Dit artikel presenteert een reproduceerbare bio-informatica- en single-cell workflow voor het onderzoeken van associaties tussen de expressie van myeloperoxidase (MPO) en immuun/myeloïde kenmerken bij borstkanker. Omdat de analyses zijn gebaseerd op publieke datasets en in silico methoden, worden de bevindingen geïnterpreteerd als exploratief en hypothese-genererend.
Onderzoeksartikel
Associatie van MPO-expressie met de immuunmicro-omgeving bij borstkanker: inzichten uit bio-informatica en single-cell-analyses
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Borstkanker blijft een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte, en verkennende computationele workflows kunnen helpen bij het prioriteren van immuungeassocieerde markers voor verder onderzoek. Hier gebruikten we de bulk-transcriptomische gegevens van de cancer genome atlas breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA) en de publieke single-cell dataset GSE161529 om associaties te onderzoeken tussen de expressie van myeloperoxidase (MPO), klinische uitkomsten, immuuninfiltratie, methylering, annotaties van upstream-regulatoren, single-cell expressiepatronen, resultaten van virtuele knockdown-gevoeligheid, drug-gene interactie-opvraging en annotaties voor absorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxiciteit (ADMET). De MPO-expressie was lager in borstkankersweefsels dan in aangrenzende niet-tumorsweefsels. Een hogere MPO-expressie was geassocieerd met een langer progressievrije interval, terwijl de associaties met de totale overleving en ziekte-specifieke overleving niet statistisch significant waren. Receiver operating characteristic (ROC)-analyse suggereerde een scheiding tussen tumor en normaal weefsel binnen de geanalyseerde publieke dataset, maar dit mag niet worden geïnterpreteerd als klinische diagnostische validatie. Immuundeconvolutie- en verrijkingsanalyses gaven aan dat de MPO-expressie hoofdzakelijk correleerde met immuun- en myeloïde-gerelateerde transcriptionele kenmerken, in plaats van het vaststellen van tumor-intrinsieke regulatie van de immuunmicro-omgeving. Op single-cell resolutie was het MPO-signaal schaars, waarbij slechts 85 MPO-positieve cellen werden gedetecteerd vóór k-nearest neighbor (KNN)-gebaseerde neighborhood expansion. Detecteerbare MPO-signalen en MPO-geassocieerde scores werden voorzichtig geïnterpreteerd omdat ze beïnvloed kunnen zijn door schaarse expressie, onzekerheid in celtype-annotatie, dropout, doublets of ambient RNA. In silico virtuele knockdown suggereerde kandidaat immuun- en ontsteking-gerelateerde transcriptionele veranderingen, maar deze resultaten werden als verkennend beschouwd en vereisen validatie. Drug-gene interactie database (DGIdb)-gebaseerde drug-gene opvraging en ADMET-annotatie werden uitsluitend gebruikt als voorlopige chemische annotaties en werden niet geïnterpreteerd als therapeutisch bewijs. Over het geheel genomen biedt deze studie een reproduceerbare in silico workflow voor het genereren van hypothesen over MPO-geassocieerde immuun/myeloïde kenmerken bij borstkanker, die externe cohortvalidatie en experimentele bevestiging vereisen.
Inleiding
Borstkanker is een zeer heterogene immuungerelateerde maligniteit1. De progressie van de ziekte, het risico op recidive en metastasering, en de respons op de behandeling zijn nauw verbonden met de compositie en functionele status van de immuunmicro-omgeving van de tumor (TIME)2. Ondanks de voortdurende optimalisatie van uitgebreide behandelstrategieën vertonen sommige patiënten nog steeds progressie of recidive, wat de dringende noodzaak onderstreept om moleculaire biomarkers te identificeren die de status van de TIME kenmerken en risicostratificatie ondersteunen, terwijl hun onderliggende mechanismen worden opgehelderd.
Myeloperoxidase (MPO) is een heemhoudende peroxidase die voornamelijk tot expressie komt in neutrofielen en, in mindere mate, in monocyten en macrofagen. Door de generatie van hypochloorzuur en andere reactieve oxidanten draagt MPO bij aan de antimicrobiële verdediging, maar kan het ook oxidatieve weefselbeschadiging en chronische ontsteking bevorderen. Bij kanker lijkt de biologische betekenis van MPO contextafhankelijk te zijn3. Enerzijds is MPO-gemedieerde oxidatieve stress geïmpliceerd bij carcinogenese en tumorprogressie via DNA-schade, lipid- en proteïneoxidatie, inflammatoire signalering en remodellering van de tumormicro-omgeving4,5,6. Anderzijds is infiltratie van MPO-positieve aangeboren immuuncellen of myeloïde cellen geassocieerd met een gunstige prognose of antitumorale immuunactiviteit in bepaalde tumorcontexten7,8,9. Deze schijnbaar tegenstrijdige bevindingen suggereren dat de klinische en biologische betekenis van MPO kan afhangen van het tumortype, het ziektestadium, de cellulaire bron van MPO en de immuunsamenstelling van de tumormicro-omgeving. Het expressiepatroon en de prognostische relevantie van MPO bij borstkanker, in het bijzonder op single-cell niveau, zijn echter nog onvolledig gekarakteriseerd.
De tumor-immuunmicro-omgeving (TIME) bevat heterogene myeloïde, lymfoïde, stromale en epitheliale compartimenten10. MPO wordt klassiek geassocieerd met neutrofielen en andere cellen uit de myeloïde lijn; MPO-gerelateerde signalen in bulk-tumorprofielen kunnen daarom de immuuncelcompositie weerspiegelen in plaats van tumorcel-intrinsieke activiteit10. In borstkanker blijven de distributie van het MPO-signaal over bulk- en single-cell-datasets, de associatie met schattingen van immuuninfiltratie en de reproduceerbaarheidslimieten van downstream computationele analyses onvoldoende gekarakteriseerd. Deze studie behandelt MPO daarom als een immuun-geassocieerde marker voor de ontwikkeling van een verkennende workflow, en niet als een bewezen causale regulator van de TIME of een gevalideerd therapeutisch doelwit. In vergelijking met differentieel expressie-analyses van een enkele cohort of immuuninfiltratieschattingen op basis van een enkel platform, kan een geïntegreerde workflow die bulk-transcriptomics, immuun-deconvolutie, methylatie-annotatie, single-cell-mapping en computationele perturbatie combineert, een breder verkennend beeld geven van de gen-geassocieerde immuuncontext. Deze benadering is nuttig voor het prioriteren van kandidaatmarkers en het genereren van testbare hypothesen, vooral wanneer experimentele datasets nog niet beschikbaar zijn. Echter, een dergelijke computationele integratie kan op zichzelf geen cellulaire bron, causaliteit, farmacologische activiteit of klinisch nut bepalen. Met de vooruitgang van grootschalige publieke kankercohorten en single-cell transcriptomische technologieën kunnen bio-informatica-benaderingen worden gebruikt om associaties te onderzoeken tussen genexpressie, klinische uitkomsten, immuuncelcompositie en transcriptionele staten op zowel populatie- als single-cell-niveau11. Computationele perturbatiemethoden gebaseerd op single-cell genregulerende netwerken kunnen bovendien informatie verschaffen voor het genereren van hypothesen over gen-geassocieerde transcriptionele gevoeligheid12,13. Daarom was deze studie erop gericht om het expressiepatroon, de associatie met overleving, de immuun/myeloïde context, het methylatieprofiel, de single-cell-distributie en het verkennende computationele perturbatieprofiel van MPO in borstkanker te karakteriseren. De totale workflow wordt getoond in Figuur 1.
Protocol
Acquisitie uit de TCGA-database
RNA-sequencinggegevens en klinische informatie voor de TCGA breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA) cohort zijn verkregen uit het genomic data commons portaal14. STAR workflow RNA-seq gegevens in transcripts per million (TPM) formaat werden geëxtraheerd samen met de bijbehorende klinische annotaties. RNA-seq monsters zonder overeenkomstige klinische informatie werden uitgesloten. Voor expressiegebaseerde analyses werden TPM-waarden getransformeerd als log2(TPM + 1). MPO-expressie werd geëxtraheerd met behulp van het gensymbool MPO en Ensembl gen-ID ENSG00000005381.8. Voor analyses waarbij een indeling in MPO-hoog en MPO-laag vereist was, werden alleen TCGA-BRCA tumor-monsters opgenomen en werden aangrenzende normale monsters uitgesloten van de groepsindeling. Tumor-monsters werden verdeeld op basis van de mediaanwaarde van de log2(TPM + 1)-getransformeerde MPO-expressie binnen de TCGA-BRCA tumor-monsters. Monsters met een MPO-expressie groter dan of gelijk aan de mediaan werden toegewezen aan de MPO-hoge groep, terwijl monsters onder de mediaan werden toegewezen aan de MPO-lage groep. Deze op de mediaan gebaseerde groeperingsstrategie werd gebruikt voor overlevingsanalyse, differentiële expressieanalyse, verrijkingsanalyse, methyleringsgroepering en vergelijkingen van immuuncelverrijking, tenzij anders aangegeven. Klinisch-pathologische kenmerken, waaronder geslacht, leeftijd, etniciteit, pathologisch T-stadium, histologische graad, PAM50-subtype, pathologisch stadium, tumorstatus en overlevingsuitkomsten, waaronder algehele overleving (OS), progressievrije interval (PFI) en ziektespecifieke overleving (DSS), werden geanalyseerd met R versie 4.2.1.
