Protocol voor het differentiëren van pluripotente stamcellen tot primordiale kiemcelachtige cellen

Samenvatting

Een stapsgewijze richtlijn om primordiale kiemcelachtige cellen te genereren uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen op een robuuste manier met behulp van een 2D-monolaag-gebaseerde methode met basale membraanextract-overlay.

Samenvatting

Het gebruik van humane pluripotente stamceldifferentiatie in vitro heeft het begrip van specificatiegebeurtenissen van afstammingslijnen die plaatsvinden tijdens de vroege ontwikkeling in vivo aanzienlijk verbreed, een periode die uiterst moeilijk te onderzoeken is. Een van de eerste embryonale lijnen die in het menselijk embryo zijn gespecificeerd, is de kiemcellijn, gekenmerkt door de inductie van de primordiale kiemcellen (PGC's). De PGC's zijn de enige stichterpopulatie van de gameten later in hun leven, en hun specificatie is een cruciale eerste stap richting de vruchtbaarheid van het organisme. Hier wordt een robuust protocol beschreven voor het genereren van PGC-achtige cellen (PGCLC's) uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), beginnend met de initiële evaluatie van de pluripotente toestand en cellulaire kenmerken van de hiPSC's om effectieve PGCLC-differentiatie te waarborgen. Hiervoor worden de effecten van verschillende celdichtheden, plaatcoatings en hiPSC's die worden gebruikt voor PGCLC-differentiatie besproken. Tot slot wordt een workflow voor karakterisering en kwantificering van hPGCLC's geboden, met behulp van immunofluorescentie en flowcytometrie. Het differentiatieprotocol richt zich op omstandigheden die gemakkelijk te vestigen en te testen zijn in de meeste laboratoria en indien nodig kunnen worden aangepast. Bovendien is dit protocol snel, waardoor kan worden bepaald of hiPSC's geschikt zijn voor PGCLC-differentiatie. Het protocol heeft als doel consistentie en compatibiliteit in hPGCLC-uitkomsten over verschillende hiPSC-lijnen en kweekplatforms te bevorderen, zodat robuuste opbrengsten worden gegarandeerd die betrouwbare karakterisering ondersteunen en verdere optimalisatie van downstream differentiatiestappen richting succesvolle in vitro gametogenese bij mensen.

Inleiding

De ontwikkeling van de menselijke kiembranaal is een sterk gecoördineerd proces dat vroeg in de embryonale ontwikkeling begint en begint met de specificatie van primordiale kiemcellen (PGC's), de populatie die uiteindelijk leidt tot oocyten en zaadcellen¹. In vivo vindt PGC-specificatie kort na implantatie ^2,3 plaats als reactie op inductieve signalen van naburige cellen ^4,5. De ontwikkeling van PGC's is uitgebreid onderzocht bij knaagdieren, met name via genetische studies die de betrokkenheid van signaalroutes zoals BMP, WNT en TGFβ 6,7,8,9 hebben aangetoond. Na specificatie ondergaan de PGC's epigenetische herprogrammering, gekenmerkt door genoombrede DNA-demethylatie en chromatine-remodellering, om later (geslachtsspecifieke) kiemlijnidentiteit 10,11,12,13,14 vast te stellen.

Bij zoogdieren wordt PGC-specificatie gedreven door gecoördineerde overpraat tussen signaalpaden, en sommige aspecten zijn evolutionair behouden bij mensen, niet-menselijke primaten, varkens en muizen, waaronder de betrokkenheid van pluripotentiefactoren zoals POU5F1 en NANOG 9,15,16,17,18 . Ondanks gedeelde kenmerken beperken soortspecifieke verschillen in PGC-differentiatiemechanismen en genregulerende netwerken de directe vertaling van diermodellen naar mensen 9,19,20,21.

Om gametogenese bij mensen te begrijpen, zijn studies met menselijk materiaal noodzakelijk, maar ze blijven uitdagend vanwege beperkte toegang tot vroege menselijke embryo's. Voortdurende vooruitgang in protocollen die de in vitro differentiatie van menselijke primordiale kiemcelachtige cellen (hPGCLC's) uit menselijke pluripotente stamcellen, zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), mogelijk maken, hebben de afhankelijkheid van menselijk gonadaal weefsel verminderd en tegelijkertijd upscaling en genetische studies mogelijk gemaakt^18,22. De meeste gevestigde strategieën voor hPGCLC-differentiatie zijn gebaseerd op driedimensionale (3D) aggregaten of embryoide lichamen¹⁸. Met behulp van deze platforms hebben meerdere studies aangetoond dat hPGCLC's belangrijke epigenetische kenmerken van vroege menselijke PGC's recapituleren, waaronder kiemlijntranscriptieprogramma's^23,24 en genoom-brede DNA-methylatie-herprogrammering²⁵. Samen hebben deze in vitro-platforms aanzienlijk geavanceerde kennis van de menselijke PGC-biologie, inclusief lineage commitment en epigenetische reset. Echter, aggregatie-gebaseerde hPGCLC-differentiatieprotocollen blijven uitdagend omdat ze tijdrovend zijn, en de totale opbrengst van hPGCLC's voor robuuste epigenetische karakterisering, verdere differentiatietests of gebruik in hoge-doorvoerde experimentele toepassingen blijft laag.

