Gestandaardiseerde voorbereiding van geïsoleerde duodenale gladde spier van konijnen voor in vitro farmacologische beoordeling van contractiele activiteit

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de voorbereiding van geïsoleerde gladde spiermassa van konijnen te standaardiseren voor in vitro farmacologische beoordeling, met gebruik van een Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System voor realtime gegevensregistratie van contractiele activiteit.

Samenvatting

De gecoördineerde contractiele activiteit van de gladde spier in het maag-darmkanaal vormt de fysiologische basis voor het behouden van normale verterings-, opname- en transportfuncties, waarbij de disfunctie nauw samenhangt met motiliteitsstoornissen. De geïsoleerde orgaanperfusietechniek elimineert complexe in vivo interferenties — zoals neurale, endocriene en hemodynamische factoren — en dient als klassiek model voor farmacologische studies. Daartoe beschrijft deze studie een stapsgewijs protocol voor de gestandaardiseerde bereiding van konijn geïsoleerde duodenale gladde spier. De procedurele workflow benadrukt de cruciale stappen van het voorbereiden van oplossingen, het inslapen van het konijn, het uitvoeren van een nauwkeurige aseptische mid-abdominale laparotomie voor snelle weefselexisie, het ophangen van de gladde spierstrips en het kalibreren van transducers voor realtime spanningsregistratie. Op basis van dit technische platform valideerden we de methode verder door de effecten van Huoxiang Zhengqi Oral Liquid (HXZQ-OL) op spontane contracties en door acetylcholine/bariumchloride geïnduceerde tetanische contracties te evalueren. Concluderend levert dit protocol een robuust en zeer reproduceerbaar methodologisch kader op, dat een breed toepasbaar in vitro screeningplatform biedt voor de farmacologische beoordeling van therapeutische middelen gericht op gastro-intestinale motiliteit.

Inleiding

De gecoördineerde contractiele activiteit van gastro-intestinale gladde spieren vormt de fysiologische basis voor het behouden van normale spijsverterings-, absorptie- en transportfuncties¹. De disfunctie ervan is nauw verbonden met verschillende veelvoorkomende klinische aandoeningen, waaronder prikkelbare darm syndroom², functionele dyspepsie³ en postoperatieve gastro-intestinale motiliteitsstoornissen⁴. Het ophelderen van de moleculaire en farmacologische mechanismen die de gladde spieractiviteit reguleren is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe prokinetische of antispasmodische therapieën. In dit onderzoeksveld dient de geïsoleerde orgaanperfusietechniek als een klassiek model. Het biedt praktische waarde door complexe in vivo interferenties zoals neurale, endocriene en hemodynamische factoren te elimineren, waardoor directe en nauwkeurige beoordeling van de effecten van geneesmiddelen of werkzame stoffen op de gladde spiertonus ^5,6 mogelijk is.

Het opzetten van stabiele en betrouwbare protocollen voor in-vitro weefselvoorbereiding en gegevensregistratie is essentieel om reproduceerbare, hoogwaardige resultaten te verkrijgen. Bestaande in vitro intestinale spierexperimentele methoden vereisen verdere optimalisatie en standaardisatie op verschillende gebieden: gestandaardiseerd beheer van proefdieren, nauwgezette chirurgische technieken voor weefseloogst, consistente milieucontrole van perfusiesystemen en geautomatiseerde gegevensverzameling in combinatie met gestandaardiseerde analyse. Zo kunnen de temperatuur en pH-waarde van de perfusievloeistof, mechanische schade tijdens weefseloogst, en de instellingen voor de weefselpreload allemaal een aanzienlijke invloed hebben op de levensvatbaarheid van het weefsel en experimentele fouten veroorzaken. Deze factoren ondermijnen de betrouwbaarheid van de resultaten en belemmeren de vergelijkbaarheid tussen verschillende studies ^7,8.