Openbare zoekfunctie voor immunohistochemie-afbeeldingen
Representatieve immunohistochemie-afbeeldingen (IHC) van MPO van aangrenzend normaal borstweefsel en borstkankerweefsel werden gebruikt als kwalitatieve referenties voor het eiwitniveau. Deze afbeeldingen zijn niet opgenomen in kwantitatieve morfometrische of statistische analyses. De omkaderde gebieden geven regio's aan die bij een hogere vergroting worden getoond. Schaalbalken geven 100 µm aan in de 20× afbeeldingen en 50 µm in de 40× afbeeldingen.
Analyse van expressiecorrelatie
De TCGA-BRCA-dataset werd gebruikt om genen te onderzoeken die samen variëren met de MPO-expressie bij borstkanker. Genoombrede Pearson-correlatiecoëfficiënten werden berekend tussen MPO en proteencoderende genen, waarbij de top 30 positief en de top 30 negatief gecorreleerde genen werden geselecteerd voor visualisatie. Voor correlatieanalyses met meerdere geteste genen werden de nominale p-waarden gecorrigeerd met de Benjamini-Hochberg-methode voor de false discovery rate. Het MPO-geassocieerde proteïne-proteïne interactie (PPI) netwerk werd geconstrueerd met behulp van de Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) database, waarbij proteïne-paren met interactiescores groter dan 0,40 werden behouden voor visualisatie15.
Functionele verrijkingsanalyse
Differentieel tot expressie gekomen genen (DEGs) werden geïdentificeerd door de MPO-hoge en MPO-lage TCGA-BRCA tumorgroepen te vergelijken met drempelwaarden van |log2FC| > 1 en een volgens Benjamini-Hochberg gecorrigeerde p-waarde < 0,05. Functionele enrichment-analyse van de DEGs werd uitgevoerd met het R-pakket clusterProfiler versie 4.4.4, inclusief gene ontology (GO) biologische processen, cellulaire componenten, moleculaire functies en Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway-analyses16,17,18,19,20. Verrijkte GO- en KEGG-termen werden als significant beschouwd wanneer de gecorrigeerde p-waarde < 0,05 was.
Gene set enrichment analysis (GSEA) werd uitgevoerd met behulp van een vooraf gerangschikte genenlijst op basis van differentiële expressiestatistieken tussen MPO-high en MPO-low groepen. De MSigDB C2 Canonical Pathways collectie c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, overeenkomend met MSigDB v2022.1.Hs en bevattend 3.050 gene sets, werd gebruikt21,22. Verrijkte termen werden als significant beschouwd op basis van een Benjamini–Hochberg gecorrigeerde p-waarde < 0,05, FDR q-waarde < 0,25 en |genormaliseerde verrijkingsscore| > 1. Indien van toepassing werden Z-scores voor significant verrijkte termen berekend met het GOplot-pakket voor visualisatie.
Analyse van immuuncelverrijking in tumoren
De immuun- en stromale componenten in de TCGA-BRCA cohort werden geëvalueerd met behulp van het ESTIMATE-algoritme, geïmplementeerd in het R-pakket estimate versie 1.0.13. Log2(TPM + 1)-getransformeerde expressiegegevens werden als input gebruikt, en de immuunscore, stromale score en ESTIMATE-score werden voor elk tumoronderzoek berekend. TIMER/TIMER2.0 werd gebruikt om associaties te evalueren tussen MPO-expressie en de geschatte infiltratieniveaus van belangrijke immuuncelpopulaties in de TCGA-BRCA cohort, waaronder B-cellen, CD8+ T-cellen, CD4+ T-cellen, macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen23,24,25. Resultaten op basis van TIMER werden geïnterpreteerd als schattingen van immuuninfiltratie afgeleid van de overeenkomstige online bron. Voor de analyse van immuuncelverrijking over 24 immuunceltypen werd single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) geïmplementeerd met behulp van het R-pakket GSVA versie 1.46.026. De LM22-immuuncel-signatuurmatrix die werd gebruikt voor CIBERSORT-gebaseerde deconvolutie van 22 immuunceltypen is opgenomen in Supplementary Table 1. Correlaties tussen MPO-expressie en immuuncelverrijkingsscores werden geëvalueerd met de Spearman-rangcorrelatie. Verschillen in immuuncelverrijkingsscores tussen de op de mediaan gedefinieerde MPO-hoge en MPO-lage tumorgroepen werden vergeleken met de Wilcoxon-rangsomtoets. Voor analyses met meerdere immuunceltypen werden p-waarden gecorrigeerd met de Benjamini-Hochberg methode voor de false discovery rate.
DNA-methylering van het MPO-gen
DNA-methylatiepatronen binnen de MPO-locus werden geëvalueerd met MethSurv. CpG-methylatie beta-waarden en overlevingsassociaties voor TCGA-BRCA werden verkregen via het MethSurv-platform. Geselecteerde MPO-gerelateerde CpG-sites werden gevisualiseerd, en hun associaties met overlevingsuitkomsten werden geëvalueerd met behulp van de resultaten van de overlevingsanalyse verstrekt door MethSurv27. Voor analyses met meerdere CpG-sites werden de p-waarden gecorrigeerd over de geteste MPO-gerelateerde CpG-sites met de Benjamini-Hochberg-methode voor de false discovery rate. Deze methylatieanalyses werden geïnterpreteerd als exploratieve epigenetische annotaties.
Constructie van een PPI-netwerk en correlatieanalyse van neutrofiel-gerelateerde genen
Om de associatie tussen MPO en neutrofiel-gerelateerde biologie te onderzoeken, werd een systematische netwerkanalyse uitgevoerd. Een genset bestaande uit gevestigde mediatoren van neutrofielactivatie en geassocieerde ontstekingsprocessen werd samengesteld op basis van de huidige literatuur. De volledige lijst met neutrofiel-gerelateerde genen is opgenomen in Aanvullende Tabel 2. Gensymbolen werden geharmoniseerd naar officiële gensymbolen, dubbele vermeldingen werden verwijderd en de beschikbare genen werden gekruist met de TCGA-BRCA expressiematrix voorafgaand aan de STRING/PPI-analyse, prioritering van hub-genen en de correlatieanalyse tussen MPO en hub-genen. Het PPI-netwerk tussen deze genen werd geconstrueerd met behulp van de STRING-database (versie 11.5) met een drempelwaarde voor de interactiescore van gemiddelde betrouwbaarheid (>0,40). Hub-genen binnen dit netwerk werden algoritmisch geprioriteerd op basis van de graadcentraliteit (degree centrality), wat het aantal directe interacties per knoop kwantificeert. De 20 genen met de hoogste graadscores werden geselecteerd voor de daaropvolgende correlatieanalyse.
Vervolgens werden de expressieprofielen van deze hub-genen en MPO geëxtraheerd uit de TCGA-BRCA transcriptomische dataset. De associatie tussen MPO en elk hub-gen werd statistisch geëvalueerd met behulp van de rankcorrelatie van Spearman. Om de correlatiepatronen tussen de hub-genen onderling te karakteriseren, werd een paarsgewijze Spearman-correlatiematrix berekend over alle tumorstalen. Deze correlatieanalyses vormden de kwantitatieve basis voor de daaropvolgende visualisaties, waaronder de lollipop-plot van de correlaties tussen MPO en de hub-genen en het chord-diagram/heatmap dat de correlatiepatronen van de hub-genen weergeeft.
Voorspelling van upstream transcriptiefactoren en miRNA's die MPO targeten
De KnockTF-database (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, de ChIP-database (http://chip-atlas.org/)30,31 en de GTRD-database32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) werden gebruikt om de doelwit-TF's van MPO te voorspellen. Daarnaast werd de TargetScan-database (https://www.targetscan.org/vert_80/) gebruikt om potentiële miRNA-bindingsplaatsen die MPO targeten te voorspellen. Venn-diagrammen werden gegenereerd met behulp van de MicroBioinformatics-website (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34.
