Epigenoom-brede CRISPR-Cas9-gebaseerde knockout-screens op chemoresistente cellen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van chemoresistente cellen met behulp van een dosis-escalatie-methode, gevolgd door een CRISPR/Cas9-gebaseerde screen met een gerichte sgRNA-bibliotheek die epigenetische modifiers gebruikt om regulatoren van verworven chemoresistentie te identificeren. Het protocol biedt ook meerdere optimalisatiepunten die zijn afgestemd op chemoresistente celmodellen, en biedt een robuust kader voor onderzoekers die resistentiemechanismen onderzoeken.

Samenvatting

Chemotherapieresistentie blijft een grote uitdaging in de kankerbehandeling, gedreven door het vermogen van kankercellen om adaptieve eigenschappen te verwerven, signaalroutes te herbedraaden en chromatinestructuur te veranderen om door medicijnen veroorzaakte cytotoxiciteit te vermijden. Omdat deze processen sterk afhankelijk zijn van epigenetische mechanismen die de organisatie van chromatine en transcriptionele plasticiteit reguleren, zijn epigenetische regulatoren uitgegroeid tot belangrijke bijdragers aan chemotherapieresistentie. Om resistentie tegen paclitaxel te onderzoeken, een van de meest gebruikte chemotherapeutische middelen bij triple-negatieve borstkanker (TNBC), gebruikten we een epigenoomgerichte knockout-bibliotheek (EPIKOL), een CRISPR-Cas9-gebaseerde bibliotheek, ontworpen om genen die betrokken zijn bij chromatineregulatie systematisch te verstoren. Chemoresistente cellijnen werden gegenereerd via een stapsgewijze dosis-escalatieprotocol dat klinisch relevante geneesmiddeladaptatie herhaalt. Deze resistente cellen vertonen echter een multidrugresistent (MDR) fenotype, wat aanzienlijke uitdagingen vormt voor efficiënte virale transductie en de selectie van stabiele celpopulaties. In deze studie beschrijven we belangrijke methodologische stappen voor het bereiken van hoogefficiënte lentivirale transductie en selectie, waardoor de succesvolle toepassing van EPIKOL CRISPR-screens in chemoresistente TNBC-modellen mogelijk is. Na het beschreven protocol werd een epigenoom-brede CRISPR-screen uitgevoerd op chemoresistente TNBC-cellen, en werden nieuwe epigenetische regulatoren van chemoresistentie geïdentificeerd. Dit protocol biedt een robuust kader voor het identificeren van epigenetische regulatoren die bijdragen aan verworven paclitaxelresistentie met behulp van een CRISPR-gebaseerde functieverlies-benadering.

Inleiding

Drievoudig negatieve borstkanker (TNBC) is een subtype borstkanker dat 12–17% van alle borstkankergevallen^{uitmaakt 1}. Het wordt gekenmerkt door een verminderde expressie van oestrogeenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR) en humane epidermale groeifactorreceptor-2 (HER2), wat de beschikbaarheid van gerichte therapieopties sterk beperkt en conventionele chemotherapie als primaire behandelmethode² overlaat. Taxanen en anthracyclines worden vaak gebruikt bij de behandeling van TNBC; patiënten ontwikkelen echter meestal resistentie ^2,3. Het verwerven van chemoresistentie is een complex en multidimensionaal proces dat zowel genetische, metabole, transcriptie- als epigenetische aanpassingen omvat ^2,4. Epigenetische veranderingen zijn naar voren gekomen als centrale regulatoren van cellulaire plasticiteit, die dynamische transcriptionele herprogrammering mogelijk maken waardoor kankercellen chemotherapie-geïnduceerde toxiciteit kunnen verdragen⁵.

Taxol (paclitaxel) behoort tot de taxaanklasse, die celdood veroorzaakt door de dynamica van de microtubuli te verstoren en functioneert als antimitotisch middel⁶. Hoewel TNBC-patiënten aanvankelijk reageren op de chemotherapieregimes inclusief Taxol, ontwikkelt resistentie zich meestal^{na verloop} van tijd. Verworven Taxol-resistentie wordt vaak geassocieerd met overexpressie van ATP-bindende cassette (ABC) transporters, specifiek ABCB1 (MDR1, P-glycoproteïne), die de geneesmiddeluitvloeiing van Taxol mediëren, wat resulteert in een verminderde intracellulaire toxiciteit⁷. Aangezien een breed scala aan chemotherapeutische middelen substraten vormen van deze ABC-transporters, beperkt hun upregulatie het gebruik van andere chemotherapeutische middelen, wat leidt tot een multiresistent fenotype (MDR)⁸. Remming van ABC-transporters is grotendeels onsuccesvol gebleken als strategie om multigeneesmiddelresistentie in klinische omgevingen te overwinnen, voornamelijk vanwege hun alomtegenwoordige expressie en essentiële rol bij het transporteren van een breed scala aan endogene en exogene substraten⁹. Hoewel verapamil, een eerste generatie ABCB1-remmer, beperkte of geen klinische voordelen toonde en in klinische studies^werd geassocieerd met significante toxiciteit, blijft het een waardevol experimenteel hulpmiddel om de selectie-efficiëntie in in vitro modellen van MDR te verbeteren.

Het MDR-fenotype is een dynamisch en adaptief proces dat vooral ontstaat tijdens stressomstandigheden². De expressie van ABC-transporters wordt voornamelijk gecontroleerd door transcriptionele en epigenetische reguleringsmechanismen, in plaats van door mutatiegebeurtenissen ^5,11. De beperking van het direct richten op ABC-transporters benadrukt de noodzaak om de upstream regulatoren van deze eiwitten te identificeren als een kwetsbaarheid specifiek voor de resistente cellen. Daarom is systematisch onderzoeken van epigenetische factoren een belangrijke strategie geworden om nieuwe regulatoren van chemotherapieresistentie te identificeren en combinatietherapieën te ontwikkelen die deze kwetsbaarheden aanpakken.

CRISPR-Cas9-gebaseerde functionele knockout-screens maken onbevooroordeelde, systematische genoombrede verstoringen mogelijk om effecten van genverlies bij kanker op genoomschaal¹² te bestuderen. Echter, genoom-brede CRISPR-bibliotheken bieden beperkte single guide RNA (sgRNA) representatie per gen, wat de gevoeligheid vermindert in vergelijking met gefocuste bibliotheken¹³. Belangrijk is dat een robuust scherm niet alleen afhangt van de kwaliteit van de verstoringen, maar ook van een passend model en een geoptimaliseerd experimenteel protocol. In deze context kan het bestuderen van een dynamisch en complex proces zoals geneesmiddelresistentie baat hebben bij een gerichte bibliotheek met een aangepast protocol¹³. In een eerder werk genereerden we een epigenoomgerichte CRISPR-Cas9 knockoutbibliotheek om chromatineregulatoren¹⁴ te targeten. In vergelijking met andere publiek beschikbare epigenoomgerichte CRISPR-bibliotheken bevat de epigenetische knockout-bibliotheek (EPIKOL) 779 genen, bestaande uit chromatine-lezers, schrijvers, gummen en bijbehorende eiwitten, elk gericht op 10 sgRNA's, waardoor de diepte per gen kan worden verhoogd en de robuustheid en reproduceerbaarheid van chromatinegerichte functionele screens verbeterd¹⁴. EPIKOL is beschikbaar in zowel het LentiGuide-systeem, waarin Cas9 wordt uitgedrukt vanuit een andere vector, als in het LentiCRISPR-systeem, dat Cas9 bevat, wat flexibiliteit biedt afhankelijk van de cellijn. Het bereiken van voldoende bibliotheekdekking, gedefinieerd als het gemiddelde aantal cellen per sgRNA (bijv. 500×–1000×), is voor EPIKOL gemakkelijker dan genoom-brede bibliotheken, wat een voordeel biedt bij het bestuderen van de langzaam groeiende chemoresistente cellijnen.

Hoewel CRISPR-screening een krachtige benadering biedt om chemoresistentiemechanismen te onderzoeken, zijn standaard pooled screeningworkflows niet geoptimaliseerd voor chemoresistente cellen met actieve geneesmiddelefflux. Puromycine, een veelgebruikt selectieantibioticum in lentivirale CRISPR-systemen, kan uit de resistente cellen worden gepompt door ABC-transporters, voornamelijk ABCB1, waardoor succesvolle selectie van getransduceerde cellen^15,16 wordt voorkomen. Deze beperking kan leiden tot heterogene celpopulaties, meer achtergrondruis en uiteindelijk de datakwaliteit aantasten. Om deze uitdaging aan te pakken, optimaliseerden we de puromycineselectiestap door tijdelijk ABC-gemedieerde geneesmiddelefflux te remmen met verapamil, waardoor efficiënte verrijking van sgRNA-geïnfecteerde cellen mogelijk werd. Met deze strategie identificeerden we Bromodomain en PHD Finger Containing 1 (BRPF1) als regulator van ABCB1-expressie en Taxol-resistentie in TNBC¹⁷. BRPF1-remming, genetisch of farmacologisch, herstelde de Taxol-gevoeligheid in resistente cellen, waarmee het nut van dit geoptimaliseerde protocol werd aangetoond bij het identificeren van actiebare doelwitten in chemoresistentie¹⁷.

Hier beschrijven we de belangrijkste stappen bij negatieve selectie CRISPR-screening op chemoresistente modellen, met specifieke focus op de technische uitdagingen die vaak over het hoofd worden gezien in de meeste chemoresistentie- of CRISPR-screeningsprotocollen. Het protocol demonstreert eerst een stapsgewijze dosisescalatiemethode voor de generatie van chemoresistente cellen en optimaliseert vervolgens de virale afgifte en selectievoorwaarden om ABC-transporter-gemedieerde geneesmiddeluitvloei te overwinnen. Samen zorgen deze optimalisaties voor een efficiënte verrijking van sgRNA-positieve cellen tijdens de CRISPR-screens, terwijl de niet-getransduceerde cellen effectief worden geëlimineerd, waardoor een robuuste en efficiënte strategie voor transductie en selectie in chemoresistente TNBC-cellen ontstaat. Tot slot benadrukt het protocol de fundamenten van het identificeren van CRISPR-screeninghits via next-generation sequencing en bio-informatische analyse.  Samen maakt dit protocol een effectieve implementatie van het EPIKOL-screeningsplatform mogelijk om potentiële therapeutische doelen te identificeren om resistentie te overwinnen 17,18,19.

