Het beoordelen van intrinsieke stijfheid van de murine aorta met behulp van pinmyografie: een translationeel kader voor het onderzoeken van de invloed van het circulerende milieu

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het beoordelen van de intrinsieke wandstijfheid van aorta (elasticiteitsmodulus) via pinmyografie en benaderingen om de potentiële rol van het circulerende milieu bij het moduleren van de intrinsieke wandstijfheid van de aorte te onderzoeken.

Samenvatting

Aortaverstijfing is een onafhankelijke risicofactor voor hart- en vaatziekten en andere chronische aandoeningen, waaronder cognitieve achteruitgang, nierfunctiestoornissen, visuele beperking en verminderde glucose-insulinefunctie. In vivo wordt aortastijfheid vaak beoordeeld met tonometrie- of echografietechnieken die respectievelijk arteriële golfvormen of longitudinale arteriële segmenten visualiseren. In vivo metingen worden echter beïnvloed door meerdere factoren — zoals arteriële druk en autonome input — die het mechanistische inzicht beperken in hoe en waarom aortastijfheid verandert. Preklinische muismodellen, die directe verwerving van aortaweefsel mogelijk maken, bieden een uniek experimenteel kader om zowel de stijfheid van aorta in vivo als de intrinsieke mechanische eigenschappen van de aorta te beoordelen, vrij van verstorende fysiologische variabelen. Deze modellen maken ook directe onderzoeken van het circulerende milieu mogelijk (d.w.z. verzameling van circulerende bioactieve moleculen in de bloedbaan) en de rol ervan bij het moduleren van aortastijfheid over het preklinisch naar klinisch translationele spectrum. Veranderingen in het circulerende milieu zijn naar voren gekomen als een belangrijke mechanistische basis van aortaverstijfing bij tal van aandoeningen—waaronder primaire veroudering en voortijdige veroudering geassocieerd met kanker en kankertherapieën—in zowel preklinische als klinische studies, evenals in het mediëren van de effecten van interventies. Dit artikel biedt een stapsgewijze gids voor het beoordelen: (1) intrinsieke aortastijfheid (elasticiteitsmodulus) in preklinische muismodellen, en (2) de bijdrage van het circulerende milieu (en zijn bestanddelen) aan aortaversteviging met behulp van zowel preklinische als klinische biomonsters.

Inleiding

Aortaverharding is een onafhankelijke risicofactor voor hart- en vaatziekten en andere chronische ziekten ^1,2. De beoordeling van aortastijfheid in vivo kan mechanistische resolutie missen, gezien de integratieve fysiologische processen die de stijfheid van de aorta in vivo reguleren (bijv. bloeddruk en autonome input)^2. Als zodanig biedt de beoordeling van de intrinsieke stijfheid van de aorta (d.w.z. stijfheid van de aortawand/elasticiteitsmodulus) ex vivo met behulp van pinmyografie de mogelijkheid tot directe beoordeling van aortastijfheid, onafhankelijk van verstorende fysiologische variabelen². Bovendien maakt het gebruik van een ex vivo experimentele benadering het mogelijk om mogelijke moleculaire mechanismen te onderzoeken die de versteviging van de aortawand kunnen bemiddelen. In tegenstelling tot andere gevestigde methoden voor het beoordelen van arteriële stijfheid ex vivo, zoals drukmyografie, biaxiale planaire testen en cyclische/pulsatile myograafsystemen, die vertrouwen op fysiologische systeemmodellering (bijv. intraluminale druk en pulsatiele hemodynamica), maakt pinmyografie het mogelijk om de stijfheid van de aortakand direct te beoordelen via isometrische kracht, onder sterk gecontroleerde omstandigheden die geen in vivo modellering vereisen.