Single-cell analyse van MPO
De specifieke dataset GSE161529 is afkomstig van de Gene Expression Omnibus (GEO). Bij de preprocessing van de gegevens werd eerst filtering op celniveau uitgevoerd om cellen van lage kwaliteit uit te sluiten; dit betrof cellen die voldeden aan een van de volgende criteria: een mitochondriale genexpressie van meer dan 25%, een totaal aantal unique molecular identifiers (UMI) lager dan 5000, of minder dan 2500 gedetecteerde genen. Vervolgens werden ambient RNA-contaminatie en technische batch-effecten gecorrigeerd35. Voor dimensiereductie werd een principal component analysis (PCA) uitgevoerd om de cellulaire gelijkenis te beoordelen, gevolgd door UMAP voor celclustering en visualisatie. Daarna werden de verschillende clusters, op basis van de typische markergenen van cellen, geannoteerd naar celtypen11. De MPO-geassocieerde genset die is gebruikt voor de single-cell signature scoring is opgenomen in Supplementary File 1. Voorafgaand aan de scoring werden gensymbolen geharmoniseerd naar officiële gensymbolen, werden dubbele vermeldingen verwijderd en werden de beschikbare genen geïntersecteerd met de expressiematrix van GSE161529. AUCell, Seurat AddModuleScore en ssGSEA werden gebruikt om de MPO-geassocieerde scores per cel te berekenen. De scores van deze drie methoden werden Z-score genormaliseerd, geschaald naar een vergelijkbaar bereik en geïntegreerd om een samengestelde MPO-geassocieerde score te genereren voor verdere beschrijvende analyses. Cel-cel interactienetwerken werden onderzocht om de afgeleide ligand-receptor communicatiepatronen te vergelijken tussen epitheliale tumorcellen, gestratificeerd naar MPO-geassocieerd signaal, en diverse partnerceltypen. Deze resultaten werden geïnterpreteerd als beschrijvende communicatiepatronen en niet als bewijs dat MPO-expresserende cellen direct intercellulaire communicatie mediëren.
Virtuele knockdown op single-cell niveau van MPO en pad-verrijkingsanalyse met behulp van scTenifoldKnk
Virtuele knockdown van MPO op single-cell niveau werd uitgevoerd door de integratie van Seurat en scTenifoldKnk. Na standaard kwaliteitscontrole (200–6.000 genen per cel; mitochondriaal fractie < 10%) werden de gegevens log-genormaliseerd en werden 2.000 sterk variabele genen geselecteerd voor dimensionaliteitsreductie en clustering. Om MPO-relevante contexten te verrijken, werden cellen behouden die in de top 50% scoorden voor een myeloïde/neutrofiele genmodule. Vanuit deze cellen werd een MPO-buurtsubset gedefinieerd door uit te breiden vanaf MPO-positieve seeds met behulp van k = 40 dichtstbijzijnde buren in de PCA-ruimte. Deze uitgebreide subset werd niet beschouwd als een zuivere MPO-positieve populatie, en er zijn geen conclusies getrokken over de celtypeproporties op basis van deze KNN-expansiestap. Deze subset werd onderworpen aan virtuele knockdown-analyse via scTenifoldKnk, waarbij de unie van sterk variabele genen en MPO (geëxpresseerd in ≥25 cellen) als genset werd gebruikt. Significant verstoorde genen werden geïdentificeerd (FDR < 0,05, BH-gecorrigeerd). De resulterende genen werden verder geanalyseerd op functionele verrijking in GO Biological Processes en KEGG-paden (q < 0,05).
Exploratief medicijn-gen-opvraagproces en ADMET-annotatie
DGIdb werd geraadpleegd om voorlopige records van MPO-geassocieerde interacties tussen geneesmiddel-gen of chemische stof-gen te verkrijgen. Omdat interactielijsten uit databases vermeldingen kunnen bevatten die worden ondersteund door heterogene bewijstypen en mogelijk niet direct overeenkomen met klinisch toepasbare therapeutische middelen, werden de opgehaalde verbindingen behandeld als verkennende annotaties in plaats van als geprioriteerde behandelkandidaten. SwissADME en ADMETlab werden vervolgens gebruikt om de voorspelde fysisch-chemische, farmacokinetische en toxicologische eigenschappen samen te vatten. Deze in silico annotaties werden gebruikt om een voorlopige context te bieden voor de interpretatie op verbindingniveau en om de noodzaak van verdere farmacologische, toxicologische en klinische curatie te benadrukken voordat er enige therapeutische relevantie kan worden overwogen36.
Resultaten
MPO-expressiepatronen en verkennende overlevingsassociaties bij borst kanker
Om de expressiepatronen van MPO in verschillende kankerdatasets te beschrijven, hebben we MPO RNA-seq data uit de TCGA pan-cancer dataset geanalyseerd en een lagere MPO-expressie waargenomen in tumorweefsels van blaasurotheelcarcinoom (BLCA), invasief borstcarcinoom (BRCA), glioblastoma multiforme (GBM), plaveiselcelcarcinoom van de hoofd- en halsregio (HNSC), chromofoob niercelcarcinoom (KICH), hepatocellulair levercarcinoom (LIHC), longadenocarcinoom (LUAD), longplaveiselcelcarcinoom (LUSC), pancreadenocarcinoom (PAAD), prostaatadenocarcinoom (PRAD) en schildkliercarcinoom (THCA), en een hogere MPO-expressie in colonadenocarcinoom (COAD), papillair niercelcarcinoom (KIRP) en andere weefsels (Figuur 2A). Vervolgens hebben we de associaties tussen MPO-expressie en klinische uitkomsten in elk kankertype geëvalueerd. In de TCGA-BRCA cohort toonden zowel ongepaarde als gepaarde vergelijkingen een lagere MPO-expressie in tumorweefsel dan in normaal/aanliggend weefsel (Figuur 2B,C). Na stratificatie van TCGA-BRCA tumorstalen met behulp van de mediaan van de tumor MPO-expressie als afkapwaarde, toonde Kaplan-Meier-analyse aan dat patiënten met een hogere MPO-expressie een langer progressievrij interval hadden (Hazard Ratio (HR) = 0.67, p = 0.028) (Figuur 2D). De algehele overleving (OS) (p = 0.296; Supplementary Figure 1A) en ziektespecifieke overleving (DSS) (p = 0.18; Supplementary Figure 1B) waren niet statistisch significant. De ROC-curve van tumor versus normaal suggereerde een scheiding tussen weefselgroepen in deze dataset (Figuur 2E), maar deze analyse mag niet worden geïnterpreteerd als klinische diagnostische validatie. Dit exploratieve onderscheid kan beïnvloed zijn door de bron van de normale stalen, batch-effecten, tumorzuiverheid en verschillen in weefselcompositie. MPO-expressie was ook geassocieerd met het pathologische T-stadium (Figuur 2F) en de PAM50-subtypeverdeling (Figuur 2G). Representatieve beelden van MPO-immunohistochemie (IHC) van aanliggend normaal borstweefsel en borstkankerweefsel werden toegevoegd als kwalitatieve referenties op proteïneniveau (Figuur 2H). De omkaderde gebieden geven regio's aan die bij een hogere vergroting worden getoond. De 20× overzichtsbeelden bevatten schaalbalken van 100 µm, terwijl de 40× beelden bij hogere vergroting schaalbalken van 50 µm bevatten.
Correlatie- en verrijkingsanalyse van MPO in de TCGA-BRCA cohort
Pearson-correlatieanalyse identificeerde de top 30 genen die positief correleerden met MPO, welke een gecoördineerde upregulatie vertoonden langs de MPO-expressiegradiënt (Figuur 3A), terwijl de top 30 negatief correlerende genen een omgekeerd expressiepatroon vertoonden (Figuur 3B). Op pathway-niveau was de MPO-expressie significant en positief geassocieerd met meerdere tumorgerelateerde signature-scores, waaronder de signature voor de inflammatoire respons (r = 0.41; Figuur 3C), EMT-markers (r = 0.264; Figuur 3D) en de score voor de set genen gerelateerd aan reactieve zuurstofverbindingen (ROS) (r = 0.415; Figuur 3E), wat suggereert dat de MPO-expressie correleert met inflammatoire/oxidatieve en mesenchym-achtige transcriptionele toestanden in de TCGA-BRCA-cohort.
Ongecontroleerde clustering van MPO-geassocieerde genen stratificeerde tumoren verder in expressiepatronen die overeenkwamen met klinische annotaties, waaronder het pathologische T-stadium en PAM50-intrinsieke subtypen (Figuur 3F). Om mogelijke connectiviteit tussen MPO-geassocieerde genen te onderzoeken, hebben we met behulp van STRING een eiwit-eiwitinteractie-netwerk (PPI) geconstrueerd, waardoor een onderling verbonden module tussen verschillende MPO-gecorreleerde genen werd onthuld (Figuur 3G). In het PPI-netwerk vertoonden ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 en KRT18 een hoge netwerkconnectiviteit binnen deze uit correlatie afgeleide module. Deze resultaten identificeren genen die covariëren met MPO-expressie, maar stellen geen MPO-gerelateerde pathogenese of directionaliteit vast. Differentieel expressieonderzoek tussen de MPO-hoge en MPO-lage groepen onthulde transcriptomische verschillen die zijn samengevat in het volcano-plot (Figuur 3H). In totaal werden 1.159 opgereguleerde en 854 neergereguleerde genen geïdentificeerd, wat diende als input voor daaropvolgende verrijkingsanalyses.
