Microalgenolie verbetert het leverlipidmetabolisme in een door een vetrijk dieet geïnduceerd muismodel

Samenvatting

Met behulp van een door een vetrijk dieet geïnduceerd muismodel van door metabole disfunctie geassocieerde steatotische leverziekte, evalueert deze studie de effecten van docosahexaenoïnezuur (DHA)-rijke microalgenolie en toont aan dat de interventie de leverlipidenprofielen verbetert en geassocieerd is met veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota.

Samenvatting

Metabolisch gezien is dysfunctionele steatotische leverziekte een veelvoorkomende metabole aandoening die geassocieerd wordt met dysbiose van de darmmicrobiota en een onbalans in leverlipiden. In deze studie werd een door hoog vet dieet geïnduceerd muismodel ontwikkeld om de effecten van suppletie met DHA-rijke microalgenolie te evalueren. Muizen (n = 4 per groep) kregen 8 weken lang een vetrijk dieet en kregen dagelijks orale toediening van microalgenolie, probiotica of een combinatie van DHA-rijke microalgenolie en probiotica. Metabole parameters, samenstelling van darmmicrobiota (16S rRNA-sequencing), microbiële functionele routes en levermetabolomische profielen werden beoordeeld. De resultaten toonden aan dat DHA-rijke microalgenolie de lipidenhomeostase verbeterde, zoals blijkt uit verlaagde serum LDL-c- en levertriglyceridenniveaus en een verhoogde high-density lipoproteïne (HDL-c), en dat het geassocieerd was met verlichting van leverschade en oxidatieve stress. Microbioomanalyse toonde selectieve veranderingen in de darmmicrobiële samenstelling aan, waaronder verrijking van Lactobacillus en Bifidobacterium en vermindering van vetrijke taxa zoals Clostridium en Ruminococcus. Functionele profilering wees veranderingen aan in microbiële metabole routes, waaronder de L-methionine salvagecyclus en fenylethylamineafbraak. Geïntegreerde microbioom–metaboloomanalyse identificeerde verder verbanden tussen microbiële taxa en levermetabolieten die betrokken zijn bij vetzuurmetabolisme, galzuuromzet en aminozuurroutes. Deze bevindingen geven aan dat DHA-rijke suppletie van microalgenolie in verband gaat met verbeteringen in het leverlipidmetabolisme en de samenstelling van de darmmicrobiota in dit model, zonder een direct causaal mechanisme te impliceren.

Inleiding

Metabolisch-disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) is een zeer voorkomende wereldwijde aandoening die ongeveer 32,4% van de wereldbevolking treft¹. MASLD wordt gedefinieerd door overtollig vet in de lever, wat bijdraagt aan diverse bijbehorende gezondheidsproblemen. Het menselijke spijsverteringskanaal bevat een geavanceerde en uitgebalanceerde microbiële gemeenschap, waaronder bacteriën, virussen, schimmels en parasieten^. Door de interactie tussen deze microbiële gemeenschap en de lever worden probiotica gezien als een veelbelovende methode om MASLD te voorkomen en te behandelen door deze kritieke verbinding^te moduleren. Opkomend onderzoek wijst erop dat probiotica een positieve invloed kunnen hebben op MASLD door het darmmicrobioom te moduleren en ontstekingen te verminderen. Specifiek bleek het toedienen van probiotica het evenwicht in de darmmicrobiota te herstellen en leverontsteking te verminderen⁴. Bovendien is aangetoond dat bepaalde probiotica, vooral die welke galzuurmetabolisme kunnen verhogen, leversteatose (vetvet) verlichten en de algehele metabole gezondheid ondersteunen bij mensen met MASLD ^5,6. Bovendien gaf sterk bewijs aan dat patiënten met MASLD significante veranderingen in de darmomgeving vertonen, een aandoening die bekendstaat als dysbiose ^7,8. Een cruciale bevinding was de vermindering van de alfa-diversiteit, wat betekent dat het totale aantal en de verscheidenheid aan microbiële soorten afneemt. Bovendien wordt de darmmicrobiota van MASLD-patiënten vaak gekenmerkt door een dominantie van het bacteriële fylum Firmicutes ^9,10,11. Mensen met MASLD eten vaak slecht en eten, meestal met een hoge inname van verzadigde vetten en een lage inname van essentiële micronutriënten^12,13. Deze ongezonde eetpatronen, vaak waargenomen in stedelijke bevolkingen, correeren met een verhoogde verhouding van Firmicutes-tot-Bacteroidetes vergeleken met mensen die in landelijke gebieden^{wonen 14}. Bovendien werden vetrijke diëten direct betrokken bij het veroorzaken van een diepere darmonbalans. Specifiek toonden zowel onderzoek in diermodellen als studies bij patiënten met gevorderde leverziekte, MASLD, aan dat een hoge vetinname in verband werd gebracht met verandering in het darmvirom. Deze veranderingen omvatten een toename van de activiteit van de lytische fage, wat uiteindelijk de bestaande darmdysbiose^verergerde.

