Anthrone colorimetrische methode voor het kwantificeren van glycogeen in rattenlever en skeletspieren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een anthrone-colorimetrische methode om glycogeen in rattenlever en skeletspieren te kwantificeren over verschillende metabole toestanden.

Samenvatting

Glycogeen is een belangrijke intracellulaire glucosereserve in lever- en skeletspieren en speelt een fundamentele rol in het koolhydraatmetabolisme. Hepatische glycogeen is essentieel voor het behouden van systemische glycemische homeostase, terwijl skeletspierglycogeen fysieke activiteit en inspanningsprestaties ondersteunt. Nauwkeurige kwantificering van weefselglycogeen is daarom cruciaal voor studies waarin het glycogeenmetabolisme dynamisch wordt gereguleerd of pathologisch veranderd. Hier beschrijven we een betrouwbare en gevoelige anthronecolorimetrische methode om het glycogeengehalte in rattenlever- en skeletspieren te kwantificeren. Het protocol bestaat uit opeenvolgende stappen, waaronder alkalische vertering, deproteïnisatie, glycogeenprecipitatie, alcoholwasbeurt en kleurontwikkeling met anthrone-reagens. De toepasbaarheid van deze methode wordt aangetoond bij ratten die aan drie fysiologisch relevante aandoeningen zijn blootgesteld: ad libitum voeding, nachtelijk vasten en kortdurend hervoeren. Deze experimentele paradigma's vangen belangrijke metabole toestanden vast die samenhangen met glycogeenopslag, uitputting en resynthese. Orthogonale western blot-analyse van belangrijke enzymen, glycogeensynthase en glycogeenfosforylase, biedt mechanistische ondersteuning voor de waargenomen metabole veranderingen. De toepasbaarheid van deze methode wordt verder aangetoond bij dieren die met epinefrine werden behandeld om acute door stress veroorzaakte glycogeenafbreking te modelleren. Gezamenlijk biedt deze methode een breed dynamisch bereik en voldoende gevoeligheid om weefselglycogeen te kwantificeren over duidelijk verschillende fysiologische toestanden. Het biedt een betrouwbaar hulpmiddel voor het onderzoeken van glycogeenmetabolisme in vivo en kan ook worden toegepast op in vitro celkweekmodellen.

Inleiding

Glycogeen is een sterk vertakte polysaccharide die dient als een belangrijk energiereservoir in skeletspieren en lever van zoogdieren, en in mindere mate in andere organen zoals de hersenen, nieren, het hart en vetweefsel¹. Tijdens het voeden ondergaat overtollige glucose polymerisatie of de novo lipogenese, en wordt opgeslagen als glycogeen of lipiden. Tijdens vasten of fysieke inspanning ondergaat glycogeen echter enzymatische afbraak, waardoor een constante en snelle aanvoer van glucose wordt gegarandeerd om aan de energievraag te voldoen. Deze buffercapaciteit van glycogeen is essentieel voor het handhaven van de glycemische homeostase tijdens fysiologische vaste-hervoedingscycli².

De glycogeensynthese wordt gekatalyseerd door glycogeensynthase (GYS), die voorkomt in twee zoogdierisoformen: GYS1 en GYS2. GYS1 wordt voornamelijk tot expressie gebracht in skeletspieren, terwijl GYS2 de leverisoform is. De katalytische activiteit van GYS wordt onderdrukt door fosforylering op meerdere locaties, waaronder Ser641, onder nuchtere omstandigheden, terwijl de activiteit wordt gestimuleerd bij defosforylering onder voedingsomstandigheden. De afbraak van glycogeeen wordt gekatalyseerd door glycogeenfosforylase. De leverisoform is PYGL en de spierisoform is PYGM. In tegenstelling tot GYS wordt hun katalytische activiteit gestimuleerd bij fosforylering bij Ser15 tijdens het vasten en onderdrukt bij defosforylering na voeding³.

Een juiste regulatie van het glycogeenmetabolisme is fundamenteel voor tal van biologische processen, en ontregelde glycogeenmetabolisme is geïdentificeerd als een oorzakelijke factor bij veel ziekten. Specifiek is veranderde leverglycogeenmetabolisme geassocieerd met diverse metabole stoornissen, waaronder glycogeenopslagziekten⁴, type 2 diabetes⁵, metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte ^6,7 en een verstoorde tegenregulerende respons op hypoglykemie⁸. Daarnaast is hersenglycogeen essentieel voor de vorming van langetermijngeheugen⁹, terwijl skeletspierglycogeen een belangrijke regelaar is van het uithoudingsvermogen¹⁰. Daarom is nauwkeurige kwantificering van weefselglycogeen cruciaal voor studies waarin het glycogeenmetabolisme dynamisch wordt gereguleerd of pathologisch veranderd, waardoor het mogelijk wordt om ziektemechanismen te onderzoeken en glycogeenmodulerende interventies te evalueren.