Protocol

Alle reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, zijn opgenomen in de Materiaalkundige Tafel.

1. Generatie van Taxol-resistente drievoudig-negatieve borstkankercellijnen

1. Om de medicijngevoeligheid van de cellen te bepalen, pas je de celdichtheid van SUM159PT hechtende cellen aan naar 2 × 10^{à 3} cellen per put in 96-put zwarte heldere bodemplaten met Ham's F12 voedingsmix aangevuld met 5% foetaal rundserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 5 μg/mL insuline, 10 mM HEPE's en 1 μL/mL hydrocortison, en incubeer je de cellen 16 uur in een celkweekincubator bij 37 °C met 5%_CO2.
2. Bereid Taxol-olie voor opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). Om cellen te behandelen, bereid seriële verdunningen van Taxol voor in kweekmedia, variërend van 0,3 nM tot 10 μM (bijv. 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 30 nM, 100 nM, 1μM, 10 μM), en gebruik DMSO alleen als voertuigcontrole.
3. Behandel cellen met 200 μL toenemende doses Taxol (bereid in stap 1.2) als driedubbele doses en laat de plaat 72 uur in een celkweekincubator bij 37 °C met 5%_CO2.
4. Na 72 uur medicamenteuze behandeling wordt de levensvatbaarheid van de cel gemeten met een luminescentie-gebaseerde adenosinetrifosfaat (ATP) kwantificatie-cellevensvatbaarheidsassay. Gebruik een microplaatmeter om luminescentie te meten en waarden te normaliseren naar DMSO-regelaars. Bereken de waarden van 10% inhibitieconcentratie (IC10) en IC50 door niet-lineaire regressie met behulp van een logistisch dosis-responsmodel met vier parameters in een geschikte statistische software.
5. Om chemoresistente cellen te genereren, zaad je 2 × 10 à⁵ SUM159PT cellen per put in platen met 6 putjes. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 5%_CO2.
6. De volgende dag behandel je cellen met ofwel IC10- of IC50-waarden van Taxol in 2 mL kweekmedium gedurende 72 uur als startconcentraties.
7. Als cellen de huidige medicijnconcentratie verdragen, splits je ze in twee putten. Houd één put als back-up controle in een nieuw medium en vervang het medium in het tweede put door medium met twee keer de vorige Taxol-concentratie.
   OPMERKING: Als cellen herstel nodig hebben door stress-geïnduceerde morfologische veranderingen zoals abnormale cellulaire projecties, uitgebreide afronding en loslating, of duidelijke vermindering van proliferatie, houd ze dan in een medicijnvrij medium en wacht tot cellen gezond en confluent zijn. Herhaal vervolgens de stappen vanaf stap 1.7.
8. Bij het genereren van resistente cellen passeren oudercellen met een DMSO-bevattend medium als controle. Pas het volume van de DMSO aan om overeen te komen met de hoeveelheid DMSO die aanwezig is in de bijbehorende Taxol-behandeling.
9. Meet de levensvatbaarheid van cellen zoals in stappen 1,2–1,4 elke 3–4 weken en zet deze procedure voort totdat er een significant verschil (p < 0,05 of 10–50 keer afhankelijk van het toegepaste medicijn) is bereikt tussen IC50-waarden van ouderlijke en resistente cellijnen. De dosisverhogingsprocedure duurt doorgaans 6–9 maanden, afhankelijk van het gebruikte medicijn.
10. Nadat stabiele resistente cellen zijn verkregen, houd je deze in de onderhoudsdosis (laatst toegediende dosis) van het geneesmiddel tijdens het cultiveren om het resistente fenotype te behouden.
    OPMERKING: Chemoresistente celgeneratie met de dosis-escalatiemethode is een tijdrovend proces, en de duur hangt af van verschillende factoren, waaronder de cellijn, de intrinsieke groeisnelheid en het specifieke chemotherapeutisch middel dat wordt gebruikt. Het duurt doorgaans 6–9 maanden, afhankelijk van het klinisch relevante weerstandsniveau. Een alternatieve benadering om significante verschillen in resistentieniveaus te bepalen, is het beoordelen van de minimale medicijnconcentratie waarbij resistente cellen overleven, maar oudercellen niet.
11. Karakterisering van resistente cellen: Voer RNA-sequencing, western blotting, kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en cellevensvatbaarheidstests uit met medicamenteuze behandeling (bijv. kolonievormingsassay) om het fenotype van resistente cellen te karakteriseren. Zorg ervoor dat je het resistente fenotype na meerdere passages opnieuw beoordeelt om aan te tonen dat het verhoogde IC50-fenotype stabiel is over de tijd.

2. Lentivirusproductie

1. Dag 0: Zaad HEK293T cellen als 4 × 10^{à 6} per 100 mm weefselkweekschotel met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, om de volgende dag 90% confluentie te bereiken.
2. Dag 1: Bereid polyethyledienimine (PEI) en DNA-mengsels in serumvrije DMEM (-/-) apart voor elk virus. Gebruik Tabel 1 en Tabel 2 om het volume en de concentraties van PEI en DNA aan te passen volgens de gewenste virale opbrengst.
   OPMERKING: PEI wordt vier keer gebruikt van het totale μg DNA (bijvoorbeeld, in een 100 mm plaat, gebruik 30 μL PEI voor een totaal van 7,5 μg DNA). Virusproductie in 100 mm schotels wordt gevolgd in dit protocol en virussen verkregen uit 5–10 100 mm schotels maken het mogelijk om meerdere screens uit te voeren. Voor validatie-experimenten of kleinschalige infecties is een enkele put van een 6-put plaat of een schotel van 60 mm voldoende. Aangezien lineair polyethyleniminehydrochloride een giftig transfectiemiddel is, zorg ervoor dat de celconfluentie 90% is op het moment van transfectie.
   1. Na het grondig mengen voeg je het DNA-mengsel toe aan de PEI-buis. Meng goed en laat PEI-DNA-complexen 30 minuten staan bij kamertemperatuur.
   2. Voeg vervolgens de 600 μL PEI-DNA-complex toe aan de HEK293T's, druppelgewijs. Plaats platen in de virusincubator gedurende 16 uur bij 37 °C met 5%_CO2.
3. Dag 2: Vervang het medium van geïnfecteerde cellen door het PEI en virushoudende medium te aspireren en 8 mL volledige DMEM toe te voegen voor elke 100 mm weefselkweekschaal. Incubeer de cellen om virale productie mogelijk te maken.
4. Dag 3: Voer de eerste verzameling virussen uit door voorzichtig de 8 mL supernatant in een centrifugebuis van passende grootte te verwijderen en op te slaan bij 4 °C. Als er meerdere platen zijn voor de virale productie, combineer dan de supernatanten. Voeg vervolgens 8 ml verse complete DMEM toe aan elke schotel en breng de platen terug in de virusincubator.
5. Dag 4: Herhaal de verzamelstappen en combineer met supernatanten vanaf dag 3.
   1. Bereid een 50% (w/v) polyethyleenglycol (PEG)-8000 oplossing in fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) om 5× PEG-bouillon te verkrijgen. Autoclaaf om op te lossen en te steriliseren.
   2. Centrifugeer de verzamelde virale supernatanten op 300 x g gedurende 5 minuten om residuele cellen te pelleten, en ga daarna over naar filtratie.
   3. Filter 16 mL viraal supernatant met een 0,45 μm filter (een spuit of 50 mL vacuümfilter) in de buis met 4 mL PEG-oplossing om een uiteindelijke 1× PEG-concentratie te bereiken en resterende resten en cellen te verwijderen.
   4. Stop de tube en meng door inversie. Herhaal deze stap voor alle virale voorbereidingen. Bewaar hem een nacht bij 4 °C in het donker, met optionele lichte roering.
   5. De volgende dag zouden zichtbare neerslagen aanwezig moeten zijn. Centrifugeer de buizen op 1400 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: PEG-geprecipiteerde virale pellets kunnen tot 5 dagen voor centrifugatie bij 4 °C worden bewaard; de virale titer kan echter afnemen bij langere incubatie.
   6. Na centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig weggegooid, waarbij een klein volume (ongeveer 100 μL) in de buis blijft om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord.
   7. Centrifugeer de buizen 5 minuten op 300 x g om zoveel mogelijk vloeistof van de zijkanten van de buis te verzamelen. Gooi dan voorzichtig het resterende supernatant weg.
   8. Om het virus 100 keer te concentreren, voeg je PBS toe aan 1/100 van het initiële volume van het virale supernatant aan de pellet en laat je de pellet opnieuw suspenderen door te pipetteren (bijvoorbeeld, als je begint met 16 mL virale supernatant, voeg dan 120–140 μL PBS toe aan de pellet om het eindvolume van 160 μL te bereiken, rekening houdend met het pelletvolume). Vermijd intensief pipetteren; Aliquot het virus.
      OPMERKING: De verwachte titer na de PEG-concentratie is >1 × 10⁸ infectieuze deeltjes/mL (ip/mL) voor het LentiGuide-systeem en >1 × 10⁷ voor het LentiCRISPR-systeem. Titers die één orde van grootte lager zijn, kunnen nog steeds acceptabel zijn, maar moeten worden verifiërd aan de infectiviteit van de doelcellijn en het benodigde virale volume.
   9. Als virusconcentratie niet nodig is, aliquot het virus om vries-dooicycli te minimaliseren. Bewaar geconcentreerd of ongeconcentreerd virus bij -80 °C. Bleekmiddel en afvalborden.
      OPMERKING: Voor een meer gedetailleerde beschrijving van lentivirale productie en behandeling worden lezers verwezen naar vastgestelde protocollen²⁰. Voor veelvoorkomende problemen die bij lentivirusproductie voorkomen, zie Aanvullende Tabel 1.