Vervolgens hebben we de functionele relevantie van de differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen de MPO-hoog en MPO-laag groepen onderzocht met behulp van het clusterProfiler-pakket in R. Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse wees uit dat deze DEGs voornamelijk betrokken waren bij immuun-gerelateerde biologische processen, waaronder de regulatie van celoppervlakreceptorsignalering gerelateerd aan de immuunrespons en lymfocyt-gemedieerde immuniteit; verrijking werd ook waargenomen in cellulaire componenten zoals het T-celreceptorcomplex en moleculaire functies gerelateerd aan receptoractivatoractiviteit (Figuur 4A). In overeenstemming hiermee benadrukte de KEGG-padanalyse immuun- en ontstekingsgerelateerde signaalpaden, waaronder cytokine-cytokinereceptorinteractie, chemokine-signalering, T-celreceptorsignalering, natural killer cel-gemedieerde cytotoxiciteit, Th1/Th2- en Th17-differentiatie, NF-κB-signalering, primaire immunodeficiëntie en het intestinale immuunnetwerk voor IgA-productie (Figuur 4B).
Om de richting van de expressie verder te integreren met functionele termen, werd de GO-plot gebruikt om Z-scores op term-niveau te berekenen op basis van DEG |log2FC|-waarden, wat opnieuw immuun-verrijkte transcriptionele programma's benadrukte, zoals de humorale immuunrespons, leukocyten/lymfocyten-gemedieerde immuniteit, activering van de immuunrespons en signaaltransductie (Figuur 4C). Gene set enrichment analysis (GSEA) op basis van de gerangschikte genenlijst toonde eveneens verrijking van immuunsysteempaden aan, waaronder het adaptieve immuunsysteem, cytokine-cytokinereceptorinteractie en neutrofiel degranulatie (Figuur 4D–G). Omdat MPO een myeloïde/neutrofiel-geassocieerd gen is, worden deze verrijkingen geïnterpreteerd als bewijs dat MPO-hoge monsters sterkere immuun/myeloïde transcriptionele signalen vertonen, in plaats van als bewijs dat MPO zelf de immuunmicro-omgeving remodelleert.
Correlatie tussen MPO-expressie en infiltratie van immuuncellen in borstkanker
We hebben de relatie tussen MPO-expressie en kenmerken van de tumormicro-omgeving in de TCGA-BRCA-cohort geëvalueerd. Toepassing van het ESTIMATE-algoritme onthulde significante positieve correlaties tussen MPO-expressie en de ESTIMATE-score (R = 0,347, p < 0,001), de immuunscore (R = 0,361, p < 0,001) en de stromale score (R = 0,232, p < 0,001) (Figuur 5A). De distributie van deze scores over de monsters wordt getoond in Figuur 5B. Analyse met gebruik van de TIMER/TIMER2.0-bron wees erop dat MPO-expressie geassocieerd was met geschatte infiltratieniveaus van belangrijke immuuncelpopulaties in de TCGA-BRCA-cohort, waaronder B-cellen, CD8+ T-cellen, neutrofielen, CD4+ T-cellen, macrofagen en dendritische cellen (Figuur 5C). Dit associatiepatroon werd verder geëvalueerd met behulp van op ssGSEA gebaseerde immuuncelverrijkingsscores voor 24 immuunceltypes. Na correctie voor de false discovery rate via de Benjamini–Hochberg-methode vertoonde MPO-expressie positieve associaties met meerdere immuuncelverrijkingsscores, waaronder T-cellen, B-cellen, cytotoxische cellen, subsets van dendritische cellen, macrofagen, T-helper-subsets, regulatoire T-cellen, CD8+ T-cellen, NK-cellen, mestcellen en neutrofielen (Figuur 5D). Deze bevindingen worden geïnterpreteerd als associaties met de immuuncompositie en niet als bewijs dat MPO de immuuncelinfiltratie direct reguleert. Er werd een heatmap gegenereerd om de immuuncelverrijkingspatronen op monsterniveau in de TCGA-BRCA-cohort te visualiseren (Figuur 5E). Vervolgens hebben we de via ssGSEA geschatte immuuncelverrijkingsscores vergeleken tussen tumorgroepen met een hoge en lage MPO-expressie, gedefinieerd op basis van de mediaan. Verschillende immuuncelverrijkingsscores verschilden tussen de twee groepen, waaronder geactiveerde dendritische cellen (aDC), B-cellen, CD8+ T-cellen, cytotoxische cellen, neutrofielen, T-cellen, Tregs, Th1-cellen, Th2-cellen, Th17-cellen, γδ T-cellen, folliculaire helper T-cellen (TFH), highly variable gene (HVG)-cellen, effector memory T-cellen, central memory T-cellen en T-helpercellen (Figuur 5F,G). Daarnaast werd CIBERSORT-gebaseerde deconvolutie met behulp van de LM22-signatuurmatrix uitgevoerd om de relatieve fracties van 22 immuunceltypes te schatten, en de resulterende immuuncelcompositiepatronen worden getoond in Figuur 5H.
DNA-methyleringsanalyse van MPO in de TCGA-BRCA cohort
Met gebruik van dezelfde mediane MPO-expressiedrempel in de tumor werden de TCGA-BRCA-monsters verdeeld in MPO-hoge en MPO-lage groepen, en werden de DNA-methyleringspatronen voor elke groep gevisualiseerd (Figuur 6A). Geselecteerde CpG-sites binnen de MPO-locus vertoonden overlevingsassociaties in de MethSurv-analyse, waaronder cg22331200, cg14619064 en cg11151395 (Figuur 6B–G). Deze methyleringsgerelateerde resultaten werden geïnterpreteerd als verkennende epigenetische annotaties en vereisen onafhankelijke validatie voordat er prognostische of mechanistische conclusies kunnen worden getrokken.
Associatie tussen MPO-expressie en neutrofiel-gerelateerde gennetwerken bij borstkanker
De TCGA-BRCA-cohort werd gebruikt om de associatie tussen MPO-expressie en neutrofielen-gerelateerde genen te onderzoeken. Er werd een STRING-gebaseerd PPI-netwerk geconstrueerd voor neutrofielen-geassocieerde genen, en hub-genen werden geprioriteerd op basis van de netwerktopologie (Figuur 7A). De top 20 hub-genen werden vervolgens geëvalueerd op hun correlatie met MPO-expressie. Zoals weergegeven in de lollipop-plot vertoonde MPO voornamelijk positieve correlaties met meerdere neutrofielen-gerelateerde mediatoren, waarbij sterkere associaties werden waargenomen voor componenten van chemokine/innate immuunsignalering zoals CCL5, CCL2 en TLR2, evenals TLR4, CXCR4, TNF en MMP9 (Figuur 7B).
Om het co-regulatiepatroon tussen deze hub-genen verder te karakteriseren, hebben we hun paarsgewijze relaties gevisualiseerd met behulp van een chord-diagram en een correlatie-heatmap, waaruit uitgebreide positieve intergenetische correlaties binnen de hub-module bleken, wat consistent is met een gecoördineerd inflammatoir/neutrofielen-geassocieerd transcriptioneel programma (Figuur 7C,D). Gezamenlijk wijzen deze resultaten erop dat een hogere MPO-expressie gepaard gaat met de gecoördineerde expressie van een neutrofielen-gerelateerd gennetwerk bij borstkanker.
Annotatie van kandidaat-transcriptiefactoren voor MPO
Om kandidaat-transcriptiefactoren te verkennen die mogelijk geassocieerd zijn met MPO, werden openbare transcriptiefactor-bronnen, waaronder KnockTF, ChIP-Atlas en GTRD, geraadpleegd en met elkaar gekruist. Kandidaat-transcriptiefactoren werden verder samengevat met behulp van netwerkgebaseerde prioritering en correlatieanalyse. Een grafische samenvatting wordt getoond in Aanvullende Figuur 2, en de volledige tabellarische resultaten zijn opgenomen in Aanvullend Bestand 2. Omdat deze databanken bewijsmateriaal uit heterogene experimentele contexten integreren, werden database-overlap en netwerkgraad uitsluitend gebruikt voor de annotatie en prioritering van kandidaten. Deze resultaten werden niet geïnterpreteerd als functioneel bewijs voor directe transcriptionele regulatie van MPO in borstkanker. Kandidaat-factoren, waaronder MYC, worden daarom gepresenteerd als aanvullende verkennende annotaties in plaats van als gevalideerde upstream-regulatoren.
Single-cell clustering en beschrijvende cel-cel communicatieanalyse gestratificeerd naar MPO-signaal
Om celtypen te annoteren, voerden we eerst een clusterspecifieke expressieanalyse uit op basis van canonieke markers voor elke lijn. De gemiddelde expressieniveaus en het percentage cellen dat deze sleutelgenen over de clusters uitdrukt zijn weergegeven, wat de daaropvolgende annotatie ondersteunt (Figuur 8A). Overeenkomstig worden de geannoteerde celclusters gevisualiseerd in een uniform manifold approximation and projection (UMAP) plot, waarin elke populatie kleurgecodeerd is volgens het geïdentificeerde type, waaronder plasmacytoïde dendritische cellen, endotheelcellen, myoepitheliale cellen, cyclerende epitheliale cellen, plasmacellen, cytotoxische T-cellen, epitheliale tumorcellen, B-cellen, geactiveerde CD4 T-cellen, monocyten-macrofagen, fibroblasten en conventionele T-cellen (Figuur 8B). De heatmap toont de expressieniveaus van geselecteerde genen over de celclusters (C1-C8). Elke rij representeert een gen en elke kolom representeert een celcluster. De kleurgradiënt geeft de expressieniveaus aan, waarbij rood staat voor hoge expressie en blauw voor lage expressie. Het linker dendrogram clustert genen met vergelijkbare expressiepatronen (Figuur 8C). De MPO-geassocieerde score werd per cel berekend met behulp van de MPO-geassocieerde genset zoals verstrekt in Supplementary File 1. AUCell, Seurat AddModuleScore en single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) werden gebruikt om de scores per cel te berekenen. Scores van de drie methoden werden Z-score genormaliseerd, geschaald naar een vergelijkbaar bereik en geïntegreerd om een samengestelde MPO-geassocieerde score te verkrijgen voor verdere beschrijvende analyse (Figuur 8D).
