Klinisch relevante transplanteerbare tumormodellen voor het bestuderen van uitgezaaide eierstokkanker en therapeutische respons bij muizen

Samenvatting

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het vaststellen van de intraperitoneale en intrabursale tumormodellen om de progressie, metasatis en therapeutische respons van eierstokkanker te bestuderen. Verder beschrijven we hoe luciferase-gebaseerde niet-invasieve in vivo beeldvorming in deze modellen gebruikt kan worden om tumorprogressie bij muis te monitoren.

Samenvatting

Metastaserende eierstokkanker is een uiterst dodelijke gynaecologische maligniteit die geen effectieve behandelingsmogelijkheden heeft. De ontwikkeling van klinisch vertaalbare therapeutische benaderingen voor eierstokkankerpatiënten is afhankelijk van het begrijpen van factoren die de metastase van eierstokkanker aansturen. Hoewel de meeste solide tumoren hematogene metastasen vertonen, verspreiden eierstokkankercellen zich voornamelijk via de intraperitoneale route. Dit proces omvat het loslaten en afstoten van kankercellen van de primaire tumor naar de peritoneale holte, die vervolgens eigenschappen verkrijgen waarmee ze anoikis kunnen weerstaan en meercellige aggregaten kunnen vormen. Deze celaggregaten hechten zich vervolgens aan en dringen het mesotheliale bekledingsscherm van het peritoneum binnen, waarbij metastatische laesies ontstaan. Klinisch relevante in vivo modellen zijn essentieel om te begrijpen hoe cellulaire factoren en de tumormicro-omgeving de verschillende stappen in het metastatische proces beïnvloeden en voor het testen van nieuwe therapeutische strategieën. Twee transplanteerbare muistumormodellen die veel worden gebruikt om de metastase en therapeutische respons van eierstokkanker te bestuderen, zijn de intraperitoneale en intrabursale modellen. In dit rapport beschrijven we de stapsgewijze methodologie voor het opstellen van deze modellen en benadrukken we hun voordelen en beperkingen. Daarnaast beschrijven we hoe bioluminescente beeldvorming kan worden gebruikt om de tumorprogressie niet-invasief te monitoren met behulp van deze modellen.

Inleiding

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van factoren die de progressie van eierstokkanker aanjagen, blijft eierstokkanker de op één na dodelijkste gynaecologische maligniteit in de Verenigde Staten¹. Door het ontbreken van duidelijke symptomen en het ontbreken van betrouwbare vroege diagnostische markers heeft meer dan 70 procent van de eierstokkankerpatiënten bij diagnose ^2,3 een gevorderde metastaserende ziekte. Huidige therapieën zijn niet effectief bij de behandeling van uitgezaaide eierstokkanker en daardoor blijven de 5-jaars overlevingspercentages voor patiënten met een vergevorderde ziekte minder dan 30 procent⁴. Een belangrijke oorzaak van het gebrek aan therapeutisch succes is het ontstaan van chemoresistentie⁵. Daarom is er een dringende behoefte om factoren te identificeren die eierstokkankermetastase en chemoresistentie aanjagen. Het aanpakken van deze kenniskloof zal cruciaal zijn voor het ontwikkelen van effectievere therapeutische strategieën om deze ziekte aan te pakken. Om deze doelen te bereiken, hebben we in vivo modellen nodig die de belangrijkste stappen van de progressie van eierstokkanker nauwkeurig nabootsen.

Hoewel eierstokkankercellijnen en driedimensionale in vitro-modellen enorm hebben bijgedragen aan ons begrip van factoren die metastase en therapeutische respons beïnvloeden, hebben deze modellen verschillende beperkingen ^6,7,8. Deze modellen houden bijvoorbeeld geen rekening met de verschillende niet-kankercellen die deel uitmaken van de tumormicro-omgeving, noch vangen ze de complexe interacties die binnen de tumor-micro-omgeving plaatsvinden ^6,7,8. Bovendien is het uiterst uitdagend om systemische factoren en hun invloed op tumorprogressie en medicijnrespons te bestuderen met in vitro modellen ^6,7,8. Deze beperkingen van in vitro-modellen benadrukken de noodzaak van in vivo modellen die de verschillende stappen in eierstokkankermetastase nauwkeurig nabootsen, inclusief complexe interacties met andere celtypen en factoren binnen de microomgeving.

Genetisch gemodificeerde muismodellen (GEMM's) bieden een in vivo platform waarbij tumoren spontaan ontstaan in een natuurlijke micro-omgeving met een intact immuunsysteem⁹. Ze zijn echter tijdrovend, uitdagend en kostbaar om¹⁰ te genereren en te onderhouden. De meeste GEMM's van eierstokkanker hebben ook een lange latentieperiode voor tumorontwikkeling, wat het werken ermee tijdrovend en kostbaar maakt, zelfs nadat ze^zijn gegenereerd. Transplanteerbare modellen, zoals xenograft- en allograftmodellen, bieden een goede balans tussen biologische relevantie en experimentele gemak, en zijn vaak veel goedkoper te genereren dan GEMM's¹¹. Naast het lagere latentie dan GEMM's, maakt de eenvoudige manier waarop tumorcellen genetisch in vitro kunnen worden genetisch gemodificeerd deze modellen deze modellen handig en geschikt om te bestuderen hoe verschillende genetische factoren de tumorprogressie^beïnvloeden. Vanwege deze voordelen zijn transplanteerbare tumormodellen uitgegroeid tot waardevolle hulpmiddelen voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek naar eierstokkanker.