	1 put van 6 putplaat	60 mm plaat	100 mm plaat	150 mm plaat
PEI (stock 1 mg/mL) volume	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
DMEM (-/-) volume	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tabel 1: Vereiste PEI- en DMEM-volumes voor verschillende platen voor het PEI-mengsel.

	1 put van 6 putplaat	60 mm plaat	100 mm plaat	150 mm plaat
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Doelvector	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) pas het eindvolume aan op	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tabel 2: Vereiste plasmide- en DMEM-volumes voor verschillende platen voor het DNA-mengsel.

3. Vaststelling van geoptimaliseerde puromycineselectie voor MDR-cellen

OPMERKING: In chemoresistente cellen met ABCB1-overexpressie faalt de selectie van puromycine door actieve ABCB1-gemedieerde efflux van puromycine, waardoor effectieve selectie van met sgRNA geïnfecteerde cellen wordt verhinderd. Om deze beperking te overwinnen, wordt verapamil samen met puromycine toegediend om ABCB1-gemedieerde efflux tijdelijk te remmen, waardoor intracellulaire ophoping van puromycine mogelijk wordt en niet-geïnfecteerde cellen efficiënt worden geëlimineerd.

1. Bepaal de verapamilconcentratie die ABCB1-gemedieerde geneesmiddeluitvloeiing blokkeert zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden. Hiervoor gebruik je het chemotherapeutisch middel waarvoor resistentie is verkregen (in dit geval Taxol) in combinatie met toenemende doses verapamil.
   1. Zaad SUM159PT Taxol-resistente en oudercellen aan 96-put zwarte heldere bodemplaten bij 2 × 10³ cellen per put in drievoud van drie. Incubeer cellen 's nachts op 37 °C met 5%_CO2.
   2. Behandel cellen met seriële verdunningen van verapamil (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 en 80 μM) terwijl je een constante concentratie van Taxol (bijv. onderhoudsdosis) handhaaft bij alle aandoeningen.
   3. Na 72 uur behandeling wordt de levensvatbaarheid van de cel beoordeeld met een luminescentie-gebaseerde ATP-kwantificatie-cellevensvatbaarheidsassay. Bepaal de verapamilconcentratie die op zichzelf de levensvatbaarheid niet vermindert (≥90%–95% vergeleken met onbehandelde controles), maar de gevoeligheid in resistente cellen herstelt.
2. Om de puromycineconcentratie te vinden die in combinatie met verapamil wordt gebruikt, zaad SUM159PT Taxol-resistente cellen in een 96-wellplaat met 2 × 10 à³cellen per put. Incubeer de plaat 16 uur bij 37 °C met 5%_CO-2.
   1. Bereid seriële verdunningen van puromycine voor (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 μg/mL) in het medium met de eerder vastgestelde verapamilconcentratie en behandel de cellen dienovereenkomstig.
   2. Meet na 72 uur de levensvatbaarheid van de cel met een luminescentie-gebaseerde ATP-kwantificatie-cellevensvatbaarheidsassay en bepaal de minimale concentratie puromycine die alle cellen elimineert (≤5% levensvatbaarheid) in aanwezigheid van verapamil. Deze concentratie zal worden gebruikt voor selectie tijdens de CRISPR-screening.
      OPMERKING: Deze stappen voor het optimaliseren van geneesmiddelconcentraties zijn afhankelijk van de cellijn en de context. Factoren zoals intrinsieke geneesmiddelgevoeligheid, ABC-transporterexpressieniveaus en groeisnelheid kunnen de effectieve concentraties beïnvloeden. Voer deze optimalisatie dus uit voor elk nieuw cellijn- en weerstandsmodel. (Ter referentie: 5 μg/mL puromycine in combinatie met 20 μM verapamil wordt gebruikt voor Taxol-resistente cellen die in deze studie^{worden gebruikt 17}). Voor het oplossen van het probleem met puromycine + verapamil, zie Aanvullende Tabel 1.

4. Berekening van virale titratie en multipliciteit van infectie (MOI)

1. Dag -1: Zaad SUM159PT Taxol-resistente cellen als 2 × 10⁵ in elke put van een 6-put plaat met een complete Ham's F12 voedingsmix.
2. Dag 0: Vier opeenvolgende verdunningen van het virus uitvoeren in Ham's F12-voedingsmix met Protaminesulfaat (PS) bij 8 μg/mL. (Voor geconcentreerde virussen begin je met 1 μL en verdun je tienvoudig bij elke verdunning tot 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Voor ongeconcentreerde virussen pas je de volumes dienovereenkomstig aan (bijv. 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Geef 1 ml virushoudend medium aan elk van de vier putten. Laat één goed puromycineselectiecontrole en één als onbehandelde controle.
3. Dag 1: Vervang het virale medium door 2 ml verse media 16 uur na infectie.
4. Dag 2: Cellinhoud van elke put overbrengen naar een 100 mm celkweekschotel met Ham's F12 voedingsmix met puromycine + verapamil in concentraties bepaald in stap 3.2. Als niet-geselecteerde cellen overconfluent zijn, zaad dan een gedefinieerd deel (bijv. 1/2), en dit wordt meegenomen bij de uiteindelijke berekeningen.
   OPMERKING: Vul het medium aan met verse puromycine + verapamil, indien nodig, binnen de volgende 3-4 dagen totdat alle cellen in de controleplaat dood zijn.
5. Dag 4–5: Wanneer de cellen in de controleplaat dood zijn, bepaal je welke platen genoeg cellen hebben om te tellen. Trypsiniseer de cellen, tel en bepaal het totale aantal cellen.
6. Na het tellen van levensvatbare cellen bereken je de transductie-efficiëntie en de Multipliciteit van Infectie (MOI) als volgt (gebruik Aanvullende Tabel 2 als sjabloon):
   1. Bereken de transductiesnelheid (het aandeel geïnfecteerde cellen) met behulp van de onderstaande formule
      
      
      N_geselecteerd: Totaal aantal cellen na puromycineselectie in de geïnfecteerde putten
      N_Controle: Totaal aantal cellen in de niet-transduceerde, niet-geselecteerde controleput
      p: Transductiesnelheid (fractie van geïnfecteerde cellen).
      OPMERKING: Als slechts een fractie van de onbehandelde controlecellen is gezaaid, houd dit dan mee in de rekening bij het berekenen van N_Control
   2. Bereken MOI. Tijdens lentivirale transductie volgen infectiegebeurtenissen een Poisson-verdeling. Daarom wordt het aandeel cellen dat met ten minste één virus is geïnfecteerd gedefinieerd als:
      p =1- e ^-MOI
      Bereken dus MOI als:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Bereken lentivirale titer (infectieus deeltje/milliliter, IP/mL) op basis van het aantal geïnfecteerde cellen:
      Titer (IP/mL) = (MOI x N_start)/ Volume van het virus
      N_begint: aantal cellen die voor infectie zijn ingezaaid
      Volume virus: volume van het toegevoegde virus per put (in mL)
      OPMERKING: Bereken de lentivirale titer voor elke infectie afzonderlijk en bepaal de uiteindelijke titer door het gemiddelde te nemen van de putten die evenredig zijn met de hoeveelheid en titerwaarden van het virus. Putten die verzadiging of afwijking van proportionele schaal vertonen, moeten worden uitgesloten van titerberekeningen.

5. Generatie en/of validatie van een Cas9-expressieve stabiele cellijn

OPMERKING: Deze stap is vereist bij het gebruik van LentiGuide_EPIKOL. Als er al een gevalideerde Cas9-stabiele lijn beschikbaar is, of als LentiCRISPR_v2_EPIKOL wordt gebruikt, ga dan direct door naar Sectie 6.

1. Produceer Cas9-lentivirus met behulp van de LentiCas9_blast vector zoals beschreven in sectie 2.
2. Infecteer de volgende dag cellen, met een MOI van 10. Bereken de hoeveelheid virus volgens de beoogde MOI in sectie 4, gebruik de berekende hoeveelheid virusvolume en geef deze direct aan de cellen in de plaat die kweekmedium bevat met 8 μg/mL Protamine sulfaat (PS).
3. Vervang viraal medium door vers medium 16 uur na infectie
4. De volgende dag breng je blasticidineselectie toe door cellen het kweekmedium te geven met de eerder vastgestelde concentratie blasticidine (de uiteindelijke concentratie bepaald per cellijn met een cellevensvatbaarheidstest zoals beschreven in sectie 3) totdat niet-geïnfecteerde cellen zijn geëlimineerd (meestal 6–7 dagen).
   OPMERKING: Als Cas9-expressieve cellen gedurende langere periodes vóór screening worden gekweekt, herhaal dan blasticidineselectie om Cas9-negatieve cellen te elimineren.
5. Cas9-validatie (aanbevolen): Valideer Cas9-activiteit met behulp van controle-sgRNA's die zich richten op essentiële genen (sgRNA-sequenties zijn beschikbaar binnen de EPIKOL-bibliotheek; zie aanvullende tabel 3) of rapportagesystemen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) om de knockout-efficiëntie en kinetiek te beoordelen. Gedetailleerde validatiemethoden zijn te vinden in een eerdere studie¹⁹.