Het circulerende milieu (d.w.z. de verzameling bioactieve moleculen in de bloedbaan), dat in direct en frequent contact komt met de aorta, verandert vaak in situaties van aortaversteviging (bijvoorbeeld chronologische/primaire veroudering en voortijdige veroudering, zoals bij kankeroverlevenden of modellen van kankeroverlevenden)^3,4. We hebben, met zowel preklinische (muis) als klinische (menselijke) biospecimens (plasma en serum), vastgesteld dat het circulerende milieu direct bijdraagt aan aortaverstijfing bij zowel primaire⁴ als voortijdige veroudering^{van 3}. Bovendien hebben we een experimenteel kader opgesteld om de directe bijdrage(s) van geselecteerde bestanddelen binnen het circulerende milieu te bepalen bij het bemiddelen van het effect op aortaversteviging ^3,5,6. Hier beschrijven en beschrijven we stapsgewijze experimentele benaderingen voor het beoordelen van intrinsieke stijfheid van aorta en de bijdrage van het circulerende milieu (en zijn bestanddelen) aan aortaversteviging met behulp van pinmyografie, en geven we representatieve resultaten (met figuren en bronnen).

Protocol

Mannelijke wildtype C57BL/6J jonge volwassen muizen (4 maanden oud) werden gedurende deze studie gebruikt. Huisvesting en procedures met experimentele muizen werden goedgekeurd door de University of Colorado Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Bereiding van koude fysiologische zoutoplossing (CPSS)

1. Bereid Ca²⁺ Ringer's Stock Solution voor in 1 L diH₂O en bewaar bij 4 °C (Tabel 1).
2. Voeg 13,9 g MOPS toe aan 100 mL diH_2Oom de MOPS-buffervoorraadoplossing te bereiden en bewaar bij 4 °C.
3. Voeg 0,186 g EDTA toe aan 100 mL diH₂O om de EDTA-bouillonoplossing te bereiden, pH tot 8,0, en bewaar bij kamertemperatuur.
4. Bereid CPSS voor met bovengenoemde voorraadoplossingen en de hieronder genoemde chemicaliën (Tabel 2). Breng het totale volume naar 2 L met diH₂O, pH naar 7,4 bij 34 °C, en filter CPSS via een ≤ 0,45 μm filter. Verdeel in 50 mL conische buizen en bewaar bij -20 °C.

2. Dissectie van de muizeraorta (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3)

1. Verdoof de muis met inademing van isoflurane (2,5%) en plaats de muis in een dorsale liggende positie (Figuur 1A-C).
2. Zodra de muis onder het chirurgische vlak van anesthesie is, wordt bloed verzameld door een hartpunctie uitgevoerd en wordt de secundaire euthanasiemethode uitgevoerd door bilaterale thoracotomie (Figuur 1B–C).
3. Verwijder vervolgens voorzichtig de aorta van de aortaboog naar de buikaorta (Figuur 1D–F).
4. Plaats de aorta in CPSS en verwijder al het bind- en perivasculaire vetweefsel met behulp van Fine Science Tools Vannas Spring Scissors (2,5 mm) (Figuur 2A–E).
5. Snijd voorzichtig drie 1 mm brede aortasegmenten in het thoracale gebied net onder de aortabooghoek (Figuur 3).
6. Plaats de twee 1 mm aortasegmenten in een 1,5 mL buis gevuld met CPSS en bewaar in -80 °C tot stress-rek pinmyografie-experimenten. Bewaar het^{derde segment op} de juiste manier voor latere histologische metingen zoals hieronder beschreven.

3. Stress-rek pinmyografie-experimenten

OPMERKING: Het Pin Myography System zal worden gebruikt voor in-vitro testen van aortastijfheid (Figuur 4 en Figuur 5).