Verschillende glycogeenkwantificatiemethoden zijn gerapporteerd, waaronder de anthronemethode^11,12, amyloglucosidasemethode¹³, fenol–zwavelzuurmethode¹⁴ en de niet-invasieve nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (MRS) methode¹⁵, waarbij elke methode bepaalde voordelen en beperkingen heeft. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de anthrone-colorimetrische methode om glycogeen te kwantificeren in rattenlever- en skeletspieren (Figuur 1). Dit protocol omvat opeenvolgende stappen van alkalische vertering, deproteïnisatie, glycogeenprecipitatie, alcoholwasbeurt en kleurontwikkeling met behulp van anthrone-reagens. Deze methode is eenvoudig, economisch en vereist minimale gespecialiseerde instrumentatie. Om de gevoeligheid en reproduceerbaarheid aan te tonen, berekenden we de detectielimiet (LOD), kwantificatiegrens (LOQ), evenals de intra-assay en inter-assay variatiecoëfficiënt (CV%) met behulp van een reeks glycogeenstandaarden. Om de toepasbaarheid aan te tonen, werden glycogeenniveaus in lever- en skeletspieren beoordeeld onder drie fysiologisch relevante omstandigheden: ad libitumvoeding, 16 uur durende nachtvasten en kortdurende hervoeding. Daarnaast werd de methode gedemonstreerd met behulp van met epinefrine behandelde dieren om acute door stress veroorzaakte glycogeenafbreking te modelleren. Orthogonale western blot-analyse van belangrijke enzymen die betrokken zijn bij glycogeenmetabolisme werd uitgevoerd om de waargenomen metabole veranderingen te bevestigen.

Figuur 1: Overzicht van de glycogeenkwantificatieworkflow. Schematische weergave van de experimentele workflow voor glycogeenkwantificering in lever- en skeletspieren. De procedure omvat weefselverzameling, alkalische vertering, eiwitprecipitatie, glycogeenisolatie en anthrone-gebaseerde colorimetrische detectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; #1905019) van de Nanjing Medical University.

1. Bereiding van reagentia

1. Raadpleeg de Materiaaltabel voor alle reagentia die in deze studie zijn gebruikt.
2. Bereid alle oplossingen voor vóór de start van de experimenten.
3. Schaal de volumes van oplossingen op naar behoefte.
4. Maak 1 M natriumhydroxide (NaOH) oplossing
   1. Weeg 40 g NaOH-pellets.
   2. Voeg de NaOH-pellets toe aan 800 mL gedestilleerd water.
   3. Roer de oplossing met een glazen staaf totdat er geen onopgeloste deeltjes meer aan de bodem van het vat overblijven.
   4. Breng de oplossing over in een 1 L volumetrische kolf.
   5. Breng het volume tot precies 1 liter met gedestilleerd water.
   6. Bewaar de oplossing in een goed gesloten fles op kamertemperatuur (RT; 18°C–23°C).
      WAARSCHUWING: NaOH is corrosief. Draag een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas. Commerciële NaOH-pellets zijn niet 100% puur en absorberen water. Vermijd langdurige blootstelling van pellets aan lucht.
5. Bereid een oplossing van 20% lithiumchloride (LiCl)
   1. Weeg 20 g watervrij LiCl-poeder.
   2. Voeg het LiCl-poeder toe aan 80 mL gedestilleerd water.
   3. Roer de oplossing totdat er geen onopgeloste deeltjes meer aan de basis van het vat overblijven.
   4. Overbreng de oplossing naar een volumetrische kolf van 100 mL.
   5. Breng het volume precies tot 100 mL met gedestilleerd water.
   6. Bewaar de oplossing in een stevig gesloten fles bij RT.
      OPMERKING: LiCl kan de huid, ogen en de luchtwegen irriteren. Draag een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas. LiCl is sterk hygroscopisch. Minimaliseer blootstelling aan lucht om wateropname te voorkomen.
6. Bereid een anthrone-reactieoplossing voor
   1. Doe 28 ml gedestilleerd water in een 1 L beker.
   2. Voeg 72 mL hoogzuiver geconcentreerd (98%) zwavelzuur (H₂SO₄) toe aan het water.
   3. Laat het mengsel afkoelen tot RT.
   4. Voeg 50 mg anthrone toe aan de oplossing.
   5. Roer tot de anthron is opgelost.
   6. Voeg 3 g thiourea toe aan de oplossing.
   7. Roer tot de thiourea is opgelost.
   8. Breng de oplossing over in een met amberkleurige of folie omhulde glazen fles.
   9. Bewaar de oplossing maximaal één week in een koelkast (2°C–8°C).
      VOORZICHTIG: Zwavelzuur is zeer corrosief, veroorzaakt ernstige chemische brandwonden en reageert heftig met water. Draag een labjas, chemisch bestendige handschoenen en een gezichtsscherm. Voer alle stappen uit in een gecertificeerde chemische dampkap. Verdunning veroorzaakt intense hitte. Voeg altijd zuur toe aan water.
7. Bereid 95% ethanol met 0,1% LiCl
   1. Voeg 95 ml absolute ethanol toe aan een glazen fles.
   2. Voeg 4,5 ml gedestilleerd water toe.
   3. Voeg 0,5 mL 20% LiCl-kolf oplossing toe.
   4. Meng grondig.
8. Bereid 80% methanol voor met 0,1% LiCl
   1. Voeg 80 mL absolute methanol toe aan een glazen fles.
   2. Voeg 19,5 mL gedestilleerd water toe.
   3. Voeg 0,5 mL 20% LiCl-kolf oplossing toe.
   4. Meng grondig.
9. Maak een oplossing van 100% (met v) trichloorazijnzuur (TCA)
   1. Weeg 100 g TCA-poeder.
   2. Voeg het TCA-poeder toe aan 80 mL gedestilleerd water.
   3. Roer tot het opgelost is.
   4. Overbreng de oplossing naar een volumetrische kolf van 100 mL.
   5. Breng het volume precies tot 100 mL met gedestilleerd water.
   6. Bewaar de oplossing in een stevig gesloten glazen fles bij RT.
10. Maak een verzadigde benzoëzuuroplossing
    1. Voeg 0,5 g benzoëzuurkristallen toe aan 100 ml gedestilleerd water in een glazen beker van 250 ml.
    2. Verhit het mengsel tot 90°C op een hete plaat met continu magnetisch roeren.
    3. Blijf verwarmen totdat er geen onopgeloste deeltjes meer aan de basis van het vat overblijven.
    4. Laat de oplossing afkoelen naar RT.
    5. Aspiraat het heldere supernatant dat vrij is van zichtbare deeltjes.
    6. Bewaar de oplossing in een goed afgesloten glazen fles bij RT.
11. Bereid glucosenormen voor
    1. Los 50 mg glucosepoeder op in 50 mL verzadigde benzoëzuuroplossing om een 1 mg/mL bouillonoplossing te maken.
    2. Bereid glucosestandaarden voor (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 en 1 mg/mL) in 1,5 mL microcentrifugebuizen door seriële verdunning met verzadigd benzoëzuur als volgt.
       1. Voeg 500 μL van 1 mg/mL kolfoplossing toe aan buis 1 om de standaard van 1 mg/mL te maken.
       2. Voeg 250 μL voorraadoplossing en 250 μL verzadigd benzoëzuur toe aan buis 2 om de 0,5 mg/mL standaard te bereiden.
       3. Voeg 200 μL oplossing van buis 2 en 300 μL verzadigd benzoëzuur toe aan buis 3 om de standaard van 0,2 mg/mL te bereiden.
       4. Voeg 250 μL Tube 3-oplossing en 250 μL verzadigd benzoëzuur toe aan Tube 4 om de 0,1 mg/mL standaard te bereiden.
       5. Voeg 250 μL Tube 4-oplossing en 250 μL verzadigd benzoëzuur toe aan Tube 5 om de 0,05 mg/mL standaard te bereiden.
       6. Voeg 200 μL Tube 5-oplossing en 300 μL verzadigd benzoëzuur toe aan Tube 6 om de 0,02 mg/mL standaard te bereiden.
       7. Voeg 250 μL buis 6-oplossing en 250 μL verzadigd benzoëzuur toe aan buis 7 om de 0,01 mg/mL standaard te bereiden.
       8. Voeg 500 μL verzadigd benzoëzuur toe aan een aparte buis om de blank (0 mg/mL) te bereiden.
    3. Sluit elke tube af en laat het kort vortexen voor 10 seconden om goed te mengen.