In dit rapport beschrijven we het protocol voor het opzetten van twee verschillende transplanteerbare muistumormodellen die veel worden gebruikt om metastatische eierstokkanker te bestuderen: (1) het intraperitoneale model en (2) het orthotope of intrabursale model. Beide modellen kunnen worden vastgesteld als xenograft- of allograftmodellen. In het intraperitoneale model worden kankercellen geïnjecteerd in de peritoneale holte van de muizen. Het inbrengen van eierstokkankercellen in de intraperitoneale ruimte weerspiegelt het stadium van eierstokkankermetastase waarbij uitgezaaide eierstokkankercellen van de primaire tumor in de peritoneale holte worden afgestoten. Net als bij het metastatische proces bij mensen, moeten deze getransplanteerde eierstokkankercellen zich aanpassen aan de vijandige peritoneale micro-omgeving, zich hechten aan en binnendringen in de mesotheellaag die de peritoneale holte bekleedt, en metastatische laesies vormen op intraperitoneale organen en weefsels zoals het omentum, mesenterium, lever en middenrif. Afhankelijk van de kankercellijn die is gebruikt om het intraperitoneale model te maken, kunnen metastatische tumoren gepaard gaan met ascites, zoals waargenomen bij een late stadium van ziekten bij mensen. Daarom is het intraperitoneale model veelvuldig gebruikt om factoren te begrijpen die de metastase van eierstokkanker aansturen en hun progressie naar een late fase van ziekte¹². Deze modellen zijn ook nuttig om de effectiviteit van nieuwe therapeutische strategieën voor metastatische eierstokkanker^te bepalen. In het intrabursale of orthotope model worden kankercellen geïmplanteerd in de bursa, een membraanstructuur die de eierstok van de muis omringt. Dit model bootst de vroege stadia van ovariumtumorvorming en metastase na. In dit stadium zijn kankercellen nog steeds beperkt tot de eileider en de eierstok. Vanaf deze locaties worden kankercellen afgestoten in de peritoneale holte, waar ze uiteindelijk uitzaaien naar andere organen. Daarom is het intrabursale model nuttig voor het bestuderen van zowel vroege stadia van eierstoktumorigenese als gebeurtenissen die leiden tot hun daaropvolgende transcoelomische metastase door de peritoneale holte¹².

Dus hoewel zowel de intraperitoneale als intrabursale modellen uitstekende instrumenten zijn om de metastase en therapeutische respons van eierstokkanker te bestuderen, verschillen ze in het specifieke stadium van het metastatische proces dat ze nabootsen. Hoewel de intrabursale modellen de progressie van eierstokkanker van vroege tot latere stadia van het metastasische proces kunnen nabootsen, worden ze vanwege de latentie die met dit proces gepaard gaat, meestal gebruikt om vroege gebeurtenissen van eierstokkankermetastasen te bestuderen. Voor studies die zich richten op latere stadia van eierstokkankermetastase is het intraperitoneale model geschikter. Bovendien is het intrabursale model technisch ook moeilijker vast te stellen dan het intraperitoneale model¹². Het opzetten van het intrabursale model vereist toegang tot een operatiekamer uitgerust met microchirurgische apparatuur die precieze injectie van kankercellen in de ovariumbursa mogelijk maakt. Het vermogen van kankercellen om tumoren te ontwikkelen ("take rate" of "engraftment rate") is meestal ook lager in intrabursale modellen dan in intraperitoneale modellen. Bovendien wordt tumoren, omdat tumoren na orthotopische of intraperitoneale injecties niet gemakkelijk kunnen worden waargenomen, doorgaans een niet-invasieve bioluminescente beeldvormingstechniek gebruikt om de tumorprogressie te monitoren. Daarom vereisen zowel intraperitoneale als intrabursale modellen extra apparatuur die niet-invasieve beeldvorming van tumoren^mogelijk maakt. Uiteindelijk zullen de experimentele doelen, beschikbaarheid van middelen en technische vaardigheden bepalen welke model voor elke studie wordt gekozen.

Dit rapport beschrijft het stapsgewijze protocol voor het opzetten van intraperitoneale en intrabursale muis xenograftmodellen met behulp van humane eierstokkankercellijnen. Deze modellen kunnen worden opgebouwd door de cellen te transplanteren in immuungecompromitteerde muisstammen zoals NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) of de Foxn1 naakt (B6. Cg-Foxn1 nu/J). Dezelfde methode kan worden aangepast om allograft (syngene) modellen te genereren. Bij het opzetten van allograftmodellen worden muis-eierstokkankercellen geïmplanteerd in immunocompetente muizen met dezelfde genetische achtergrond. Omdat allograftmodellen worden ontwikkeld met behulp van immunocompetente muizen, zijn ze nuttig om te bestuderen hoe verschillende factoren de microomgeving van eierstoktumoren reguleren, de rol van het immuunsysteem bij de progressie van eierstokkanker en de effectiviteit van immunotherapie. Naast het vaststellen van de intraperitoneale en intrabursale xenograft-muismodellen, beschrijft dit rapport ook hoe bioluminescente beeldvorming kan worden gebruikt om de tumorprogressie in deze modellen niet-invasief te monitoren.

