Een reeks triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten werden gesynthetiseerd en geëvalueerd als urease- en α-glucosidase-remmers. Compound 8c vertoonde de sterkste urease-remming, terwijl 9e beter presteerde dan acarbose tegen α-glucosidase. BSA-bindings- en in silico-studies ondersteunden hun geneesmiddelachtige eigenschappen, waarbij beide verbindingen als veelbelovende leadkandidaten werden geïdentificeerd.
Onderzoeksartikel
Synthese, biologische evaluatie en in silico studies van nieuwe triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamiden als urease- en α-glucosidase-remmers
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie onderzocht het therapeutisch potentieel van nieuwe 1,2,4-triazol- en 1,3,4-oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten als dual-target remmers van urease en α-glucosidase, twee enzymen die respectievelijk betrokken zijn bij gastro-intestinale aandoeningen en type 2 diabetes. Een geïntegreerde benadering die multistep organische synthese, in vitro biologische evaluatie, moleculaire koppeling, in silico ADME-voorspelling en analyse van dichtheidsfunctionele theorie (DFT) combineert, werd toegepast om krachtige leidende verbindingen met gunstige farmacokinetische eigenschappen te identificeren. Beginnend met benzoëzuur werden een reeks 1,2,4-triazoolderivaten (8a–c) en 1,3,4-oxadiazolderivaten (9d–f) met gesubstitueerde acetamidegroepen succesvol gesynthetiseerd. Alle verbindingen vertoonden remmende activiteit tegen beide doelenzymen. Verbinding 8c was de krachtigste urease-remmer (IC₅₀ = 6,14 ± 1,06 μM), terwijl verbinding 9e de sterkste remming van α-glucosidase vertoonde (IC₅₀ = 27,29 ± 0,41 μM), waarmee hij de referentie-remmer acarbose (IC₅₀ = 38,25 ± 0,12 μM) overtrof. Computationele analyses ondersteunden de experimentele bevindingen: ADME-voorspellingen gaven gunstige geneesmiddelachtige eigenschappen aan, en moleculaire koppeling toonde sterke bindingsinteracties, waarbij verbinding 8a de hoogste affiniteit vertoonde voor α-glucosidase (−7,165 kcal/mol) en verbinding 9e de sterkste binding aan urease vertoonde (−7,30 kcal/mol). DFT-berekeningen correleerden de biologische activiteit verder met elektronische eigenschappen, waarbij relatief kleine HOMO–LUMO-energieverschillen voor de meest actieve verbindingen, 8c (0,14831 a.u.) en 9e (0,14302 a.u.) werden aangetoond. Gezamenlijk identificeren deze bevindingen de verbindingen 8c en 9e als veelbelovende loodsteigers voor de ontwikkeling van de volgende generatie remmers van urease en α-glucosidase.
Inleiding
Heterocyclische groepen zijn eerder gerapporteerd in veel bestaande geneesmiddelen, en heterocycli vormen een belangrijke klasse van enzymremmers die worden gebruikt bij de behandeling van metabole en infectieziekten1. Onder heterocycli zijn 1'3'4-oxadiazolen een van de meest bestudeerde steigers in geneesmiddelenontwikkeling en zijn gerapporteerd als antiviraal, antibacterieel, antibacterieel, kankerbestrijdend, hypotensief, neuroprotectiv, anticonvulsivum, antituberculcula en antituberculaire middelen2, 3,4,5. Evenzo hebben 1'2'4-triazolderivaten ook anticonvulsiva', antibacteriëf', antiviraal, antituberculair, antidiabetisch, anti-inflammatoir, antiproliferatief', antioxidant, antimalaria-, en urease-remmende werkingvertoond 6,7. Paracetamide-bevattende verbindingen hebben een sterk farmacologisch profiel en zijn gebruikt als synthetische intermediairen in heterocyclische chemie, evenals als antidiabetica, Anticoagulantia en chemosensensibiliserende middelen, waardoor ze aantrekkelijke loodstructuren zijn voor geneesmiddelenontdekking 8,9.