2. Dierbehandeling

1. Algemene veeteelt
   1. Huisdieren mannelijke Sprague–Dawley-ratten (230–270 g) in een dierenfaciliteit onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden (VAF/Plus gezondheidsstatus, Charles River Laboratories), gecertificeerd vrij van veelvoorkomende knaagdierpathogenen zoals Sendai-virus, Mycoplasma pulmonis en ratparvovirussen.
   2. Bied een standaard voedseldieet aan en zorg voor vrije toegang tot water.
   3. Houd de dieren op een licht/donker-cyclus van 12 uur (licht aan om 08:00 uur en licht uit om 20:00 uur).
   4. Houd de RT aan op 22°C–23°C.
   5. Houd de relatieve luchtvochtigheid op 30%–70%.
2. Nachtvast
   1. Breng ratten over naar gewone kooien.
   2. Verwijder voedsel en zorg voor gratis toegang tot water.
   3. Blijf 16 uur vasten van 16:30 tot 08:30 de volgende ochtend.
3. Hervoeding
   1. Geef regelmatig voedselvoer (200 g) aan ratten die 's nachts vasten.
   2. Laat dieren 2 uur ad libitum eten.
4. Epinefrine-uitdaging
   1. Maak een oplossing voor epinefrinehydrochloride.
      1. Weeg 5 mg epinefrinehydrochloridepoeder met een gekalibreerde analytische weegschaal.
      2. Breng het poeder over in een 15 mL centrifugebuis en voeg 10 mL zoutoplossing toe.
      3. Sluit de buis af en draai 10 keer om een 0,5 mg/mL bouillonoplossing te bereiden.
   2. Injecteer niet-nuchtere ratten intraperitoneaal met epinefrinehydrochlorideoplossing met een volume van 1 mL/kg lichaamsgewicht (0,5 mg/kg lichaamsgewicht)³.
      1. Houd het dier in een hoofd-naar beneden positie zodat de buikinhoud zich kraniaal kan bewegen.
      2. Steek een naald van 25 gauge in het rechterbenedenkwadrant van de buik onder een hoek van 45°.
      3. Aspireer om de afwezigheid van bloed of enterische inhoud te bevestigen vóór de injectie.
   3. Injecteer controledieren intraperitoneaal met zoutoplossing met een volume van 1 mL/kg.
   4. Verzamel bloedmonsters van de staartader.
      1. Houd de rat vast om de staart bloot te leggen.
      2. Druk de staart samen en warm hem 10 seconden om de bloedstroom te bevorderen.
      3. Prik de laterale staartvader 3 cm vanaf de punt met een steriele naald van 25 gauge.
      4. Verwijder de eerste druppel bloed met schone gaas om vervuiling van weefselvloeistof te voorkomen.
      5. Verzamel de tweede druppel bloed voor het meten van de glucose.
   5. Meet de bloedsuiker elke 15 minuten gedurende 60 minuten met een glucometer.
      1. Kalibreer de glucometer volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Controleer de nauwkeurigheid van de glucometer maandelijks met behulp van controlemiddelen.
      3. Bewaar teststrips in de originele verpakking om blootstelling aan vocht te voorkomen.
      4. Gebruik meteen na het verwijderen uit de container teststrips van de verpakking.
      5. Steek een teststrip in de glucometer om de meter automatisch te activeren.
      6. Laat het bloedmonster via capillaire werking de strip binnenkomen.
      7. Noteer de weergegeven bloedsuikerwaarde.