Daarom is deze studie bedoeld om een gestandaardiseerd protocol op te stellen en uit te werken voor het bereiden van geïsoleerde duodenale gladde spiermonsters uit konijnen en het uitvoeren van realtime spanningsregistratie. Dit protocol beschrijft systematisch het hele proces, van experimentele dierethiek en welzijn, aseptische laparotomie en precieze isolatie van darmsegmenten, tot het bereiken van omgevingscontrole, gestandaardiseerde spanningsvoorbelastinginstellingen en hoogwaardige gegevensverzameling met behulp van een geïntegreerd horizontale constante-temperatuur perfusiesysteem en een multikanaals fysiologisch signaalacquisitiesysteem. Op basis van dit gestandaardiseerde technische platform hebben we cumulatieve doseringsmethoden toegepast om de effecten van Huoxiang Zhengqi Orale Vloeistof (HXZQ-OL) kwantitatief te evalueren, die voldoet aan de kwaliteitsnormen van de Chinese Farmacopoea (editie 2025)⁹, op spontane contracties en door acetylcholine en bariumchloride geïnduceerde tetanische contracties in geïsoleerde gladde spiermassa van de twaalfvingerige darm. Huoxiang Zhengqi Orale Vloeistof (HXZQ-OL), een orale toedieningsvorm van de klassieke traditionele Chinese medicijnformule Huoxiang Zhengqi, wordt in China veel gebruikt bij gastro-intestinale aandoeningen en vormt de reden om de directe effecten ervan op geïsoleerde gladde darmspieren te evalueren. Deze studie levert niet alleen direct experimenteel farmacologisch bewijs dat de gastro-intestinale gladde spierregulering van HXZQ-OL verduidelijkt, maar het experimentele protocol dient ook als een gestandaardiseerd, reproduceerbaar methodologisch model voor farmacologische screening en in vitro weefselstudies van gastro-intestinale gladde spieren.

Protocol

Gezonde volwassen Nieuw-Zeelandse witte konijnen van beide geslachten (met een gewicht van 2,0–2,5 kg) werden in dit werk gebruikt. Alle dierproevenprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Laboratoriumdieren van de Chengdu Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde (Goedkeuringsnummer: [2026070]). Alle inspanningen werden geleverd om dierenleed te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren te verminderen. Het workflowdiagram is geïllustreerd in Figuur 1.

1. Oplossingsvoorbereiding

OPMERKING: Alle werkende oplossingen, waaronder de oplossing van Tyrode, acetylcholine (ACh), bariumchloride, atropine en verapamil, moeten onmiddellijk voor het experiment vers worden bereid.

1. Bereid 1 L van Tyrode's oplossing voor door 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 1,0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃ en 5,6 mM D-glucose op te lossen. Voor gebruik verzadig je met een mengsel van 95% O₂ / 5% CO₂ gedurende 15–30 minuten, waarbij je de pH aanpast naar 7,3–7,4 (zie de Tabel van Materiaal).
2. Maak een 1 mM ACh kolfoplossing klaar. Neem 20 μL en voeg 20 mL van de Tyrode-oplossing toe. Meng grondig om een 1 μM ACh-oplossing te verkrijgen.
3. Maak een 1 M bariumchloride (BaCl₂) bouillonoplossing. Neem 20 μL en voeg 20 mL van Tyrode's oplossing toe. Meng grondig om een 1 mM BaCl₂-oplossing te verkrijgen.
   OPMERKING: BaCl₂ is zeer giftig en irriterend. Draag bij het hanteren persoonlijke beschermingsmiddelen in een afzuigkap en gooi afvalvloeistof af volgens de regelgeving.
4. Maak een oplossing van 10 mM atropinesulfaat. Neem 20 μL en voeg 20 mL van Tyrode's oplossing toe. Meng grondig om een 10 μM atropinesulfaatoplossing te verkrijgen.
5. Maak een 1 mM verapamilhydrochloride bouillonoplossing. Neem 2 μL en voeg 20 mL van de Tyrode-oplossing toe. Meng grondig om een 0,1 μM verapamilhydrochloride-oplossing te verkrijgen.
   OPMERKING: De concentraties van de voorbereide oplossingen werden bepaald door eerdere studies ^6,10,11 te raadplegen en verder geoptimaliseerd door onze voorlopige experimenten om optimale experimentele omstandigheden te waarborgen.