Onlangs bleek een 2D-monolaag-gebaseerde feeder-vrije methode met verdund basalmembraanextract (BMEx) in combinatie met lage niveaus van BMP4 om hiPSC's te differentiëren in hPGCLC's relatief eenvoudig op te schalen in weefselkweekplaten en bereikte hoge efficiënties (~55%) binnen een kort differentiatievenster (5 dagen)²⁶. In vergelijking met andere 2D-systemen die een tussenliggende Activin A-primingstap vereisten vóór inductie en hogere BMP4-concentraties gebruikten (40–50 ng/mL)^27,28, vereiste deze BMEx-benadering geen pre-inductiestap en gebruikte lagere BMP4-niveaus (10 ng/mL), terwijl vergelijkbare efficiëntie en verbeterde schaalbaarheid behouden bleven.

Hier wordt een gedetailleerde, stapsgewijze gids gegeven voor het 2D hPGCLC BMEx-differentiatieprotocol, te beginnen met de initiële evaluatie van het hiPSC-onderhoud, inclusief pluripotentie en cellulaire kenmerken, gevolgd door het testen van de effecten van verschillende hiPSC-plaatcoatings en celdichtheden op hPGCLC-differentiatie. Ook wordt de downstream karakterisering door flowcytometrieanalyse en immunofluorescentie beschreven. Kritieke afhandelingspunten en probleemoplossingsrichtlijnen om laboratoriumafwijkingen te verminderen, worden aangeboden, waardoor onderzoekers hPGCLC-differentiatie consistent kunnen reproduceren in dit 2D-formaat.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen en voorschriften van het Universitair Medisch Centrum Leiden (LUMC), de LUMC Biobank & Biomaterialen (TCBio) en het LUMC Leiden hiPSC Center (onder BB24.037). Alle materialen en besturingsmannelijke (XY) hiPSC-lijnen (M54 en M199) die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel. Alle weefselkweekprocedures werden uitgevoerd in een speciale Biosafety Level 2 weefselkweekruimte, uitgerust met een bevochtigde normoxische broedmachine (37 °C, 5% CO₂), een multifunctionele benchtop centrifuge (swing-bucket rotor) en een klasse II bioveiligheidskast met een stereomicroscoop.

VOORZICHTIG: Niet alle hiPSC-lijnen kunnen onderscheiden in hPGCLC's^26,29. Als echter andere hiPSC's werden gebruikt voor PGCLC-differentiatie en PGCLC's werden waargenomen, zal de hier beschreven methode (Figuur 1A) het mogelijk maken om hPGCLC-productie op te schalen.

1. Coatings van weefselkweekplaten voor hiPSC-kweek

Dit protocol beschrijft het coaten van weefselkweekplaten met zowel verdund BMEx als vitronectine.

1. Basale membraanextract (BMEx) coating
   1. Ontdooi een aliquot van BMEx op ijs. Dit kan Geltrex, Cultrex of Matrigel zijn.
   2. Verdun het aliquot van basaal membraanextract in koud DMEM/F12 tot een uiteindelijke concentratie van 1% (v/v) en susse voorzichtig op.
   3. Bedek het gewenste aantal putten van een 6-put plaat met 1 mL van de verdunde BMEx per put.
   4. Incubeer de gecoate plaat minstens 30 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Gecoate platen kunnen tot 1 week worden bewaard op 2–8 °C. Bij gebruik van gecoate platen die bij 2–8 °C worden bewaard, incubeer de plaat minstens 10 minuten bij 37 °C voordat je hem verder gebruikt.
2. Vitronectinecoating
   1. Ontdooi een aliquot vitronectine op kamertemperatuur (RT) gedurende 10–15 minuten.
   2. Verdun vitronectine tot een eindconcentratie van 5 μg/mL in DPBS zonder calcium en magnesium (DPBS -/-) en sussen voorzichtig.
   3. Bedek het aantal gewenste putten van een 6-put plaat met 1 mL verdund vitronectine per put.
   4. Incubeer de gecoate 6-put plaat 1 uur bij RT.