Deze analyse van cel-celinteracties vergeleek afgeleide ligand-receptorcommunicatiepatronen tussen celgroepen gestratificeerd naar MPO-geassocieerd signaal, inclusief het interactienetwerk, heatmaps van signaleringspatronen, een bubble plot van uitgaande signalering en een bubble plot van inkomende signalering (Figuur 8E–H). Omdat het MPO-signaal op single-cell niveau schaars was en de schijnbare distributie over geannoteerde celtypen beïnvloed kan zijn door dropout, ambient RNA, doublets en onzekerheid bij de annotatie, moeten deze communicatieplots worden geïnterpreteerd als beschrijvende workflow-uitvoer. Ze tonen niet aan dat MPO-expresserende cellen intercellulaire communicatie mediëren of controleren. Detecteerbaar MPO-signaal werd waargenomen in een beperkt aantal cellen, waaronder geannoteerde epitheliale tumorcellen en monocyten-macrofagen (Figuur 8I). Gezien het feit dat MPO canoniek geassocieerd is met neutrofiel/myeloïde lijnen, vereist dit patroon validatie in onafhankelijke single-cell datasets of via orthogonale experimentele methoden.
Exploratieve scTenifoldKnk-gevoeligheidsanalyse op basis van schaarse MPO-positieve cellen
Verschillende 10x Genomics-monsters werden geïntegreerd, gevolgd door normalisatie en selectie van HVG, PCA-gebaseerde dimensionaliteitsreductie, constructie van een k-nearest neighbor-graaf en Louvain-clustering. Canonieke expressiepatronen van markergenen over de clusters heen werden samengevat met een DotPlot, wat de daaropvolgende celtype-annotatie ondersteunde (Afbeelding 9A). UMAP-visualisatie toonde de geannoteerde single-cell-populaties in de geïntegreerde dataset (Afbeelding 9B). Canonieke lijnmarkers (bijv. EPCAM en KRT8/KRT18 voor epitheelcellen; PTPRC voor immuuncellen; MS4A1 voor B-cellen; LST1/S100A8/S100A9 voor myeloïde cellen; PECAM1 voor endotheelcellen; en COL1A1 voor fibroblast-/gladspierlijnen) vertoonden clusterspecifieke expressiepatronen, wat de celtype-annotatie ondersteunde (Afbeelding 9C). Per monster gestratificeerde gestapelde staafdiagrammen gaven aan dat elk monster meerdere clusters bevatte met beperkte algemene batch-tot-batch variatie (Afbeelding 9D).
De expressie van MPO was relatief schaars in de single-cell dataset, waarbij aanvankelijk slechts 85 MPO-positieve cellen werden gedetecteerd (Figuur 9E). Vanwege dit beperkte aantal werd KNN-gebaseerde buurtuitbreiding uitsluitend gebruikt om een lokale MPO-buurtsubset te definiëren voor een exploratieve sensitiviteitsanalyse. Deze uitgebreide subset mag niet worden geïnterpreteerd als een zuivere MPO-positieve populatie, omdat deze naburige cellen met een lage of ondetecteerbare MPO-expressie kan bevatten. Binnen deze MPO-buurtsubset werd een virtuele knockdown van MPO uitgevoerd met scTenifoldKnk als computationele sensitiviteitsanalyse. De resulterende volcano plot, manifold displacement-analyse, manifold alignment-visualisatie, GO/KEGG-verrijkingsresultaten en top-displacement-genen (Figuur 9F-N) benadrukten kandidaat-transcriptionele programma's gerelateerd aan antigeenpresentatie, myeloïde/lymfocytactivatie, cytokineproductie en fagosoom-gerelateerde pathways. Deze resultaten moeten worden geïnterpreteerd als exploratieve outputs van transcriptionele sensitiviteit en niet als direct bewijs dat MPO deze pathways mechanistisch reguleert in borstkanker. Onafhankelijke single-cell datasets en orthogonale experimentele validatie, zoals immunohistochemie, flowcytometrie, qPCR of functionele assays, zullen nodig zijn om deze observaties te onderbouwen.
Exploratieve retrieval van geneesmiddel-geninteracties en ADMET-annotatie
Als verkennende uitbreiding van de MPO-gecentreerde analyse werden informatie over interacties tussen geneesmiddelen en genen opgehaald uit DGIdb. Een grafisch overzicht is weergegeven in Aanvullende Figuur 3, en de resultaten op verbindingniveau zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 3. De DGIdb-query leverde een heterogene set MPO-geassocieerde chemische vermeldingen op, waaronder verbindingen met beperkte klinische plausibiliteit of ongunstige toxicologische profielen. Daarom werden deze uit de database afgeleide verbindingen op basis van de huidige analyse niet beschouwd als therapeutische kandidaten voor borstkanker. ADMET-gerelateerde informatie werd samengevat om een voorlopige annotatie te geven van de voorspelde fysisch-chemische, farmacokinetische en toxicologische eigenschappen. Het ophalen van verbindingen uit databases en ADMET-annotatie zijn niet gelijk aan klinisch gecureerde prioritering van geneesmiddelen. Deze resultaten dienen daarom enkel als chemische annotaties op screeningsniveau en illustreren de noodzaak van zorgvuldige farmacologische, toxicologische en klinische filtering voordat een verbinding in aanmerking kan komen voor therapeutisch onderzoek. De belangrijkste bevindingen van deze studie richten zich op de associatie tussen MPO-expressie en immuun-/myeloïde-gerelateerde transcriptionele kenmerken.
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS>:
TCGA-BRCA transcriptomische en klinische gegevens werden verkregen via het Genomic Data Commons portaal (https://portal.gdc.cancer.gov; gedownload op 26 augustus 2025; data release/versie 202208). De single-cell dataset GSE161529 werd verkregen via de Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). In deze studie werden geen nieuwe sequencinggegevens gegenereerd. De analysescripts zijn publiekelijk beschikbaar op https://github.com/tengfeitcm/MPO.