1. Eerst verhit je de kamers voor tot 37 °C met ongeveer 6 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en ontdooi je 1 mm bevroren aortasegmenten.
   OPMERKING: Alternatieve fysiologische zoutoplossingen die goed geoxygeneerd en pH-gereguleerd zijn, kunnen ook worden gebruikt zoals eerder beschreven⁷.
2. Zodra 37 °C is bereikt, volgt u het kalibratieprotocol van de fabrikant.
   1. Plaats de kalibratiebrug op de myograaf zodat de T-balansbalk de pin die verbonden is met de krachttransducer van de pinmyografiekamer niet raakt.
   2. Zorg ervoor dat de krachttransducerpin niet aan enige kracht wordt blootgesteld. Wanneer de relatieve kracht stabiel is, plaats je een gewicht van 2 g op de T-brug zodat de T-balansstang nu ~2 g kracht uitoefent op de krachttransducerpin.
   3. Bevestig dat de krachtmeting binnen 9,71–9,91 mN ligt. Als dat zo is, is de kalibratie voltooid.
3. Bepaal de baseline micrometerafmeting en recordwaarde (d.w.z. de initiële meting).
   1. Bepaal onder een dissectiescope de basislijn micrometerafstand waarop de twee parallelle pinnen bijna elkaar raken (Figuur 4).
      OPMERKING: Laat de twee pinnen elkaar niet raken, omdat dit schade kan veroorzaken of de krachttransducer in de myograafkamer kan verstoren.
4. Plaats onder een dissectiemicroscoop een aortasegment van 1 mm over de twee pinnen en registreer de breedte van het segment met microkalipers (Figuur 6A). Sluit vervolgens de kamerunit aan op de interface van het pinmyografiesysteem.
   OPMERKING: Vergroot de pinbreedte om spanning op het aortasegment uit te oefenen terwijl je de aorta monteert om deze op de twee pinnen te bevestigen, zodat het aortasegment niet losraakt.
5. Als er spanning op de aorta wordt uitgeoefend en de kamer is aangesloten en gemonteerd op het pinmyografiesysteem, breng dan de micropositioneerder terug naar de "beginpositie" zoals bepaald in stap 3.3 hierboven.
6. Volledige pre-stretch van de aorta.
   1. Rek de aorta uit door de afstand tussen de twee pinnen met 1 mm te vergroten vanaf de initiële positie van de micro-positioneerder (Figuur 6B).
   2. Vervolgens ontspan je de aorta door de pinnen terug te brengen naar de initiële micro-positionermeting. Voer deze stretch-relax-sequentie drie keer uit (Figuur 6A).
      OPMERKING: Na de laatste stretch-relax-sequentie zou de micropositioner terug moeten zijn naar de initiële meting.
7. Op de interface van het pinmyografiesysteem is nul krachtafmeting voor elke gebruikte kamer (Figuur 7).
8. Start het spanning-rek experiment.
   1. Verhoog de krachtmeting tot ongeveer 1 mN door de micropositioner aan te passen (Figuur 7).
   2. Na een krachtevenwicht van ~1 mN (3–5 s) registreer je de nieuwe micropositioner-meting bij de ~1 mN kracht en registreer je de eerste krachtmeting.
   3. Verhoog de micropositioner met 50 μm (dus 5 klikken/hashes) en laat het aortasegment 3 minuten worden opgerekt. Na 3 minuten, recordkracht.
   4. Blijf de micropositioner elke 3 minuten met 50 μm verhogen en de kracht registreren tot het "vloeipunt" is bereikt.
      OPMERKING: Het vloeipunt is de hoogste hoeveelheid kracht die wordt opgezet voordat onomkeerbare structurele schade aan de aorta optreedt (d.w.z. een scheur of breuk in de aorta, een aanzienlijke daling van de kracht).
   5. Bevestig het vloeipunt door de aorta met nog eens 50 μm te rekken na het initiële vloeipunt. Zorg ervoor dat de krachtwaarde afneemt of iets boven het vloeipunt ligt. Als het wisselpunt niet is bevestigd, ga dan door met 3 minuten verhogingen totdat het wisselpunt is bereikt.
   6. Na bevestiging van het vloeipunt zijn de experimenten voltooid. Begin nu met de analyse.