6. Epigenoom-brede CRISPR-eliminatie, lentivirale bibliotheekinfectie en screening

OPMERKING: Om nauwkeurige genotype-naar-fenotype mapping te garanderen, vereisen gepoolde CRISPR-screens een laag-MOI infectie en voldoende bibliotheekdekking (meestal 500×–1000), afhankelijk van experimentele strengheid en cellijngedrag. Voor algemene principes van gepoolde, genoombrede CRISPR-screeningsworkflows, inclusief bibliotheekontwerp en experimentele opstelling, zie eerder gepubliceerde protocollen^21,22. Voor EPIKOL wordt sterk aanbevolen om gedurende de screening >500x dekking te behouden, omdat onder deze drempel het risico op stochastische sgRNA-uitval toeneemt, vooral in de drugsbehandelarm van de screening. De volgende berekeningen zijn nodig om het startcelnummer, transductie-efficiëntie en virale volume te bepalen die nodig zijn voor EPIKOL-transductie om een laag-MOI infectie uit te voeren zonder de bibliotheekcomplexiteit in gevaar te brengen.

1. Dag -1: Zaai een totaal aantal cellen, berekend hieronder in 100 mm of 150 mm celkweekschaaltjes met een passend aantal cellen per plaat.
   1. Bereken het aantal succesvol geïnfecteerde cellen om de gewenste bibliotheekdekking te bereiken (gebruik Aanvullende Tabel 2 als sjabloon):
      N_{geïnfecteerd} = (aantal sgRNA's) × (doelbedekking)
   2. Bereken het startcelaantal per replicate om het aandeel niet-geïnfecteerde cellen bij een lage MOI (0,3–0,4) infectie te compenseren:
      N_beginnend = N_{geïnfecteerd}/p
      waarbij p de transductiesnelheid is (aandeel geïnfecteerde cellen) bepaald op basis van Poisson-verdeling (zie stap 4.6).
      OPMERKING: Deze aanpassing zorgt ervoor dat er bij een laag-MOI infectie voldoende aantal enkele sgRNA-geïnfecteerde cellen aanwezig zal zijn in de pool om de gewenste bibliotheekdekking te bereiken.
2. Dag 0 - Transductie
   1. Bereken het benodigde virale volume per replica
      Benodigd viraal volume = (N_beginnend × MOI) / (Virale Titer (voorheen bepaald ip/mL))
      OPMERKING: Transductie-efficiëntie bij het doel-MOI-bereik van 0,3–0,4 komt ongeveer overeen met
      26%–33% puromycineresistente cellen vóór selectie.
   2. Cellen infecteren met het berekende virale volume in het volledige kweekmedium dat 8 μg/mL Protaminesulfaat (PS) bevat. Verminder het mediavolume om het contact tussen viruscellen en viruscellen tijdens infectie te vergroten (bijvoorbeeld 8 mL in plaats van 10 mL voor een plaat van 100 mm)
   3. Bereid onafhankelijke infectiemengsels voor voor elke biologische replicatie.
      OPMERKING: Ten minste twee biologische replicaten worden aanbevolen; Drie worden geprefereerd. Biologische replicaten moeten afzonderlijk worden getransduceerd, geselecteerd en onderhouden (inclusief mediawijzigingen en passaging) en mogen op geen enkel moment vóór sequencing worden samengevoegd.
3. Dag 1 - Vervang virale media door verse media na 16 uur en incubeer bij 37 °C met 5%_CO2
4. Dag 2 - Selectie van getransduceerde cellen: Toepassing van puromycineselectie in aanwezigheid van verapamil (concentraties bepaald in stap 3.2) om sgRNA-geïnfecteerde cellen in SUM159PT Taxol-resistente cellen te verrijken. Blijf selecteren totdat alle cellen in de niet-geïnfecteerde controleplaat zijn geëlimineerd (meestal ~3 dagen).
5. Dag 5 - T₀ Referentiemonster: Na voltooiing van puromycine + verapamil selectie, trypsiniseer je de cellen en verzamel je een initiële timepoint time zero (T₀) celpellet van elke biologische replica die overeenkomt met het dekkingsniveau dat tijdens transductie is bepaald. Omdat het dient als referentie voor de initiële bibliotheekdistributie, verzamel celpellets zodra de selectie is voltooid, voordat er celverlies plaatsvindt. Zaad voldoende celaantallen om de dekking te behouden op elk moment.
   OPMERKING: Na puromycine + verapamil selectie zal het aantal overgebleven getransduceerde cellen variëren afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellijn en de bereikte transductie-efficiëntie. De overlevende populatie herstelt zich doorgaans tot de oorspronkelijke zaaidichtheid na voltooiing van de selectie en kan deze overtreffen in sneller groeiende cellijnen. Als het overgebleven celnummer het toelaat, verzamel dan meerdere T_0-pellets en vries reservemonsters in bij -80 °C. Daarnaast kunnen met EPIKOL geïnfecteerde cellen worden gecryoppreserve in vloeibare stikstof terwijl de dekking behouden blijft. Deze reservevoorraden kunnen worden ontdooid in geval van een onverwachte screening failure of voor toekomstige alternatieve experimentele benaderingen (bijvoorbeeld het testen van aanvullende medicamenteuze behandelingen). Controleer de transductie-efficiëntie met een niet-geïnfecteerde besturingsplaat om te bevestigen dat de beoogde transductie-efficiëntie is bereikt (zie sectie 4). Als de waargenomen transductie-efficiëntie hoger is dan verwacht, start het experiment opnieuw om te garanderen dat de transductie bij een lage MOI wordt uitgevoerd, waardoor meerdere sgRNA-integratie per cel wordt voorkomen.
6. Screening-uitvoering: Na voltooiing van Cas9-gemedieerde genoombewerking, voor de duur bepaald in sectie 5, splitst men de cellen in behandelgroepen.
   OPMERKING: Dit duurt doorgaans 7–9 dagen na transductie, aangezien de maximale knockout-efficiëntie ongeveer wordt bereikt op post-transductie dag^7-23. Voor epigenetische doelwitten maakt een 9-daags venster ook veranderingen op chromatineniveau mogelijk vóór de start van de geneesmiddelselectie.
   1. Splits cellen in experimentele armen terwijl je dekking behoudt: de ene is de controlearm die een basisaandoening is die DMSO ontvangt, en de andere is de behandelarm die Taxol ontvangt.
   2. Onderhoud van culturen voor 14–16 verdubbelingen van de bevolking. Het bevolkingsverdubbelingsniveau (PDL) wordt als volgt berekend:
      PDL = PDL_s + 3,322 (log C_f – log C_i)
      PDL_s = startpopulatieverdubbelingsniveau
      C_i = het initiële celnummer dat wordt gezaaid
      C_f = totaal aantal cellen aan het einde van een groeiperiode
   3. Controleer bij elke passage de levensvatbaarheid en groeikinetiek en vermijd knelpunten door voldoende celaantallen te behouden. Pas de intensiteit van de behandeling aan als er overmatige celdood optreedt.
      OPMERKING: Streef ernaar om bij elke passage back-up celpellets te verzamelen, wekelijks of bij bepaalde PDL's tijdens het scherm. Deze back-upmonsters kunnen dienen als alternatieve tijdspunten voor sequencing of als optimalisatiemonsters voor het genomische DNA-extractieproces. Cryoppreserve cellen periodiek om onverwacht celverlies te voorkomen.
7. _T-laatste bemonstering: Na het bereiken van de gewenste PDL, verzamel je eind-tijdpuntpellets (_T-finale) voor elke replica en conditie door de bibliotheekdekking per pellet te behouden. Bewaar pellets bij -80 °C tot de volgende gDNA-extractie.
   OPMERKING: Streef ernaar het scherm te beëindigen bij vergelijkbare PDL's tussen armen, zelfs als de kweekduur per situatie verschilt.

7. Genomische DNA-extractie

1. Extracteer genomisch DNA (gDNA) met een gevalideerde methode (bijv. MN NucleoSpin Tissue Kit), met kleine protocolaanpassingen om de lysisefficiëntie van grote, samengevoegde celpellets te verbeteren.
   1. Volg het weefselprotocol in plaats van het celprotocol vanwege de grote korrelgrootte. Overweeg het verhogen van de reagensvolumes en het gebruik van meerdere spinkolommen per celpellet (niet meer dan 5 × 10 à⁶ cellen per kolom) indien nodig om efficiënte lyse te garanderen.
      OPMERKING: Voorafgaand aan de lysis kan het opnieuw suspenderen van de pellet met een minimale hoeveelheid PBS (~50 μL) de lysisefficiëntie verbeteren. Onvolledige lysatie van de pellet kan de spinkolom verstoppen, wat resulteert in een verminderde DNA-opbrengst.
   2. Volg de aanbevelingen voor hoog-opbrengst en hoge concentratie-elusie. Eluteer gDNA in een verminderd volume elusiebuffer (ongeveer 2/3 van het aanbevolen volume) per kolom, vooral als celpellets in meerdere kolommen zijn verdeeld.
2. Meet de kwaliteit en hoeveelheid van gDNA (bijv. Nanodrop).