Omega-3 meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's), die vaak in visolie voorkomen, kunnen de lipidmetabolisme verbeteren en het darmmicrobiota reguleren. Microalgenolie is uitgegroeid tot een veelbelovende en duurzame bron van omega-3 PUFA's. Specifiek is schizochitrium-microalgenolie een veelbelovende commerciële bron omdat het een hoge concentratie zuiver docosahexaenzuur (DHA) bevat. Eerdere studies van deze groep rapporteerden dat, in een door vetrijke voeding (HFD)-geïnduceerde obesitas-muismodel, de effectiviteit van microalgenolie bij het bevorderen van gewichtsverlies vergelijkbaar was met die van visolie en het afvalmedicijn Orlistat. Cruciaal is dat microalgenolie deze gewichtsverlieseffecten eerder vertoonde dan visolie of Orlistat¹⁷. Eerdere bevindingen toonden ook aan dat microalgenolie een duidelijk en gunstig effect had op de darmmicrobiota in vergelijking met commerciële visolie en Orlistat. Hoewel microalgenolie de algehele bacteriële diversiteit niet significant veranderde, werd het geassocieerd met een toename van gunstige bacteriën die korteketenvetzuren (SCFA) produceren en een vermindering van pathogene taxa, waaronder het obesitas-geassocieerde geslacht Desulfovibrio. Bovendien herstelde microalgenolie opmerkelijk de metabole capaciteit van de darmmicrobiota, versterkte de routes die verband houden met aminozuren, SCFA's en galzuurmetabolisme, terwijl de biosynthese van lipopolysaccharide (LPS) cruciaal werd verminderd. Deze modulaties waren waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verbeterde lipidmetabolisme en de verhoogde colonale slijmvliesbarrière, wat suggereert dat microalgenolie een superieur voedingssupplement was voor de verlichting van obesitas¹⁷.

Ondanks vooruitgang in het koppelen van darmmicrobiotadysbiose aan de ontwikkeling van MASLD, blijven de specifieke relaties tussen microbiële samenstelling, microbiële metabole functies en leverlipidmetabolisme onvolledig begrepen. In het bijzonder blijven de oorzakelijke verbanden tussen veranderingen in de microbiota en ziekteprogressie onduidelijk, en of dieetinterventies, zoals DHA-rijke microalgenolie, geassocieerd zijn met gecoördineerde veranderingen in darmmicrobiële gemeenschappen en metabole profielen van de gastheer is niet systematisch onderzocht. DHA-rijke microalgenolie is een duurzame en efficiënte bron van omega-3 vetzuren, met een DHA-rijke hoeveelheid microalgenolie vergelijkbaar met visgebaseerde supplementen. Eerdere studies suggereren dat suppletie met DHA-rijke microalgenolie de leversteatose en metabole parameters^{kan verbeteren 18,19}. De verbanden met de samenstelling van darmmicrobiota en microbiële metabole functie in de context van MASLD blijven echter onduidelijk.