2. Bereiding van in vitro konijn duodenale gladde spiermonsters

1. Konijnen-euthanasie
   1. Zet het konijn vast in het konijnenfixeringsapparaat (Figuur 2A, B en Figuur 3A). Voer euthanasie uit door een overdosis natriumpentobarbital (120 mg/kg) via de auriculaire ader bij konijnen toe te dienen (Figuur 2C en Figuur 3B).
      OPMERKING: Volledige dood moet worden bevestigd met de volgende criteria: verwijdde pupillen, afwezigheid van pupillichtreflex, stilstand van ademhaling en hartslag, en verlies van plantaire reflex.
2. Voorbereiding en desinfectie van de operatielocatie
   1. Zet het konijn vast in rugligging op de operatietafel (Figuur 2D en Figuur 3C). Gebruik chirurgische schaar (Figuur 2E) of een elektrische scheermachine om alle buikharen grondig te verwijderen om de huid in het aangewezen chirurgische gebied bloot te leggen (Figuur 3D).
   2. Met een sponstang (Figuur 2E) grijp je een met jodium doordrenkte wattenbal (Figuur 2F,G). Beginnend in het midden van de geplande chirurgische incisie breng je de antiseptische oplossing aan in een concentrisch, cirkelvormig patroon van binnenuit (Figuur 3E).
      OPMERKING: Het desinfectiegebied moet voorbij de incisieranden reiken om volledige dekking van de gehele huid van het operatieveld te garanderen. Wacht na de desinfectie minstens 3 minuten om het antisepticum natuurlijk op het huidoppervlak te laten drogen.
   3. Plaats een steriel doek (Figuur 2H) over het gedesinfecteerde buikgebied om het operatieveld bloot te leggen (Figuur 3F).
3. Positionering en incisie van de buikincisie
   1. Maak met een scalpel (lemmet #23) (Figuur 2E) een 8 cm lange incisie langs de middenlijn van het achterlijf van onder het xiphoïde uitsteeksel tot boven de symfyse pubis.
   2. Ontleed de huid en het subcutane weefsel laag voor laag. Volg de linea alba en snijd de voorste schede van de rectus abdominis-spier, spiervezels en peritoneum laag voor laag uit om de buikholte binnen te gaan (Figuur 3G).
   3. OPMERKING: Vermijd tijdens de ingreep beschadiging van buikorganen terwijl je zorgt voor hemostase om bloedbesmetting van het operatieveld en buikorganen te voorkomen.
4. Scheiding van de duodenale ogen
   1. Open de buikholte langs de incisie (Figuur 3H). Trek voorzichtig de leverlobben cephalad terug met vochtig zoutgaas (Figuur 2I) om de maag en het duodenum volledig bloot te leggen (Figuur 3I).
   2. Kies het eerste segment van de duodenum (bulbair of bovenste dalende deel) op 2–3 cm van de pylorus als plek voor het oogsten van het weefsel.
   3. OPMERKING: Vermijd directe tractie of klem van het doel-darmsegment waar mogelijk om mechanische schade te minimaliseren. Gebruik in plaats daarvan een stompe pincet om voorzichtig het aangrenzende mesenterium vast te pakken, of gebruik zoutwaterbevochtigde wattenstaafjes om het weefsel voorzichtig te manipuleren en te positioneren.
   4. Met steriele oogschaar (Figuur 2E) verwijder je snel en nauwkeurig een segment van 1–2 cm (Figuur 2J) van de twaalfvingerdarmbuis (Figuur 3J, K).
   5. Breng het verwijderde darmsegment onmiddellijk over in een kweekschaal (Figuur 2K) met voorgekoelde (4 °C) Tyrode-oplossing die continu wordt doorgepompt met een gemengd gas (95% O₂ / 5% CO₂).
5. Darmsegmenten trimmen, reinigen en tijdelijke opslag
   1. Met oogzwang (Figuur 2E) ontleed je voorzichtig het mesenterium en het omliggende vetweefsel dat aan de darmwand hecht.
   2. Met een spuit gevuld met koude Tyrode-oplossing (uitgerust met een stompe naald) (Figuur 2L) injecteer je de klysma-oplossing voorzichtig in de darmholte. Spoel langzaam het binnenste van de darmholte 2–3 keer door om de inhoud grondig te verwijderen.
   3. Plaats de gereinigde darmsegmenten in verse, zuurstofhoudende koude Tyrode-oplossing voor tijdelijke opslag tot volgende experimenten.