8. EPIKOL-sequencing bibliotheekvoorbereiding uit genomisch DNA

1. Gebruik een speciale PCR-kast om alle bibliotheek-PCR-stappen uit te voeren en plasmidbesmetting tijdens gDNA-PCR's te voorkomen, omdat de plasmidesjabloden efficiënter amplificeren dan genomisch DNA en de sgRNA-distributie kunnen vervormen.
   1. Maak de werkplek, micropipetten en rekken schoon met respectievelijk 10% bleekmiddel en 70% ethanol.
   2. Aliquot alle reagentia (vooral primers) in eenmalige hoeveelheden vóór gebruik om het risico op kruisbesmetting en vries-dooicycli te verminderen.
   3. Bewaar reagentia bij -20 °C en houd ze op ijs tijdens het PCR-opzetten.
2. Optimaliseer het startvolume van gDNA-invoer door te mikken op een dekking van 200×–500× per sgRNA om een passende bibliotheekcomplexiteit te behouden. Voorbeeld: Voor de EPIKOL-bibliotheek worden gDNA's bij voorkeur extraherd uit celpellets die zijn verzameld met een dekking van 1000×, en de uiteindelijke dekking van 250× wordt gebruikt voor gDNA-amplificatie.
   1. Bereken de vereiste gDNA-invoer voor de gewenste dekking als volgt.
      gDNA-hoeveelheid = (Aantal sgRNA's) × dekking × (66pg DNA/kern)
      Voorbeeld: 8000 gRNA × (250× dekking) × (6,6 pg DNA/kern) = 13,2 μg gDNA/monster moet worden geamplificeerd.
   2. Voer een test-PCR uit met externe en interne PCR-reactiecondities in Tabel 3, Tabel 4, Tabel 5 en Tabel 6 met toenemende hoeveelheden gDNA per reactie (bijv. 1 μg, 3 μg, 6 μg) om de optimale hoeveelheid gDNA per buis te bepalen.
      OPMERKING: Onvoldoende gDNA-invoer of overmatige PCR-cyclus kan amplificatiebias veroorzaken en de sgRNA-dekking vervormen.
   3. Voer een 2% agarosegel uit om interne PCR-producten te analyseren. Zorg ervoor dat er een heldere band van ongeveer 350 bp wordt waargenomen.
   4. Op basis van de optimale gDNA-hoeveelheid per buis bepaal men het totale aantal PCR-reacties dat per monster nodig is om de gewenste bibliotheekdekking te bereiken, terwijl overmatige hoeveelheden gDNA per individuele reactie worden vermeden.
      OPMERKING: Als 13,2 μg totale gDNA vereist is en 3,3 μg gDNA per reactie optimale amplificatie oplevert, bereid dan vier parallelle PCR-reacties voor met 3,3 μg gDNA in een reactievolume van 100 μL. In deze context mag het volume van gDNA niet meer dan 10% van het reactievolume overschrijden om PCR-remming door overmatige template-invoer te voorkomen.
3. Versterk sgRNA-cassettes uit een gDNA-sjabloon (Eerste/Externe PCR)
   1. Versterk genomische regio's die de stabiel geïntegreerde lentivirale sgRNA-cassette bevatten met behulp van de primers die in Aanvullende Tabel 2 zijn vermeld. Voer PCR-reacties uit met de hoeveelheid gDNA bepaald in stap 8.2 (zie Tabel 3) door gebruik te maken van de PCR-reactievoorwaarden in Tabel 4. Bereid een PCR-controlebuis voor zonder sjabloon-DNA om mogelijke besmetting te controleren, en houd de buisjes altijd op ijs.
   2. Voeg tenslotte DNA-polymerase toe, meng goed door te tappen of te pipetten, en draai de PCR-buizen kort door voordat je ze in de thermische cycler doet. Voer een hotstart uit om niet-specifieke versterking te voorkomen.
   3. Na voltooiing van de externe PCR worden alle PCR-reacties in één microcentrifugebuis gebundeld. PCR-opruiming of gelvisualisatie na externe PCR is niet nodig. Gebruik het gepoolde PCR-product direct als sjabloon in de tweede (interne) PCR. Bewaar PCR-producten op -20 °C.

Reagens	Volume per reactie
dNTP (10 mM elk)	2 μL
Phusionpolymerase	1 μL
6' GC Buffer	20 μL
Voorste primer (10 μM)	5 μL
Omgekeerde primer (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Nucleasevrij water	tot 100 μL (67–X μL)
Totaal	100 μL

Tabel 3: Benodigde reagentia voor de eerste/externe PCR.

Cyclusnummer	Denaturering	Gloeien	Uitbreiding
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabel 4: PCR-voorwaarden voor de eerste/externe PCR.

4. Voer indexbarcodering uit (Second/Internal PCR) en gelextractie
   1. Tijdens de tweede (interne) PCR wordt een omgekeerde indexprimer gebruikt om de monsters als barcode te markeren; Gebruik daarom verschillende indexprimers voor elk monster.
      OPMERKING: Voor bibliotheken die zijn gegenereerd met de pLentiCrispr v2 backbone, gebruik reverse index primers die eindigen met CT-bases, gelabeld als lenticrisprv2_rev(index X) (zie Aanvullende Tabel 2).
   2. Voor bibliotheken die zijn gegenereerd met de pLentiGuide-backbone , gebruik indexen die eindigen met GT-bases en zijn gelabeld als rev_index_X in Aanvullende Tabel 2.
   3. Bereid een voorste gespreide primermix voor door 2 μL uit elk van de negen verspringende primers (standaard 100 μM) te combineren en 162 μL nucleasevrij water toe te voegen aan een steriele microcentrifugebuis. De uiteindelijke concentratie van het primermengsel zal 10 μM zijn.
   4. Gebruik het gepoolde externe PCR-product als invoer en voer twee parallelle interne PCR-reacties van 100 μL per monster uit met behulp van de instructies in Tabel 5 en Tabel 6. Bereid een PCR-controlereactie voor met de 'Geen sjabloon DNA'-controle van externe PCR (stap 7.3) als input om mogelijke besmetting te monitoren.
   5. Voeg tenslotte DNA-polymerase toe, meng goed door te tappen of te pipetteren, draai de PCR-buizen kort door voordat je ze in de thermische cycler doet. Voer een hotstart uit om niet-specifieke versterkingen te voorkomen.
   6. Combineer en voer interne PCR-reacties uit in 2% agarosegel om de doelamplicon te scheiden.
      OPMERKING: Er mogen geen banden worden gedetecteerd in de PCR-besturing zonder sjabloon. Er moet een duidelijke band van ongeveer 337 bp voor LentiCrispr_V2 en 357 bp voor LentiGuide-bibliotheken worden geobserveerd. Een bovenste niet-specifieke band van ongeveer 500 bp kan ook aanwezig zijn en moet worden uitgesloten van downstream verwerking.
   7. Laad 12 μL (10 μL PCR-product + 2 μL laadkleurstof) van het interne PCR-product om de banden te visualiseren, en laad de rest van het PCR-product in samengevoegde of aangrenzende putten die zijn bestemd voor gelextractie. Minimaliseer de dikte van agarose om het DNA-herstel te maximaliseren. Vermijd het overbelichten van de gelextractiebanen tijdens het visualiseren om de door UV veroorzaakte DNA-schade tijdens de gel-excisie te minimaliseren.
   8. Zuiver PCR-producten van agarosegel met een specifieke gelextractiekit (bijv. NucleoSpin Gel en PCR Clean-up) volgens de instructies van de fabrikant. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Bewaar PCR-producten op -20 °C.
      OPMERKING: Een minimale concentratie van >20 ng/μL na gelextractie is vereist voor een juiste sequencing. Als het vereiste resultaat zelfs niet kan worden bereikt met drie parallelle interne PCR-reacties, isoleer dan nieuw gDNA en herhaal het proces.

Reagens	Volume per reactie
dNTP (10 mM elk)	2 μL
Phusionpolymerase	1 μL
6' GC Buffer	20 μL
Voorste Stagger Mix primer (10 μM)	5 μL
Omgekeerde Index Primer (10 μM)	5 μL
Externe PCR	5 μL
Nucleasevrij water	62 μL
Totaal	100 μL

Tabel 5: Vereiste reagentia voor de tweede/interne PCR.

Cyclusnummer	Denaturering	Gloeien	Uitbreiding
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tabel 6: PCR-condities voor de tweede/interne PCR.

9. Sequencing

1. Bepaal het vereiste aantal toegewezen lezingen op basis van de bibliotheekdekking die aan het begin van het scherm is gedefinieerd. Uitgaande van een mapping-efficiëntie van 60%–70%, vraag dan om een hoger aantal totale reads om het leesverlies te compenseren. Voor 1000× dekking van de EPIKOL-bibliotheek zijn ~8 miljoen toegewezen lezingen vereist, wat overeenkomt met 10–12 miljoen totale lezingen.
2. Voer kwaliteitscontrole uit van de sequencingbibliotheken met behulp van Tapestation of Bioanalyzer vóór het sequencen om de bibliotheekgrootte en integriteit te bevestigen.
3. Poolen bibliotheken uit verschillende samples vóór het sequencen, omdat deze uniek zijn gebarcoded met indexprimers.
4. Bevestig de leesstructuur (R1/R2-oriëntatie) en demultiplexvereisten met de sequencing-faciliteit. 2× 150 bp gepaarde sequencing wordt voorgesteld in Illumina HiSeq, Novaseq of een equivalent Illumina-compatibel sequencingplatform. Overweeg om minstens 5% PhiX spike-in aan te vragen om de sequencingdiversiteit te verbeteren.