Daarom gebruikte deze studie een muizenmodel met een hoog vetdieet om de effecten van DHA-rijke microalgenolie op metabole parameters, de samenstelling van darmmicrobiota en levermetabolomische profielen te evalueren. Er werd verondersteld dat suppletie met DHA-rijke microalgenolie geassocieerd zou zijn met verbeteringen in het leverlipidmetabolisme en gelijktijdige veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota en microbiële metabole routes.

Protocol

Details van alle dieren, diëten, reagentia, kits, instrumenten, software en dienstverleggers die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in de Materiaaltabel. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en kregen goedkeuring van het Proefdierencomité van het Provinciaal Ziekenhuis van Shandong (ethische goedkeuring nr. 2022–007, goedgekeurd op 24 januari 2022).

VOORZICHTIG: Dierlijk bloed, ontlasting en weefsels moeten worden behandeld als mogelijk biologisch gevaarlijke stoffen. Alle procedures met levende dieren, biologische monsters, scherpe voorwerpen, organische oplosmiddelen en chemische assayreagentia moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele regelgeving voor bioveiligheid, dierenverzorging en chemische veiligheid. Dierlijke karkassen, weefsels, met bloed besmette materialen en ontlastingsmonsters moeten worden verzameld in aangewezen containers voor biohazard afval en worden afgevoerd via de institutionele dierenfaciliteit of het bioveiligheidskantoor. Naalden, gavagenaalden, capillaire buizen en andere scherpe stoffen moeten onmiddellijk na gebruik worden weggegooid in goedgekeurde scherpe verpakkingen. Organisch oplosmiddelafval, waaronder methanol, acetonitril en oplossingen met mierzuur, moet worden verzameld in gelabelde containers voor chemisch afval en worden afgevoerd via het institutionele programma voor gevaarlijk chemisch afval. Afval van biochemische en oxidatieve stressassays moet worden verzameld en afgevoerd in overeenstemming met de veiligheidsgegevensbladen van de fabrikant en de institutionele chemische veiligheidsregels.

Proefdieren

Mannelijke C57BL/6J muizen van zes weken oud (n = 4 per groep) werden gehouden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden met een 12 uur licht/donker cyclus bij 22 ± 2 °C en 50–60% relatieve luchtvochtigheid. Dieren hadden ad libitum toegang tot voedsel en water, met maximaal vijf muizen per kooi. De controlemuizen kregen een standaard chow-dieet dat bestond uit 70% koolhydraten, 20% eiwitten en 10% vet (kcal). Om het MASLD-muismodel op te stellen, kregen muizen 8 weken lang een vetrijk dieet met 20% koolhydraten, 20% eiwit en 60% vet (kcal). Alle diëten werden bewaard op 4 °C en tweemaal per week aangevuld. Muizen werden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen met behulp van een willekeurige getallengenerator, en de steekproefgrootte (n = 4 per groep) werd bepaald op basis van eerdere studies met vergelijkbare door hoog vet geïnduceerde muismodellen en voorlopige experimenten. Alle behandelingen werden elke dag op hetzelfde tijdstip toegediend om circadiane variatie te minimaliseren.

Microalgenolie werd gewonnen en gezuiverd door de Shandong Academie voor Landbouwwetenschappen, met een zuiverheid van ongeveer 99%. De microalgenolie werd opgeslagen bij −30 °C en beschermd tegen licht. Voor toediening werd de olie bereid met een emulgator en grondig gemengd om homogeniteit te waarborgen. Specifiek werd DHA-rijke microalgenolie geëmulgeerd in steriele 0,5% carboxymethylcellulosenatrium met 0,5% Tween-80 in normale zoutoplossing. De microalgenolie en het emulgatorvoertuig werden gemengd in een verhouding van 1:9 (v/v) en direct voor de wandage 2 minuten vortex om een uniforme ophanging te verkrijgen. Muizen in de microalgenolie-behandelde groep kregen de bereiding eenmaal per dag door orale gavage met een steriele voedingsnaald bij een dosis van 10 μL/g lichaamsgewicht. Het gavagevolume werd dagelijks aangepast aan het lichaamsgewicht om dosisconsistentie te waarborgen. Muizen in de controlegroep ontvingen onder dezelfde omstandigheden een gelijkwaardige hoeveelheid steriele normale zoutoplossing. De gebruikte zoutoplossing was 0,9% natriumchloride-injectie.