3. Horizontale constante temperatuur gladde spier experimenteel systeem opstarten en oplossingsinfusie

1. Voeg de oplossing van Tyrode toe aan de voorverwarmingsschaal van het DSQG-1 Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System (Figuur 4B; zie de Tabel van Materialen).
2. Zet de systeemstroom aan, raak het bedieningspaneel aan om de badtemperatuur op 37 °C in te stellen en begin met voorverwarmen (Figuur 4C).
3. Druk op de infusieknop en het systeem doseert automatisch 20 mL Tyrode-oplossing in het badbad.
4. Druk op de Drainage-knop om de vloeistof volledig in de afvalcontainer te laten lopen.
5. Druk op de Spoel-knop en het systeem voltooit automatisch het proces van eerst afgieten van de inhoud en daarna opnieuw vullen met vloeistof.
6. Druk op de Stop-knop om alle lopende infusie-, drainage- en spoelprocessen onmiddellijk te beëindigen.
7. Druk op de inflatieknop om continu het gemengde gas (95% O₂ / 5% CO₂) in het bad te brengen. Pas de gasstroom aan op schaal 5 om een latere experimentele weefselzuurstoftoevoer te waarborgen.
   OPMERKING: Schaal 5 geeft een gasdebiet van 100 mL/min aan. Te hoge gasstromen kunnen leiden tot verhoogde turbulentie in de oplossing, wat de stabiliteit van spanningsmetingen beïnvloedt.

4. Het verbinden van een multikanaals fysiologisch opname- en verwerkingssysteem met softwarewerking

1. Verbind de datakabel van de Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System-transducer op kanaal 1 van het Multi-Channel Physiological Recording and Processing System (Figuur 4D).
2. Zet de externe voeding voor het Multi-Channel Physiological Recording and Processing System aan en start de computer. Dubbelklik op het RM6240XC Multi-Channel Physiological Recording and Processing System-icoon op het bureaublad om het experimentele softwaresysteem te starten (zie de Tabel van Materiaal).
3. Selecteer in de menubalk Experiment | Spijsvertering | Fysiologische kenmerken van de gladde darmspier om de bijbehorende experimentele module te laden.
4. Stel de volgende parameters in: kanaalmodus op spanning, bemonsteringsfrequentie op 400 Hz, gevoeligheid op 1,5 g, tijdconstante op DC, en filterfrequentie op 30Hz.
5. Klik op de Startknop rechtsboven in de software-interface om realtime signaalacquisitie en weergave te starten. Klik op de knop Opnemen om gelijktijdig de oscilloscoop te tonen en het verkregen signaal in realtime op de harde schijf op te slaan.
6. Selecteer in de menubalk Experiment | Rapid Zeroing om het spanningssignaal aan te passen op het basisniveau.
   OPMERKING: Als het signaal met meer dan één verticale coördinateneenheid afwijkt van de basislijn, stel dan handmatig het nulpunt van de spanningstransducer af met een schroevendraaier.
7. Selecteer in de menubalk Experiment | Realtime dataweergavemethode | Drijvende plaat. Kies in het dialoogvenster dat verschijnt voor Normaal Realtime Measurement-Fast omrealtime spanningsgegevens van de darmspier in het floating window weer te geven.