10. Overzicht van sequencinganalyse voor EPIKOL

1. Gebruik de MAGeCK-analysepijplijn om gepaarde FASTQ-bestanden te analyseren²⁴. Organiseer elke biologische replicatie als een individueel invoerbestand.
2. Gebruik het sgRNA-invoerbestand van EPIKOL dat compatibel is met MAGeCK als referentiebibliotheek (verstrekt in Aanvullende Tabel 4) en pas de telfunctie toe om sgRNA-lezingen uit individuele FASTQ-bestanden te kwantificeren om ruwe telbestanden te maken voor elke replicate en conditie.
   1. Normaliseer elk telbestand met behulp van Reads per million (RPM) normalisatie om de kwaliteit en distributie van elk monster te controleren door de genormaliseerde sgRNA-tellingsgrafieken¹⁴ te visualiseren.
3. Voer een tweede -telling functie uit om tellingen samen te voegen tot één bestand met mediaannormalisatie en standaardinstellingen.
4. Voer de functie -test uit om genniveauwijzigingen te identificeren met behulp van samengevoegde ruwe tellingbestanden. Om de screenprestaties te evalueren, vergelijk_{T-eindmonsters} met de T_0-monsters en controleer je de verdeling van niet-gerichte controle- en essentiële gengerichte sgRNA's.
   OPMERKING: Het is cruciaal om de uitputting van positieve controlegenen in elke screenarm te beoordelen om de screenprestaties te evalueren. Er wordt verwacht dat er biologische variabiliteit zal zijn tussen replicaten in de door medicijnen behandelde screengroep, aangezien blootstelling aan geneesmiddelen stochastische verschillen in cellulaire respons kan veroorzaken. Deze variabiliteit is inherent aan chemoresistentiescreens en duidt niet noodzakelijkerwijs op een slechte screenkwaliteit. Daarom moeten tijdens hit-calling minstens drie biologische herhalingen samen worden geanalyseerd, en moeten hits worden bepaald als genen met minstens 6 effectieve sgRNA's van de 10.
5. Om door medicijnen veroorzaakte veranderingen in sgRNA-abundanties en gen-niveau effecten te identificeren, vergelijk T_final-Taxol behandelde monsters met T_final-DMSO, waarbij de DMSO-groep als controlegroep wordt gebruikt.
6. Pas een false-discovery rate (FDR) cutoff van FDR < 0,05 toe om uitgetaste genen in de behandelgroep te identificeren en zo de genen te onthullen die bijdragen aan de fitness of weerstand van de Taxol-resistente cellen.

Resultaten

Om epigenetische regulatoren van chemoresistentie in TNBC te bestuderen, wordt het algemene protocol met de SUM159PT cellijn weergegeven in Figuur 1. Eerst werden de IC₁₀ - en IC_50-waarden van Taxol in SUM159PT cellen bepaald door de cellen met toenemende concentraties Taxol te behandelen (Figuur 2A). Er werd een stapsgewijze dosisverhogingsmethode gebruikt om Taxol-resistente SUM159PT cellen te genereren. Na enkele maanden illustreert een verschuiving in IC50-waarden de succesvolle vestiging van een resistent fenotype met dit protocol in vergelijking met controlecellen die parallel werden doorgevoerd zonder Taxol-blootstelling (Figuur 2B).

Figuur 1: Schema van de EPIKOL-screen in Taxol-resistente SUM159PT cellen. Algemene workflow van EPIKOL-screening in de gegenereerde Taxol-resistente SUM159PT cellen. De figuur is gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zodra de resistente cellen waren gevestigd, werden verschillende experimenten uitgevoerd om hun fenotypische en moleculaire veranderingen te karakteriseren. De proliferatiecapaciteiten van resistente cellen onder Taxol-behandeling werden beoordeeld met een kolonievormingstest in vergelijking met oudercellen. Zoals te zien is in Figuur 2C,D, behouden resistente cellen hun proliferatieve capaciteit onder Taxol-behandeling, terwijl oudercellen niet kunnen overleven. Deze assay is een van de belangrijke stappen bij de karakterisering van resistente cellen en toont aan hoe proliferatieve capaciteit onder medicamenteuze behandeling kan worden beoordeeld tussen ouderlijke en resistente cellen.

Als onderdeel van de karakterisering van resistente cellen werd RNA-sequencing uitgevoerd op ouder- en resistente cellen om de transcriptomische veranderingen die samenhangen met chemoresistentie te analyseren (Figuur 2E). Een van de meest gereguleerde genen in resistente cellen was ABCB1, gevolgd door een paar andere ABC-transporters, waaronder ABCB4 en ABCA5. De upregulatie van ABCB1-expressie werd gevalideerd met kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), en dit illustreert hoe kandidaatgenexpressieveranderingen kunnen worden gevalideerd met qPCR (Figuur 2F).

Figuur 2: Generatie van resistente cellen en hun karakterisering. (A) Schema dat de generatie van Taxol-resistente SUM159PT cellen toont met de dosisverhogingsmethode. (B) Dosis-responscurve die het verschil toont tussen IC50-waarden van ouderlijke en gegenereerde resistente cellen. Ouderlijke IC50 = 6 nM en Taxol-resistente IC50 = 355,4 nM. (C) Kolonievormingstest in aanwezigheid van Taxol. (D) Kwantificering van koloniegebieden in (C.) Tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's post hoc-test werd toegepast met Prism 8 (GraphPad Software). De significantieniveaus werden vastgesteld als *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Vulkaangrafieken tonen differentieel tot expressie gebrachte genen in Taxol-Res-cellen vergeleken met oudercellen, met een afkapwaarde van LFC>2 en p<0,001. (F) qPCR-validatie van ABCB1 mRNA-expressie in oudercellen en Taxol-Res-cellen. P-waarden bepaald door tweezijdige Student's t-test in vergelijking met de controlegroep; **P < 0,01. Paneel A is gemaakt met BioRender.com. Paneel E-figuur is aangepast met toestemming van Yedier-Bayram et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na het aantonen van overexpressie van ABCB1 en andere ABC-transporters in Taxol-resistente cellen en het overwegen van het brede substraatspectrum van ABCB1, werd de aanwezigheid van het MDR-fenotype beoordeeld. Hiervoor werden Taxol-resistente cellen behandeld met meerdere geneesmiddelen die bekende substraten zijn van de ABCB1-transporter en verschillende werkingsmechanismen hebben, en hun medicijngevoeligheid werd geëvalueerd (Figuur 3A,B). In lijn met het waargenomen ABC-transporterexpressieprofiel vertoonden Taxol-resistente cellen ook resistentie tegen Doxorubicine en Vincristine, wat de aanwezigheid van een MDR-profiel bevestigt en illustreert hoe het multidrug resistentiefenotype functioneel kan worden beoordeeld.

Het MDR-fenotype vormt een uitdaging voor de CRISPR-gebaseerde screeningsbenadering, EPIKOL, aangezien de bibliotheek puromycine selecteert om getransduceerde cellen te verrijken. Omdat puromycine uit de cellen kan worden gepompt door ABCB1-gemedieerde geneesmiddelefflux, is de selectie van puromycine mogelijk niet efficiënt in resistente cellen (Figuur 3C). Daardoor kunnen niet-getransduceerde cellen selectie overleven, wat screenresultaten verstoort.

Om deze beperking aan te pakken, werd het selectieproces van chemoresistente cellen met een MDR-profiel geoptimaliseerd voorafgaand aan de EPIKOL-screening. Verapamil, een eerste generatie ABCB1-remmer, werd gebruikt om door ABC-transporter gemedieerde geneesmiddelefflux te blokkeren, waardoor intracellulaire accumulatie van chemotherapeutische middelen of puromycine mogelijk werd (Figuur 3D). Hoewel verapamil alleen geen invloed had op de levensvatbaarheid van de cel, herstelde het de gevoeligheid van het medicijn wanneer het werd gecombineerd met chemotherapeutische middelen (Figuur 3E, F). Evenzo toonden puromycine-killcurves in combinatie met niet-toxische doses verapamil aan dat ABCB1-remming de gevoeligheid voor puromycine herstelt (Figuur 3G,H). Dit zorgt ervoor dat cellen die de selectie overleven, degenen zijn die succesvol worden getransduceerd, in plaats van cellen die aan selectie ontsnappen door ABCB1-gedreven geneesmiddeluitvloei. Het opzetten van een effectieve selectieworkflow in chemoresistente cellen is cruciaal voor betrouwbare EPIKOL-screenresultaten.

Figuur 3: Multidrug resistentiefenotype en effect van verapamil op resistente cellen. Dosisresponscurves die het verschil tonen tussen IC50-waarden van ouderlijke en gegenereerde resistente cellen met (A) Doxorubicine, (B) Vincristine, (C) Puromycine. (D) Schema dat de selectie van Taxol-resistente SUM159PT cellen met en zonder verapamil toont. De figuur is gemaakt met BioRender.com. (E) Cellevensvatbaarheidstest met Taxol-Res cellen om de optimale verapamilconcentratie met Taxol te bepalen. (F) Verapamil resensibiliseert Taxol-resistente cellen voor Taxol. (G) Verapamil verandert de respons van ouderlijke cellen op puromycine niet. (H) Verapamil herstelt de gevoeligheid voor puromycine in Taxol-Res-cellen. Panelen A, B en F zijn met toestemming van Yedier-Bayram et ^al.17 hergebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om nieuwe regulatoren van chemoresistentie bij TNBC te vinden, werd een EPIKOL-screening uitgevoerd met Taxol-resistente SUM159PT cellen, zoals geïllustreerd in Figuur 4A. Omdat resistente cellen langzamer groeien dan oudercellen¹⁷, werden populatieverdubbelingsniveaus gedurende het hele screening gemonitord in zowel Taxol- als DMSO-behandelde groepen om de benodigde tijd te bepalen om 16 populatieverdubbelingen te bereiken (Figuur 4B). Dienovereenkomstig werd de EPIKOL-screening voor de door DMSO behandelde groep afgerond rond dag 35, terwijl de met Taxol behandelde groep nog eens 15 dagen werd gekweekt om hetzelfde verdubbelingsniveau van de populatie te bereiken.

Na sequencing werd de MAGeCK-analysepijplijn gebruikt om het effect van sgRNA's die hetzelfde gen targetten te combineren om de genniveauveranderingen bij knockout²⁴ te onthullen. De EPIKOL-bibliotheek bevat sgRNA's die essentiële genen als positieve controles aanpakken; de eerste kwaliteitscontrolestap was om te beoordelen of deze sgRNA's zoals verwacht waren uitgeput. Watervalgrafieken illustreren de Log2-vouwveranderingen van essentiële genen over verschillende vergelijkingen heen (Figuur 4C–E). Wanneer de laatste tijdspuntmonsters van met DMSO of Taxol behandelde aandoeningen werden vergeleken met het initiële tijdstip, waren bijna alle essentiële genen uitgeput bij knock-out, wat wijst op effectieve screenprestaties (Figuur 4C,D). Deze uitputting wordt echter niet duidelijk waargenomen wanneer de twee eindpuntmonsters (DMSO-behandeld en Taxol-behandeld) met elkaar werden vergeleken, zoals verwacht, aangezien essentiële genen nodig zijn voor celoverleving onder beide omstandigheden (Figuur 4E).

