Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Bij zebravis was Mollugin bij veilige doses (≤200 µg/mL) geassocieerd met een verbeterde staartregeneratie, vergezeld door veranderingen in de expressie van apoptose-gerelateerde genen, inflammatoire markers, antioxidant-enzymactiviteit en macrofaag-geassocieerde markers. Deze bevindingen suggereren dat Mollugin de lokale letselrespons tijdens de staartregeneratie van de zebravis kan moduleren.
Mollugin is een natuurlijke naftochinonverbinding met gerapporteerde ontstekingsremmende en antioxidantactiviteiten, maar de rol ervan bij weefselregeneratie is nog onvolledig begrepen. In deze studie werd een model van staartamputatie bij zebravis gebruikt om de effecten van Mollugin op wondherstel en de bijbehorende immuun- en redoxresponsen te onderzoeken. Zebravissenembryo's werden na staartbeschadiging behandeld met Mollugin in concentraties van 22 µg/mL, 66 µg/mL en 200 µg/mL. De behandeling met Mollugin was geassocieerd met een dosisafhankelijk verbeterd herstel van het staartoppervlak, gepaard gaand met een verminderde expressie van apoptose-gerelateerde genen en onderdrukking van pro-inflammatoire mediatoren, waaronder IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 en NF-κB1. Parallel hieraan herstelde Mollugin de antioxidantenzymactiviteiten van superoxidedismutase en catalase. Fluorescentie-imaging in Tg(mpeg1:GFP) zebravis toonde een tijdsafhankelijk effect van Mollugin op de accumulatie van macrofagen, zonder duidelijke vermindering na 24 h, maar met een afgenomen macrofaag-positief areaal na 48 h in de groepen van 66 en 200 µg/mL vergeleken met de beschadigde modelgroep. qRT-PCR-analyse toonde verder een verminderde expressie van de M1-geassocieerde marker iNOS en een verhoogde expressie van de M2-geassocieerde marker arginase-1 aan. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat Mollugin de staartregeneratie bij zebravis kan ondersteunen in verband met veranderingen in ontstekings-, oxidatieve stress-, apoptose-gerelateerde en macrofaag-geassocieerde markers. Verdere studies zijn nodig om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen te definiëren.
Weefselregeneratie is een kritiek fysiologisch proces waarmee organismen schade herstellen, waarbij sprake is van een complexe regulatie van celproliferatie, differentiatie en het behoud van de micro-omgevingshomeostase1. Onder de gewervelde modellen zijn zebravisen een cruciaal systeem geworden voor het bestuderen van wondherstelmechanismen vanwege hun opmerkelijke regeneratieve vermogen. In het bijzonder omvat de regeneratie van de staartvin bij zebravisen de spatiotemporele coördinatie van meerdere biologische gebeurtenissen, waaronder de regulatie van inflammatie, de balans in de oxidatieve respons en de controle van apoptose2,3. In recente jaren zijn de farmacologische activiteiten van natuurproducten een brandpunt geworden in het onderzoek naar regeneratieve geneeskunde. Naftochinonverbindingen zijn in het bijzonder uitgebreid bestudeerd vanwege hun diverse biologische effecten4. Mollugin is een naftochinonverbinding afgeleid van Rubiaceae-planten en heeft in eerdere studies ontstekingsremmende, antioxidatieve en celcyclusregulerende activiteiten vertoond5,6. Het werkingsmechanisme bij weefselregeneratie blijft echter onduidelijk, en de potentiële rol bij het moduleren van de inflammatoire micro-omgeving en immuuncelpolarisatie rechtvaardigt een systematisch onderzoek.