Protocol

Alle dierprocedures die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de University of Maryland, Baltimore County (Hoofdonderzoeker - Achuth Padmanabhan; Protocolnummer - 1947).  De volledige lijst van materialen en apparatuur die in dit protocol zijn gebruikt en hun catalogusnummers zijn te vinden in de Materiaaloverzicht.

1. Bereiding van eierstokkankercellijnen voor transplantatie bij muizen

Opmerking: Voor alle in vivo modellen die in dit protocol worden beschreven, moeten eierstokkankercellen worden voorbereid op transplantatie in de muis. Eierstokkankercellen moeten worden voorbereid in een laminaire weefselkweekkap zoals hieronder beschreven bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld:

1. Kweek eierstokkankercellen bij 37 ^°C in een met water bedekte CO2-incubator die op 5% _CO2 wordt gehouden met standaardmedium zoals aanbevolen in de literatuur. Als niet-invasieve in vivo beeldvorming van de tumor gewenst is, moeten de eierstokkankercellen zo worden gemanipuleerd dat ze luciferase stabiel tot expressie brengen vóór de transplantatie.
2. Wanneer cellen ongeveer 80%–85% confluentie bereiken, oogst je ze onder steriele omstandigheden, zoals hieronder beschreven:
   1. Aspiraat het medium van de weefselkweekplaat.
   2. Was hechtende cellen twee keer met steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium. De aanwezigheid van calcium en magnesium in PBS kan de trypsineactiviteit verstoren en de celadhesie bevorderen. Aspiraat de PBS van de weefselkweekplaat.
   3. Voeg 0,05% trypsine-EDTA toe aan de weefselkweekplaat. De hoeveelheid trypsine die gebruikt moet worden hangt af van de grootte van de weefselkweekplaat en de cellijn die wordt onderzocht. Voor de meeste cellijnen die op een 100 mm plaat groeien, gebruik 1 mL 0,05% trypsine-EDTA. Voor sterk hechtende eierstokkankercellijnen zoals OVCA420 wordt 1 ml van 0,25% Trypsine-EDTA aanbevolen.
   4. Breng de plaat met cellen terug naar de 37 ^°C watermantel_CO 2-incubator die wordt gebruikt voor weefselkweek en incubeer 1–5 minuten. De exacte benodigde incubatietijd hangt af van de cellijn. Sommige cellijnen, zoals TYK-Nu en HEYA8, laten zich zeer snel los (1–2 min), terwijl andere, zoals OVCA420, er langer over doen (4–5 min).
   5. Zodra de cellen zijn losgekoppeld, voeg je FBS-bevattend medium toe om de werking van trypsine te stoppen. Voeg 6 ml FBS-bevattend medium toe per 1 ml trypsine. Pipetteer voorzichtig op en neer om cellen van de weefselkweekplaat los te maken en ze te dissocieren tot een enkele cel suspensie.
      Opmerking: Wanneer ze onder een bright-field omgekeerde microscoop worden bekeken, zullen losstaande cellen afgerond lijken (in plaats van vlak/langwerpig) en vrij zweven in plaats van aan de onderkant van de plaat vast te zitten.
   6. Verzamel de cellen in een conische buis en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Verwijder het trypsine-houdende supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in verse FBS-bevattende celkweekmedia.
3. Tel cellen met een levensvatbaarheidskleurstof zoals trypan blue en een hemocytometer. Als alternatief kan een automatische celteller worden gebruikt om cellen te tellen.
4. Reconstrueren de cellen in een gedefinieerd volume van steriel 1X PBS (pH 7,4) zodat de gewenste concentratie cellen per volume-eenheid wordt bereikt. Het aanbevolen aantal cellen om te injecteren voor veelgebruikte menselijke eierstokkankercellijnen wordt weergegeven in Tabel 1¹³.
   Opmerking: Het maximale volume dat veilig in muizen kan worden geïnjecteerd hangt af van het model. Voor het intraperitoneale model is het maximaal aanbevolen volume 500 μL (zie sectie 2.1). Voor het intrabursale model is het maximaal aanbevolen volume 5 μL (zie sectie 2.2).
5. Houd de celsuspensie op ijs tot het tijd is om het in muizen te injecteren. Injecteer zo snel mogelijk cellen in muizen, bij voorkeur binnen 30–45 minuten na het bereiden van de cellen.