Een alternatieve visualisatie van de schermresultaten is de vulkaangrafiek, die de Log2-vouwveranderingen samen met statistische significantie (de p-waarde of FDR-waarden) toont. In de EPIKOL-screening uitgevoerd in Taxol-resistente cellen werden meerdere positieve controlegenen als significant uitgeput geïdentificeerd, wat de betrouwbaarheid van de screening verder ondersteunt aangezien uitputting van sgRNA's gericht op positieve controlegenen een typische kwaliteitscontrole van een succesvolle screening illustreert (Figuur 4F). Naast essentiële gencontroles bevat de EPIKOL-bibliotheek contextspecifieke positieve controle sgRNA's die zich richten op verschillende ABC-transportergenen. Zoals verwacht benadrukten genormaliseerde tellingen van ABCB1 sgRNA's in verschillende groepen de significante uitputting van ABCB1-gerichte sgRNA's, specifiek in de door Taxol behandelde groep (Figuur 4G). Al met al laat dit zien hoe veranderingen op sgRNA-niveau kunnen worden geïnterpreteerd om kandidaatgenen te identificeren die geassocieerd zijn met de medicijnrespons.

Figuur 4: EPIKOL-screening resulteert in Taxol-resistente cellen en voorbeeldgrafieken. (A) Schema van het EPIKOL-screenprotocol. (b) Populatieverdubbelingsniveau (PDL) van Taxol-Res-cellen. (C–E) Watervalgrafieken tonen resultaten van EPIKOL-screening op Taxol-Res cellen, waarbij essentiële genen worden benadrukt, DMSO-behandelde groep vergeleken met het initiële tijdstip in paneel C, Taxol-behandelde groep vergeleken met het initiële tijdstip in paneel D, Taxol-behandelde groep vergeleken met de DMSO-behandelde groep in paneel E. (F) Vulkaangrafiek die Log2FoldVeranderingen van genen in Taxol-behandelde monsters toont ten opzichte van het initiële tijdspunt. Genen met p<0,05 waren gekleurd en gelabeld. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie¹⁷. (G) Lezen per miljoen (rpm) tellingen van 10 verschillende ABCB1 sgRNA-grafieken van EPIKOL. Paneel A is gemaakt met BioRender.com. Paneel E is hergebruikt met toestemming van Yedier-Bayram et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Probleemoplossingstafel.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: Berekening van virale titer en MOI.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: sgRNA-lijst van de EPIKOL-bibliotheek.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Primers gebruikt bij de voorbereiding van EPIKOL-sequencing-bibliotheken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

CRISPR-Cas9-gebaseerde pooled screeningbenaderingen zijn goed gevestigd in verschillende cellulaire contexten. Screening in chemoresistente cellen brengt echter duidelijke uitdagingen met zich mee en vereist extra optimalisatie. Omdat chemoresistente cellen waardevolle modellen zijn om de kwetsbaarheden van chemoresistente tumoren te bestuderen, is het belangrijk deze beperkingen aan te pakken in screeningsstrategieën om genetische of epigenetische regulatoren van chemoresistentie betrouwbaar te identificeren.

De vorming van chemoresistente cellijnen kan omslachtig zijn en is sterk afhankelijk van het gebruikte chemotherapeutisch middel. Hoewel cellen zich gemakkelijk kunnen aanpassen aan bepaalde medicijnen, kunnen ze zeer gevoelig zijn voor andere²⁵. Daarom is het belangrijk om cellijnspecifieke IC50-waarden te bepalen vóór het protocol voor het generatie van resistente cellenlijnen. In gevallen waarin cellen de blootstelling van IC50-niveau over meerdere passages niet kunnen verdragen, is het mogelijk te beginnen met een lagere medicijnconcentratie (bijv. IC10-20) (zie Protocol sectie 1)¹⁷. Omdat het verkrijgen van resistentie een stochastisch proces is, kunnen meerdere putten/platen van cellen tegelijkertijd worden behandeld om de kans op resistente cellen te vergroten. Het is cruciaal om de verkregen geneesmiddelresistente celpopulatie volledig te karakteriseren om transcriptionele en fenotypische veranderingen tijdens de dosisverhogingsprocedure te beschrijven in vergelijking met hun naïeve toestand. Globale profileringsbenaderingen zoals RNA-seq kunnen worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen ten opzichte van de ouderlijn te identificeren. Functioneel gezien moet verworven geneesmiddelresistentie worden gevalideerd met cellevensvatbaarheids- en proliferatie-assays om aan te tonen dat resistente cellen overleven onder medicatiebehandelingen die cytotoxisch zijn voor oudercellen. Ook moeten mogelijke veranderingen in hun proliferatiecapaciteit en groeisnelheid worden gemeten in vergelijking met de oudercellijn om hun respectievelijke PDL's te berekenen. Aangezien verworven Taxol-resistentie bekend is als gedeeltelijk gemedieerd door ABC-gemedieerde geneesmiddelefflux, moet de expressie van belangrijke ABC-transporters (bijv. ABCB1) worden geëvalueerd op mRNA- en eiwitniveaus met qPCR en Western blotting, en kan worden aangevuld met transcriptomische gegevens. Op basis van het ABC-transporterexpressieprofiel moet de aanwezigheid van het MDR-fenotype worden overwogen, en moet resistentie tegen andere chemotherapeutische middelen worden beoordeeld. In onze vorige studie karakteriseerden we de Taxol-resistente cellijnen en identificeerden we ABCB1 als een van de meest gereguleerde genen, en redeneerden we dat ABCB1-gemedieerde multigeneesmiddelresistentie kan leiden tot falen in puromycineselectie¹⁷. Daarom moet na de vorming van resistente cellen de expressie van ABC-transporters en het MDR-fenotype worden beoordeeld voordat elke transfectieprocedure wordt uitgevoerd.

De dosis-escalatiemethode biedt voordelen ten opzichte van hoge doses blootstellingsprotocollen, omdat cellen bij elke stap kunnen worden gecryoppreserve voordat de medicijndosis wordt verhoogd, wat flexibiliteit biedt en kweekverlies voorkomt. Bovendien maakt geleidelijke dosisverhoging het mogelijk om resistentiefenotypen in de loop van de tijd te verwerven, wat adaptieve evolutie mogelijk maakt; in tegenstelling tot acute behandeling met hoge doses, die resulteert in selectie van reeds bestaande resistente subpopulaties. De stapsgewijze progressie stelt onderzoekers in staat bewust het gewenste weerstandsniveau te kiezen waarbij de selectie kan stoppen en de eigenschappen van het resulterende fenotype te evalueren. Ook kunnen de tussenliggende stappen van de dosisverhoging worden ingezet om mechanismen van verworven resistentie in een tijdsloop te bestuderen. Volgens de onderliggende biologische vraag konden verschillende resistentieniveaus worden verkregen om vroege adaptieve mechanismen met lagere resistentieniveaus te bestuderen of stabiele en volledig gevestigde resistentiefenotypen in resistentere cellen. Bovendien variëren klinisch relevante resistentiedrempels aanzienlijk afhankelijk van het geneesmiddel, de cellijn en de intrinsieke proliferatiesnelheid; daarom kan de tijdlijn van dosisverhoging dienovereenkomstig verschillen (in ons geval duurde de generatie van Taxol-resistente cellen ongeveer 6 maanden). In overeenstemming met deze redenering hebben we in onze vorige studie twee verschillende niveaus van resistentie vastgesteld met SUM159PT cellen en hun onderscheiden en gedeelde kenmerken^{vergeleken 17}. Daarom raden we aan dat onderzoekers het doelbereik van IC50 van het geneesmiddel van belang definiëren op basis van klinische en biologische relevantie.

Het is goed bekend dat het terugtrekken van medicijndruk kan leiden tot verlies van chemoresistentie, omdat cellen hun epigenoom en transcriptoom²⁵ kunnen herbedraad. Om deze reden wordt aangeraden om de stabiliteit van het resistentiefenotype over meerdere maanden te beoordelen. Als cellen bij het onttrekken van het medicijn geneigd zijn terug te keren naar een gevoelige toestand, kunnen resistente cellen worden gekweekt in aanwezigheid van de onderhoudsdosis, die doorgaans overeenkomt met de uiteindelijke geneesmiddelconcentratie die tijdens resistentiegeneratie wordt gebruikt, om hun resistentiefenotype te behouden. Hoewel in vitro chemoresistente cellijnmodellen praktisch, reproduceerbaar en veel gebruikt zijn voor het bestuderen van verworven chemoresistentie, kunnen ze mogelijk niet volledig de fenotypische heterogeniteit die bij patiënttumoren wordt waargenomen reproduceerend en missen ze de tumormicro-omgeving, immuuninteracties en ruimtelijke heterogeniteit ^3,4,25. Bovendien kan langdurige passaging tijdens de resistentiegeneratie genetische en epigenetische veranderingen veroorzaken die afwijken van die waargenomen in patiëntmonsters, wat mogelijk de translationele relevantie van geïdentificeerde hits beperkt. Daarom moeten kandidaatgenen en mechanismen die via dit protocol zijn geïdentificeerd, verder worden gevalideerd in meer klinisch relevante experimentele systemen, zoals co-cultuurmodellen, door patiënten afgeleide organoïden of in vivo-studies. EPIKOL biedt voordelen door zijn gefocuste aard als complementaire screenings op deze modellen moeten worden uitgevoerd, waarbij het maximale aantal cellen dat kan worden verkregen inherent beperkt is.