4. Analyse van spannings-rek pinmyografie-experimenten om de elastische modulus van collageen en elastine te bepalen

1. Met behulp van de krachtmetingen verkregen van de myograaf genereer je een spanning-rekcurve met de volgende vergelijkingen:
   Strain (λ)=∆d/[d(i)]
   Hier is d de diameter en d_i is de begindiameter en;
   Klemtoon (t)=λL/[2(HD)]
   waarbij L de eendimensionale belasting is, H de dikte van het intima-medium en D de lengte van het vat. Zodra de spanning-rekcurves zijn gegenereerd, gebruik je deze om de gebieden met hoge en lage kracht te berekenen zoals eerder beschreven ^8,9 (Figuur 8).
2. Bereken het gebied met hoge kracht (Collageenregio) (Figuur 8B).
   1. Bepaal de elastische modulus van de spanning-rekcurve als de helling van de lineaire regressiepassing naar de laatste vier punten van de spanning-rek curve. Om de hoogkrachtmeting te verkrijgen uit de spanning-rek grafiek, volgt u de onderstaande stappen:
      1. Klik met de rechtermuisknop op een datapunt in de grafiek en selecteer gegevens selecteren > Voeg toe > voer serienaam in: Elastic modulus.
      2. Series X-waarden: Selecteer 4 datapunten uit de rekwaarden. Dit zouden de 3 punten moeten zijn wanneer de kracht het "wisselingspunt" nadert. Zorg ervoor dat je het voorrangpunt als vierde punt vermeldt.
      3. Serie Y-waarden: Selecteer 4 datapunten uit de spanningswaarden. Dit zouden de 3 punten moeten zijn wanneer de kracht het "wisselingspunt" nadert. Zorg ervoor dat je het voorrangpunt als vierde punt vermeldt.
      4. Klik op OK en voeg Trendlijn toe > Lineaire > Toon de vergelijking op de grafiek > Toon de R-kwadraat waarde op de grafiek.
   2. De helling van de vergelijking is de elastische modulus met hoge kracht. Zorg ervoor dat de R-kwadraatwaarde ≥ 0,99 is om de elasticiteitsmodulus nauwkeurig te maken.
3. Bereken het laag-krachtgebied (elastinegebied) (Figuur 8C)
   1. Bepaal de grenzen van het elastine-dominante gebied (laagkrachtgebied waar kromming ~0 is) van de spanning-rekcurve door een polynoomvergelijking van de zevende orde aan de data toe te passen (r² > 0,99) en vervolgens de wortels van de vergelijking te berekenen. Beschouw de eerste wortel, de grens tussen het zeer laag-krachtgebied en het elastinegebied, en de tweede wortel, de grens tussen het elastinegebied en het begin van de collageenvezel-betrokkenheid.
   2. Bepaal vervolgens de elasticiteitsmodulus van het laag-krachtgebied als de helling van een lineaire vergelijking die past bij de spanning-rekgegevens tussen de twee nulpunten ^8,9. Om dit te verkrijgen:
      1. Maak een spreadsheet met kolommen zoals geïllustreerd in Aanvullende Tabel 1.
      2. Verander dit in een "txt"-document en open het in het R-code softwarescript "Modulus of Elasticity" R.
      3. Om de data te gebruiken, controleer je op normale hellingen – de^{derde afgeleide} graaf op de R-output moet de vorm hebben van "M".
      4. In het tabblad resultaten is de numerieke waarde onder de kolom Helling de elasticiteitsmodulus. Zorg ervoor dat de R-kwadraatwaarde groter is dan of gelijk aan 0,99 om de elasticiteitsmodulus nauwkeurig te maken.
      5. Om deze waarde in de spreadsheet te krijgen, selecteer je de rekwaarden (en hun bijbehorende spanningswaarden) tussen de eerste en tweede afgeleide die je krijgt via het tabblad R-code resultaten .
      6. Volg de stappen in stap 4.2 om de vergelijking en de^R2-waarde op de spreadsheetgrafiek te verkrijgen.