2. Het opzetten van transplantatiemodellen voor eierstokkanker bij muizen

1. Het vaststellen van het intraperitoneale model van eierstokkanker
   Opmerking: In dit proces worden eierstokkankercellen die luciferase stabiel uitdrukken geïnjecteerd in de peritoneale holte van een volwassen vrouwelijke muis. Het gebruik van cellen die luciferase stabiel tot expressie brengen, maakt longitudinale, niet-invasieve monitoring van tumorprogressie mogelijk met het In Vivo Imaging System (IVIS).
   1. Bereid de cellen voor zoals beschreven in sectie 1. Suspenseer de cellen voorzichtig met een micropipet van 1000 μL en zorg ervoor dat de cellen gedissocieerd blijven.
      Opmerking: Als je de klonten niet losmaakt, raken de naalden verstopt.
   2. Trek 500 μL celsuspensie in een 1 mL spuit en bevestig een naald van 21G x 1 inch. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten.
      Opmerking: Het maximale volume dat intraperitoneaal in een volwassen vrouwtje muis kan worden geïnjecteerd (25–30 g) is 500 μL. Suspendeer daarom cellen opnieuw in een volume zodat het vereiste aantal cellen wordt opgenomen in een maximaal volume van 500 μL. Het aanbevolen aantal cellen om te injecteren voor veelgebruikte menselijke eierstokkankercellijnen wordt weergegeven in Tabel 1¹³.
      Opmerking: Als de muis tussen de 20 en 25 g weegt, wordt aanbevolen een kleiner volume (minder dan 400 μL) te injecteren.
   3. Haal het dier uit de kooi en zet het op een ruw of bedraad oppervlak om het vast te houden.
   4. Houd de muis vast door voorzichtig de losse huid aan de basis van de nek te schurken met de niet-dominante hand, zoals getoond in Figuur 1A.
   5. Pak de muis voorzichtig op en draai hem zodat de buikzijde naar boven wijst. Zet de staart van het dier vast met vingers zoals weergegeven in Figuur 1B.
   6. Trek een denkbeeldige lijn over het midden van de buik. Om de injectieplaats te lokaliseren, stel je een driehoek voor tussen de middenlijn en de twee tepels in het rechterbenedenkwadrant. Zorg ervoor dat de injectieplaats in het midden van deze denkbeeldige driehoek ligt. Zie Figuur 1B.
   7. Kantel het hoofd van de muis iets naar de grond, zodat het lager is dan de achterkant. Het vasthouden van de muis in deze positie helpt de buikinhoud craniaal te verschuiven. Dit vermindert het risico op het doorprikken van inwendige organen tijdens de injectie.
   8. Gebruik een steriel alcoholwattenstaafje om het injectiegebied schoon te maken.
   9. Met de dominante hand steek je de naald in de injectieplaats onder een hoek van 45° of lager. Zet slechts 0,5 inch vooruit en niet meer dan de helft van de lengte van de naald. Zorg ervoor dat de naald stabiel blijft, want beweging in de buikholte kan schade aan de inwendige organen veroorzaken.
   10. Geef de cellen langzaam en gestaag in de buikholte van de muis.
   11. Trek de naald uit de muis onder dezelfde inbrengingshoek. Plaats onmiddellijk een gesteriliseerde meter boven de injectieplaats om lekkage te voorkomen.
   12. Gooi de naald en de spuit weg in de juiste container voor scherpe voorwerpen.
   13. Voordat je de muis in de kooi zet, gebruik je een oortag met een voorkeursmethode. Oortagging maakt het later mogelijk om de geïnjecteerde muis te identificeren.
2. Het vaststellen van het intrabursale model van eierstokkanker
   Opmerking: In het intrabursale model worden eierstokkankercellen die luciferase stabiel tot expressie brengen, direct in de eierstokbursa van een volwassen vrouwelijke muis geïnjecteerd. Bursa is een membraneuze zak die de muiseierstokken omringt. Stabiele luciferase-expressie in eierstokkankercellen maakt niet-invasieve longitudinale monitoring van tumorprogressie mogelijk met behulp van IVIS.
   1. Dag 1 – Apparatuur en muis voorbereiden voor de intrabursale transplantatieoperatie
      1. Autoclaaf de instrumenten die nodig zijn voor de operatie. De lijst van instrumenten is (Figuur 2A):
         Fijnpuntschaar, 5-inch gebogen fijnpunttang, Mayo-Heger naaldhouder, Dissectie-juweliersmicropincet, fijnpunt, Instrumenten Dissectietang met fijne punten
      2. Geef elke 24 uur een preoperatieve pijn van carprofen (15 mg/kg) via subcutane injectie in de muis.
         Opmerking: Dien het pijnstillende carprofen elke 24 uur subcutaan toe, beginnend 1 dag voor de operatie en 3 dagen na de operatie.
   2. Dag 2 – Intrabursale transplantatie van eierstokkankercellen bij een muis
      1. Bereid eierstokkankercellen voor op injectie zoals beschreven in sectie I. Het maximale volume dat veilig intrabursaal in een muis kan worden geïnjecteerd is 5 μL. Daarom is het de voorkeur om cellen te hebben met een concentratie van 10⁴ cellen/μL. Dit maakt transplantatie van 5 x 10 van⁴ cellen mogelijk.
         Opmerking: Het aanbevolen aantal cellen om te injecteren voor veelgebruikte menselijke eierstokkankercellijnen is weergegeven in Tabel 113.
      2. Houd de cellen ijskoud tot gebruik. Na het oogsten wordt aanbevolen om de cellen zo snel mogelijk te injecteren, bij voorkeur binnen 30–45 minuten.
      3. Induceer anesthesie door de muis in een isofluranenkamer te plaatsen met een isofluranestroom van 4 procent en een zuurstofstroom van 3,5 L/min. Controleer of de muis verdoofd is door te controleren op immobilisatie en het ontbreken van de teenkrijpreflex.
      4. Breng de verdoofde muis over op een steriele chirurgische doek die bovenop een knaagdierverwarmingskussen wordt gelegd op 37 °C. Plaats snel een neuskegel en houd de narcose vast met 1,5% isofluraan en 98,5% zuurstof. Zorg ervoor dat de muis verdoofd is door te controleren of de teenknijpreflex niet aanwezig is.