3. Weefseloogst

1. Euthanasie en voorbereiding
   1. Dieren inslapen door een isoflurane overdosis. Plaats dieren in een inductiekamer en stel ze bloot aan 5% isoflurane die in 100% zuurstof bij 2 L/min wordt toegediend, minstens 3 minuten.
   2. Bevestig de dood door het stoppen van de ademhaling te bevestigen.
   3. Bevestig verlies van de hoornvliesreflex en de kneepreflex van de teen.
      1. Raak voorzichtig het hoornvlies aan met een steriele applicator met een katoenen tip om te bevestigen dat er geen knipperrespons is.
      2. Geef een stevige kneep op het webbing tussen de tenen van een achterpoot met een stompe pincet om te bevestigen dat er geen motorische reactie is.
   4. Leg de ventrale kant van de rat op een dissectiebak.
   5. Maak de buikhuid nat met 75% ethanol met een spuitfles.
      OPMERKING: Minimaliseer de tijd tussen euthanasie en weefselbehoud om glycogeenafbraak veroorzaakt door postmortale ischemische te verminderen.
2. Leverdissectie
   1. Maak een kleine incisie in de huid, ongeveer 1 cm caudaal van het uitsteeksel van het xiphoïed.
   2. Verleng de incisie richting het borstbeen.
   3. Scheid de huid van de onderliggende spier.
   4. Voer een bilaterale transversale laparotomie uit door een horizontale incisie van 4 cm te maken, ongeveer 1 cm caudaal van het xiphoïdale uitsteeksel en lateraal uitstrekkend naar de linker- en rechter subcostale randen om de buikholte volledig bloot te leggen.
   5. Identificeer de lever.
   6. Exciseer de rechter middenlob (Figuur 2A).
   7. Weeg het weefsel binnen 1 minuut.
   8. Plaats het weefsel in een polypropyleen plastic bakje.
   9. Vries het weefsel in droogijs.
3. Skeletspierdissectie
   1. Gebruik de gastrocnemiusspier als representatief exemplaar omdat deze een gemengde populatie van snel- en langzaam trekkende vezels bevat die de metabole en contractiele kenmerken van de achterpoot¹⁶ weerspiegelen.
   2. Leg de rat op zijn buik.
   3. Maak een longitudinale huidinsnijding langs het achterste deel van het achterste ledemaat, van de popliteale fossa tot de calcaneale tuberositeit.
   4. Haal de huid van elkaar.
   5. Identificeer en weerspiegel de biceps, femoris en semitendinosus-spieren.
      1. Identificeer de biceps femoris als de grote, zijwaarts geplaatste spier die de bovenste helft van de achterdij bedekt.
      2. Identificeer de semitendinosus als de smalle, bandachtige spier die middelmatig langs de achterdij loopt en zich nabij de knie inzet.
   6. Laat de gastrocnemiusspier zien.
   7. Snijd de achillespees door bij de distale aanhechting op de calcaneus met behulp van een fijne chirurgische schaar.
   8. Haal de soleusspier uit elkaar.
   9. Bevrijd de proximale aanhechting van de gastrocnemiusspier bij de mediale en laterale epicondylen van het dijbeen.
   10. Verwijder de hele gastrocnemiusspier (Figuur 2B).
   11. Weeg het weefsel binnen 1 minuut.
   12. Plaats het weefsel in een polypropyleen plastic bakje.
   13. Vries het weefsel in droogijs.

Figuur 2: Weefseldissectieprocedures voor lever- en skeletspieren. (A) Opeenvolgende stappen voor het blootleggen van de buikholte en het oogsten van leverweefsel, inclusief huidincisie, verlenging van de incisie, scheiding van huid van de onderliggende spier en transversale laparotomie. (B) Sequentiële stappen voor het isoleren van de gastrocnemiusspier, waaronder longitudinale incisie, reflectie van overliggende spieren, identificatie van anatomische structuren en excisie van de spier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Glycogeen Colorimetrische Assay