De probioticabehandeling bestond uit een samengestelde formulering met Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) en Bacillus coagulans (GIM 1.645). De vier stammen werden gemengd met een gelijke viable-cel verhouding van 1:1:1:1. Elke stam droeg 2,5 × 10⁷ CFU/mL bij aan de uiteindelijke formulering, wat resulteerde in een totale bacteriële concentratie van 1 × 10⁸ CFU/mL. Het probioticamengsel is gesynthetiseerd door de Shandong Academy of Agricultural Sciences en is niet commercieel verkrijgbaar. De probiotische behandeling bestond uit een samengestelde probiotische fermentatiebouillon met Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC en Bacillus coagulans GIM 1.645. De bacteriële concentratie van de formulering was 1 × 10⁸ CFU/mL. De probiotische fermentatiebouillon werd voor gebruik bewaard op 4 °C. Muizen in de met probiotica behandelde groep kregen de probiotische formulering eenmaal per dag via orale gavage in een dosis van 0,01 mL/g lichaamsgewicht gedurende de experimentele periode.

Individuele stammen werden onder geschikte omstandigheden gekweekt en geoogst in de midden-log groeifase (OD₆₀₀ ≈ 0,6), waarna ze gecombineerd werden in de aangegeven verhouding. Bacteriële culturen werden gecentrifugeerd om het supernatant te verwijderen, en de pellets werden opnieuw opgehangen in steriele fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS). De vers bereide bacteriële suspensie werd vóór toediening op ijs gelegd om de levensvatbaarheid te behouden. De uiteindelijke bacteriële concentratie werd aangepast naar 1 × 10^{8 CFU} /mL vóór toediening. Muizen in de probioticagroep kregen de formulering door orale gavage in een dosis van 0,01 mL/g lichaamsgewicht eenmaal per dag gedurende de experimentele periode. Er werd geen antibioticavoorbehandeling toegepast vóór het toedienen van probiotica. Om experimentele bias te verminderen, werd uitkomstbeoordeling uitgevoerd door geblindeerde onderzoekers waar van toepassing. MASLD werd bevestigd door middel van bloedbiochemische analyse.

Bloedanalyse

Aan het einde van de experimentele periode werden muizen 's nachts (12 uur) gevast, met gratis toegang tot water voordat de glucose werd gemeten en het laatste bloed werd afgenomen. Muizen werden diep verdoofd met isofluraan met behulp van een anesthesievaporizer totdat het verlies van de pedaalreflex werd bevestigd. Terminale bloedmonsters werden verzameld door retro-orbitale bloedingen. Na bloedafname werden muizen geëuthanaseerd door een cervicale ontwrichting terwijl ze diep onder narcose stonden, en de dood werd bevestigd door het stoppen van ademhaling en hartslag. Bloed werd bij kamertemperatuur laten stollen en vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd bij 3.000 × g om serum te verkrijgen. Serummonsters werden gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C tot analyse. Serumglucose, totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), low-density lipoproteïnecholesterol (LDL-c), high-density lipoproteïnecholesterol (HDL-c), aspartaataminotransferase (AST) en alanineaminotransferase (ALT) werden gemeten met een automatische biochemische analyzer, volgens de instructies van de fabrikant. Deze parameters werden gekwantificeerd met enzymatische colorimetrische assays met standaard reagenskits geïntegreerd in het analyzersysteem. Alle biochemische parameters werden genormaliseerd naar het serumvolume en uitgedrukt in de door de fabrikant gespecificeerde eenheden.