Chemoresistente cellen groeien vaak langzamer dan hun ouderlijke tegenhangers, wat een praktische uitdaging kan vormen voor genoom-brede screenings die grote celpopulaties vereisen om bibliotheekdekking te behouden. Gefocuste bibliotheken zoals EPIKOL bieden het voordeel om een screen uit te voeren met minder startmateriaal, terwijl ze een grotere sgRNA-diepte per gen bieden, waardoor de gevoeligheid en reproduceerbaarheid binnen het gedefinieerde doelgebied verbeteren. EPIKOL bevat echter opzettelijk alleen epigenetische resistentiemechanismen en dekt niet niet-epigenetische bijdragers aan chemoresistentie. De keuze van bibliotheek moet daarom worden geleid door eerdere experimenten en de specifieke biologische vraag. Gebruikers van deze bibliotheken moeten zich bewust zijn van de beperkingen van de gerichte bibliotheken en de resultaten binnen de reikwijdte van de bibliotheek interpreteren.

Een belangrijke barrière bij CRISPR-screening van chemoresistente modellen is het ontstaan van het MDR-fenotype, aangedreven door ABC-transporter-upregulation ^9,10. Verschillende ABC-transporters mediëren de efflux van verschillende substraten. Zodra een medicijnresistente cellijn is gegenereerd, is het belangrijk te beoordelen of resistentie zich ook uitstrekt naar andere chemotherapeutische middelen. Puromycineresistentie wordt voornamelijk veroorzaakt door overexpressie van ABCB1, wat het selectieproces van de gepoolde CRISPR-screeningsmethoden beïnvloedt, aangezien de meeste van deze bibliotheken puromycine-selectiecassettes bevatten voor verrijking van getransduceerde cellen. Hier gebruikten we verapamil, een eerste generatie ABCB1-remmer, om intracellulaire ophoping van puromycine te faciliteren en selectief de niet-transduceerde resistente cellen te elimineren die anders aan de selectie zouden ontsnappen door ABCB1-gemedieerde geneesmiddelefflux. Omdat verapamil ABCB1 reversibel bindt, wordt de ABCB1-functie binnen enkele uren hersteld na verwijdering van verapamil. Daarom geeft verapamil tijdens de daaropvolgende medicatiefase van de screening geen extra kwetsbaarheid voor resistente cellen. Er moeten echter verschillende beperkingen van verapamil worden erkend. Omdat verapamil een remmer is van calciumkanalen en andere transporters, kan het de cellulaire fysiologie beïnvloeden voorbij ABCB1-remming¹⁰. Daarnaast varieert de effectieve verapamilconcentratie tussen cellijnen en MDR-modellen, afhankelijk van het niveau van ABCB1-expressie en de activiteit van andere transporters. Daarom moet de verapamilconcentratie voor elke cellijn worden geoptimaliseerd, en kan een nieuwe generatie ABCB1-remmers die specifieker zijn voor ABCB1 worden overwogen als off-target effecten een zorg zijn. Als een andere cruciale stap moet virale titering worden uitgevoerd op de resistente cel zelf in plaats van op de ouderlijke tegenhangers, omdat de infectiviteit en selecteerbaarheid vaak verschillen voor resistente cellen.

Een andere belangrijke overweging is het bepalen van de juiste duur van de screening, aangezien chemoresistente cellen vaak langzamer groeien dan hun gematchte ouderlijke tegenhangers²⁶. Om dit verschil te compenseren, maakten we gebruik van populatieverdubbelingsniveauberekeningen (Protocol sectie 6) om te beoordelen wanneer de controle- en behandelgroepen de gewenste PDL-drempel bereikten. Screenings kunnen daarom op verschillende dagen worden beëindigd, waardoor vergelijkbare populatieverdubbelingen mogelijk zijn en de interpretatie van sgRNA-effecten in de behandelgroep veiliger kan worden geïnterpreteerd.

PCR's voor bibliotheekvoorbereiding zijn van groot belang voor de nauwkeurigheid van de downstream hit-identificatie. Bias geïntroduceerd door lage gDNA-input en verhoogde PCR-cycli kan leiden tot amplificatie van bepaalde sgRNA-sequenties, wat leidt tot vals-positieve verrijking of uitputting. Om dit te beperken, raden we aan om zoveel mogelijk gDNA te gebruiken, zich te houden aan de PCR-cyclusnummers die door dit protocol worden aangeboden, en parallelle reacties uit te voeren om te poolen voordat het sequenced wordt geïnvesteerd. Waar mogelijk mag bibliotheekdekking niet onder de aanbevolen drempels (>300× dekking) vallen om betrouwbare detectie van uitgepundte sgRNA's te garanderen in plaats van stochastische uitval van lage abundantie van sgRNA's door lage dekking.

Na sequencing gebruikten we het MAGeCK-analysekader en voerden we verschillende downstream kwaliteitscontroleanalyses en stappen van data-interpretatie^uit. Ten eerste werd principal component analysis (PCA) gebruikt om de distributie en reproduceerbaarheid van biologische replicaten te beoordelen (gegevens niet getoond, MAGeCK-output). Replicate clustering in PCA wordt binnen elke arm verwacht; Echter, een hogere variabiliteit in de door medicijnen behandelde groep is een veelvoorkomend kenmerk van chemoresistentiescreenings, omdat het medicijn stochastische veranderingen kan veroorzaken. Als de positieve en negatieve controles zich in elke arm gedragen zoals verwacht, voorkomt deze variabiliteit niet dat echte positieve treffers worden geïdentificeerd. Vervolgens werd reads per million (RPM) normalisatie van sgRNA-tellingen op de initiële en laatste tijdstippen toegepast om te evalueren of sgRNA's die essentiële genen aanpakken zoals verwacht^{waren uitgeput 14}. Vervolgens werd mediane normalisatie gebruikt om sgRNA-niveau effecten te aggregeren, waardoor genniveau-depleties werden geïdentificeerd²⁴. Genniveau-depletion scores werden visualiseerd met behulp van watervalplots, die genen rangschikken van de meest uitgeputte tot de verrijkte. Wijzigingen in het kopienummer en polyploïdie als gevolg van langdurige blootstelling aan medicijnen kunnen de screenresultaten verstoren door inefficiënte of overmatige Cas9-schrijving²⁷. Hoewel EPIKOL zich richt op chromatineregulatoren die doorgaans niet onderworpen zijn aan door Taxol aangedreven amplificaties, raden wij aan om de ploidiestatus en veranderingen in het aantal kopieën in de resistente cellen te beoordelen vóór screening. Als er wijzigingen in kopienummers worden vermoed, kunnen computationele correctietools zoals CRISPRcleanR of CERES worden toegepast tijdens MAGeCK-analyse.

Bij screenings met twee experimentele groepen, controle- en behandelgroepen, zijn verschillende vergelijkingen nodig om screenprestaties en biologische afhankelijkheden correct te interpreteren¹⁷. Eerste tot eindvergelijkingen zijn geschikt om de screenprestaties te beoordelen, inclusief het verwachte gedrag van essentiële genen en niet-doelgerichte controles. De vergelijking van het eindpunt van de controlegroep (DMSO) met het initiële tijdstip maakt het mogelijk genen te identificeren die nodig zijn voor de groei en fitheid van resistente cellen zonder medicijndruk. Daarentegen onthult de vergelijking van twee eindpuntmonsters, medicijnbehandeld (Taxol) en controlegroep (DMSO), de specifieke genen die nodig waren voor resistentie tegen het medicijn in plaats van algemene fitheid. Het moet worden opgemerkt dat directe vergelijking van de twee eindpuntmonsters leidt tot een scheve verdeling van essentiële gencontroles, omdat deze nodig zijn voor overleving in beide groepen. Een alternatieve visualisatiemethode zou de Volcano-grafiek kunnen zijn, die log2-voudige veranderingen samen met significantiewaarden toont, waardoor significant uitgeputte genen kunnen worden geïdentificeerd. Zodra de kandidaatgenen zijn geïdentificeerd, zijn genormaliseerde sgRNA-tellingen en visualisatiegrafieken nuttig om de best presterende sgRNA's voor downstream validatietests te bepalen. Voor de EPIKOL-screening raden we aan om kandidaatgenen te prioriteren die worden ondersteund door het concordante gedrag van ten minste 6 op de 10 sgRNA's, omdat dit meer vertrouwen geeft in effecten op genniveau.

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van EPIKOL-screening op Taxol-resistente cellijnen die ABCB1 hebben opgewaardeerd en het MDR-fenotype hebben vertoond. Dit protocol is breed toepasbaar op elk chemoresistent model dat kruisresistentie vertoont tegen puromycine of andere selectieantibiotica, waardoor CRISPR-screening in deze cellen mogelijk wordt. Praktische richtlijnen voor de meest voorkomende technische uitdagingen die zich bij alle protocolstappen voordoen, worden gegeven in Aanvullende Tabel 1.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm plate	Corning	353003	Celcultuur
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Celcultuur
6 well plate	Corning	3506	Celcultuur
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	Voor CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Voor selectie
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Voor CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
DMEM	Gibco		Celcultuur
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Celcultuur
FBS	Gibco	16140071	Celcultuur
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Celcultuur
HEK293T cells			Vriendelijk verstrekt door Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Celcultuur
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Celcultuur
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Celcultuur
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Voor Cas9-stabiele cellijngeneratie
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone voor gRNA klonering
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	Voor genomische DNA extractie
PBS	Gibco	10010023	Celcultuur
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Celcultuur
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone voor gRNA klonering
Polyethyleenglycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Voor lentiviruconcentratie
Polyethyleeniminee, lineair (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Voor lentiviruproductie
Protaminesulfaat (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Voor lentiviruinfectie
psPAX2	Addgene	# 12260	Voor lentiviruproductie
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Voor selectie
SUM159PT adherent cells			Vriendelijk verstrekt door Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Voor res celgeneratie en onderhoud
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Celcultuur
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Voor selectie
VSV-G	Addgene	# 8454	Voor lentiviruproductie