1. Dag 1: Alkalische vertering
   1. Voeg 0,4 g weefsel toe aan een 50 mL centrifugebuis. Een tolerantie van ± 0,1 g is toegestaan om snelle verwerking te garanderen en weefselafbraak te minimaliseren.
   2. Voeg 10 mL 1 M NaOH-oplossing toe aan de buis.
   3. Snijd het weefsel met steriele messen of schaar totdat de weefselfragmenten ongeveer 1–2 mm groot zijn.
   4. Plaats de buis in een waterbad op 95°C ± 5°C.
   5. Breng 30 minuten uit.
   6. Vortex het monster tijdens de incubatie gedurende 10 seconden gedurende 10 seconden op 2.500 rpm.
   7. Haal de slang uit het waterbad.
   8. Laat het monster afkoelen naar RT.
2. Bereiding van lysaat voor eiwittest
   1. Breng 1 ml alkalisch lysaat over op een microcentrifugebuis met behulp van een gekalibreerde P1000-pipettor.
   2. Centrifugeer op 8.000 × g gedurende 10 minuten.
   3. Verzamel het supernatant.
   4. Reserveer het supernatant voor de BCA-eiwittest.
3. TCA-gemedieerde deproteïnisatie
   1. Breng 3 ml alkalisch lysaat over naar een 15 mL centrifugebuis.
   2. Voeg 1 ml 100% (met v) TCA-oplossing toe.
   3. Voeg 6 ml gedestilleerd water toe om het totale volume op 10 ml te brengen.
   4. Vortex het mengsel op 2.500 rpm gedurende 10 seconden.
   5. Zet de buis op ijs (0°C–4°C).
   6. Incubeer 1 uur om eiwitten te laten neerslaan.
4. Verzameling van gedeïnïnïniseerde supernatant
   1. Breng 1 ml van het mengsel over in een microcentrifugebuis.
   2. Centrifugeer op 8.000 × g gedurende 10 minuten bij RT.
   3. Reserveer het supernatant.
5. Glycogeenprecipitatie
   1. Breng 0,4 mL van het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
   2. Voeg 0,8 mL 95% ethanol toe met 0,1% LiCl.
   3. Vortex het mengsel grondig.
   4. Incubeer 16 uur bij RT.
6. Dag 2: Glycogeenpelleting
   1. Centrifugeer het monster op 1.000 × g gedurende 15 minuten bij RT om een stevige, halfdoorschijnende witte glycogeenpellet te verkrijgen (Figuur 3A en Figuur 3B).
   2. Gooi het supernatant weg.
7. Eerste glycogeenwas
   1. Voeg 1,5 mL 80% methanol met 0,1% LiCl toe aan de pellet.
   2. Vortex het monster op 2.500 rpm gedurende 10 seconden.
8. Centrifugatie na het wassen
   1. Centrifugeer op 1.000 × g gedurende 5 minuten bij Rot.
   2. Gooi het supernatant weg.
9. Tweede glycogeenwas
   1. Herhaal de wasstap één keer.
   2. Verwijder eventuele resterende vloeistof door voorzichtig te aspireren met een P200-pipettor met een fijne tip om ervoor te zorgen dat de glycogeenpellet onaangetast blijft.
10. Glycogeenoplossing
    1. Voeg 0,8 ml gedestilleerd water toe aan de pellet.
    2. Vortex bij 2.500 rpm totdat een heldere, homogene oplossing zonder zichtbare deeltjes is bereikt.
11. Voorbereiding van standaarden en monsters
    1. Bereid 1,5 mL microcentrifugebuizen voor voor glucosestandaarden, blanco en onbekende monsters in drievoud voor.
       OPMERKING: Voeg reagentia toe aan elke buis volgens Tabel 1.
    2. Voeg 50 μL van elke glucosestandaard toe aan de aangewezen buizen.
    3. Voeg 50 μL gedestilleerd water toe aan de blanke buis.
    4. Voeg 50 μL glycogeenmonster toe aan elke onbekende monsterbuis.
    5. Voeg 200 μL anthrone-reactieoplossing toe aan elke buis.
12. Meting van de ontwikkeling en absorptie van de anttronkleurontwikkeling
    1. Vortex alle buizen grondig.
    2. Plaats de buizen in een waterbad bij 95°C ± 5°C.
    3. Breng 15 minuten uit.
    4. Verwijder de buizen en laat ze afkoelen tot RT.
    5. Breng 200 μL over van elke buis naar een 96-well-plaat.
    6. Meet de absorptie bij 620 nm met een microplaatlezer (eindmodus, 25°C) met geautomatiseerde padlengtecorrectie tot 1 cm.
    7. De standaardcurve moet een determinatiecoëfficiënt (R²) van ≥0,995 hebben, bepaald door lineaire regressie, om als acceptabel te worden beschouwd.
    8. Elke individuele standaard- of steekproefreplicatie met een CV% van >20% onder drievoudige metingen moet als onbetrouwbaar worden beschouwd en opnieuw worden uitgevoerd.

Figuur 3: Glycogeenisolatie en kwantificatie onder verschillende voedingstoestanden. (A) Representatieve afbeelding van neergeslagen glycogeenpellets uit levermonsters onder gevoede, nuchtere en ref-omstandigheden. (B) Representatieve afbeelding van neergeslagen glycogeenpellets uit skeletspiermonsters onder gevoede, vastende en vernieuwde omstandigheden. (C) Standaardcurve gegenereerd uit glucosestandaarden die de lineaire relatie toont tussen absorptie bij 620 nm en glucoseconcentratie. (D) Bloedsuikerwaarden onder gevoede, nuchtere en gevoede omstandigheden. (E) Leverglycogeengehalte onder gevoede, vastende en geremde omstandigheden. (F) Glycogeengehalte van skeletspieren onder gevoede, vastende en ref-omstandigheden. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 6 per groep). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een gewone eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met meervoudige vergelijkingen gecorrigeerd met de Benjamini–Hochberg-methode. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns: niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagentia	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Leeg	Onbekend voorbeeld
Glucosestandaardoplossing	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Gedestilleerd water (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Glycogeenmonster	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Anthrone-reactieoplossing	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tabel 1: Reactie-opstelling voor glycogeen-colorimetrische assay. Reactie-opstelling voor glucosestandaarden, blanco en onbekende glycogeenmonsters die worden gebruikt in de anthronecolorimetrische assay. Gedefinieerde volumes van glucosestandaarden, gedestilleerd water of glycogeenmonsters werden gecombineerd met anthronereactieoplossing voorafgaand aan de incubatie en absorptiemeting.

5. Berekening van het weefselglycogeengehalte

OPMERKING: Normaliseer gemeten glycogeen op ofwel het weefsel natgewicht of de totale eiwitmassa.