Na een letsel wordt ontsteking snel geactiveerd en beïnvloedt deze direct het weefselherstel. Matige inflammatoire signalering is essentieel voor het opruimen van necrotisch weefsel en het initiëren van het regeneratieprogramma, terwijl een overmatige inflammatoire cascade oxidatieve stress kan verergeren en kan leiden tot weefselfibrose7. Cytokinen, waaronder IL-1β, IL-6 en TNF-α, nemen na letsel aanzienlijk toe en gaan gepaard met de activatie van TLR4/NF-κB-signalering, wat leidt tot versterkte ontstekingsreacties en weefselremodellering8,9. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) en CC chemokine ligand 2 (CCL-2) zijn na letsel eveneens verhoogd en zijn geassocieerd met een toegenomen rekrutering van neutrofielen en macrofagen naar de beschadigde weefsels10. Opmerkelijk is dat een oxidatieve disbalans weefselbeschadiging verder verergert, en verminderde superoxide dismutase (SOD)- en catalase (CAT)-activiteiten wijzen op een beperkte antioxidantcapaciteit2,11.
Macrofagen dienen als belangrijke regulatoren van de inflammatoire micro-omgeving, en hun functionele polarisatie heeft een aanzienlijke impact op het regeneratieve proces12. M1-macrofagen worden geassocieerd met de expressie van induceerbaar stikstofoxide-synthase (iNOS) en inflammatoire activiteit, terwijl M2-macrofagen arginase-1 (Arg-1) tot expressie brengen en gekoppeld zijn aan weefselherstel13,14. Macrofaagpolarisatie wordt beïnvloed door lokale cytokinen, oxidatieve stress en apoptose-gerelateerde signalen. Binnen deze context beïnvloedt het apoptotische regulatienetwerk, bestaande uit B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) familie-eiwitten en caspase-3, niet alleen de celoverleving op de plek van het letsel, maar moduleert het ook indirect het chemotactische gedrag van immuuncellen via de afgifte van "find-me" signalen15. Daarom kan het onderzoeken van interventiestrategieën die gelijktijdig inflammatoire reacties, oxidatieve stress en macrofaagpolarisatie moduleren, helpen bij het verbeteren van weefselregeneratie.
Natuurlijke verbindingen hebben unieke voordelen getoond bij het moduleren van deze biologische processen. Recente studies hebben bevestigd dat naftochinonstoffen, dankzij hun geconjugeerde structuren, het vermogen hebben om vrije radicalen weg te vangen; hun benzochinonkern kan redoxgevoelige signaleringspaden beïnvloeden via elektronentransfermechanismen16,17. Er is gerapporteerd dat mollugin ontstekingsreacties bij DSS-geïnduceerde colitis vermindert, met een lagere productie van pro-inflammatoire cytokinen en een verlaagde TLR4-expressie in colonweefsels18. Mollugin is ook aangetoond in het remmen van TAK1-NF-κB/MAPK-signalering en het activeren van het Keap1-Nrf2-pad in macrofagen6; de impact ervan op de polarisatie van macrofagen en het apoptose-anti-apoptose-netwerk in een in vivo wondmodel is echter nog niet opgehelderd. Bovendien moeten de dosisafhankelijke biologische effecten van mollugin en de regulerende rol ervan tijdens het regeneratieproces nog systematisch worden verduidelijkt.
De huidige studie onderzocht de effecten van Mollugin in een model voor vinstartregeneratie bij zebravis. In het bijzonder hebben we de staartregeneratie, de expressie van apoptose-gerelateerde genen, ontstekingssignalering, antioxidant-enzymactiviteit en macrofaag-geassocieerde responsen na behandeling met Mollugin onderzocht. Onze bevindingen suggereren dat behandeling met Mollugin geassocieerd is met een verbeterde staartregeneratie en veranderingen in meerdere markers voor de letselrespons in dit zebravismodell.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de Ethiekcommissie van het Fuzhou First General Hospital (goedkeuringsnummer 202408002).
Fokken van zebravissen
Alle experimenten werden uitgevoerd met zebravissen (Danio rerio) die werden gehouden onder standaard laboratoriumomstandigheden. Wild-type AB zebravissen werden gebruikt voor de toxiciteitsassay en de regeneratieassay na staartamputatie. Tg(mpeg1:GFP) zebravissen werden specifiek gebruikt voor macrofaagbeeldvorming. Tg(mpeg1:GFP) is een macrofaag-reporterlijn waarin GFP-expressie cellen van de macrofaaglijn markeert onder controle van de in macrofagen tot expressie komende mpeg1-promotor. Alle zebravislijnen werden gehouden bij 28.5 °C onder een licht/donkercyclus van 14 u/10 u. Alleen morfologisch normale embryo's werden gebruikt voor de experimenten. Voor alle experimenten werden de embryo's geïncubeerd in Danieau-buffer, die werd bereid met chemicaliën van reagentiekwaliteit, waaronder NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O en HEPES, ingesteld op pH 7.2.