Er zijn aanzienlijke inspanningen gericht op de ontwikkeling van multitargetremmers van α-glucosidase en urease. α-Glucosidase-remming vertraagt de koolhydraatvertering en glucoseabsorptie, waardoor de postprandiale bloedsuikerspiegels bij patiënten met type 2 diabetes mellitus worden verlaagd. Huidige remmers zoals acarbose zijn effectief, maar worden geassocieerd met gastro-intestinale bijwerkingen, wat een behoefte creëert aan structureel diverse remmers10,11. Urease breekt ureum af tot ammoniak en kooldioxide. Deze reactie zorgt ervoor dat de bacterie Helicobacter pylori, die zweren veroorzaakt en de gastheer vatbaarder maakt voor maagkanker, in de maag kan overleven, waardoor urease een belangrijk doelwit is bij de ontwikkeling van anti-ulcusmedicijnen. A Het therapeutische doel is de ontwikkeling van nieuwe remmers voor beide enzymen 9,12.
Echter, ondanks de beschikbare onderzoeksstudies naar 1'2'4-triazol en 1'3'4-oxadiazol scaffolds, zijn er zeer weinig studies gerapporteerd die verband houden met de acetamidederivaten van 1'2'4-triazol en 1'3'4-oxadiazol die een thioether-groep bevatten als dubbele α-glucosidase- en ureaseremmers13. Hun eiwitbindingsgedrag en computationele karakterisering hebben in deze context ook beperkte aandacht gekregen. Hierin, We stelden voor dat het samenvoegen van triazol of oxadiazol en substituerende acetamidefragmenten in hetzelfde moleculaire kader een bevredigend enzymremmend profiel met acceptabele fysisch-chemische eigenschappen zou opleveren.
Om deze hypothese te testen, werden een reeks van 1,2,4-triazool-gebaseerde acetamidederivaten (8a–c) en 1,3,4-oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten (9d–f) gesynthetiseerd en geëvalueerd op hun remmende activiteit tegen α-glucosidase en urease. De bindingsinteracties van de meest actieve verbindingen (8a, 8c en 9e) met runderserumalbumine (BSA) werden onderzocht met behulp van fluorescentiespectroscopie, binding constant determinatie en thermodynamische analyse. Daarnaast werden moleculaire koppeling, ADME-voorspelling en dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT)-berekeningen uitgevoerd om hun bindingsmodi, farmacokinetische eigenschappen en elektronische eigenschappen te onderzoeken.
Protocol
Alle reagentia waren van analytische kwaliteit en werden zonder verdere zuivering gebruikt. De reactievoortgang werd gemonitord met dunne-laagchromatografie (TLC) op silicagel met n-hexaan/ethylacetaat (7:3–6:4, v/v), waarbij vlekken zichtbaar werden onder ultraviolet licht. Tenzij anders vermeld, werden alle reacties uitgevoerd onder omgevingsatmosfeer. De gesynthetiseerde verbindingen werden gekarakteriseerd door Fouriertransformatie infrarood (FTIR), 1HNMR en 13C NMR spectroscopie. De 1H en 13C NMR-spectra werden geregistreerd in CDCl₃ bij respectievelijk 600 MHz en 150 MHz, en chemische verschuivingen werden gerapporteerd in ppm ten opzichte van het resterende oplosmiddelsignaal. Het synthetische pad is afgebeeld in Figuur 1. De volledige fysisch-chemische karakteriseringsgegevens voor alle gesynthetiseerde verbindingen zijn beschikbaar in Supplementair Bestand 1.
Synthese van ethylbenzoaat (1)
Benzoëzuur (50 g, 0,41 mol) werd in een 500 mL rondbodemkolf geplaatst, en absolute ethanol (150 mL) werd toegevoegd. Geconcentreerd zwavelzuur (6 mL) werd druppelgewijs als katalysator toegevoegd onder continue magnetische roering. Het reactiemengsel werd 4–6 uur onder terugvloei verwarmd bij 78 °C met behulp van een watergekoelde condensor. De voortgang van de reactie werd gemonitord door TLC. Na voltooiing werd het mengsel gekoeld tot kamertemperatuur en geneutraliseerd met verzadigd waterig natriumcarbonaat totdat de pH 7–8 bereikte. Het reactiemengsel werd overgebracht naar een scheidingstrechter, en de organische laag werd opgevangen, gewassen met gedestilleerd water en gedroogd boven anhydrus natriumsulfaat. Na de filtratie werd ethylbenzoaat (1) direct gebruikt in de volgende stap zonder verdere zuivering (Figuur 1).