1. Standaardcurve en concentratiebepaling
   1. Gebruik absorptiemetingen van de acht standaard glucosebuizen.
   2. Trek blanco waarden af van de absorptiemetingen voordat je ze plott tegen glucoseconcentraties.
   3. Pas een lineaire regressiecurve aan met gewone kleinste-kwadratenregressie in Excel (Figuur 3C).
   4. Bereken de concentratie glucose in elk onbekend glycogeenmonster (C_onbekend) door de blank-subtractie absorptie te interpoleren op de lineaire standaardcurve met behulp van de regressievergelijking verkregen in stap 5.1.3.
2. Normalisatie naar weefsel nat gewicht
   1. Bereken het glycogeengehalte met behulp van de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer C_onbekend als de concentratie glucose (mg/mL) in het onbekende glycogeenmonster bepaald in stap 5.1.4.
   3. Definieer 0,8 als het volume van het opgeloste glycogeenmonster (mL) in stap 4.10.1.
   4. Definieer 0,9 als de factor die wordt gebruikt om de glucosewaarde om te zetten naar de glycogeenwaarde.
   5. Definieer 2,5 als de verdunningsfactor die tijdens glycogeenprecipitatie wordt geïntroduceerd in stap 4,5.
   6. Definieer 10 als de verdunningsfactor die rekening houdt met de 1 mL aliquot die is geanalyseerd uit het totale mengsel van 10 mL dat in stap 4.3.3 is bereid.
   7. Definieer 10/3 als de verdunningsfactor die rekening houdt met de 3 mL aliquot die wordt gebruikt uit de totale 10 mL alkalische digest die in stap 4.1.2 is bereid.
3. Normalisatie naar totale eiwitmassa
   1. Bereken het glycogeengehalte met behulp van de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer C_onbekend als de concentratie glucose (mg/mL) in het onbekende glycogeenmonster bepaald in stap 5.1.4.
   3. Definieer 0,8 als het volume van het opgeloste glycogeenmonster (mL) in stap 4.10.1.
   4. Definieer 0,9 als de factor die wordt gebruikt om de glucosewaarde om te zetten naar de glycogeenwaarde.
   5. Definieer 2,5 als de verdunningsfactor die tijdens glycogeenprecipitatie wordt geïntroduceerd in stap 4,5.
   6. Definieer 10 als de verdunningsfactor die rekening houdt met de 1 mL aliquot die is geanalyseerd uit het totale mengsel van 10 mL dat in stap 4.3.3 is bereid.
   7. Definieer 1/3 als de correctiefactor die rekening houdt met de 3 mL aliquot die wordt gebruikt uit de alkalische digest in Stap 4.3.1.
   8. Definieer de eiwitconcentratie als de concentratie van het totale eiwit (mg/mL) in de alkalische digestie bepaald door de BCA-assay in Stap 4.2.4.

6. Western Blot van Belangrijke Enzymen Die Glycogeenmetabolisme Katalyseren

1. Algemene overwegingen
   1. Zie eerder beschreven protocollen voor standaard western blot-procedures^17,18.
2. Eiwitextractie
   1. Weeg 75 mg snap-frozen weefsel. Een tolerantie van ± 25 mg is toegestaan om een snelle verwerking te garanderen en weefselontdooiing te minimaliseren.
   2. Voeg 1 mL ijskoude RIPA-lysisbuffer toe (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% natriumdeoxycholaat; 0,1% SDS; en 1 mM EDTA) aangevuld met protease- en fosfataseremmers.
   3. Homogeniseer het weefsel met een handheld rotor-stator homogenisator.
3. Lysaatbereiding
   1. Broed homogenaten 30 minuten op ijs.
   2. Vortex de monsters tijdens de incubatie gedurende 10 seconden op 2.500 rpm.
   3. Centrifugeer op 10.000 × g met een vaste hoek rotor gedurende 5 minuten bij 4°C.
4. Eiwitkwantificatie
   1. Verzamel het supernatant als volledig eiwitlysaat.
   2. Voer een BCA-assay uit om de eiwitconcentratie te bepalen.
   3. Bereid BSA-standaarden voor van 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 en 1 mg/mL verdund in de RIPA-lysisbuffer.
   4. In een microplaat met 96 putten wordt 20 μL van elk standaard- of onbekend monster in individuele putten geladen.
   5. Voeg 200 μL BCA-werkreagens toe (bereid door 50 delen Reagens A te mengen met 1 deel Reagens B) aan elke put.
   6. Incubeer de reactieplaat bij 37°C gedurende 30 minuten.
   7. Na afkoeling tot RT (18°C–23°C) meet u de absorptie bij 562 nm met een microplaatlezer (eindmodus, 25°C) met geautomatiseerde padlengtecorrectie tot 1 cm.
5. SDS-PAGE
   1. Meng 15 μg eiwit met SDS-PAGE laadbuffer.
   2. Verwarm de monsters 5 minuten op 95°C.
   3. Laat de monsters op ijs afkoelen.
   4. Laad de monsters op een 10% SDS-PAGE gel.
   5. Eiwitten worden opgelost door elektroforese in een loopbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% SDS).
   6. Laat de gel constant op 100 V draaien totdat de voorkant van de bromofenolblauwe kleurstof de onderkant van de gel bereikt.
6. Eiwitoverdracht en blokkering
   1. Eiwitten worden overgebracht naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan.
   2. Voor nitrocellulosemembranen moet het membraan in evenwicht worden gebracht in de transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8,3) gedurende 10 minuten.
   3. Voor PVDF-membranen activeer je het membraan door 30 seconden in 100% methanol te onderdompelen, en vervolgens 10 minuten in balans te brengen in de transferbuffer.
   4. Stel de overdrachtsandwich in de volgende volgorde samen: spons, filterpapier, gel, membraan, filterpapier, spons.
   5. Voer eiwitoverdracht uit bij een constante stroom van 200 mA gedurende 90 minuten bij 4°C.
   6. Bereid 3% (met alcohol) BSA voor in TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; en 0,1% Tween-20).
   7. Blokkeer het membraan op RT gedurende 1 uur met constant wiegen.
      OPMERKING: Gebruik BSA in plaats van magere melk bij het detecteren van gefosforyleerde eiwitten.
7. Primaire antistofincubatie
   1. Bereid de primaire antistofoplossing voor in de blokkerende buffer bij een verdunning van 1:1.000.
   2. Incubeer het membraan met een primair antilichaam bij 4°C 's nachts met constant wiegen.
8. Wassen
   1. Was het membraan met TBST.
   2. Herhaal het wassen drie keer gedurende 10 minuten per stuk.
9. Secundaire antilichaamincubatie
   1. Bereid HRP-geconjugeerde secundaire antistoffen voor in een blokkeringsbuffer bij een verdunning van 1:10.000.
   2. Incubeer het membraan op RT gedurende 1 uur met constant wiegen.
10. Wassen
    1. Was het membraan met TBST.
    2. Herhaal het wassen drie keer gedurende 10 minuten per stuk.
11. Chemiluminescentiedetectie
    1. Bereid chemiluminescente substraat voor door gelijke hoeveelheden luminol/enhancer en stabiele peroxideoplossingen te mengen.
    2. Breng het substraat aan met een volume van 0,1 mL/cm² membraanoppervlak en incubeer 2 minuten bij RT op een orbitale shaker (100 rpm).
    3. Vang signalen op met een chemiluminescente beeldvormer.
    4. Test belichtingstijden variërend van 10 tot 300 seconden en selecteer een belichting binnen het lineaire detectiebereik voor elke blek.
    5. Controleer de signaallineariteit door de afwezigheid van pixelsaturatie te bevestigen met behulp van de ingebouwde software van het instrument.
12. Beeldanalyse
    1. Analyseer bandintensiteit met ImageJ-software (versie 1.51, NIH).
    2. Converteer afbeeldingen naar 8-bit grijstinten en pas rolling-ball achtergrondaftrekking toe met een straal van 50 pixels.
    3. Definieer elke band met behulp van een rechthoekig interessegebied van identieke afmetingen en trek lokale achtergrond af van een aangrenzend leeg gebied om ruwe geïntegreerde dichtheidswaarden te verkrijgen.
13. Totale eiwitkleuring
    1. Incubeer het membraan in 0,1% Indiase inktoplossing in TBST bij RT gedurende 1 uur met constant wiegen.
    2. Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met TBST.
    3. Kwantificeer meerdere gekleurde banden als belastingscontroles om immunoblottingsignalen te normaliseren.
       OPMERKING: Gebruik totale eiwitkleuring in plaats van huishoudelijke genen (HKG's), aangezien HKG-expressie kan variëren onder verschillende experimentele omstandigheden¹⁹.

7. Gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de methode

1. Voorbereiding van glycogeenstandaarden
   1. Maak een glycogeenbouillon van 20 mg/mL in 1 M NaOH.
   2. Bereid een reeks glycogeenstandaarden voor (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 en 1 mg/mL) in 15 mL centrifugebuizen door stapsgewijze verdunning met 1 M NaOH zoals hieronder beschreven.
      1. Bereid buis 1 (1 mg/mL) voor door 500 μL glycogeenbouillonoplossing te mengen met 9,5 mL van 1 M NaOH.
      2. Bereid buis 2 (0,5 mg/mL) voor door 250 μL glycogeenbouillon te mengen met 9,75 mL van 1 M NaOH.
      3. Bereid buis 3 (0,2 mg/mL) voor door 100 μL glycogeenvoorraadoplossing te mengen met 9,9 mL 1 M NaOH.
      4. Bereid buis 4 (0,1 mg/mL) voor door 50 μL glycogeenvoorraadoplossing te mengen met 9,95 mL van 1 M NaOH.
      5. Bereid buis 5 (0,05 mg/mL) voor door 25 μL glycogeenvoorraadoplossing te mengen met 9,975 mL van 1 M NaOH.
      6. Bereid buis 6 (0,02 mg/mL) voor door 10 μL glycogeenvoorraadoplossing te mengen met 9,99 mL van 1 M NaOH.
      7. Bereid buis 7 (0,01 mg/mL) voor door 100 μL buis 1-oplossing te mengen met 9,9 mL 1 M NaOH.
      8. Bereid buis 8 (0,005 mg/mL) voor door 50 μL buis 1-oplossing te mengen met 9,95 mL 1 M NaOH.
      9. Bereid de blank voor (0 mg/mL) door 10 mL 1 M NaOH toe te voegen aan een 15 mL centrifugebuis.
   3. Stop elke buis en vortex op 2.500 rpm gedurende 10 seconden om te mengen.
2. Anthrone colorimetrische assay
   1. Haal glycogeen uit en voer de anthrone-colorimetrische test uit volgens stappen 4.1.4–4.12.6.
   2. Recordopnamewaarden bij 620 nm (A₆₂₀).
3. Berekening van de glycogeenconcentratie
   1. Genereer de glucosestandaardcurve en bereken de concentratie glucose in elk standaardmonster (_C-standaard) zoals gespecificeerd in stap 5.1.
   2. Bereken de glycogeenconcentratie in elke standaardbuis met de volgende vergelijking:
      