      5. Zorg ervoor dat de muis gedurende de hele procedure onder narcose blijft door elke 15 minuten te controleren of de teenknijpreflex aanwezig is. Houd de ademhalingsfrequentie van de muis tijdens de narcose in de gaten om te zorgen dat deze langzaam en soepel verloopt. Als de ademhalingsfrequentie verandert, pas dan de isofluranedosering aan. Als de muis zwaar ademhaalt of hijgt, verlaag dan de dosis. Omgekeerd, als de muis een verhoogde ademhalingsfrequentie vertoont, verhoog dan de isofluranedosis iets.
         Opmerking: Vermijd het langer dan 40 minuten onder narcose te houden. Om dit te bereiken is het belangrijk efficiënt en snel te zijn tijdens de operatie.
      6. Plaats de muis aan de zijde waar de eierstokkankercellen intrabursaal getransplanteerd moeten worden, met het gezicht naar boven zoals weergegeven in Figuur 2B.
      7. Breng oogzalf aan op beide ogen van de muis om ze te beschermen tegen uitdroging (hoornvliesdroog).
      8. Als de muis vacht heeft, scheer dan het haar aan de onderkant van de muis aan de kant die naar boven wijst. Maak het geschoren gebied goed schoon en leg de muis op een nieuw steriel matje. Als je werkt met de Foxn1 naakt (B6. Cg-Foxn1 nu/J) muisstam, sla deze stap over.
      9. Gebruik een steriele chirurgische doek om de muis zo te bedekken dat alleen de onderste helft van het lichaam zichtbaar is.
      10. Was je handen goed met zeep voordat de operatie begint en doe een nieuw paar steriele chirurgische handschoenen aan. Vermijd het aanraken van niet-steriele plekken of voorwerpen nadat je chirurgische handschoenen hebt aangetrokken.
      11. Gebruik een steriele watten tip applicator om betadinevloeistof aan te brengen op de operatieplaats in een kloksgewijs cirkelvormige beweging van binnenuit. Gebruik vervolgens een steriel alcoholwattenstaaf om hetzelfde gebied op een vergelijkbare manier schoon te maken. Herhaal deze procedure nog twee keer.
          Opmerking: Raak tijdens de operatie geen niet-steriele voorwerpen of gebieden aan. Vervang onmiddellijk de handschoenen als er contact is met een niet-steriel oppervlak. Het wordt sterk aanbevolen om een andere persoon te laten helpen tijdens het uitvoeren van intrabursale injectie. Deze persoon kan helpen bij het hanteren van niet-steriele voorwerpen tijdens de operatie.
      12. Wacht 1 minuut tot de alcohol droog is.
      13. Lokaliseer de plek die ongeveer 1,5 cm boven de achterpoot ligt en 5 mm van de ribbenkast van de muis, zoals weergegeven in Figuur 2B. Til de huid op deze plek op met de gebogen pincet en maak vervolgens een verticale incisie van 5 mm met een fijnpuntige schaar.
          Opmerking: Controleer voordat je de incisie maakt of de muis volledig onder invloed van verdoving staat door te bevestigen dat de teenknijpreflex ontbreekt.
      14. Houd de huid aan één kant vast met fijne micropincetten en maak een incisie in het onderhuidse weefsel op dezelfde plek.
      15. Op dit punt wordt de peritoneale laag onder het subcutane weefsel zichtbaar. Gebruik een fijnpuntige, gebogen, gekartelde tang om de buiklaag vast te houden en maak een incisie van ongeveer 2,5 mm lang met een fijnpuntschaar.
      16. Houd de zijkant van de peritoneale incisieflap vast met de gekartelde pincet en lokaliseer het vetkussen van de eierstok met fijne pincet. De eierstok bevindt zich onder het vetkussen.
      17. Trek voorzichtig een stukje van het vetkussen van de eierstok samen met de eierstok door de incisie.
      18. Gebruik de dissectietang om het vetkussen zo te houden dat de eierstok naar boven gericht is en onbeweeglijk is.
          Opmerking: Houd de eierstok niet vast met een tang. Gebruik altijd gekartelde pincet om het vetkussen vast te houden, omdat het weefsel glad is.
      19. Vraag de persoon die assisteert om de spuit met de celsuspensie klaar te maken. Het wordt aanbevolen een 0,3 mL insulinespuit te gebruiken.
      20. Steek de naald voorzichtig in met de afschuining omhoog in de eierstokbursa vanaf de aansluiting van de eileider en eierstok. Zorg ervoor dat de hele afschuining in de bursa gaat voordat je op de zuiger drukt.
          Let op: Wees voorzichtig dat je de bursa niet doorboort aan het andere uiteinde van de plaatsplaats.
      21. Duw voorzichtig op de zuiger en doe de inhoud van de spuit over in de eierstokbursa. Verwijder de naald snel.
      22. Zwelling van de bursa rondom de eierstok duidt op een succesvolle inoculatie van cellen.
      23. Wacht 5 seconden en plaats de eierstok voorzichtig terug in de buikholte.
      24. Sluit het peritoneum met een 6-0 absorberbare monofilamenthechting met één of twee eenvoudige onderbroken chirurgische hechtingen.
      25. Sluit de huidincisie met de 6-0 absorberbare monofilamenthechting met een eenvoudige lopende chirurgische hechting. Zorg ervoor dat er geen bloeding is vanaf de incisieplaats.
      26. Breng drievoudige antibiotische zalf aan (Bacitracine, Neomycine en Polymyxine B) op de incisieplaats nadat je deze hebt gesloten.
      27. Dien Carprofen 15 mg/kg subcutaan toe aan de muis ter pijnverlichting.
      28. Oortag de muis met een voorkeursmethode. Oortagging maakt het later mogelijk om de geïnjecteerde muis te identificeren.
      29. Breng de muis over naar een verse kooi. Zet deze kooi met een half op een warmtekussen voor minstens 60 minuten. Zorg ervoor dat het effect van de narcose tegen die tijd volledig is verdwenen en dat de muis wakker en actief is.
          Opmerking: Muizen zijn gevoelig voor onderkoeling onder narcose. Daarom is het belangrijk om externe warmte te leveren om de lichaamstemperatuur te reguleren.
      30. Controleer de muizen na 4-5 uur na de operatie op tekenen van bloedingen bij de incisie of ander ongemak.
      31. Geef muizen elke 24 uur carprofen 15 mg/kg subcutaan gedurende de volgende 3 dagen.
      32. Als de geïnëntopeerde cellen genetisch zijn gemodificeerd om luciferase stabiel tot expressie te brengen, kan de tumorlast worden gemeten met IVIS vanaf dag 1 na injectie, zoals beschreven in sectie 3.