Synthese van benzohydrazide (2)
Ethylbenzoaat (1; 0,41 mol) werd opgelost in absolute ethanol (100 mL), en hydrazinehydraat (80%, 25 mL, overschot) werd toegevoegd onder continu roeren. Het reactiemengsel werd onder terugvloei verhit bij 78 °C gedurende 4–5 uur onder lucht met behulp van een watergekoelde condensor. De voortgang van de reactie werd gemonitord door TLC. Na voltooiing werd het witte kristallijne neerslag van benzohydrazide (2) opgevangen door filtratie, gewassen met koud ethanol, gedroogd tot constant gewicht bij kamertemperatuur, en gebruikt in latere synthetische stappen (Figuur 1).
Synthese van 5-fenyl-1,3,4-oxadiazol-2-thiol (3)
Benzohydrazide (2; 10 g, 0,073 mol) en kaliumhydroxide (4,12 g, 0,073 mol) werden in een 250 mL rondbodemfles met ethanol (30 mL) geplaatst. Het mengsel werd 10 minuten onder terugvloei verwarmd bij 78 °C met behulp van een watergekoelde condensor. Koolstofdisulfide (CS₂; 5 mL, 0,083 mol) werd vervolgens toegevoegd en de reflux werd nog eens 3–4 uur voortgezet. De voortgang van de reactie werd gemonitord door TLC. Na voltooiing werd het reactiemengsel overgebracht in gedestilleerd water en met continu roeren verwarmd. Verdund zoutzuur werd druppelwijs toegevoegd totdat de pH 5 bereikte, wat resulteerde in neerslag van verbinding (3) (Figuur 1). Het neerslag werd door filtratie opgevangen, grondig gewassen met koud gedestilleerd water, gedroogd tot een constant gewicht en gewogen om de opbrengst te bepalen. De verbinding werd gekarakteriseerd door FTIR, 1H NMR en 13C NMR spectroscopie.
Synthese van 4,5-difenyl-4H-1,2,4-triazool-3-thiol (4)
Benzohydrazide (2; 5 g, 0,037 mol) en fenylisothiocyanaat (4 mL, 0,037 mol) werden geplaatst in een 100 mL rondbodemkolf voorzien van een watergekoelde condensor. Het reactiemengsel werd onder reflux verhit bij 78 °C totdat de vorming van het thiosemicarbazide-intermediair voltooid was, zoals bevestigd door TLC met n-hexaan/ethylacetaat (7:3, v/v). Kaliumhydroxide (2 g, 0,036 mol), opgelost in ethanol (20 mL), werd vervolgens toegevoegd, en de reflux werd voortgezet tot de vorming van verbinding (4), zoals bevestigd door TLC. Het reactiemengsel werd overgebracht naar gedestilleerd water, verhit met continu roeren en verzuurd met verdund zoutzuur tot pH 5 om verbinding (4) neer te slaan (Figuur 1). Het neerslag werd opgevangen door filtratie, grondig gewassen met koud gedestilleerd water, gedroogd tot constant gewicht en gekarakteriseerd met FTIR, 1H NMR en 13C NMR spectroscopie.
Synthese van bromoacetamide-tussenproducten 7(a–f)
Elke gesubstitueerde anilineafgeleide 5(a–f) (1 equivalent) werd opgelost in chloroform en afgekoeld in een ijsbad om de reactietemperatuur op 0–5 °C te houden. Bromoacetylbromide (6, ≥98%, 1 equivalent) werd druppelwijs toegevoegd met continu roeren. Tijdens de reactie werd naar behoefte 18% waterige natriumcarbonaatoplossing toegevoegd om de pH van de reactie tussen 9 en 10 te behouden door het geproduceerde hydrobrominzuur te neutraliseren. Nadat de toevoeging van bromoacetylbromide was voltooid, werd het reactiemengsel tot kamertemperatuur opgewarmd en geroerd totdat TLC de volledige consumptie van het uitgangsmateriaal bevestigde. De resulterende bromoacetamide-tussenproducten 7(a–f) werden door filtratie verzameld, gewassen met koud gedestilleerd water, gedroogd tot een constant gewicht en direct gebruikt in de daaropvolgende synthetische stap zonder verdere zuivering (Figuur 1).