5. Ophanging en spanningsvoorbelasting van de duodenale spierstrip

1. Pas de afstand van voor naar achter van de weefselhaken aan door de horizontale schroefknop te draaien volgens de lengte van de duodenale spierstrip, zodat deze overeenkomt met de lengte van de strip.
2. Houd het darmsegment in zijn natuurlijke cilindrische configuratie en lijn de zichtlijn uit met de cirkelvormige dwarsdoorsnede van het darmlumen.
3. Met oogpincet trekt u de darmopening voorzichtig terug om de openheid te behouden.
4. Steek voorzichtig de punt van de weefselhaak in het darmlumen.
5. Op een afstand van 2–3 mm vanaf de darmrand doorboor je de bovenste enkellaagige darmwand van binnenuit met behulp van de punt van de weefselhaak.
   OPMERKING: De weefselhaak moet de spierlaag doorboren om een stevige verankering te garanderen, waarbij oppervlakkige hechting alleen aan de serosale laag wordt vermeden, om zo mechanisch snijden en scheuren van de darmwand door de haak bij het aanbrengen van voorbelasting te voorkomen.
6. De andere kant van de darmwand is identiek aan de eerste kant. Na het identificeren van het parallelle corresponderende punt, dringt u alleen door de enkellaagige darmwand op dat punt (Figuur 3L).
7. Draai de horizontale schroefknop opnieuw om de haakafstand aan te passen, zodat de duodenumspierstrip van nature ontspannen blijft.
8. Voer geleidelijk spanning uit door de eendimensionale fijne afstelschakelaar aan te passen totdat de gemiddelde spanning van de duodenusspierstrip stabiliseert op 0,8 ± 0,1 g (Figuur 4A).
   OPMERKING: Inspecteer visueel de gehele lengte van de darm om te zorgen dat deze recht en cilindrisch blijft, vrij van draaiing, rotatie of spiraalvouwen. Als dit niet het geval is, verlaag dan onmiddellijk de spanning en stel het bevestigingspunt aan één kant opnieuw bij.
9. Voordat het experiment begint, balanceer je de duodenumspierstrip in de perfusiekamer gedurende 60 minuten. Tijdens deze evenwichtsperiode vervangt u de oplossing van de Tyrode elke 15–20 minuten door een nieuwe buffer totdat het spontane contractiele ritme stabiliseert.
   OPMERKING: De evenwichtsperiode van 60 minuten werd als voltooid beschouwd wanneer de geïsoleerde darmsegmenten stabiele spontane contractiele activiteit vertoonden gedurende minstens 15 opeenvolgende minuten. De objectieve criteria voor stabilisatie werden kwantitatief als volgt gedefinieerd: (1) basisspanning van < ±5%, (2) variantie in gemiddelde contractiele amplitude van < ±10% over opeenvolgende intervallen van 5 minuten, en (3) frequentiefluctuatie van < ± 1 cyclus/min.
10. Noteer de spontane contractie-activiteitscurve van de duodenale spierstrip als referentiedata voor latere experimenten.

6. Experimentele gegevensverzameling

1. Voor lopende experimenten selecteert u in de menubalk Tools | Split view om realtime statistische analyse uit te voeren op vastgelegde golfvormgegevens.
2. Voor opgeslagen databestanden klik je op de Open-knop in de werkbalk, selecteer je een opgeslagen databestand met de .lsd-extensie en laad je historische experimentrecords.
3. Klik op het Meet-icoon in de werkbalk en selecteer Regiomodus . Beweeg de muiscursor over het golfvormgebied, houd de linkermuisknop ingedrukt om twee punten te selecteren, en het systeem toont een datapaneel met de gemiddelde spanningswaarde binnen dat segment.
4. Klik op het Maat-icoon in de werkbalk en selecteer Periodemodus . Klik met de linkermuisknop op vijf opeenvolgende verschillende golfpieken (piekpunten) langs de golfvorm. Klik met de rechtermuis en het datapaneel berekent en toont de contractiefrequentie (in bpm) (Aanvullende Figuur S1).

Resultaten

Dit experimentele protocol beschrijft de gestandaardiseerde voorbereidingsmethode voor geïsoleerde duodenale spierstrips van konijnen en het proces waarbij hun dynamische spannings- en frequentieveranderingen in realtime worden geregistreerd met behulp van een geïsoleerd orgaanperfusiesysteem. Na dit protocol werd HXZQ-OL sequentieel toegevoegd via cumulatieve dosering in een 20 mL Tyrode-oplossingsbad, waarbij uiteindelijke volume-concentraties van 10, 20, 30, 40 en 50 μL/mL in het bad werden bereikt. Met verwijzing naa...

Discussie

Geïsoleerde orgaanperfusie- en spanningsopnametechnieken vertegenwoordigen klassieke methoden voor het bestuderen van gladde spierfysiologie en farmacologie. Hun bevindingen zijn van groot belang voor het verduidelijken van de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan gastro-intestinale motiliteitsstoornissen, vaatziekten en baarmoederdysfunctie 12,13,14,15.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetrische kolf	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetrische kolf	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetrische kolf	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conische centrifugeerbuis	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfaat	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Vriespunt osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontaal Constant-Temperatuur Soepele Spier Experiment Systeem	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Mondvloeistof	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-kanaals Fysiologisch Opname- en Verwerkingssysteem	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
Nieuw-Zeelandse Witte konijnen	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (Licentie nr.: SCXK[Su]2022-0004)	van beide geslachten (met een gewicht van 2,0–2,5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidon-jodium	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precisiebalans (0,1 mg)	Sartorius	BCE64i
Zoutoplossing	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S6014
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S9888
Natriumdiwaterstoffosfaat	Supelco	1063700250
Natrium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortexmixer	Kylin-Bell	XW-80A