5. Beoordeling van aortadiameter en wanddikte

1. Plaats het laatste 1 mm aortasegment in een cryomold gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT) stof. Oriënteer de ring zo dat de lumen plat en gecentreerd aan de onderkant van de mal is, met de luminale as loodrecht op het snijvlak om dwarsdoorsneden te verkrijgen.
2. Bereid een container 2-methylbutaan voor die gekoeld is in vloeibare stikstof en dompel de cryomold onder in koude 2-methylbutaan totdat OCT ondoorzichtig wit wordt.
3. Bewaar de cryomold bij -80 °C tot het in secties worden geplaatst. Stel de cryostattemperatuur in op de juiste OCT-snijtemperatuur (≈-20 °C) en monteer het bevroren blok vervolgens op de monsterhouder.
4. Zodra het aan de bevestiging is bevestigd, knip het blok voorzichtig af terwijl de dikte op 7 μm blijft totdat er weefsel verschijnt.
5. Label een preparaat met de muis-ID en snijd 4–5 dwarsdoorsneden van het aortaweefsel van 7 μm dikte.
6. Om het gesneden weefsel op de glaasjes over te brengen, plaats je alle gesneden secties op de cryostatfase (ook wel mesfase genoemd) voordat je de gelabelde glaasje direct erop plaatst.
7. Zodra de overdracht is voltooid, laat je het aan de lucht drogen.
8. Beeldsecties onder 10x vergroting op een brightfield-microscoop. Sla afbeeldingen op in een JPG/TIFF-formaat met een schaalbalk onderaan de afbeelding.
9. Voor analyse open je ImageJ, ga je naar File > Open en selecteer je het aortabeeld.
10. Zodra het aortabeeld is omgebouwd, zoom je in op de schaalbalk met het pictogram Control + + en gebruik je vervolgens het lijngereedschap om de lengte van de schaalbalk te meten. Om het resultaat te vullen, druk je op Control + M. De meting die onder lengte wordt berekend, is de maat van de schaalbalk.
11. Om de software te kalibreren, ga naar Analyze > Set Scale. Voor de afstand in pixels voer je de lengte van de lijn in die door ImageJ in stap 8 is berekend. Voor de bekende afstand voer je de werkelijke lengte van de schaalbalk in, en schrijf onder eenheden de meeteenheid (μm, mm, cm, enz.).
12. Vink het globale vakje aan om automatisch alle volgende afbeeldingen te kalibreren. Let op of de schaalbalk in de andere afbeeldingen verschilt, of dat ImageJ gesloten is; Als dat zo is, is herkalibratie vereist.
13. Voor wanddikte gebruik je het rechte lijngereedschap en trek je een loodrechte lijn van luminale rand tot buitenste adventitiale rand. Druk op Knop + M om de lengte automatisch in het tabblad resultaten in te vullen.
14. Herhaal stap 5.13 om metingen uit te voeren op 6 gelijkmatig verdeelde posities rond de omtrek van de aorta en registreer elke waarde.
15. Om de gemiddelde dikte per muisaorta te berekenen, gemiddeld u alle diktes die uit 4–5 monsters van dezelfde muis zijn verkregen.
16. Om de luminale diameter te meten, selecteer je het polygongereedschap en volg je de binnenste luminale rand met de klok mee. Registreer perimeter (μm) door op Control + M te drukken.
17. Herhaal het overtrekken tegen de klok in, beginnend op een ander punt. Zorg ervoor dat de twee omtrekwaarden dicht bij elkaar liggen en gemiddeld ze voor die aorta-ring.
18. Herhaal stap 5.16 voor de 4–5 aortamonsters van dezelfde muis en gemiddeld alle omtrekswaarden.
19. Om de diameter te berekenen, gebruik je de vergelijking: Diameter (μm) = Omtrek/3,14.