Figuur 1: Stroomschema van het proces van gegevensverzameling en -analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MPO-expressiepatronen en verkennende overlevingsassociaties bij borstkanker. (A) MPO-expressieniveaus werden geanalyseerd in 33 verschillende kankertypes en hun aangrenzende normale weefsels met behulp van de TCGA-database. (B) Ongepaarde monsters werden geselecteerd uit de TCGA-BRCA-dataset om de MPO mRNA-expressie in borstkanker en normaal weefsel te analyseren. (C) Gepaarde monsters werden geselecteerd uit de TCGA-BRCA-dataset om de MPO mRNA-expressie in borstkanker en normaal weefsel te analyseren. (D) Kaplan-Meier-analyse van PFI bij patiënten gestratificeerd naar de mediane tumor-MPO-expressie-cutoff in de TCGA-BRCA-cohort. (E) Verkennende ROC-curve die het onderscheid tussen tumor en normaal weefsel evalueert op basis van MPO-expressie in de geanalyseerde publieke transcriptomische dataset. (F) MPO-expressie over verschillende pathologische T-stadia. (G) MPO-expressie over PAM50-moleculaire subtypen, waarbij de subtype-labels worden weergegeven. (H) Representatieve MPO-immunohistochemie (IHC) beelden van aangrenzend normaal borstweefsel en borstkankerweefsel. De omkaderde gebieden geven regio's aan die bij een hogere vergroting worden getoond. De 20× overzichtsbeelden bevatten schaalbalken van 100 µm, terwijl de 40× beelden met hogere vergroting schaalbalken van 50 µm bevatten. Deze beelden worden getoond als kwalitatieve referenties op proteïneniveau en werden niet gebruikt voor kwantitatieve morfometrische of statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MPO-geassocieerde correlatie- en differentiële-expressieanalyse bij borstkanker. (A) Top 30 coderende genen die positief correleren met MPO-expressie op mRNA-niveau, gebaseerd op Pearson-correlatiecoëfficiënten uit de TCGA-database. (B) Top 30 coderende genen die negatief correleren met MPO-expressie op mRNA-niveau, gebaseerd op Pearson-correlatiecoëfficiënten. (C) Scatter-plots die Spearman-correlaties illustreren tussen MPO en genen die upregulated zijn door de ontstekingsrespons. (D) Scatter-plots die Spearman-correlaties illustreren tussen MPO en genen die upregulated zijn door EMT-markers. (E) Scatter-plots die Spearman-correlaties illustreren tussen MPO en genen die upregulated zijn door ROS. (F) Heatmap van MPO-geassocieerde genclusters gebaseerd op klinische significantie (T-stadium en PAM50). (G) PPI-netwerk voorspeld met behulp van de STRING-database voor MPO-geassocieerde eiwitten. (H) Volcano-plot van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen mediaan-gedefinieerde MPO-high en MPO-low tumorgroepen in de TCGA-BRCA-cohort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verrijkingsanalyse van MPO bij borstkanker. (A) Gene Ontology-verrijkingsanalyse van de 2.013 differentieel tot expressie gebrachte genen tussen MPO-hoge en MPO-lage groepen. (B) Pathway-verrijkingsanalyse via de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes van de 2.013 differentieel tot expressie gebrachte genen. (C) Gecombineerde visualisatie van Gene Ontology-verrijking waarin verrijkte termen zijn geïntegreerd met de richting van de differentiële expressie en |log2FC|-waarden. (D) Representatieve GSEA-verrijkingsplot voor een MPO-geassocieerde immuun-gerelateerde genset; de naam van de genset, de genormaliseerde verrijkingsscore en de FDR q-waarde worden in het paneel weergegeven. (E) Representatieve GSEA-verrijkingsplot voor een additionele MPO-geassocieerde immuun-gerelateerde genset; de naam van de genset, de genormaliseerde verrijkingsscore en de FDR q-waarde worden in het paneel weergegeven. (F) Representatieve GSEA-verrijkingsplot voor een additionele MPO-geassocieerde immuun-gerelateerde genset; de naam van de genset, de genormaliseerde verrijkingsscore en de FDR q-waarde worden in het paneel weergegeven. (G) Representatieve GSEA-verrijkingsplot voor een additionele MPO-geassocieerde immuun-gerelateerde genset; de naam van de genset, de genormaliseerde verrijkingsscore en de FDR q-waarde worden in het paneel weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Correlatie tussen immuuncelverrijking en MPO-expressie bij borstkanker. (A) Spreidingsdiagrammen die de correlaties tonen tussen MPO-expressie en de ESTIMATE-score, immuunscore en stromale score. (B) Boxplots die de verschillen in ESTIMATE-score, immuunscore en stromale score tonen tussen tumorgroepen met een hoge en lage MPO-expressie, gedefinieerd op basis van de mediaan. (C) Op TIMER/TIMER2.0 gebaseerde analyse die de associaties toont tussen MPO-expressie en de geschatte infiltratie van belangrijke immuuncelpopulaties. (D) Lollipop-plot die de Spearman-correlaties toont tussen MPO-expressie en de via ssGSEA geschatte verrijkingsscores voor 24 immuunceltypen. P-waarden van meerdere immuuncelcorrelaties werden gecorrigeerd met de Benjamini–Hochberg-methode voor de false discovery rate. (E) Heatmap die de verrijkingspatronen van immuuncellen op monsterniveau illustreert binnen de TCGA-BRCA-cohort. (F) Boxplots die de eerste set verschillen in ssGSEA-geschatte immuuncelverrijkingsscores tonen tussen tumorgroepen met een hoge en lage MPO-expressie, gedefinieerd op basis van de mediaan; groepvergelijkingen werden uitgevoerd met de Wilcoxon rank-sum test met Benjamini–Hochberg-correctie. (G) Boxplots die de tweede set verschillen in ssGSEA-geschatte immuuncelverrijkingsscores tonen tussen tumorgroepen met een hoge en lage MPO-expressie, gedefinieerd op basis van de mediaan; groepvergelijkingen werden uitgevoerd met de Wilcoxon rank-sum test met Benjamini–Hochberg-correctie. (H) Gestapelde staafdiagram die de via CIBERSORT geschatte immuuncelfracties toont op basis van de LM22-signatuurmatrix voor 22 immuunceltypen in tumorgroepen met een lage en hoge MPO-expressie, gedefinieerd op basis van de mediaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: DNA-methyleringsanalyse van het MPO-gen bij borstkanker. (A) Heatmap die MPO-methyleringspatronen laat zien in op de mediaan gedefinieerde MPO-hoge en MPO-lage groepen. (B) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg27456487-site. (C) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg02668773-site. (D) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg07110356-site. (E) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg11151395-site. (F) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg14619064-site. (G) Kaplan-Meier-overlevingscurve die de prognostische significantie aantoont van methylering op de cg22331200-site. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van correlaties tussen MPO en neutrofiel-gerelateerde genen op mRNA-niveau met behulp van de TCGA-database. (A) Visualisatie van het proteïne-interactienetwerk, met weergave van interacties tussen het kernproteïne en andere proteïnen. (B) Correlatieanalyse van de top 20 neutrofiel-gerelateerde genen met MPO, waarbij de correlatiecoëfficiënten en P-waarde-verdelingen voor verschillende genen worden getoond. (C) Chord-diagram van correlaties tussen de top 20 neutrofiel-gerelateerde genen, waarin de sterkte en richting van genassociaties visueel worden weergegeven. (D) Correlatie-heatmap van de top 20 neutrofiel-gerelateerde genen, met weergave van correlatiecoëfficiënten en significantieniveaus via kleurgradiënten en statistische markeringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Single-cell clustering en MPO-geassocieerde cel-cel-communicatieanalyse in de single-cell dataset van borstkanker. (A) DotPlot van canonieke markergenen over clusters voor celtype-annotatie. (B) UMAP-visualisatie van geannoteerde celpopulaties. (C) Heatmap van geselecteerde markergenen over celclusters. (D) DotPlot die MPO-geassocieerde scores over geannoteerde celtypen samenvat, berekend met AUCell, ssGSEA en Seurat AddModuleScore op basis van de genset in Aanvullend Bestand 1. (E) Netwerk van cel-cel-interacties dat de communicatie weergeeft tussen epitheliale tumorcellen, gestratificeerd naar MPO-geassocieerd signaal, en andere celtypen; de lijndikte vertegenwoordigt de interactiesterkte en de knoopgrootte weerspiegelt de totale interactieactiviteit. (F) Heatmaps die uitgaande en inkomende signaleringspatronen over celtypen tonen. (G) Bubble plot van uitgaande signaleringspaden van epitheliale tumorcellen, gestratificeerd naar MPO-geassocieerd signaal, naar andere celtypen. (H) Bubble plot van inkomende signaleringspaden van andere celtypen naar epitheliale tumorcellen, gestratificeerd naar MPO-geassocieerd signaal. (I) MPO-expressieverdeling over geannoteerde celtypen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Single-cell atlas-analyse en exploratieve virtuele knockdown van de MPO-gevoeligheidsoutput. (A) DotPlot die de expressie van canonieke markergenen over single-cell clusters laat zien; de grootte van de stip vertegenwoordigt het percentage cellen dat elke marker tot expressie brengt, en de kleurintensiteit vertegenwoordigt het gemiddelde expressieniveau. (B) UMAP-visualisatie van geannoteerde single-cell populaties, waarbij elke kleur een onderscheidend celtype of cluster vertegenwoordigt. (C) UMAP-visualisatie van de expressie van belangrijke markergenen, die de expressieverdeling van markergenen voor celtypen laat zien, inclusief myeloïde cellen. (D) Gestapeld staafdiagram van de celclusterproporties over de monsters. (E) UMAP-visualisatie van MPO-genexpressie. (F) Violinplot die de QC-metrieken van single-cell sequencing laat zien. (G) Clusteringplot van belangrijke markergenen. (H) DotPlot van canonieke markergenen op clusterniveau. (I) Volcano-plot van genen die veranderd zijn in de virtuele knockdown-gevoeligheidsanalyse. (J) Scatterplot van verplaatsing versus significantie. (K) Manifold alignment pijlplot. (L) GO BP-enrichmentanalyse van genen uit de virtuele knockdown-output. (M) KEGG-pathway enrichmentanalyse van genen uit de virtuele knockdown-output. (N) Top 20 genen met de hoogste manifold-verplaatsing na uitsluiting van MPO. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Aanvullende overlevingsanalyses voor MPO in de TCGA-BRCA-cohort. (A,B) Dit bestand bevat aanvullende Kaplan-Meier-overlevingsanalyses voor (A) algehele overleving en (B) ziekte-specifieke overleving, gestratificeerd op basis van de mediane afkapwaarde van de MPO-expressie in de tumor. Deze analyses worden verstrekt als aanvullende uitkomstanalyses voor figuur 2D en waren niet statistisch significant in de huidige cohort.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Figuur 2: Exploratieve annotatie van kandidaat-transcriptiefactoren voor MPO. (A) Venn-diagram dat de overlap van kandidaat-transcriptiefactoren uit drie openbare bronnen voor transcriptiefactoren laat zien. (B) Output van de vergelijking van MYC-expressie. (C) Heatmap van de correlatie tussen transcriptiefactoren met rij- en kolomlabels. (D) Output van de MPO–MYC-correlatie. (E) Output van de MYC-overlevingsanalyse. (F) Output van de MYC-ROC. MYC-gerelateerde outputs worden uitsluitend getoond als aanvullende annotaties van kandidaat-transcriptiefactoren en worden niet gebruikt om conclusies over mechanistische upstream-regulatoren te ondersteunen.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Exploratieve output van DGIdb-geneesmiddel-gen retrieval voor MPO. Grijze knooppunten vertegenwoordigen het MPO-gen, oranje knooppunten vertegenwoordigen opgehaalde vermeldingen van kleine moleculen, en verbindingslijnen geven door de database voorspelde relaties tussen geneesmiddel en gen aan.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 1: De LM22 immuuncel-signatuurmatrix gebruikt voor CIBERSORT-gebaseerde immuuncel-deconvolutieanalyse van 22 immuunceltypen. Gene symbols werden geharmoniseerd, dubbele vermeldingen werden verwijderd en beschikbare genen werden gekruist met de overeenkomstige TCGA-BRCA of GSE161529 expressiematrices voorafgaand aan de verdere analyse.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: De lijst met neutrofiel-gerelateerde genen die is gebruikt voor STRING/PPI-analyse, prioritering van hub-genen en MPO-hubgen-correlatieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 3: Exploratieve DGIdb drug-gen retrieval en ADMET-annotatieoutputs voor MPO. Dit bestand bevat door DGIdb opgehaalde records van chemische-geninteracties geassocieerd met MPO en voorspelde fysicochemische, farmacokinetische en toxiciteitsgerelateerde annotaties op verbindingsniveau. Deze outputs worden uitsluitend verstrekt als preliminaire chemische annotaties en mogen niet worden geïnterpreteerd als lijsten met therapeutische kandidaten. Ze bewijzen geen MPO-inhibitie, target engagement, ligand-specificiteit, selectiviteit, veiligheid, therapeutische effectiviteit of klinische geschiktheid. De waarden in deze tabel vertegenwoordigen voorspelde fysicochemische parameters en drug-likeness parameters voor de vermelde verbindingen. Molecuulgewicht wordt uitgedrukt in gram per mol (g/mol). De waarden voor waterstofbrugacceptoren en waterstofbrugdonoren geven respectievelijk het voorspelde aantal waterstofbrugacceptoren en -donoren aan. De Moriguchi octanol-water partitiecoëfficiënt geeft de voorspelde lipofiliteit aan. Lipinski's violations geven het aantal criteria van de Lipinski rule-of-five aan dat niet wordt voldaan door elke verbinding. De bioavailability score vertegenwoordigt de voorspelde score met betrekking tot orale biologische beschikbaarheid, en topological surface area verwijst naar het voorspelde topologisch polair oppervlak.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: De MPO-geassocieerde genenlijst gebruikt voor single-cell signature scoring met AUCell, Seurat AddModuleScore en ssGSEA. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Exploratieve annotatie-outputs van kandidaat-transcriptiefactoren en miRNA's voor MPO. Dit bestand bevat uit databases afgeleide annotatieresultaten van kandidaat-transcriptiefactoren en miRNA's op basis van openbare bronnen, waaronder KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD en TargetScan. Deze annotaties worden uitsluitend verstrekt voor de exploratieve prioritering van kandidaten en mogen niet worden geïnterpreteerd als functioneel bewijs van upstream-regulatie van MPO bij borstkanker.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie presenteert een verkennende workflow op basis van een publieke dataset en in silico voor het onderzoeken van associaties tussen MPO-expressie en immuun-/myeloïde kenmerken bij borstkanker. De TCGA-BRCA-analyses toonden aan dat de MPO-expressie lager was in tumorweefsels dan in aangrenzende niet-tumorweefsels en dat een hogere MPO-expressie geassocieerd was met een langer progressievrije interval. De algehele overleving en ziekte-specifieke overleving waren echter niet statistisch significant. Daarom mag MPO op basis van de huidige bewijslast niet worden geïnterpreteerd als een robuuste of gevestigde prognostische biomarker. Toekomstige studies dienen MPO te evalueren met behulp van multivariabele Cox-regressiemodellen, gecorrigeerd voor gevestigde clinicopathologische variabelen, onafhankelijke validatiecohorten en subtype-gestratificeerde analyses.
In vergelijking met conventionele differentieel-expressieanalyse van een enkele cohort of immuuninfiltratieschatting op basis van één enkel platform, integreert deze MPO-gecentreerde workflow bulk-transcriptomica, immuunverrijking, methylatie-annotatie, single-cell mapping en virtuele perturbatie om een breder exploratief beeld te geven van MPO-geassocieerde immuun-/myeloïde kenmerken. Deze workflow blijft echter complementair aan, en is geen vervanging voor, validatie in externe cohorten, validatie op ruimtelijk of eiwitniveau en experimentele perturbatie-assays.
De resultaten van de immuuninfiltratie en verrijking moeten worden geïnterpreteerd als een MPO-geassocieerde immuuncontext in plaats van als MPO-gestuurde immuunremodellering. MPO komt voornamelijk tot expressie in neutrofielen en andere cellen van de myeloïde lijn37. Daarom zijn positieve correlaties tussen MPO-expressie en ESTIMATE-scores, immuunscores, verrijkingsscores van immuuncellen, neutrofiel-gerelateerde genen, cytokineroutes, antigen-presentatiesignaturen of neutrofiel-degranulatieroutes biologisch plausibel en kunnen deze grotendeels verschillen in de abundantie van immuun-/myeloïde cellen binnen bulk-tumorstalen weerspiegelen. Deze interpretatie is consistent met eerdere studies waaruit blijkt dat MPO-positieve neutrofielinfiltratie geassocieerd is met een gunstige prognose bij borstkanker en dat MPO betrokken is bij de functie van dendritische cellen en T-cel-gestuurde weefselontsteking38,39. Bulk RNA-seq data kunnen niet bepalen of MPO een tumorcel-intrinsieke activiteit heeft of dat het waargenomen signaal primair infiltrerende immuuncellen weerspiegelt. Onafhankelijke single-cell datasets, ruimtelijke profilering, immunohistochemie, flowcytometrie of perturbatie-gebaseerde experimentele modellen zouden nodig zijn om de cellulaire bron en functie te verduidelijken.
De single-cell analyse verschaft aanvullende beschrijvende informatie, maar blijft beperkt door de schaarse detectie van MPO. In eerste instantie werden slechts 85 MPO-positieve cellen gedetecteerd vóór de KNN-gebaseerde buurtuitbreiding. Hoewel KNN-uitbreiding een sensitiviteitsanalyse mogelijk maakte van cellen in de lokale transcriptionele buurt van MPO-positieve cellen, kan deze procedure cellen bevatten die MPO niet direct tot expressie brengen. Bijgevolg moet de output van de scTenifoldKnk virtuele knockdown worden geïnterpreteerd als een verkennende computationele sensitiviteitsanalyse en niet als bewijs voor MPO-gemedieerde padregulatie40. Validatie in onafhankelijke single-cell borstkankerdatasets en orthogonale experimentele assays zal vereist zijn voordat mechanistische conclusies kunnen worden getrokken.
De analyse van transcriptiefactoren moet bovendien met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. De overlap van KnockTF-, GTRD- en ChIP-Atlas-voorspellingen, gevolgd door prioritering op basis van graad, kan kandidaat-transcriptiefactoren aanwijzen, maar kan geen functionele transcriptionele regulatie van MPO in borstkanker vaststellen. MYC en andere kandidaatfactoren werden daarom slechts als explorerende annotaties behouden. Omdat de activiteit van transcriptiefactoren sterk contextafhankelijk is en kan variëren per tumorsubtype, cellulaire samenstelling, assayplatform en preprocessingstrategie, is contextspecifieke validatie vereist voordat een kandidaatfactor een stroomopwaartse regulerende rol kan worden toegewezen. Dergelijke validatie dient ChIP-qPCR of ChIP-seq, promoter-reporterassays en perturbatie van de transcriptiefactor, gevolgd door meting van de MPO-expressie, te omvatten.
Het ophalen van geneesmiddel-geninteracties en de ADMET-annotatie moeten ook met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. DGIdb kan heterogene chemische-genassociaties retourneren, waaronder verbindingen die geen selectieve MPO-liganden zijn en mogelijk een beperkte klinische plausibiliteit of ongunstige toxicologische eigenschappen hebben36. ADMET-voorspellingen bieden voorlopige chemische annotaties, maar bewijzen geen target engagement, potentie, selectiviteit, veiligheid of therapeutische effectiviteit41. Daarom mogen de huidige resultaten op verbindingniveau niet worden gebruikt om therapeutisch potentieel af te leiden. Een betekenisvolle translationele evaluatie zou een gecureerde set van farmacologisch relevante MPO-remmers of probes vereisen, vergelijking met gevestigde MPO-gerichte verbindingen en validatie met behulp van biochemische, cellulaire en farmacologische assays. De contextafhankelijke en potentieel dubbele rol van MPO bij kanker moet ook worden meegewogen bij de interpretatie van geneesmiddelgerelateerde bevindingen. MPO kan bijdragen aan tumorbevorderende processen via oxidatieve stress, de generatie van reactieve oxidanten, DNA-schade, chronische ontsteking en remodellering van de tumormicro-omgeving. Tegelijkertijd kan MPO-expressie in bulk-tumordatasets wijzen op infiltratie door neutrofielen of andere myeloïde immuuncellen, wat in sommige contexten geassocieerd kan zijn met een immuunactieve micro-omgeving en gunstigere klinische uitkomsten39,42. De biologische interpretatie van MPO is derhalve afhankelijk van het tumortype, de cellulaire bron, het ziektestadium en de compositie van de immuuncellen.