Oxidatieve stressassays

Biomarkers voor oxidatieve stress werden gemeten met kits, waaronder die voor malondialdehyde, superoxidedismutase en catalase. Er werden tests uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden leverweefsels gehomogeniseerd in een ijskoude buffer en gecentrifugeerd om supernatanten voor analyse te verkrijgen. Malondialdehyde (MDA) niveaus werden bepaald met behulp van een thiobarbiturzuur-reactieve stoffen (TBARS) assay; De activiteit van superoxide-dismutase (SOD) werd gemeten aan de hand van het vermogen om superoxide-gemedieerde reacties te remmen; en de activiteit van catalase (CAT) werd gekwantificeerd door het monitoren van de afbraaksnelheid van waterstofperoxide. Metingen werden uitgevoerd met een microplaatlezer en waarden werden berekend met standaardcurves of de formules die in de kits werden geleverd. Oxidatieve stressmarkers werden genormaliseerd op het leverweefselgewicht en uitgedrukt volgens de specificaties van de fabrikant.

16S rRNA-sequencing en microbioomanalyse

Aan het einde van de experimentele periode werden poepmonsters direct van individuele muizen onder steriele omstandigheden verzameld, direct ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij −80 °C tot DNA-extractie. Microbieel DNA werd geëxtraheerd met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. De V3–V4-regio van het bacteriële 16S rRNA-gen werd geamplificeerd met primers 341F/806R. PCR-amplificatie werd uitgevoerd in een 25 μL reactiesysteem met template-DNA, 2x PCR mastermix en 0,2 μM van elke primer. Het versterkingsprogramma bestond uit een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 25 cycli van 95 °C voor 30 s, 55 °C voor 30 s, en 72 °C voor 45 s, met een laatste verlenging bij 72 °C voor 10 minuten. Amplicon-bibliotheken werden gebouwd en gesequenced op een Illumina MiSeq-platform met behulp van een paired-end 2 × 250 bp-strategie door een commerciële sequencing-dienstverlener. De bibliotheekkwaliteit werd beoordeeld vóór het sequencen, en gepoolde bibliotheken werden geladen op de door de fabrikant aanbevolen clusterdichtheid. Laagwaardige leesopdrachten met ambigue basissen, onvoldoende lengte of een gemiddelde kwaliteitsscore onder Q20 werden verwijderd vóór de downstream analyse.

Ruwe sequencing-reads werden verwerkt met QIIME 2 versie 2019.4²⁰. Kort gezegd werden gepaarde eindlezingen gedemultiplexeerd, kwaliteitsgefilterd, gedenoised, samengevoegd en chimera-gefilterd met DADA2 met standaardparameters tenzij anders vermeld. Varianten van niet-singleton ampliconsequenties (ASV's) werden behouden voor downstream analyse. De taxonomische toewijzing werd uitgevoerd met behulp van de Greengenes-database versie 13_8, geïmplementeerd in QIIME2²¹. Gezien de inherente resolutiebeperkingen van 16S rRNA-gensequencing, vooral bij gebruik van de Greengenes-database, werden taxonomische annotaties uitsluitend op geslachtsniveau geïnterpreteerd. Classificatie op soortniveau werd niet als betrouwbaar beschouwd en werd daarom niet gebruikt in downstream-analyses, statistische vergelijkingen of biologische interpretaties. Alle microbiële kenmerken werden vóór visualisatie en analyse tot het geslachtsniveau ingeklapt.