2. Goedkeuring voor het behoud van hiPSC's

1. Bereid kweekmedium voor: serumvrij celkweekmedium mTeSR Plus aangevuld met mycoplasma besmettingspreventieoplossing (MycoZap (1:1000)).
2. Aspireer het kweekmedium uit de cellen die klaar zijn om te worden doorgevoerd.
3. Voeg 0,5 mL humane PSC-selectie- en passagingmiddel (ReLeSR) toe aan elke put en aspiraat dit binnen 1 minuut. Zorg ervoor dat er een heel dunne laag op de cellen blijft.
4. Incubeer de cellen 6 minuten bij 37 °C.
5. Tik een paar keer op de zijkanten van de 6-well plaat.
6. Verwijder de cellen voorzichtig met 1 mL kweekmedium door op en neer te pipetteren met een p1000-pipet, en controleer regelmatig de grootte van koloniefragmenten om hun grootte tussen 50–200 μm te houden.
7. Neem de voorgecoate platen met 6 putjes en verwijder de coatingoplossing (Stap 1).
8. Voeg 2 mL kweekmedium toe aan elke put.
9. Breng het kweekmedium met de losgekoppelde hiPSC-koloniefragmenten over naar de nieuwe put in de gewenste verhouding.
   OPMERKING: De ideale verhouding voor het splitsen van hiPSC-koloniefragmenten is 1:6-1:50, waardoor elke 4–7 dagen doorgegeven kan worden.
10. Plaats de celkweekplaat met de doorgevoerde hiPSC-koloniefragmenten in een bevochtigde normoxische broedmachine (37 °C, 5%_CO2).
11. Ververs het kweekmedium om de dag met 2 ml kweekmedium totdat de hiPSC's weer klaar zijn om te worden doorgevoerd.
    OPMERKING: Voeg 4 mL kweekmedium toe in plaats van 2 ml aan elke 6-put om te voorkomen dat je in het weekend hoeft te verversen.
    VOORZICHTIG: Geef geen hiPSC's wanneer de confluentie te laag is, en gooi de kweek weg wanneer de confluentie te hoog is om een gezonde hiPSC-kweek te behouden en spontane differentiatie te voorkomen.

3. hPGCLC-differentiatie

1. Voorbereiding voorafgaand aan hPGCLC-differentiatie (Dag 0).
   1. Vernieuw het kweekmedium van de hiPSC's 1 uur voordat je begint met hPGCLC-differentiatie.
   2. Bereid de coatingoplossing voor: 1% BMEx-oplossing verdund v/v in koude DMEM/F12.
   3. Bedek het gewenste aantal putten van een 12-put plaat met 0,5 mL coatingoplossing.
   4. Incubeer de gecoate plaat minstens 30 minuten op 37 °C voordat je begint met differentiëren.
   5. Bereid het plateringsmedium voor: 2% (v/v) BMEx-oplossing in koud kweekmedium en vul dit aan met een herstelmedium na ontdooi (RevitaCell) (1:100).
      VOORZICHTIG: Houd het platingmedium op ijs tijdens de voorbereiding en het aanbrengen van hiPSC's.
2. hiPSCs plating voor hPGCLC-differentiatie (dag 0).
   1. Verwijder het kweekmedium uit de 6-put met de hiPSC's om te gebruiken voor hPGCLC-differentiatie. Begin met hoogwaardige hiPSC's bij 50–80% confluentie, zonder tekenen van spontane differentiatie.
   2. Voeg per put 1 ml trypsine-oplossing (TrypLE) toe.
   3. Incubeer hiPSC's 5 minuten bij 37 °C.
   4. Maak een single-cell suspension door de kolonies van hiPSC voorzichtig 2–3 keer opnieuw te suspenderen met een p1000-pipet.
   5. Controleer onder een omgekeerde microscoop of er een single-cell suspension is verkregen. Zo niet, stop dan de kolonies van de hiPSC nog eens 1–2 keer met een p1000-pipet.
   6. Breng de hiPSC-celsuspensie over naar een 15 mL buis.
   7. Voeg 4 mL DMEM-F12 medium toe aan de 15 mL buis.
   8. Centrifugeer de hiPSC-celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten.
   9. Aspireer het supernatant en suspendeer de hiPSC-cellen zorgvuldig opnieuw in een platingmedium van 0,5–1,0 mL.
   10. Tel het aantal hiPSC's met een celteller of hemocytometer en bereken het aantal hiPSC's dat per put nodig is voor de hPGCLC-differentiatie.
       OPMERKING: Als uitgangspunt kan een platingdichtheid van 40–80K cellen/cm² worden gebruikt. Voor elke cellijn en bij elk doorgangsnummer wordt echter optimalisatie van de platingdichtheid aanbevolen om een optimale opbrengst te bereiken. Hier werden hiPSC's geplateerd met een platingdichtheid van 10K tot 100K cellen/cm².
   11. Suspensie zorgvuldig het vereiste aantal hiPSC's in het juiste volume van het platingmedium (1 mL per put van een 12-put plaat), en zorg ervoor dat een homogene celsuspensie wordt verkregen met een p1000-pipet.
   12. Haal de gecoate 12-wells plaat uit de incubator en verwijder de coatingoplossing.
   13. Voeg 1 mL celsuspensie toe aan elke put van een 12-put plaat.
   14. Schud de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdeeld zijn.
   15. Plaats de 12-putplaat in een bevochtigde, normoxische broedmachine (37 °C, 5%_CO2) gedurende 16–24 uur.
3. hPGCLC-differentiatie (Dag 1–2)
   1. Bereid RB27 basaal medium: geavanceerde RPMI160 met B-27 (1:100), 1X aminozuursubstitutie (Glutamax), 1X MEM niet-essentiële aminozuren en mycoplasma besmettingspreventieoplossing (1:1000).
   2. Bereid differentiëringsmedium voor: 2% (v/v) BMEx-oplossing in een koud RB27 basaal medium en voeg BMP4 toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL. Het basale membraanextract is nodig om lumenogenese te induceren en PGCLC-specificatie in vivo te activeren.
      VOORZICHTIG: Houd het differentiatiemedium op ijs of op 4 °C. Het differentiatiemedium kan worden voorbereid voor dag 1 en 2 van het differentiatieprotocol.
   3. Op dag 1 (binnen 16–24 uur na het opmaken van hiPSC's) haal je de plaat uit de broedmachine en verwijder je het platingmedium.
   4. Was de wells door 0,5 mL RB27 basaal medium per put toe te voegen.
   5. Aspireer het RB27 basale medium en voeg per put 1 mL differentiatiemedium toe.
   6. Plaats de plaat met de cellen terug in de bevochtigde normoxische broedmachine (37 °C, 5% CO₂).
   7. Op dag 2 van de differentiatie vernieuw je de cellen met 1 mL differentiatiemedium per put.
4. hPGCLC-differentiatie (Dag 3–5)
   1. Bereid switchmedium voor: RB27 basaal medium aangevuld met BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) en EGF (50 ng/mL). Switch medium weerspiegelt de in vivo verschuiving van hPGC-specificatie naar survival en proliferatie. BMEx wordt weggelaten omdat lumenogenese niet langer nodig is.
   2. Op dag 3 en dag 4 ververs je elke put met 1 mL switch medium.
   3. Op dag 5 van differentiatie kunnen de hPGCLC's worden gekarakteriseerd met behulp van immunofluorescentie of flowcytometrie.