   3. Definieer_{de C-standaard} als de concentratie glucose (mg/mL) die in elk standaardmonster wordt bepaald.
   4. Definieer 0,8 als het volume van het glycogeenmonster (mL).
   5. Definieer 0,9 als de factor voor het omzetten van de glucosewaarde naar de glycogeenwaarde.
   6. Definieer 2,5 als een verdunningsfactor.
   7. Definieer 10 als de verdunningsfactor die rekening houdt met de 1 mL aliquot die is geanalyseerd uit het totale mengsel van 10 mL dat in stap 4.3.3 is bereid.
   8. Definieer 1/3 als de correctiefactor die rekening houdt met de 3 mL aliquot die wordt gebruikt uit de alkalische digest in Stap 4.3.1.
   9. Herhaal de volledige procedure nog drie keer binnen één dag, voor in totaal vier runs.
   10. Herhaal de vier runs over vier dagen, in totaal 16 runs.
4. Berekening van LOD en LOQ
   1. Plot alle 16 absorptiemetingen op de y-as tegen elke glycogeenstandaardconcentratie op de x-as.
   2. Bereken de lineaire regressiecurve en R². Een lineaire regressie met R² van ≥0,995 wordt als acceptabel beschouwd.
   3. Bereken de LOD en LOQ met behulp van de volgende vergelijkingen:
      
      
   4. Definieer σ als de standaardfout van de respons (y-interceptie).
   5. Definieer S als de helling van de lineaire regressiecurve.
5. Berekening van intra-assay en inter-assay CV%
   1. Voor elke glycogeenstandaard bereken je het intra-assay CV% van de berekende waarden van de vier runs op dag 1 met behulp van de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer s₁ als de standaardafwijking van waarden ten opzichte van de vier runs op dag 1.
   3. Definieer als de gemiddelde waarde van de vier runs op dag 1.
   4. Herhaal deze berekening voor dag 2, dag 3 en dag 4 om CV₂, CV₃ en CV₄ te verkrijgen.
   5. Bereken het uiteindelijke intra-assay CV% met behulp van de volgende vergelijking:
      
   6. Bereken de inter-assay CV% met behulp van de volgende vergelijking:
      
   7. Definieert s_inter als de standaarddeviatie van CV₁, CV₂, CV₃ en CV₄.
   8. Definieer als de gemiddelde waarde van CV₁, CV₂, CV₃ en CV₄.

Resultaten

Lever- en skeletspierglycogeenniveaus onder verschillende voedingstoestanden

Nuchtere nacht verlaagde de bloedsuikerspiegel significant (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde [SEM]) van 7,9 ± 0,4 mM bij ratten die ad libitum gevoed waren tot 5,4 ± 0,3 mM. De bloedglucosespiegels werden na 2 uur hervoeding hersteld tot 8,3 ± 0,1 mM (Figuur 3D). In overeenstemming met deze veranderingen waren leverglycogeenwaarden (gemiddelde ± SEM)...

Discussie

In dit artikel beschrijven we een aangepaste anthrone-colorimetrische methode om glycogeen in dierlijke weefsels te kwantificeren. Naast de conventionele sequentiële stappen van weefseloogst, alkalische vertering, glycogeenprecipitatie, alcoholwasbeurt en anthrone-gebaseerde kleurontwikkeling, hebben we een deproteïnisatiestap toegevoegd om achtergrondinterferentie te verminderen (Figuur 1). Vervolgens pasten we deze methode toe om veranderingen in het glyco...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Gebruikt voor monsterverwerking en reactie-opstelling
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Gebruikt voor lysate-handeling en precipitatie-stappen
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Buffer voor membraanwassing in western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	BCA-testplaat incubatie
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Gebruikt voor weefseldigestie en extractie
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Plate-based absorptiemeting
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Chemische poeders wegen
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagens voor glycogeen kleurendetectie
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Detectie van glycogeensynthase 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Detectie van glycogeensynthase 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Detectie van gefosforyleerd GYS
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Detectie van gefosforyleerd glycogeenfosforylase
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Detectie van leverglycogeenfosforylase
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Detectie van spierglycogeenfosforylase
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Eiwit kwantificering
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Bereiding van verzadigde oplossing voor standaarden
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Vinger knijpen; weefseldissectie
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Blocking agent in western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Detectie van western blot-signalen
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Signaalontwikkeling in western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Oplosmiddel voor reagensbereiding
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Inductie van glycogeenafbraak in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Glycogeenprecipitatie en wassing
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Weefseldissectie
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Monstercentrifugering
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Meting van bloedglucose
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Meet de bloedglucosespiegel van de staartvene
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Meet de bloedglucosespiegel van de staartvene
Glucose	Macklin	G6172	Bereiding van standaardcurve
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Bereiding van een reeks glycogeenstandaarden
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Detectie van primaire antilichamen
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Weefselhomogenisatie
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Totale eiwitvlek voor normalisatie
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Dierlijke euthanasie
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Monsterverwarming tijdens tests
Lithium chloride	Macklin	767397	Verbetert glycogeenprecipitatie
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Glycogeenwasstap
Microplate reader	BioTek	ELx800	Absorptiemeting bij 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Eiwitoverdrachtmembraan
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubatie van chemiluminescent substraat
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Oplossing overbrengen
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Verwijdering van restvloeistof
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Behoud van eiwitfosforylering
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Opslag van geoogst weefsels
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Voorkomen van eiwitdegradatie
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Eiwitextractie
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Eiwitscheiding
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Mengen met protien-voorbeelden voor het laden in SDS-PAGE gelcellen
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	SDS-PAGE elektroforese
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Dierlijke euthanasie
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Weefseldigestie en glycogeenextractie
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Experimenteel diermodel
Spray bottle	Beyotime	TB6310	75% ethanol aanbrengen op dierdieren voor bevochtiging en desinfectie
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Rodentenonderhoudsdieet
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Weefseldissectie
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	Intraperitoneale injectie en staartveneprikken
Thiourea	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	T112512	Stabilise