Bevindingen over DNA-methylering binnen de MPO-locus werden ook als verkennend beschouwd. Geselecteerde CpG-sites vertoonden overlevingsassociaties in de MethSurv-analyse, maar deze resultaten vereisen onafhankelijke validatie voordat er prognostische of mechanistische conclusies kunnen worden getrokken. Epigenetische regulatie van MPO kan interageren met transcriptiefactorbinding en regulatie op chromatineniveau, maar dergelijke interacties blijven speculatief zonder functionele chromatine- of perturbatiedata43.
De klinische implicaties van MPO-expressie moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. De huidige resultaten stellen MPO niet vast als een klinisch toepasbare biomarker of als een marker die momenteel beslissingen over immunotherapie bij borstkanker kan sturen. In plaats daarvan kan MPO een myeloïde/neutrofiel-gerelateerde immuuncontext binnen de tumoromgeving weerspiegelen. In toekomstige studies zou de MPO-expressie kunnen worden geëvalueerd samen met gevestigde immunotherapie-gerelateerde markers, waaronder tumor-infiltrerende lymfocyten, PD-L1-expressie, expressie van immuuncheckpoint-genen, moleculair subtype en gevalideerde immuunsignaturen. Dergelijke analyses zouden onafhankelijke cohorten, multivariabele modellen en datasets van behandelingsresponsen moeten bevatten voordat MPO in aanmerking kan komen voor patiëntenstratificatie of besluitvorming over immunotherapie.
Verschillende stappen in de workflow zijn cruciaal voor de reproduceerbaarheid, waaronder een consistente voorbewerking van TCGA-BRCA-gegevens, de grouping van MPO-high/MPO-low op basis van de mediaan van enkel tumorweefsel, vooraf gedefinieerde statistische drempelwaarden en correcties voor meervoudig testen, algoritmen voor immuuncelverrijking en signatuursets, kwaliteitscontrole en annotatie op single-cell niveau, KNN-gebaseerde uitbreiding van de MPO-omgeving, en de explorerende verwerking van virtuele knockdown- en DGIdb/ADMET-outputs. Wijzigingen in deze parameters kunnen de stroomafwaartse resultaten en interpretatie beïnvloeden; daarom moeten deze zorgvuldig worden gerapporteerd en gereproduceerd. Bij het oplossen van problemen moeten inconsistente outputs worden aangepakt door de monsterbron, expressienormalisatie, grouping-cutoff, correctie voor meervoudig testen, immuuncel-signatuursets, single-cell QC en annotatie, KNN-omgevingsdefinitie, virtuele knockdown-drempelwaarden, verrijking-cut-offs en heterogene DGIdb/ADMET-verbinding-records te controleren.
Verschillende beperkingen van deze studie moeten worden erkend. Ten eerste was deze studie gebaseerd op retrospectieve analyses van publieke databases met behulp van TCGA-BRCA en publiek beschikbare single-cell-gegevens, en kan deze daarom worden beïnvloed door cohort-heterogeniteit, verschillen in monsterbronnen, batch-effecten, incomplete klinische annotatie en verschillen in tumorcompositie. Ten tweede zijn de huidige bevindingen hoofdzakelijk afgeleid van transcriptomische associaties en in silico-analyses en ontbreekt directe experimentele validatie. Daarom mogen de waargenomen associaties tussen MPO-expressie, immuun-/myeloïde kenmerken, methyleringsannotaties, transcription-factor-kandidaten en virtual knockdown-outputs niet worden geïnterpreteerd als causale mechanismen. Ten derde was de detectie van MPO in de single-cell-dataset schaars, waarbij slechts 85 MPO-positieve cellen werden gedetecteerd vóór de KNN-gebaseerde neighborhood expansion. De uitgebreide MPO-neighborhood-subset kan cellen bevatten met een lage of niet detecteerbare MPO-expressie en mag niet worden beschouwd als een zuivere MPO-positieve populatie. Ten vierde, omdat MPO hoofdzakelijk geassocieerd is met neutrofielen en andere cellen van de myeloïde lijn, kunnen MPO-gerelateerde signalen in bulk RNA-seq-gegevens worden beïnvloed door immuuncel-abundantie, tumorzuiverheid en cellulaire compositie, in plaats van een weerspiegeling te zijn van tumorcel-intrinsieke activiteit. Tot slot waren de DGIdb-gebaseerde drug-gene retrieval en ADMET-annotatie slechts verkennende chemische annotaties. Deze resultaten leggen geen MPO-inhibitie, target engagement, selectiviteit, veiligheid, therapeutische effectiviteit of klinische geschiktheid vast. Toekomstige studies met behulp van onafhankelijke cohorten, ruimtelijke of eiwitniveau-validatie en functionele experimenten zijn vereist om de biologische en klinische relevantie van deze bevindingen te bevestigen.
Samenvattend ondersteunen de huidige analyses van publieke datasets een associatie tussen MPO-expressie en immuun/myeloïde transcriptionele kenmerken bij borstkanker, waarbij een hogere MPO-expressie geassocieerd is met een langer progressievrij interval in de geanalyseerde cohort. De bevindingen blijven verkennend en dienen ter genereren van hypothesen. Ze stellen niet vast dat MPO het immuunmicro-milieu van de tumor causaal reguleert, dat MYC MPO functioneel reguleert, of dat de gevonden verbindingen therapeutische relevantie hebben. De belangrijkste bijdragen van deze studie zijn een reproduceerbare computationele workflow en een reeks testbare hypothesen die validatie in externe cohorts en experimentele bevestiging vereisen.
Openbaarmakingen
De auteurs melden geen belangenverstrengeling bij dit werk. Een op AI gebaseerde tool voor taalbewerking is uitsluitend gebruikt ter ondersteuning bij het polijsten van de Engelse taal en de leesbaarheid tijdens de revisie van het manuscript. De tool is niet gebruikt voor het ontwerp van de studie, data-analyse, het genereren van figuren, de interpretatie van resultaten, de selectie van referenties of het trekken van wetenschappelijke conclusies. Alle analyses, resultaten, interpretaties, referenties en de definitieve tekst zijn zorgvuldig gecontroleerd, beoordeeld en goedgekeurd door de auteurs, die de volledige verantwoordelijkheid dragen voor de inhoud van het manuscript.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het Scientific Research Fund of Aerospace Center Hospital (YN202530) hartelijk voor de financiële ondersteuning.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CellChat | R-package/Open source | https://github.com/sqjin/CellChat | Analyse van cel-celcommunicatie |
| ChIP-Atlas | Publieke database | https://chip-atlas.org/ | Screening van TF-targets; update 2021 |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | GO/KEGG-enrichmentanalyse; v4.4.4 |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Netwerkvisualisatie en topologieanalyse |
| DGIdb | Washington University/Publieke database | https://www.dgidb.org/ | Ophalen van drug-geninteracties |
| GDC/TCGA-BRCA | National Cancer Institute | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Bron voor bulk-transcriptomische en klinische gegevens |
| Gene Expression Omnibus: GSE161529 | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | Bron voor single-cell dataset |
| GSEA/MSigDB | Broad Institute | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | Gene set enrichment-analyse en gene-set referentie; Versie 3.0 |
| GSVA | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/GSVA/ | Gene set variatie/ssGSEA-gerelateerde scoring; Versie 1.46.0 |
| GTRD | Publieke database | http://gtrd.biouml.org/ | Screening van TF-targets; 2021 |
| KnockTF | Publieke database | http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html | Hulpbron voor TF-perturbatie; Versie 2.0 |
| R | R Foundation for Statistical Computing | https://www.r-project.org/ | Omgeving voor statistische computatie |
| scTenifoldKnk | R-package/Open source | https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk | Virtuele knockdown-analyse |
| Seurat | R-package/Open source | https://satijalab.org/seurat/ | Single-cell preprocessing en clustering |
| STRING | ELIXIR/Publieke database | https://string-db.org/ | Proteïne-proteïne interactieanalyse; v11 |
| SwissADME | SIB Swiss Institute of Bioinformatics | http://www.swissadme.ch/ | Beoordeling van drug-likeness; release 2017/webtool |
| TIMER | Publieke webhulpbron | https://timer.cistrome.org/ | Analyse van immuunfiltratie; TIMER2.0 |
| UCSC Xena of gekoppelde TCGA-portal | UCSC | https://xenabrowser.net/ | Exploratieve data-toegang/validatie |
Referenties
- Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
- Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
- Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
- Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
- Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
- Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
- Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
- Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
- Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
- Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
- Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
- Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
- Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
- Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
- Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
- Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
- Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
- Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
- Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
- Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
- Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
- Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
- Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
- Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
- Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
- Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
- Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
- Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
- Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
- Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
- Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
- Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
- Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
- Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
- Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
- Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
- Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
- Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
- Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
- Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
- Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
- Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
- Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.