4. Karakterisering van hPGCLC's door immunofluorescentie en flowcytometrie

1. Karakterisering door immunofluorescentie.
   1. Maak permeabilisatieoplossing: 0,3% Triton X-100 verdund in PBS.
   2. Bereid wasoplossing voor: 0,05% Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Bereid blokkeringsoplossing: 1% runderenserumalbumine (BSA) in PBST.
   4. Verwijder het switchmedium uit de putten die worden gebruikt voor hPGCLC-differentiatie.
   5. Was de cellen met 1 ml per put DPBS (-/-).
   6. Fixeer cellen met 1 ml per put, 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
   7. Was de cellen 3 keer gedurende 5 minuten met PBS, waarbij je 1 ml per put gebruikt.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen platen worden opgeslagen bij 4 °C voordat immunofluorescentie begint.
   8. Permeabiliseer cellen met permeabilisatieoplossing gedurende 15 minuten bij RT, waarbij 1 mL per put wordt gebruikt.
   9. Was cellen 3 keer gedurende 5 minuten met wasoplossing, gebruik 1 ml per put.
   10. Blok cellen met blokkeringsoplossing voor 1 uur bij RT, gebruik 1 mL per put.
   11. Bereid primaire antilichaamoplossing voor: verdun primaire antistoffen van belang in blokkerende oplossing.
       OPMERKING: Hier werden de volgende twee antilichaamcombinaties voor PGC-markers gebruikt: geitenanti-SOX17 en konijn anti-TFAP2C, en geitenanti-SOX17 en muis anti-POU5F1 (Materiaaltabel).
   12. Verwijder de blokkerende oplossing, voeg 0,4 mL primaire antistofoplossing per put toe en incubeer een nacht bij 4 °C.
       OPMERKING: Het is belangrijk om negatieve controles op te nemen om de bindingen van niet-specifieke antistoffen te beoordelen. Hiervoor bewaar je één put een nacht in blokkerende oplossing, waarbij je de primaire antilichamen weglaat, maar vervolgens die put kleurt met de secundaire antistofoplossing.
   13. De volgende dag verwijder je de primaire antistofoplossing en was je de cellen 3 keer gedurende 5 minuten met PBST.
   14. Bereid een secundaire antilichaamoplossing voor: verdun de secundaire antilichamen van belang (Table of Materials) en DAPI (1:500) in blokkerende oplossing.
       OPMERKING: De secundaire antistofoplossing is lichtgevoelig en moet in het donker worden bewaard.
   15. Verwijder PBST en voeg 0,4 mL secundaire antistofoplossing per put toe gedurende 1 uur bij RT in het donker.
   16. Was de cellen 3 keer gedurende 5 minuten met PBS, waarbij je 1 ml per put gebruikt.
   17. Doe beeldvorming van de cellen (20x objectieflens).
       OPMERKING: Immunofluorescentiebeelden werden gemaakt met een 20x objectief op de Airyscan-microscoop, terwijl helderveldbeelden werden gemaakt met een 4x en een 10x objectief op de EVOS-microscoop.
2. Karakterisering door flowcytometrie
   1. Bereid FACS-buffer voor: 0,5% BSA in DPBS (-/-)
   2. Verwijder het switchmedium uit de putten met de hPGCLC's.
   3. Was cellen met 1 mL DPBS (-/-).
   4. Voeg 0,5 ml voorverwarmde Accutase per put toe en incubeer 15 minuten bij 37 °C. Voor dissociatie heeft Accutase de voorkeur boven trypsine-oplossing omdat de hPGCLC's zeer gevoelig zijn voor dissociatie.
   5. Maak een single-cel suspensie door de cellen zorgvuldig 2–3 keer opnieuw te suspenderen met een p1000.
   6. Controleer onder een omgekeerde microscoop of er een single-cell suspension is verkregen. Zo niet, suspensieer de cellen nog eens 1–2 keer met een p1000-pipet.
   7. Filter de celsuspensie door een 40 μm zeef in een 15 mL buis.
   8. Was het 40 μm zeef met 5 mL FACS-buffer.
   9. Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 5 minuten.
   10. Verwijder het supernatant.
   11. Sussie de celpellet opnieuw in een 0,3 mL FACS-buffer in een 1,5 mL buis.
       OPMERKING: Het is optioneel om cellen te tellen met een celteller of een hemocytometer. Als de cellen worden geteld, kun je ongeveer 1 miljoen cellen per put van een 12-wellplaat verwachten.
   12. Bereid adequate controlemonsters voor voor flowcytometrie (ongekleurde en enkelkleurige controles). Hiervoor wordt 15–30 μL van de celsuspensie overgebracht in 1,5 mL buizen en gevuld tot 100 μL met FACS-buffer.