Bereiding van het geneesmiddel en bepaling van de veiligheid
Mollugin (40 mg) werd opgelost in 1 mL DMSO om een voorraadoplossing van 40 mg/mL te verkrijgen. De voorraadoplossing werd eerst 1:10 verdund in Danieau-buffer tot 4 mg/mL, gevolgd door verdere verdunning tot 22, 66 en 200 µg/mL voor de behandelingen. Om de maximale veilige concentratie te bepalen, werden embryo's van de AB-stam 48 uur na bevruchting (hpf) gedechorioneerd en gedesinfecteerd met 0,003% natriumhypochloriet voordat ze werden verdeeld over 6-wellplaten (n=20, drieplicate wells per groep). De embryo's werden 48 uur lang bij 28,5 °C geïncubeerd met Mollugin (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL of 360 µg/mL) in E3-medium. De overleving werd gecontroleerd onder een stereomicroscoop, en de hoogste concentratie met een embryonale levensvatbaarheid van ≥90% werd vastgesteld als de veilige bovengrens voor daaropvolgende experimenten.
Constructie van het model voor staartamputatie en -regeneratie
Voor regeneratiestudies werden wild-type AB-embryo's van 48 hpf geanestheseerd met 0,03% tricaine bereid in embryo-medium en lateraal geplaatst onder een stereomicroscoop. Voorafgaand aan de staartamputatie werden de embryo's in Danieau's buffer gehouden. Onder begeleiding van een stereomicroscoop werd een gestandaardiseerde transversale staartamputatie uitgevoerd. De amputatielijn werd direct posterior van de tip van de notochord geplaatst, waarbij het posterieure uiteinde van de notochord als anatomisch referentiepunt diende. De staartvinplooi distaal van dit referentiepunt werd met een microscalpel verwijderd om een consistent letselniveau tussen de specimens te garanderen. Direct na de amputatie (0 u) werden beelden vastgelegd met een stereofluorescentiemicroscoop. Na de amputatie werden de embryo's overgebracht naar het overeenkomstige op E3 gebaseerde behandelmedium voor de regeneratie-assay. Werkoplossingen van Mollugin werden bereid door de Mollugin-stockoplossing te verdunnen in E3-medium tot eindconcentraties van 22, 66 en 200 µg/mL. Mollugin werd toegediend via badblootstelling tijdens de regeneratieperiode. Om de blootstelling aan het vehikel gelijk te maken, werden de niet-gewonde controlegroep en de gewonde modelgroep gehouden in E3-medium bevattend 0,5% DMSO, overeenkomend met de uiteindelijke DMSO-concentratie in de 200 µg/mL Mollugin-groep. De embryo's werden 2 dagen in 6-well platen gehouden bij 28,5 °C, met dagelijkse vernieuwing van het overeenkomstige op E3 gebaseerde behandelmedium. De regeneratie werd gedocumenteerd door beeldvorming op 24 en 48 u na de amputatie, onder zowel witlicht- als fluorescentie-instellingen, om de staartteruggroei en de distributie van macrofagen te beoordelen. Beeldmetingen werden uitgevoerd in ImageJ.