3. Niet-invasieve beeldvorming van een muistumor met behulp van het In Vivo Imaging System (IVIS)

Een belangrijk doel in verschillende studies met de in dit rapport beschreven transplanteerbare tumormodellen is het verkrijgen van longitudinale gegevens over tumorprogressie. Hoewel het volume subcutane tumoren kan worden geschat met een vernier-kaliper, is dit geen haalbare optie voor tumoren die zijn gevormd met de intraperitoneale en intrabursale modellen. Om deze uitdaging te overwinnen en de intraperitoneale tumorlast vast te stellen, gebruiken de meeste laboratoria luciferase-gebaseerde, niet-invasieve bioluminescentiebeeldvorming. Om dit mogelijk te maken, worden getransplanteerde kankercellen zo gemanipuleerd dat ze luciferase stabiel tot expressie brengen, wat bioluminescentie produceert bij toediening van het substraat D-luciferine. Bioluminescentie wordt niet-invasief gedetecteerd met behulp van een In Vivo Imaging System (IVIS). Dit signaal wordt vervolgens gekwantificeerd om de tumorlast te volgen en informatie te onthullen over metastasen en de therapeutische effectiviteit van de geneesmiddelen. Hieronder beschrijven we het protocol voor het volgen van tumorlast via luciferase-gebaseerde, niet-invasieve bioluminescentiebeeldvorming met IVIS bij muizen.

