical Islet Isolation-tools werden geëvalueerd onder standaard internetomstandigheden met gemiddelde download- en uploadsnelheden van respectievelijk 50 Mbps en 30 Mbps. Vijf beeldbatches met elk 12 afbeeldingen werden geanalyseerd met beeldgroottes variërend van 0,5 MB JPEG-bestanden tot 20 MB TIFF-bestanden. De downloadduur werd gemeten voor complete ZIP-resultaatpakketten.

De visualisatietijden en downloadtijden van analyse namen geleidelijk toe met de beeldgrootte voor beide tools (Tabel 4). De Clinical Islet Isolation-tool vereiste langere verwerkingstijden dan de Simple Comparison-tool voor equivalente beeldsets. Deze resultaten tonen de praktische relatie aan tussen beeldresolutie, bestandsformaat en analysedoorvoer tijdens routinematige werking.

Tabel 4: Analysevisualisatietijden en downloadduur voor de Clinical Islet Isolation en Simple Comparison tools. Vergelijking van de verwerkingstijden die nodig zijn voor resultaatvisualisatie en bestandsdownload met behulp van afbeeldingsbatches van verschillende bestandsgroottes en formaten. Metingen werden verkregen met batches met 12 afbeeldingen en worden gerapporteerd als verstreken tijd van batch-indiening tot resultaatvisualisatie of downloadvoltooiing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de praktische workflow voor potentiële en gevestigde gebruikers van IsletNet, met nadruk op twee cruciale functies van het platform: deskundige vQC en neurale netwerkhertraining. De representatieve resultaten tonen aan dat nauwkeurige geautomatiseerde kwantificering niet alleen afhangt van de beeldsegmentatieprestaties, maar ook van het vermogen van de gebruiker om de contourplaatsing en beeldgeschiktheid kritisch te evalueren voordat de resultaten worden geaccepteerd. Twee extra geavanceerde tools, Pixel-to-Pixel Comparison en My Segmentations, werden gebruikt om geselecteerde validatieresultaten te genereren; Deze tools zijn echter primair bedoeld voor ondersteuning van neurale netwerktraining en zijn daarom niet opgenomen in de protocolworkflow.

IsletNet is ontwikkeld als een samenwerkend en breed toegankelijk referentiehulpmiddel voor gestandaardiseerde beeldanalyse van eilandjes in laboratoria. Het neurale netwerk werd getraind en gevalideerd met handmatig geannoteerde GT-segmentaties van originele tweedimensionale microscopische beelden van geïsoleerde menselijke en ratteneilandjes 14,15,16. Twee aparte modellen voor dithizone-gekleurde preparaten en een extra onderzoeksmodel voor ongekleurde ratteneilandjes werden gegenereerd, met toegang op verzoek mogelijk. De platformversie en trainingsdatum worden weergegeven in de gebruikersinterface. IsletNet segmenteert automatisch eilandjes en exocrien weefsel en berekent vervolgens het aantal eilandjes, volume en zuiverheid met behulp van de door de gebruiker gedefinieerde pixelgrootte en minimale eilandjesdrempel. De keuze voor de drempelgrootte van het eilandje hangt af van de beeldkwaliteit en het doel van de analyse (naast elkaar vergelijken met handmatig tellen versus studie van kleine eilandjes) en niet van de soort. Gegeven de resolutie van conventionele microscopie is de betekenisvolle minimale eilandgrootte 50 μm 7,8,9,12, maar deze kan worden verkleind tot 10 μm voor beelden die met een geschikt instrument¹⁰ zijn verkregen. Schattingen van eilandjesvolume worden gegenereerd met behulp van standaard bol-gebaseerde conversietabel¹³ evenals alternatieve conversietabellen ^7,18,19, inclusief aangepaste ellipsbenaderingen ^5,6 en contourgebaseerde Spinacle- en Sphiracle-modellen¹⁷. De resulterende waarden worden gerapporteerd in eilandjesequivalenten en nanoliter, terwijl zuiverheid wordt berekend uit weefseloppervlak of geschatte weefselvolume. Een cruciale stap in het protocol is het verkrijgen van gestandaardiseerde microscopische beelden die geschikt zijn voor geautomatiseerde segmentatie. IsletNet werd getraind met beelden die werden gemaakt met stereo- en omgekeerde microscopen, uitgerust met een reeks complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera's en verlichtingssystemen. Objectieven met lage vergroting (1–2×) zijn voordelig omdat ze het volledige monster binnen het gezichtsveld laten blijven, terwijl een pixelgrootte behouden blijft die compatibel is met betrouwbare detectie van kleine eilandjes. Consistente belichting, stabiele witbalans en het voorkomen van overbelichting zijn essentieel voor betrouwbare contourgeneratie. De representatieve resultaten tonen aan dat hertraining met representatieve lokale beelden de segmentatieprestaties aanzienlijk kan verbeteren bij heterogene beeldvormingsomstandigheden. Als praktische richtlijn zijn beelden over het algemeen geschikt voor IsletNet-training wanneer de grenzen van eilandjes en exocriene weefsels duidelijk te onderscheiden zijn voor een ervaren waarnemer. Afbeeldingen met geclusterde of sterk overlappende eilandjes moeten waar mogelijk worden vermeden.