Voor de kwantificering van de regeneratie werd het herstelde staartoppervlak gemeten als een absoluut oppervlak in µm2 en werd dit niet genormaliseerd naar de grootte van het embryo of de oorspronkelijke staartgrootte. Om variabiliteit te minimaliseren, werden alle embryo's geamputeerd bij hetzelfde anatomische landmark direct posterieur aan de tip van de notochord, en hetzelfde landmark werd gebruikt om de meetregio tussen de groepen te definiëren. Regions of interest werden handmatig afgebakend in ImageJ op basis van de omtrek van de staart, en de analyse werd uitgevoerd door een onderzoeker die geblinddoekt was voor de behandelingsgroepen. Voor de kwantificering van het macrofaag-positieve oppervlak werden GFP-fluorescentiebeelden van Tg(mpeg1:GFP) embryo's geanalyseerd in ImageJ. Het gebied van staartbeschadiging/regeneratie werd handmatig gedefinieerd als de region of interest met gebruik van hetzelfde anatomische landmark dat werd toegepast voor de meting van het staartoppervlak. Beelden werden omgezet naar 8-bit grijswaarden, en achtergrondfluorescentie werd afgetrokken met dezelfde instellingen voor achtergrondcorrectie voor alle beelden binnen hetzelfde experiment. Vervolgens werd een vaste fluorescentiedrempel uniform toegepast op alle beelden binnen elk experiment om GFP-positieve macrofaag-geassocieerde signalen te identificeren. Het macrofaag-positieve oppervlak werd berekend als het drempelwaarde-positieve GFP-oppervlak binnen de gedefinieerde ROI. De metingen waren gebaseerd op het fluorescentie-positieve oppervlak in plaats van op fluorescentie-intensiteit of handmatige celtelling. Alle beeldanalyses werden uitgevoerd door een onderzoeker die geblinddoekt was voor de behandelingsgroepen.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
Na voltooiing van de regeneratie-assay werden embryo's van elke experimentele conditie verzameld en samengevoegd (minstens 20 embryo's per groep) voor RNA-analyse. Voor elke conditie bestond één biologisch replica uit een samengevoegd monster met minstens 20 embryo's uit dezelfde experimentele groep. Er werden drie onafhankelijke samengevoegde biologische replica's per conditie voorbereid en gebruikt voor de statistische analyse. Totaal RNA werd geïsoleerd na mechanische homogenisatie in een fenol/guanidine-gebaseerd RNA-extractiereagens. De RNA-kwaliteit en -concentratie werden spectrofotometrisch beoordeeld door de A260/A280-ratio's te meten. cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van een commerciële reverse transcriptie-kit. PCR-amplificatie werd uitgevoerd met SYBR Green-reagentia. De qRT-PCR-cycluscondities waren als volgt: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 5 s en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 s. De expressieniveaus van genen gerelateerd aan apoptose (caspase-3 en Bcl-2), inflammatie (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 en ICAM1) en het macrofaagfenotype (iNOS en arginase-1) werden gemeten. β-Actin diende als referentiegen. Fold-veranderingen in genexpressie werden bepaald met de 2−ΔΔCt-methode. De primerinformatie is vermeld in Tabel 1.
Activiteitsassays voor SOD en CAT
SOD- en CAT-niveaus werden gebruikt om de antioxidantstatus na het staartletsel te evalueren. Op 48 u na de amputatie werden zebravissen uit elke groep verzameld en gehomogeniseerd in koud PBS. Na centrifugatie werden de geklaarde extracten gebruikt voor de meting van SOD en CAT met commerciële activiteitsassaykits. De SOD-activiteit werd gemeten met een WST-1-gebaseerde assaykit volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden samen met standaarden op 96-well assayplates geladen, en de absorbentie werd afgelezen met een microplate reader. Enzymactiviteiten werden bepaald aan de hand van standaardcurven. Alle assays werden in triplo uitgevoerd.