       OPMERKING: Voor deze studie werden 3 enkelkleurige tests gemaakt: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) en 7AAD (1:200). De oplossingen die de geconjugeerde antilichamen en 7AAD bevatten, zijn lichtgevoelig en moeten in het donker worden bewaard.
   13. Voeg de geconjugeerde antilichamen van belang direct toe aan de celsuspensie om voldoende verdunning te bereiken. Hier werden de volgende geconjugeerde antilichamen voor PGC-markers samen gebruikt: EPCAM-PEcy7 (1:200) en ITGA6-BV421 (1:200) (Materiaaltabel).
   14. Breng de cellen 30 minuten op ijs in het donker met de geconjugeerde antilichamen.
   15. Voeg 1 mL FACS-buffer toe aan de monsters, ongekleurde controle en enkele antistofcontroles, en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten.
   16. Verwijder het supernatant.
   17. Sussen de monsters opnieuw in 0,5 mL, en de controlemonsters in 0,2 mL, van een FACS-buffer met 1 mM EDTA. Dit voorkomt dat cellen samenklonteren.
   18. Voeg de monsters en bedieningselementen toe aan een 5 mL FACS-buis met een cel-zeefkap en haal ze vervolgens door de zef.
   19. Voeg enkele minuten voor de meting direct 7AAD aan elk monster toe voordat je in de flowcytometer meet.
   20. Meet monsters met een flowcytometer. Hier werd de fluorescentie-gebaseerde celanalyzer gebruikt om de monsters te meten, werden gegevens verzameld met FACSDiva-software (v9.0), en FlowJo-software (v10.10.0) werd gebruikt om de data te analyseren.
   21. Gebruik de controlemonsters (ongekleurde en single-antibody controles) om de gatingstrategie op te zetten en indien nodig compensatie uit te voeren.
   22. Draai de monsters in vortex voordat je ze in de machine stopt.
   23. Haal de celpopulatie uit alle gebeurtenissen door eerst een poort in te stellen op basis van oppervlakte [forward scatter-area (FSC-A) en side scatter-area (SSC-A)].
   24. Uit deze celpopulatie extraheren we enkele cellen op basis van grootte [FSC-breedte (FSC-W) en FSC-hoogte (FSC-H)] en granulariteit [SSC-W en SSC-H].
   25. Sluit dode cellen uit van verdere analyse door een poort in te stellen voor 7AAD-negatieve cellen.
   26. Gebruik het monster om te controleren of de poorten correct zijn ingesteld en pas ze indien nodig aan.
   27. Analyseer de markers van belang van deze levende-celpopulatie. Hier correspondeerden de gegated cells die positief waren voor zowel EPCAM als ITGA6 met hPGCLC's.

Resultaten

De kwaliteit en stabiele toestand van de hiPSC's zijn belangrijk voor verdere differentiatie
hiPSC's werden in 6-putplaten onderhouden voor ten minste 3 passages (in de verschillende coatings) voorafgaand aan differentiatie-experimenten en analyses. hiPSC's werden doorgevoerd wanneer celkolonies een confluentie van 70–80% bereikten (Figuur 1B), wat ook de optimale hiPSC-confluentie is om hPGCLC-differentiatie te initiëren. Gezonde hiPSC-culturen vertoonden een uniforme koloniemorfologie zonder donkere of gedifferentieerde gebieden, zichtbaar in heldere veldbeelden (Figuur 1B). De kwaliteit van de hiPSC's werd echter beïnvloed wanneer celkolonies niet op hun optimale confluentie werden gehouden of tekenen van differentiatie vertoonden (Figuur 1B). Bij lage confluentie bleef hiPSC zich vermenigvuldigen en was er meer tijd nodig voor kolonievorming totdat de confluency geschikt was voor passaging of differentiatie-experimenten. Bij hoge confluentie groeiden hiPSC's bovenop elkaar, terwijl er onderscheiden regio's verschenen. De pluripotentietoestand van de hiPSC's werd bevestigd door expressie van SOX2 of POU5F1, beide transcriptiefactoren die essentieel zijn voor het behouden van pluripotentie en zelfvernieuwing in hiPSCs³⁰, en het belangrijkste: SOX2 wordt niet tot expressie gebracht door hPGCLCs³¹. Phalloidine-kleuring werd gebruikt om de structuur van het cytoskelet en de morfologie van de kolonie te beoordelen, wat de kwaliteit van hiPSC's aangeeft. Let op dat verschillen in celmorfologie samenhangen met de reductie van SOX2 of POU5F1 (Figuur 1B).