1. Bereiding van het D-luciferine-substraat
   1. Bereid 15 mg/mL D-luciferine-oplossing voor in 1X PBS (pH 7,4) onder steriele omstandigheden.
   2. Filtersteriliseer de oplossing met een 0,22 μm filter.
   3. Wikkel de oplossing in aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen tot gebruik.
2. Het initialiseren van de IVIS-imager voor beeldverwerving
   1. Open de "living Image"-software op de computer die verbonden is met de IVIS-imager en log in.
   2. De imager moet geïnitialiseerd worden voor beeldverwerving. Dit gebeurt als volgt:
      1. Bij het inloggen opent een venster van het IVIS-bedieningspaneel zoals te zien is in Figuur 3A.
      2. Klik op de knop "initialiseren" aan de rechteronderkant van het venster (Figuur 3A). Het duurt een paar minuten voordat het systeem initialiseert.
         Opmerking: Aanvankelijk wordt de temperatuurbalk onderaan het raam rood, wat aangeeft dat de beeldcamera bezig is zijn streeftemperatuur van -90 °C te bereiken (Figuur 3B).
      3. Wanneer de beeldcamera de doeltemperatuur (-90 °C) bereikt, wordt de temperatuurbalk groen en geeft de systeemstatus "Klaar om te gebruiken" aan (Figuur 3C). Nu is de imager klaar om de muis te fotograferen.
         Opmerking: De belichtingstijd, binning en f/stop kunnen worden aangepast volgens de gebruikersbehoeften.
3. De muis voorbereiden op IVIS-beeldvorming
   Voordat de muis wordt gefotografeerd, moet D-luciferine intraperitoneaal worden geïnjecteerd.
   1. Haal de muis uit de kooi en zet hem op een ruwe of bedrade ondergrond. Trek de muizen voorzichtig in de baard om ze goed vast te houden zoals beschreven in sectie 2.1.
   2. Pak de muis op en draai hem zo dat de buikzijde naar boven wijst.
      Opmerking: Als de muis correct vastgebonden is, zullen alle vier de poten bij het oppakken naar buiten steken, zoals te zien is in Figuur 1B. Houd zijn staart tussen de vingers als extra vorm van terughoudendheid tijdens de ingreep.
   3. Gebruik een steriel alcoholuittje om de injectieplaats schoon te maken, zoals in het intraperitoneale injectieprotocol in sectie 2.1.
   4. Gebruik een 1 ml TB-spuit en een naald van 30G, 1/2 inch om intraperitoneal een passende hoeveelheid D-luciferine uit de standaardoplossing te injecteren om een einddosis van 150 mg/kg D-luciferine te bereiken.
      Opmerking: Raadpleeg het intraperitoneale injectieprotocol in sectie 2.1 voor instructies over hoe intraperitoneale injectie uit te voeren. Bij gebruik van C57BL/6-muizen (voor syngene allograftmodellen), wordt sterk aanbevolen de vacht te verwijderen voordat bioluminescentiebeeldvorming met IVIS wordt uitgevoerd. Zwarte vacht en gepigmenteerde huid dempen het licht aanzienlijk, waardoor de signaalintensiteit afneemt.
   5. Zet de muis voorzichtig terug in de kooi. De exacte wachttijd en belichtingstijd moeten empirisch worden vastgesteld. Dit kan als volgt worden bepaald.
      1. Verdoof de muis direct na de D-luciferine-injectie en maak een beeld zoals beschreven in Sectie 3.4, elke 2 minuten gedurende 20 minuten.
         Opmerking: Bij het voor het eerst uitvoeren van dit experiment wordt aanbevolen te bepalen hoe het luciferasesignaal varieert in de tijd na toediening van D-luciferine. Dit helpt om het meest geschikte moment te bepalen om de muis te fotograferen na het toedienen van D-luciferine in latere experimenten. Het bioluminescente signaal kan variëren afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de cellijn, het muis-xenograftmodel, het niveau van luciferase-expressie, enzovoort.
      2. Neem bij elk interval expsures van 5, 10 en 15 s.
      3. Gebruik deze gegevens om een standaardcurve uit te zetten. Op basis van de curve kies je de wachttijd en belichtingstijd waarop het signaal een plateau bereikt terwijl de hoogste intensiteit behouden blijft.
         Let op: Meestal duurt deze tijd tussen de 5 en 10 minuten, maar kan variëren afhankelijk van het model.
4. Niet-invasieve beeldvorming van muistumoren met behulp van IVIS
   1. Na de wachttijd plaats je de muis in een isofluranenkamer met een isofluranensnelheid van 4% en een zuurstofdebiet van 3,5%.
   2. Controleer of de muis verdoofd is door te controleren of de teenknypreflex niet aanwezig is.
   3. Plaats de muis op het podium in de IVIS-imager en schuif de neus in de neuskegel voor anesthesie-onderhoud tijdens de beeldvorming. Zorg dat ze binnen de gemarkeerde lijnen van de camerafocus blijven en sluit de deur van de imager.
      Opmerking: Er zullen vijf posities op het podium zijn binnen de imager. Elke positie heeft ook hun respectievelijke anesthesie-neuskegels. Dit maakt het mogelijk om 5 muizen tegelijk te beeldvormen. Afhankelijk van het aantal muizen dat je moet fotograferen, stel je het cameraveld in het bedieningspaneelvak aan van "D" (breder veld) naar "A" (smalle focus). De muis kan overal op het podium worden geplaatst, mits hun neus gedurende de hele beeldvorming in de neusconen van de anesthesie blijft. Het wordt aanbevolen om de muizen achtereenvolgens eerst aan hun rugzijde en daarna aan de buikzijde te fotograferen.
   4. Pas de belichtingstijd aan en klik op "Acquire" in het configuratiescherm (Figuur 3C).
      Let op: Zorg ervoor dat luminescentie, foto en overlay "AAN" staan in het bedieningspaneel.
      Zodra de afbeelding is vastgelegd, verschijnt de afbeelding van de muis met luciferase-signaal op het scherm.
   5. Open de imager en draai de muis zodat de ventrale zijde naar boven wijst en klik op "Acquire" nadat je de deur van de imager hebt gesloten.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de neus van de muis in de neuskegel zit om de anesthesie tijdens de beeldvorming te behouden.
   6. Zodra zowel dorsale als ventrale beelden zijn gemaakt, open je de deur van de cameracamera en plaats je de muis terug in zijn kooi.
   7. Wacht 5-10 minuten om zeker te zijn dat de muis weer bij bewustzijn komt.
5. Analyse van IVIS-beeld om tumorlast bij de muis te bepalen
   1. Aanpassing van de kleurschaal van afbeeldingen
      1. Sla de ruwe afbeeldingen op in de juiste map door op "bestand" te klikken en vervolgens op "Opslaan als".
         Opmerking: De imager past de kleurschaal automatisch aan op basis van signaalintensiteit. Het is raadzaam om de kleurschaal constant te houden over alle beelden die tijdens het experiment zijn genomen. De kleurschaal kan later ook worden aangepast door de ruwe afbeelding met deze software te openen.
      2. Voor handmatige aanpassing verschijnt er een ander venster van het gereedschapspalet rechtsboven op het scherm (Figuur 3D), ga naar "Afbeelding aanpassen" en kies dan "handmatig" voor schaal. Voer het minimum- en maximumgetal in dat voor de schaalwaarde gewenst is en klik op "Enter" (Figuur 3E).
         Opmerking: Bij het aanpassen van de kleurschaal van een eerder verkregen afbeelding, open eerst het opgeslagen raw-infoclick.txt afbeeldingsbestand uit de betreffende map met "file" gevolgd door "open".
         3.5.1.3. Sla deze afbeelding apart op van de raw-afbeelding in de juiste map.
   2. Analyse van tumorlast bij de muis
      Opmerking: Voor kwantitatieve meting van tumorlast kunt u de signaalintensiteit van elke muis meten op beelden die over de hele periode zijn genomen. Je kunt die waarden in Excel of GraphPad Prism plaatsen voor statistische analyse en om lijngrafieken van tumorprogressie te genereren.
      1. Open het opgeslagen raw-infoclick.txt bestand uit de betreffende map.
      2. Ga naar het ROI (Region of Interest)-gedeelte van het gereedschapspaletvenster dat rechtsboven verschijnt (Figuur 3F).
      3. Teken het ROI-gebied op elke muis handmatig of automatisch met behulp van de "teken"-functie met elke vorm die het beste voor jou werkt. Om dit handmatig te doen, houd je het gebied consistent voor alle beelden van alle muizen die worden vergeleken.
         Opmerking: Voor intraperitoneale inenting werkt handmatige selectie van de ROI voor de hele borst en buik op het ventrale beeld van de muis het beste. Voor intrabursale inenting werkt handmatige selectie van de ROI in het dorsale beeldgebied met signaal het beste.
         Opmerking: Automatische ROI-selectie selecteert alleen regio's met een hogere beeldsignaalintensiteit.
      4. Klik op "Measure ROI" (Figuur 3F). Dit opent een nieuw venster met gegevens over het totaal en gemiddelde aantal runs per geselecteerde ROI.
      5. Sla dit bestand op in de juiste map zodat het later toegankelijk is. Gebruik deze gegevens om de grafiek uit te zetten in MS Excel of GraphPad Prism.