6. Circulerend milieu-gemedieerde aorta-elasticiteitsmodulus

OPMERKING: Om te bepalen of circulerende factoren of specifieke verbindingen de intrinsieke aortastijvheid veranderen, kunnen thoracale aortaringen van interventie-naïeve muizen ex vivo worden geïncubeerd onder gedefinieerde standaardkweekomstandigheden (37 °C, 5%_CO2, 20_{% O2}, bevochtigd) (Figuur 9).

1. Disseceer de thoracale aorta en snijd per conditie twee 1 mm ringsegmenten door. Verwijder al het perivasculaire vetweefsel.
2. In een 96-wellplaat incubeer je de aorta-ringen in standaardmedia, dat bestaat uit DMEM + 1% penicilline-streptomycine.
3. Voeg experimentele behandeling toe aan de media. Voor plasma of serum (onbehandeld plasma/serum kan hiervoor worden gebruikt), gebruik 10% van het totale mediavolume. Gebruik preklinisch en klinisch (menselijk) plasma of serum ^3,4,6 (Figuur 9).
4. Om de causale rol van een circulerende factor vast te stellen die verschilt tussen studiegroepen, herhaal je de plasma/serumblootstelling terwijl tegelijkertijd het waargenomen concentratieverschil tussen groepen wordt gecorrigeerd (d.w.z. de concentratie van de factor van belang wordt genormaliseerd), en wordt het directe effect van de factor van belang bepaald bij een concentratie die het gemiddelde groepsverschil vertegenwoordigt, of de signalering van de factor die wordt verondersteld verantwoordelijk te zijn voor het bemiddelen van het effect van het circulerende milieu te blokkeren.
   OPMERKING: De laatste twee benaderingen werden eerder respectievelijk uitgevoerd met Trimethylamine-N-oxide (TMAO)⁵ en met blokkade van de receptor voor geavanceerde glycatie-eindproducten³.
5. Voor het verduidelijken van de rol van overtollige superoxide-gerelateerde oxidatieve stress of mitochondriën-
   specifieke superoxide-gerelateerde oxidatieve stress in dit modelsysteem, gebruik de volgende respectievelijke concentraties bij het incuberen van aortaringen: TEMPOL: 1 μM ^5,10 en MitoQ: 1 μM⁶.
6. Na 48–72 uur incubatie laad je de aortaringen in de pinmyograaf en volg je de hierboven beschreven stappen.

Resultaten

Leeftijdsgebonden aortaversteviging

Voor intrinsieke mechanische stijfheid wordt de kracht die overeenkomt met elk rekinterval geregistreerd en gebruikt voor de berekeningen. In de eerder besproken berekeningen genereert men spannings-rekcurves en berekent men de elastische modulus voor het 1) collageengebied en/of 2) elastinegebied van deze krommen, zoals hierboven beschreven en oorspronkelijk getoond door Gioscia-Ryan et al.

Discussie

Het gebruik van pinmyografie voor de beoordeling van intrinsieke stijfheid van aorta ex vivo biedt de mogelijkheid om de intrinsieke stijfheid van de aorta te beoordelen, onafhankelijk van mogelijk verstorende fysiologische variabelen in vivo , zoals bloeddruk en autonome input². Bovendien biedt deze ex vivo experimentele benadering de mogelijkheid om potentiële moleculaire mechanismen te screenen die onderliggen aan verschillen in intri...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-methylbutaan	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucose (Dextrose)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Monosodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (Na salt)	Sigma-Aldrich	M9024
Multi Pin Myography System	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE antibody	R&D System	AF1145
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT compound	Sakura	4583
Trimethylamine N-oxide (TMAO)	Sigma Aldrich	317594