Effect van het hiPSC-onderhoudssubstraat op hPGCLC-differentiatie
Om te beoordelen of het behouden van hiPSC's op verschillende coatingsubstraten invloed had op differentiatie naar hPGCLC's, werden de hiPSC's op verschillende substraten gekweekt (Geltrex, Matrigel, Cultrex en vitronectine) (Figuur 2). Op alle substraten vertoonden hiPSC's robuuste en uniforme nucleaire SOX2- of POU5F1-niveaus, wat wijst op hun pluripotente toestand. hiPSC-kolonies die op Geltrex, Matrigel en Cultrex werden gehouden, hadden vergelijkbare morfologie, inclusief goed gedefinieerde koloniegrenzen en onregelmatige algemene kolonievormen, vergeleken met de ronde kolonies op vitronectine (Figuur 2). hiPSC's die een confluentie van 70–80% bereikten, werden geplateerd met een dichtheid van 40K cellen/^cm2 en gedifferentieerd naar hPGCLC's op Geltrex²⁶. Op dag 5 toonden brightfield-beelden karakteristieke hPGCLC-kolonies onder alle omstandigheden (Figuur 3). Bovendien werden drievoudig positieve SOX17/TFAP2C/PDPN of dubbel-positieve SOX17/POUF51 hPGCLC's in alle omstandigheden geïdentificeerd (Figuur 3). Dit suggereerde dat het differentiatieprotocol gebruikt kon worden met hiPSC's die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt.

Effect van de initiële hiPSC-celdichtheid op hPGCLC-differentiatie
Het is belangrijk om de optimale zaaidichtheid te controleren voor optimale hPGCLC-differentiatie (op Geltrex), aangezien verschillende hiPSC's verschillende proliferatiesnelheden hebben. Bovendien, als de efficiëntie in hPGCLC-differentiatie afneemt naarmate hiPSC's continu worden doorgevoerd, wordt geadviseerd de dichtheid van de hiPSC-zaaicel aan te passen. Om de impact van de zaaiceldichtheid op de efficiëntie van hPGCLC-differentiatie te evalueren, werden hiPSC's gezaaid bij verschillende dichtheden, van 10K tot 100K cellen/^cm2 (Figuur 4A). Op dag 5 werd het percentage hPGCLC's beoordeeld met flowcytometrie met behulp van twee verschillende geconjugeerde antilichamen voor humane PGC-markers, EPCAM en integrine α6 (ITGA6)³². De flowcytometrieanalyse volgde een standaard sequentiële gatingstrategie, getoond voor M199 hiPSC's die werden gezaaid bij 40K cellen/^cm2 (Figuur 4B). Kort gezegd werd de totale celpopulatie (alle gebeurtenissen) zo geblokkeerd dat afval (deeltjesoppervlakte) werd uitgesloten, vervolgens werden individuele cellen geselecteerd op basis van grootte (FSC) en granulariteit (SSC), en tenslotte werden dode cellen uitgesloten op basis van 7AAD-kleuring. Daarna werd de poort om cellen te kwantificeren die EPCAM-cy7 en ITGA6-BV421 expressief uitdrukken, ingesteld met gekleurde en ongekleurde monsters (Figuur 4B).

Het vergelijken van de hPGCLC-differentiatie-efficiëntie met verschillende zaaiceldichtheden en het gebruik van hiPSC gekweekt op verschillende substraten toonde een dichtheidsafhankelijke trend (Figuur 4C). Bij een zaaddichtheid van 20–40K cellen/^cm2 vertoonden M54 en M199 hiPSC's het hoogste aandeel EPCAM+/ITGA6+ dubbel-positieve hPGCLC's, bereikt met hiPSC's die op Geltrex en Cultrex werden onderhouden. Interessant genoeg resulteerden hogere dichtheden in een lagere differentiatie-efficiëntie. Immunofluorescentieresultaten met behulp van PGC-markers SOX17/TFAP2C/PDPN of SOX17/POUF51 op de hPGCLC's valideerden de flowcytometrieresultaten (Figuur 4D). Deze resultaten suggereerden dat het aanpassen van de zaaidichtheid aan de specifieke hiPSC's belangrijk is om optimale differentiatie-efficiëntie te bereiken. Het combineren van immunofluorescentie en flowcytometrie verbetert de robuustheid van de hPGCLC-differentiatietestas.