Resultaten

Representatieve gegevens van een intraperitoneaal eierstokkankermodel met luciferase-gelabelde OVCAR8-cellen in immuungecompromitteerde Foxn1 naakte muizen zijn te zien in Figuur 4. Stabiele luciferase-expressie in deze cellen maakte longitudinale monitoring van tumorprogressie mogelijk door niet-invasieve bioluminescente beeldvorming met de IVIS-imager zoals beschreven in sectie III. Intraperitoneale injectie van 5 miljoen OVCAR8-luciferasecellen in Foxn1 n...

Discussie

Het vermogen om complexe interacties tussen tumorcellen, micro-omgeving en systemische factoren na te bootsen, maakt muismodellen tot een uitstekende bron om de progressie van eierstokkanker te bestuderen¹². Naast het vergroten van ons begrip van factoren die de progressie en metastase van eierstokkanker aansturen, spelen in vivo muismodellen ook een belangrijke rol bij preklinische evaluatie van kleine moleculen en behandelstrategieën voor uitgezaaide eierstokkan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 um injectiespuit steriele filter, 33mm	Fisher Scientific	09-720-004
1 ml TB injectiespuit	BD	309659
21G, 1 inch naald	BD	305167
30G, ½ inch naald	BD	305106
5 inch gebogen fijne punt forceps	Fisher Scientific	1631
6-0 Absorbeerbare monofilament hechtdraad	MaxonTM	6532-11
Alcohol doekje(70% isoprolyl alcohol)	Dukal Corp	80003156
Betadine (1% jodium oplossing)	Purdue Products	367618150085
Carprofen Inj, 50mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Centrifuge	Eppendorf	5702
D-luciferine	Syd Labs	MB000102-R70170
Dissectie juwelier microforceps, fijne punt	Fisher Scientific	08-953E
Oogzalf	Medvet	11897
Fijne punt schaar	Fisher Scientific	8940
Verwarmingspad	Sunbeam	731-500
Instrumenten Dissectie Forceps met Fijne Punten	Fisher Scientific	S08096
Insulin Injectiespuit 3/10ml	BD	328438
Isofurane	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Mayo- Heger Strakke Naaldhouder	Fisher Scientific	08-966
Steriele 1X PBS, zonder calcium en Magnesium	Corning	21-040-CV
Steriele Katoen punt applicators	Mckeesson	24-106-1S
Steriele Gauge	Kendall	3033
Steriele Pad/Handdoek/Deksel, niet-geperforeerd	Henry-Schein	100-9687
Drievoudige Antibioticumzalf	Globe	4006-4SL
Trypsin-EDTA (0.25%), fenol rood	Gibco	25200-056