Alpha-diversiteitsmetrieken (Chao1, Waargenomen soorten, Shannon, Simpson, Faith's PD en Pielou's gelijkheid) werden gebruikt. Statistische vergelijkingen van alfadiversiteit tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van geschikte niet-parametrische tests (bijv. Kruskal–Wallis-test). De Jaccard-afstand en de Bray-Curtis-verschillen werden gebruikt als metrieken voor bèta-diversiteit. Principal Coordinate Analysis (PCoA) plots, niet-metrische multidimensionale schaal (NMDS) en lineaire discriminant analysis effectgrootte (LEfSe) werden gebruikt om veranderingen in microbiomegemeenschappen te illustreren, met een LDA-score drempel van 2,0. Permutatieve multivariate variantieanalyse (PERMANOVA) werd gebruikt om de statistische significantie in bètadiversiteit te beoordelen. Datavisualisatie en statistische analyses werden uitgevoerd met het GenesCloud-platform (https://www.genescloud.cn).

Microbiële functionele profielen werden afgeleid uit 16S rRNA-sequencinggegevens in plaats van direct gemeten met shotgun metagenomic of transcriptomic sequencing. Op basis van de genormaliseerde pathway of functionele groepsabundantietabel werden voorspelde functionele eenheden in kaart gebracht naar veelgebruikte databases, waaronder KEGG, MetaCyc en COG. De abundantie van de KEGG-routes werd samengevat volgens de hiërarchische functionele categorieën, waarbij niveau 2-padclassificaties werden gebruikt voor downstream vergelijkingen. De gemiddelde abundantie van elke padcategorie werd berekend met R-software.

Ongerichte metabolomics-analyse van levermonsters

Leverweefsels werden direct na de bevestiging van overlijden snel verwijderd, direct ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij −80 °C vóór de analyse. Ongeveer 50 mg bevroren leverweefsel werd gehomogeniseerd in ijskoude methanol: water (4:1, v/v) aangevuld met interne standaarden. De verhouding tussen weefsel en extractie oplosmiddel was 1:10 (w/v). Monsters werden 1 minuut vortex, 10 minuten op ijs gesoniceerd, en vervolgens 30 minuten geïncubeerd bij −20 °C om de eiwitprecipitatie te verbeteren. De homogenaten werden grondig gemengd, onderworpen aan sonicatie op ijs en gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. De supernatanten werden zorgvuldig verzameld, verdampt onder een milde stikstofstroom en gereconstitueerd in 50% methanol voor latere analyse.

Kwaliteitscontrolemonsters (QC) werden gegenereerd door gelijke volumes van elk monster te bundelen en werden gedurende de run met tussenpozen geanalyseerd om de analytische stabiliteit en reproduceerbaarheid te evalueren. Ongerichte metabolomics-analyse werd uitgevoerd met een ultra-high-performance vloeistofchromatografiesysteem gekoppeld aan hoogresolutie massaspectrometrie, beheerd door een commerciële dienstverlener. Metabolieten werden gescheiden op een omgekeerde fase C18-kolom met behulp van een binair oplosmiddelsysteem bestaande uit water met 0,1% mierenzuur en acetonitril met 0,1% mierenzuur. Het injectievolume was 2 μL, de kolomtemperatuur bleef 40 °C en de debiet werd ingesteld op 0,30 mL/min. Er werd een gradiënt-elusieprogramma gebruikt om brede metabolietseparatie te bereiken. Massaspectrometrische detectie werd uitgevoerd in zowel positieve als negatieve elektrospray-ionisatiemodi over een m/z-bereik van 70–1.000 om een brede metabolietdekking te bereiken. De ionensproeispanning werd ingesteld op 3,5 kV in positieve modus en −2,5 kV in negatieve modus. De capillaire temperatuur bleef op 320 °C en de gegevens werden verkregen in full-scan MS-modus met data-afhankelijke MS/MS-acquisitie voor metabolietannotatie. Ruwe data werden verwerkt met speciale metabolomics-software (MassLynx v4.1) voor feature-detectie, uitlijning en normalisatie. Metabolietidentificatie werd uitgevoerd op basis van nauwkeurige massa, retentietijd en MS/MS-fragmentatiepatronen door vergelijking met openbare databases, waaronder de Human Metabolome Database (HMDB) en de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), waar van toepassing.