Figuur 1: hPGCLC-differentiatieworkflow en kwaliteit van hiPSC's. (A) Schema van de werkwijze die in deze studie wordt gebruikt. hiPSC's bleven behouden (in kweekmedium) en bereikten 60–80% confluentie op de dag van differentiatie (dag 0, D0). Op D0 werden de hiPSC's gedissocieerd in enkele cellen en geplateerd in de gewenste zaaddichtheid (in platingmedium). De volgende dag werden de cellen behandeld met differentiatiemedium (D1–D3), gevolgd door schakelmedium (D3–D5). Op D5 werden hPGCLC's gebruikt voor immunofluorescentie of flowcytometrie. (B) Brightfield-beelden (bovenste rij - 4x vergroting); immunofluorescentie voor SOX2, PHALLOIDINE-kleuring en DAPI-kleuring (middenrij); en voor POU5F1, PHALLOÏDINE-kleuring en DAPI-kleuring (onderste rij) met hiPSC's met verschillende confluentie. Schaalbalken = 50 μm. Tekeningen in Figuur 1A zijn gemaakt door de auteurs met behulp van basistekentools in Adobe Illustrator; er werden geen betaalde software of tools gebruikt. Daarom was er geen auteursrechtlicentie vereist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Effect van verschillende coatingsubstraten tijdens hiPSC-kweek. Brightfield-afbeeldingen (bovenste rij); immunofluorescentie voor SOX2, PHALLOIDINE-kleuring en DAPI-kleuring (middenrij); en voor POU5F1, PHALLOÏDINE-kleuring en DAPI-kleuring (onderste rij) die hiPSC's laten zien die op verschillende coatingsubstraten zijn gekweekt. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Effect van verschillende coatingsubstraten tijdens hiPSC-kweek op hPGCLC-differentiatie. Brightfield-beelden (bovenste rij - 10x vergroting); immunofluorescentie voor SOX17, TFAP2C, PDPN en DAPI-kleuring (middenrij); en voor POU5F1, SOX17 en DAPI-kleuring (onderste rij) van hPGCLC-differentiatie (met Geltrex) op dag 5, beginnend met hiPSC's die op verschillende coatingsubstraten zijn gekweekt. De gele gestippelde lijn markeert gebieden met hPGCLC's. Schaalbalken = 25μm (bovenste rij) en 50 μm (midden- en onderrijen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Effect van hiPSC-zaaidichtheid op hPGCLC-differentiatie. (A) Brightfield-beelden op dag 1 (D1) en D3 van hPGCLC-differentiatie met verschillende hiPSC-zaaddichtheden (40K cellen/cm², 60K cellen/cm2, 80K cellen/cm²). Schaalbalken = 250 μm. 4x vergroting. (B) Representatieve flowcytometriegrafieken die de gatingstrategie tonen om het percentage EPCAM+/ITGA6+ hPGCLC's te kwantificeren. Hiervoor werden M199 hiPSC's (op Geltrex) gebruikt bij een zaaddichtheid van 40K cellen/cm^². (C) Bargrafiek die de percentages EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLC's bij D5 weergeeft, wanneer hiPSC's (M199 en M54) worden gebruikt die op verschillende coatings zijn gekweekt en bij verschillende dichtheden zijn gezaaid. (D) Immunofluorescentie voor SOX17, TFAP2C, PDPN en DAPI-kleuring (linker panelen); en SOX17, POU5F1 en DAPI-kleuring (rechterpanelen) bij D5 van hPGCLC-differentiatie met behulp van hiPSCs (M199 en M54, op Geltrex) die werden gezaaid bij 40K en 80K cellen/cm2. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In vitro gametogenese vormt een krachtig experimenteel platform voor het onderzoeken van de ontwikkeling van menselijke kiemlijnen, voortplantingstoxiciteit en onvruchtbaarheid onder gecontroleerde kweekomstandigheden en op patiëntspecifieke basis. Hoewel er^{in 18} meerdere protocollen zijn gerapporteerd om hPGCLC's van hiPSC's te onderscheiden, wordt de vooruitgang op dit gebied belemmerd door de beperkte beschikbaarheid van gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare benaderingen in laboratoria. Recente studies hebben vereenvoudigde en efficiënte benaderingen voor hPGCLC-inductie beschreven, waaronder BMP4-gebaseerde micropatterned differentiation²⁷, een snel 2D-monolaagplatform dat hPGCLC-generatie binnen 3,5 dagen²⁸ mogelijk maakt, en een 3D-kweeksysteem dat peri-implantatieontwikkeling en paracriene niche-signalering^{modelleert 33}. Hoewel deze protocollen efficiënt hPGCLC-differentiatie ondersteunden, ontbreekt het nog steeds aan de mogelijkheid om als high-throughput platforms te dienen. Om op hPGCLC gebaseerde studies breed toepasbaar te maken, met name voor reproductieve toxicologische screenings, moeten protocollen robuust, technisch toegankelijk en compatibel zijn met downstream kwantitatieve assays. Hier wordt een stapsgewijze analyse van het BMEx-differentiatieprotocol van hPGCLC gepresenteerd, waarbij de nadruk ligt op kritieke technische parameters die reproduceerbaarheid en prestaties bepalen.