Synthese van triazol-gebaseerde acetamidederivaten 8(a–c)
Triazoolafgeleide (4; 0,5 g, 0,002 mol) werd opgelost in N, N-dimethylformamide (10 mL) in een 50 mL rondbodemkolf. Het juiste bromoacetamide-intermediair (7a, 7b of 7c; 0,002 mol, 1 equivalent) werd toegevoegd met continu roeren, gevolgd door natriumhydride (0,05 g, 0,002 mol) om S-alkylering te bevorderen. Het reactiemengsel werd 24–48 uur op kamertemperatuur geroerd, waarbij de voortgang van de reactie werd gevolgd door TLC. Na voltooiing werd het reactiemengsel in ijskoud water gegoten om neerslag te induceren. Het neerslag werd opgevangen door filtratie, grondig gewassen met koud water, gedroogd en gekarakteriseerd met FTIR, 1H NMR en 13C NMR-spectroscopie (Figuur 1).
Synthese van op oxadiazol gebaseerde acetamidederivaten 9(d–f)
Oxadiazol-derivaat (3; 0,5 g, 0,002 mol) werd opgelost in N, N-dimethylformamide (10 mL) in een 50 mL rondbodemkolf. Het bijbehorende bromoacetamide tussentijd, 7d, 7e of 7f (0,002 mol, 1 equivalent), werd toegevoegd, gevolgd door natriumhydride (0,05 g, 0,002 mol) om S-alkylering te vergemakkelijken. Het reactiemengsel werd 24–48 uur op kamertemperatuur geroerd, waarbij de voortgang werd gevolgd door TLC. Na voltooiing werd het mengsel in ijskoud water gegoten om het product neer te slaan. Het neerslag werd opgevangen door filtratie, grondig gewassen met koud water, gedroogd en gekarakteriseerd met FTIR, 1H NMR en 13C NMR-spectroscopie (Figuur 1).
α-glucosidase-inhibitietest
De remmende activiteit van α-glucosidase werd geëvalueerd door 50 μL van de testmonsteroplossing te mengen met 100 μL α-glucosidaseoplossing (0,35 U/mL) bereid in fosfaatbuffer (pH 6,8). Het reactiemengsel werd 10 minuten geïncubeerd bij 37 °C, waarna 100 μL van 1,5 mM p-nitrofenielenyl-α-D-glucopyranoside als substraat werd toegevoegd. Na verdere incubatie bij 37 °C gedurende 20 minuten werd de reactie beëindigd door 1 mL 1 M natriumcarbonaat (Na₂CO₃) toe te voegen. De absorptie werd gemeten op 400 nm14. Acarbose werd gebruikt als positieve controle. Het reactiemengsel zonder de testverbinding diende als negatieve controle, terwijl het reactiemengsel zonder enzym als blanco werd gebruikt.
Alle experimenten werden driemaal uitgevoerd en de resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Het percentage inhibitie van α-glucosidase-activiteit werd berekend met de volgende vergelijking(1)14:
(1)
waarbij As de absorptie van de testmonsteroplossing vertegenwoordigt, Ab de absorptie van het reagensblank (zonder α-glucosidase), en A0 de absorptie van de negatieve controle (zonder het monster). De IC50-waarden werden bepaald door het testen van verbindingsconcentraties variërend van 3,125 tot 100 μM. Niet-lineaire regressieanalyse werd uitgevoerd met standaard grafische software.