Multivariate en padanalyse

Verwerkte metabolomics-gegevens werden onderworpen aan multivariate statistische analyses, waaronder principal component analysis (PCA) en partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), om metabole verschillen tussen experimentele groepen te visualiseren. Differentiële metabolieten werden geïdentificeerd op basis van een combinatie van variabele belang in projectie (VIP) scores (>1,0) en statistische significantie (p < 0,05). Geïdentificeerde metabolieten werden verder in kaart gebracht naar metabole routes met behulp van KEGG-routeverrijkingsanalyse om biologische processen te verduidelijken die geassocieerd zijn met DHA-rijke microalgenolie-supplementatie.

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05. Verrijkingsanalyse van levermetabolieten werd uitgevoerd met R (versie 4.4.1). Paargewijze associaties tussen microbiële genera en levermetabolieten werden geanalyseerd met behulp van Spearman-rangcorrelaties. Alleen significante correlaties (valse ontdekkingspercentage, FDR < 0,05) met |ρ| ≥ 0,6 werden opgenomen in de integratieve netwerkanalyses. De verwerking van microbioom- en metabolomicsgegevens werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven, inclusief het gebruik van het GenesCloud-platform en kwaliteitscontroleprocedures.

Resultaten

DHA-rijke microalgenolie verbetert het lipidmetabolisme, leverschade en leveroxidatieve stress bij door HFD geïnduceerde MASLD-muizen

Om het effect van voedingssupplementen op glucose- en lipidehomeostase te evalueren, werden biochemische parameters beoordeeld in vijf groepen: regulier voedsel (RC), vetrijk dieet (HFD), DHA-rijke microalgenolie aangevuld met microalgenolie, probiotica-supplementeerde en gecombineerde DHA-rijke microalgenolie +...