Een belangrijke factor voor succesvolle differentiatie is de initiële pluripotentietoestand van de hiPSC's. Passagenummer, cellulaire gezondheid, lijnspecifieke kenmerken en pre-differentiatie-kweekcondities kunnen invloed hebben op de uitkomsten van hPGCLC-differentiatie. Aanvankelijk kan tijdens het onderhoud van hiPSC de aandacht uitgaan naar het coatingsubstraat, de dichtheid van zaaicellen en het cultuurplaatformaat, die samen de koloniearchitectuur en signaalomgevingen definiëren bij het begin van hPGCLC-differentiatie. De huidige studie toont het effect aan van het gebruik van hiPSC's die zijn gekweekt op verschillende coatings en verschillende zaaidichtheden op de differentiatie van hPGCLCs (op Geltrex). Beide hiPSC-lijnen die hier werden getest, toonden maximale differentiatie-efficiëntie bij 20.000–40.000 cellen/cm^² zaaidichtheid. Dit onderstreept de noodzaak om optimale zaaidichtheden te bepalen bij het introduceren van nieuwe cellijnen, na langdurige doorgang, of het aanpassen van experimentele lay-outs of kweekplaatformaten. Zelfs schijnbaar kleine veranderingen in oppervlakte-volumeverhoudingen of groeikinetiek kunnen geoptimaliseerd moeten worden om een hoge differentiatie-efficiëntie te behouden. Daarom wordt aanbevolen dat gebruikers kleinschalige pilotexperimenten uitvoeren om eerst optimale voorwaarden voor hPGCLC-differentiatie te bepalen.

Ondanks zijn robuustheid kent de methode beperkingen die erkend moeten worden. Hoewel compatibel met meerdere coatings en dichtheden, blijft differentiatie-efficiëntie gevoelig voor hiPSC-intrinsieke eigenschappen, waaronder epigenetische toestand en passagegeschiedenis, die niet volledig beheersbaar zijn. Verschillende geteste hiPSC's leken niet te kunnen onderscheiden in hPGCLCs²⁶. Het belangrijkste is dat BMEx, in tegenstelling tot vitronectine, een volledig gedefinieerd product, een dierlijk product is dat onderhevig is aan batch-tot-batch variatie, wat de reproduceerbaarheid kan beïnvloeden. Hoewel verschillende batches Matrigel, Cultrex en Geltrex eerder zijn getest en consistente resultaten opleverden²⁶, blijft dit een zorg en moeten volledig gedefinieerde alternatieven voor BMEx worden overwogen om toekomstige reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid te waarborgen. Hier werden twee mannelijke (XY) hiPSC-lijnen gebruikt, maar dit protocol is getest met zowel vrouwelijke (XX) als mannelijke (XY) lijnen²⁶. Ten slotte, hoewel het protocol resulteerde in hPGCLC's, waarvan is aangetoond dat ze transcriptieel vergelijkbaar zijn met hPGC's en competent zijn voor verdere ontwikkeling^26,34, werd verdere rijping tot latere kiemcelstadia hier niet behandeld. Hoewel schaalbaarheid is aangetoond voor screeningtoepassingen, zal automatiseringsgebaseerde aanpassing en interlaboratoriumvalidatie over een breder panel van hiPSC-lijnen de translationele bruikbaarheid verder versterken.

In vergelijking met bestaande hPGCLC-differentiatiestrategieën biedt dit protocol verschillende voordelen. In tegenstelling tot sterk gespecialiseerde of matrix-beperkte benaderingen, biedt het gebruik van veelgebruikte hiPSC-onderhoudssubstraten en kweekplaatformaten, waardoor technische barrières worden verlaagd. De nadruk op dichtheidsoptimalisatie en vroege kwaliteitscontrole verbetert de reproduceerbaarheid verder, een aanhoudende uitdaging op het gebied van in vitro gametogenese.

Het hier beschreven methodologische kader is bijzonder relevant voor voortplantingstoxicologie, onvruchtbaarheidsmodellering en ontwikkelingsbiologie. De compatibiliteit met schaalbare formaten maakt middel- tot hoge-doorvoer compoundscreening mogelijk, terwijl de reproduceerbaarheid kruisstudievergelijkingen en samenwerkingsconsortia-inspanningen ondersteunt. In bredere zin zal systematische standaardisatie van hPGCLC-inductieprotocollen in laboratoria, waarbij karakterisering en functionele eindpunten worden vergeleken^18,35, essentieel zijn voor de vooruitgang van in vitro gametogenese richting voorspellende mensrelevante platforms.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment voor flowcytometrie
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Los op in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Verdun tot in koude DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment voor beeldvorming
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, met Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stamcel gekwalificeerd	Gibco	A1413302	Verdun tot in koude DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stamcel gekwalificeerd	Gibco	A1413302	Verdun tot in koude DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs kunnen worden verspreid op verzoek met MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs kunnen worden verspreid op verzoek met MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment voor celtelling
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Verdun tot in koude DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Los op tot 8% PFA in water eerst; en verdun tot 4% (1:1) met 0.2 M fosfaatbuffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentratie van 100 µg/mL in 4 mM HCL bevattend 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentratie van 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentratie van 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentratie van 100 µg/mL in PBS
Re