Urease-inhibitietest
De urease-remmende activiteit werd bepaald met een aangepaste Berthelot-methode. Het reactiemengsel bestond uit 300 μL van de testmonsteroplossing, 200 μL jackbean-ureaseoplossing en 200 μL van 25 mM ureum. Het mengsel werd 30 minuten geïncubeerd in een waterbad bij 37 °C. Na de incubatie werd 500 μL van een kleurontwikkelende oplossing toegevoegd met 10 g/L fenol en 50 g/L natriumnitroprusside, gevolgd door 500 μL van een tweede oplossing met 5% (v/v) natriumhypochloriet en 5 g/L natriumhydroxide. Het reactiemengsel werd vervolgens nog eens 15–30 minuten geïncubeerd om kleurontwikkeling mogelijk te maken.
De absorptie van de oplossing werd gemeten op 625 nm tegenover een reagensblank15. Thiourea werd gebruikt als positieve controle, het reactiemengsel zonder de testverbinding als negatieve controle, en het mengsel zonder het urease-enzym als blank. Alle experimenten werden driemaal uitgevoerd (n = 3), en de resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (S.D.). Het remmingspercentage werd berekend met de volgende wiskundige formule (2)15:
(2)
waarbij A0 de absorptie is van de controle (zonder inhibitor) en As de absorptie van het testmonster (met inhibitor). Grafieken en niet-lineaire regressieanalyses om IC50-waarden te bepalen werden uitgevoerd met standaard dataplottsoftware.
BSA-bindingsassay
Bindingsinteracties tussen runderserumalbumine (BSA) en de gesynthetiseerde verbindingen werden onderzocht met behulp van fluorescentie-afschrikkingsspectroscopie. Een 10 μM BSA-voorraadoplossing werd bereid in een 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,4). Voor elk titratieexperiment werd 1,0 mL BSA-oplossing gemengd met 2,0 mL fosfaatbuffer in een kwartscuvet. De oplossing werd getitreerd door opeenvolgende toevoegingen van 5 μL aliquot van de testverbinding (1,5 mM in methanol). Fluorescentie-emissiespectra werden geregistreerd over het golflengtebereik van 300–400 nm na excitatie bij 295 nm, met de maximale waarneming van ongeveer 336 nm. Fluorescentiemetingen werden uitgevoerd met een fluorescentiespectrofotometer uitgerust met standaard fluorescentie-acquisitiesoftware, met excitatie- en emissiespleetbreedtes ingesteld op respectievelijk 10 nm en 2,5 nm. Om de thermodynamische bindingsparameters te bepalen, waaronder de Gibbs-vrije energie (ΔG), enthalpie (ΔH) en entropie (ΔS), werden de titratie-experimenten herhaald bij 298, 308 en 313 K.
Om het fluorescentie-afkoelmechanisme te onderzoeken, werden de experimentele gegevens geanalyseerd met behulp van de Stern–Volmer-vergelijking (Vergelijking 3)16:
(3)
waarbij F0 en F respectievelijk de fluorescentieintensiteiten van BSA in afwezigheid en aanwezigheid van de afkoeler vertegenwoordigen; Kq is de bimoleculaire afkoelsnelheidsconstante; τ0 is de gemiddelde levensduur van BSA zonder een afkoeler; KSV is de Stern-Volmer afkoelconstante; en [Q] is de concentratie van de afkoeler. De bindingsconstante (Kb) en het aantal bindingsplaatsen (n) werden vervolgens bepaald door het dubbele logaritme uit te zetten volgens Vergelijking (4)16:
(4)
Bovendien werden de standaard Gibbs-vrije energieverandering (ΔG°), standaard enthalpieverandering (ΔH°) en standaard entropieverandering (ΔS°) die de bindingsinteractie regelen berekend met behulp van de Van't Hoff- en Gibbs-Helmholtz-relaties uitgedrukt in vergelijkingen (5) en (6)17:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
waarbij R de universele gasconstante is en T de absolute temperatuur in Kelvin.