Discussie

In de afgelopen jaren hebben verschillende studies veranderingen in het microbioom onderzocht die verband houden met MASLD. De meeste van deze studies richten zich echter op het vergelijken van gezonde individuen met MASLD-patiënten of het onderzoeken van verschillende steatose-graden²⁴. Er is dan ook nog steeds beperkt bewijs dat de specifieke veranderingen in darmmicrobiota die samenhangen met leverfibrose bij MASLD beschrijft, hoewel fibrose de belangrijkste fa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2x PCR Master Mix	Takara Bio Inc., Japan	RR902A	Gebazig voor 16S rRNA PCR-amplificatie
Acetonitrile	Merck, Germany	100030	Solvent gebruikt voor UHPLC mobiele fase
Anesthesie verdamper	RWD Life Science	R580	Wordt gebruikt om isofluraangestelde muizen toe te dienen
Automatische biochemische analyzer	Jian Cheng Biological Engineering Institute, Nanjing, China	A110-1 & A111-1	Meet serumparameters (glucose, TC, TG, LDL-c, HDL-c, AST, ALT) en leverlipideniveaus
Bacillus coagulans (GIM 1.645)	Guangdong Microbial Culture Collection Center, China	GIM 1.645	Componentenstrain van probioticumformulering
Carboxymethylcellulose natrium (CMC-Na)	Sigma-Aldrich, USA	C4888	Gebruikt als emulgatorcomponent voor DHA-rijk microalgen olie preparaat
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Construction Ltd.	A007-1-1	Detecteert CAT-activiteit (een indicator van antioxidantcapaciteit) in leverweefsel
DADA2 softwarepakket	DADA2 Development Team	Opgenomen in QIIME 2 v2019.4	Gebruikt voor denoising en chimera filtering van sequencing reads
DHA-rijk microalgen olie (Schizochytrium sp.-afgeleid)	-	-	Rijk aan docosahexaeenzuur (DHA); dagelijks toegediend door middel van slangvoeding met 10µL/g als experimentele interventie
Experimentele dieren (Mannelijke C57BL/6J muizen)	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	-	6 weken oud, n = 4 per groep; gebruikt voor het opzetten van het MASLD-model via HFD-voeding
Forminezuur	Sigma-Aldrich, USA	F0507	Mobile faseadditief voor metabolomics analyse
Greengenes database	Greengenes	Version 13_8	Gebruikt voor microbiële taxonomische toewijzing
High-Fat Diet (HFD)	Research Diets Inc., USA	D12492	Bestaande uit 20% koolhydraten, 20% eiwit, 60% vet (kcal); gevoerd gedurende 8 weken om MASLD te induceren
High-resolutie massaspectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA	Q Exactive Orbitrap	Gebruikt voor metaboliet detectie in positieve en negatieve ionmodi
Human Metabolome Database (HMDB)	University of Alberta, Canada	2024 release	Publieke metaboliet annotatiedatbestand
Illumina MiSeq platform	Illumina, Inc., USA	MiSeq System	Gebruikt voor paired-end 2 × 250 bp sequencing
Isofluraan	Merck, Germany	PHR2874	Gebruikt voor inhalatieanesthesie bij muizen
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)	Kanehisa Laboratories, Japan	Version 2023	Database gebruikt voor pathway verrijking en metaboliet annotaties
Lactobacillus acidophilus (KDB-03)	Shandong Academy of Agricultural Sciences, China	-	Componentenstrain van probioticumformulering
Lactobacillus casei (KDB-LC)	Shandong Academy of Agricultural Sciences, China	-	Componentenstrain van probioticumformulering
Lactobacillus plantarum (DY-1)	Shandong Academy of Agricultural Sciences, China	-	Componentenstrain van probioticumformulering
Vloeibare stikstof	Air Liquide	-	Gebruikt voor snel bevriezen en conservering van fecale en levermonsters
Malondialdehyde (MDA) assay kit	Nanjing Construction Ltd.	A003-1	Detecteert MDA (een marker van lipideperoxidatie/oxidatieve schade) in leverweefsel
MassLynx software	Waters Corporation, USA	Version 4.1	Gebruikt voor metabolomics ruwe data verwerking, feature extractie, en normalisatie
Methanol	Merck, Germany	106035	Solvent gebruikt voor metaboliet extractie
Microbioom data analyse platform	Genescloud	V1	Online platform: https://www.genescloud.cn/home; gebruikt voor PCoA, NMDS, LEfSe en andere microbioom visualisatie analyses
OMEGA Soil DNA Kit	Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)	(M5635-02)	DNA Isolatie
OTUs referentiesequenties	Genescloud		Referentie uit McDonald et al. 2012; gebruikt voor taxonomie toewijzing van amplicon sequentie varianten (ASVs)
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	10010023	Gebruikt voor bacteriële pellet resuspendering
Primer 341F/806R	Tsingke Biotechnology Co., Ltd., China	-	Gebruikt voor amplificatie van de 16S rRNA V3–V4 regio. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′
Probiotica	-	-	Specifieke stammen niet expliciet vermeld; gebruikt als vergelijkende interventie (verbetert voornamelijk glucose homeostase)
QIIME 2 software	-	2019.4	Gebruikt voor microbioom bioinformatica analyse (ASV verwerking, alfa/beta diversiteit berekening)
R software	-	4.4.1	Gebruikt voor lever metaboliet verrijkingsanalyse en Spearman correlatieanalyse van microbiële-metaboliet associaties
Gekoelde centrifuge	Eppendorf, Germany	5810R	Gebruikt voor serum en metabolomics monster centrifugatie
Reverse-phase C18 kolom	Waters Corporation, USA	186002350	Gebruikt voor chromatografische scheiding van metabolieten
Zoutenoplossing	Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical	2211112304	Dagelijks toegediend door middel van slangvoeding aan de controlegroep (vs. microalgen olie behandeling)
Standaard voerdieet	Keao Xieli Feed Ltd., China	1016706714625204224	Bestaande uit 70% koolhydraten, 20% eiwit, 10% vet (kcal); gevoerd aan de controle (RC) groep
Steriele voedingsnaald	Instech Laboratories, USA	FTP-20-38	Gebru