Statistische analyse
Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Voor de toxiciteitsassay bestond elk onafhankelijk experiment uit één embryo-batch, met 20 embryo's per groep en triplikaat putjes. Voor beeldvorming van regeneratie en macrofaag-beeldvorming in Tg(mpeg1:GFP) zebravischen werden individuele embryo's als meeteenheden gebruikt, waarbij 10 embryo's per groep werden geanalyseerd. Voor de qRT-PCR-analyse bestond één biologisch replica uit een gepoolde monstername met ten minste 20 embryo's uit dezelfde experimentele groep, en er werden drie onafhankelijke gepoolde biologische replica's per conditie geanalyseerd. Voor de analyse van SOD- en CAT-activiteit werden vijf onafhankelijke gepoolde biologische replica's per conditie geanalyseerd. Groepsverschillen werden geanalyseerd met een éénweg ANOVA met Tukey's post hoc-test. Statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism. Verschillen met p < 0,05 werden als significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Bepaling van toxiciteit en veilige dosis
Om de effecten van Mollugin te onderzoeken, hebben we eerst toxiciteitstesten uitgevoerd. De resultaten gaven aan dat de mortaliteit van zebrafish-embryo's laag bleef bij concentraties tot 200 µg/mL, terwijl bij concentraties boven 200 µg/mL een verhoogde mortaliteit werd waargenomen (Tabel 2). Daarom werd de hoogste veilige dosis vastgesteld op 200 µg/mL, terwijl de lage en middelste doses respectievelijk werden vastgesteld op 22 en 66 µg/mL....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
In dit werk hebben we de effecten van Mollugin op de regeneratie van de staart van zebravis onderzocht. Binnen het geteste dosisbereik was de behandeling met Mollugin geassocieerd met een verbeterd herstel van het staartoppervlak na letsel, samen met veranderingen in de expressie van apoptose-gerelateerde genen, inflammatoire markers, antioxidant-enzymactiviteit en macrofaag-geassocieerde markers.
Zebravissen, als een prominent model voor regeneratieonderzoek, vertonen staartregeneratie waarbi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.
De huidige studie werd gesponsord door de Health Commission of Fujian Province of China (Subsidie NR. 2022QNA085).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Weefselkweekplaten met 6 putjes | Corning | 3516 | |
| Catalase (CAT) assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| CMax Plus microplaatlezer | Molecular Devices | iD3s | |
| Danieau’s buffer – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Eindconcentratie in Danieau’s buffer: 0.6 mM. |
| Danieau’s buffer – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Eindconcentratie in Danieau’s buffer: 5 mM; pH ingesteld op 7.2. |
| Danieau’s buffer – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Eindconcentratie in Danieau’s buffer: 0.7 mM. |
| Danieau’s buffer – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Eindconcentratie in Danieau’s buffer: 0.4 mM. |
| Danieau’s buffer – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Eindconcentratie in Danieau’s buffer: 58 mM. |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E3 embryo-medium | In het laboratorium bereid (standaardrecept) | N/A | Standaardrecept. |
| Gen-specifieke qPCR-primers (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actine) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | Versie 8.0. |
| ImageJ-software | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Versie 1.52n. |
| Mollugin (≥98%, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Actieve verbinding uit Rubia cordifolia, opgelost in DMSO tot 40 mg/mL en verdund tot 22, 66 en 200 µg/mL in E3-medium. |
| Gemotoriseerde weefselhomogenisator | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (of equivalent) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Real-time PCR-systeem (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Gekoelde microcentrifuge | SCILOGEX | CF1524R | |
| RNA-vrije tips | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Phenol/guanidine-gebaseerd RNA-extractiereagens. |
| RNase-vrije microcentrifugebuisjes, 1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| SMZ800N fluorescentie-stereomicroscoop | Nikon | SMZ800N | Fluorescentie-stereomicroscoop gebruikt voor het afbeelden van Tg(mpeg1:GFP)-larven en het kwantificeren van macrofaagaggregatie. |
| Natriumhypochlorietoplossing | McLean, USA | N/A | Werkoplossing van 0.003%. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| SZX16 stereomicroscoop | Olympus | SZX16 | Gebruikt voor morfologische observaties, toxiciteitsbeoordeling en amputatie van de staartvin van larven. |
| Totale superoxide dismutase (T-SOD) assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| Transgene zebravis Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (of eigen kolonie) | N/A | Macrofaag-reporterlijn. |
| Tricaïn methansulfonaat (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Werkoplossing van 0.03%. |
| UltraPure DNase/RNase-vrij gedestilleerd water | Invitrogen | 10977023 | |
| Wild-type zebravis, CZ98-stam (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | Bevruchte embryo's en larven werden verkregen uit een volwassen fokbestand. |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.