Het protocol benadrukt ook verschillende beperkingen en probleemoplossingsoverwegingen die samenhangen met geautomatiseerde beeldanalyse. Hoewel IsletNet de doorvoersnelheid, objectiviteit en reproduceerbaarheid aanzienlijk verhoogt vergeleken met volledig handmatig tellen, blijft de methode gevoelig voor beeldkwaliteit. Onjuiste contourplaatsing (valse detectie van eilandjes en het niet sepen van aangrenzende eilandjes) kan af en toe voorkomen en kan de kwantificatie stroomafwaarts beïnvloeden. Een routinematige vQC blijft essentieel voordat geautomatiseerde resultaten worden geaccepteerd. Directe toepassing op locatie op IsletNet is voordelig omdat ongeschikte beelden opnieuw kunnen worden verkregen met aangepaste beeldparameters. Handmatige correctie van automatische contouren is mogelijk binnen het inspectievenster, behalve bij ontbrekende eilandjes of meerdere valse eilandjes. Daarnaast is het geautomatiseerde scheidingsalgoritme gebaseerd op contourgeometrie en eilandgrootteverdelingsstatistieken en kan het daarom verschillen van de initiële interpretatie van een individuele expert, terwijl het toch analytisch acceptabel blijft.

De betrouwbaarheid van IsletNet wordt voornamelijk bepaald door consistentie tussen lokale beeldkwaliteit en de trainingsdataset, en niet alleen door soorten. Hoewel de huidige trainingsset menselijke eilandjes met verschillende zuiverheden en hoogzuivere ratteneilandjes bevat, kan het platform worden uitgebreid naar andere soorten, mits de beeldkenmerken consistent blijven met de trainingsgegevens. Zo kunnen varkenseilandjes die door cultuur zijn gezuiverd, lijken op ingebedde menselijke eilandjes die aanwezig zijn in de trainingsdataset. Daarentegen waren uitgebreid gekweekte eilandjes met zwakke dithizonekleuring niet vertegenwoordigd tijdens de training en kunnen extra training vereisen. De Simple Comparison-tool ondersteunt daarom een belangrijke validatiestap voor nieuwe gebruikers of nieuwe beeldvormingsconfiguraties. De hier gepresenteerde resultaten benadrukken hoe verschillende interpretaties van experts van embedded islets de generatie van GT en downstream volumeschatting kunnen beïnvloeden. Om het ontbreken van brede deskundige consensus in toekomstige multicenterstudies aan te pakken, werd de IsletSwine-applicatie²⁰ ontwikkeld om consensusgebaseerde afbeeldingsannotatie te faciliteren.

In vergelijking met conventioneel handmatig tellen onder een microscoop biedt IsletNet aanzienlijk hogere doorvoer, permanente digitale documentatie en gestandaardiseerde kwantitatieve output, terwijl de variabele operator-afhankelijkheid wordt verminderd. Handmatige telling kan nog steeds meer vertrouwen bieden in weefselidentificatie in borderline-gevallen, maar wordt beperkt door subjectieve grootteschatting, lagere schaalbaarheid en uitgebreide personeelstraining. Als webgebaseerde dienst maakt IsletNet interlaboratoriumvergelijking mogelijk door middel van gecentraliseerde maar anonieme analyse. De analysesnelheid blijft afhankelijk van de lokale internetbandbreedte, de grootte van het afbeeldingsbestand en de complexiteit van het beeld. Grotere TIFF-bestanden kunnen de beeldkwaliteit verbeteren, maar vereisen langere upload- en downloadtijden vergeleken met gecomprimeerde JPEG-afbeeldingen.

Al met al tonen de hier gepresenteerde resultaten aan dat betrouwbare geautomatiseerde kwantificering kan worden bereikt wanneer lokale beeldacquisitie reproduceerbaar en consistent blijft met de trainingsset. Gebruikers worden aangemoedigd vQC in hun routine op te nemen en hertraining te overwegen wanneer er aanzienlijke veranderingen in lokale beeldvormingsomstandigheden worden geïntroduceerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 mm Petri schotel	Sigma-Aldrich	P5481	Ongesteriliseerd
200 µL pipette tips, brede boring	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Voor islet suspensie dosering vóór kleuring
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC grade of cell culture grade
Dithizon (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Poeder
Ethanol, 70%	Lokale leverancier	N/A	(v/v) in H2O; voor DTZ bereiding
Fetaal bovien serum (FBS)	Gibco	10270106	Heat-inactivated, gekwalificeerd
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Met of zonder fenol rood (specifiek op basis van de test)
Humaan albumine	Grifols	61953-0001-2	Hoge concentratie oplossing (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Standaard beeldopnamesoftware
Omgekeerde microscoop CKX41	Olympus	N/A	1.25x en 2x objectieven
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED lichtbron; dubbele zwanenhals gids
Lichtbron Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Halogeen lichtbron (14,5 V, 90 W); handmatige intensiteitsregeling; dubbele zwanenhals gids
Laboratorium benodigdheden	Diverse	N/A	Pipetten, buizen, naalden, spuiten, laboratoriumtimers, standaard PPE
MicroCam software	Bresser	N/A	Standaard beeldopnamesoftware
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3,1 MP camera
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0,22 µm poriëngrootte, PES membraan
Fosfaat gebufferde saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 MP, camera met hoog dynamisch bereik
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Standaard beeldopnamesoftware
Natriumhydroxide (1 M NaOH)	Lokale leverancier	N/A	Voor pH aanpassing en oplossing tijdens DTZ bereiding
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm lengte; 50 µm verdelingen voor kalibratie
Stereomicroscoop SZH10	Olympus	N/A	1x apochromatisch objectief