Moleculaire koppeling
Alle moleculaire modellering en koppelingssimulaties werden uitgevoerd met de Schrödinger Suite (Maestro-interface), waarbij koppelen werd uitgevoerd met de Glide-module. De kristalstructuren van α-glucosidase (PDB ID: 5NN8) en urease (PDB ID: 4H9M) werden gehaald uit de RCSB Protein Data Bank. Eiwitstructuren werden voorbereid met behulp van de Protein Preparation Wizard door co-gekristalliseerde liganden, watermoleculen en niet-essentiële heteroatomen te verwijderen, ontbrekende residuen en lussen toe te voegen, correcte bindingsvolgordes toe te wijzen en polaire waterstofatomen toe te voegen. Protonatie- en tautomerische toestanden werden toegewezen bij fysiologische pH (7,0 ± 2,0) met behulp van de Epik-module. De voorbereide eiwitstructuren werden vervolgens onderworpen aan een beperkte energie-minimalisatie met het OPLS-krachtveld om sterische botsingen te verlichten.
De tweedimensionale structuren van verbindingen 3, 4, 8(a–c) en 9(d–f), samen met de referentieremmers acarbose en thiourea, werden voorbereid met behulp van de LigPrep-module. Bindingsorden, stereochemie en ionisatietoestanden bij fysiologische pH werden geoptimaliseerd, en de resulterende driedimensionale ligandconformaties werden energie-geminimaliseerd met behulp van het OPLS-krachtveld.
Receptorroosters werden gegenereerd met behulp van het Receptor Grid Generation-instrument, waarbij de roosterboxen gecentreerd waren op de co-gekristalliseerde native liganden om de actieve sites te definiëren. De afmetingen van de rasterboxen waren ingesteld op 25 × 25 × 25 Å voor beide eiwitten. Het ureaserooster was gecentreerd op x = −38,76, y = −44,14 en z = 66,88, terwijl het α-glucosidaserooster gecentreerd was op x = 21,14, y = −7,56 en z = 24,37.
Koppelingsberekeningen werden uitgevoerd met de extra-precision (XP) modus van Glide met flexibele ligandbemonstering. Meerdere bindingshoudingen werden voor elke ligand gegenereerd, en de houding met de laagste Glide-koppelscore werd geselecteerd voor verdere analyse. Het koppelingsprotocol werd gevalideerd door de co-gekristalliseerde liganden opnieuw aan te koppelen in hun respectievelijke receptorroosters. Root-mean-square-deviation (RMSD) waarden van ≤2,0 Å bevestigden de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van het dockingprotocol.
De bindingsconformaties van de gedockte complexen werden weergegeven met behulp van PyMOL (versie 3.1)18. Eiwit-ligandinteracties, waaronder waterstofbruggen, hydrofobe contacten en elektrostatische interacties, werden geanalyseerd met Discovery Studio Visualizer19.
Analyse van dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT)
Alle dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT)-berekeningen werden uitgevoerd met Gaussian 09, en de geoptimaliseerde moleculaire geometrieën en frontier moleculaire orbitalen werden gevisualiseerd met GaussView 5. De gesynthetiseerde triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten, 8(a–c) en 9(d–f), werden in de waterige fase onderworpen aan geometrische optimalisatie met behulp van de Becke-drieparameter Lee–Yang–Parr (B3LYP) hybride functionaal in combinatie met de 6-311+G(d,p) basisset20. Oplosmiddeleffecten werden geïntegreerd met behulp van het Conductor-achtige Polarizable Continuum Model (CPCM)21. Vervolgens werden op hetzelfde theoretische niveau berekeningen van vibratiefrequenties uitgevoerd om te bevestigen dat alle geoptimaliseerde structuren overeenkwamen met ware lokale minima op het potentiële energieoppervlak, zoals blijkt uit de afwezigheid van imaginaire frequenties.
Om de elektronische overgangen en kinetische stabiliteit van de gesynthetiseerde verbindingen te begrijpen, werden de energieën van de hoogst bezette moleculaire orbitaal (EHOMO) en de laagste onbezette moleculaire orbitaal (ELUMO) berekend. De frontier moleculaire orbitale energiekloof (ΔE = ELUMO - EHOMO) werd voor elke afgeleide bepaald om de chemische reactiviteit en kinetische stabiliteit te beoordelen, waarbij een kleinere energiekloof een hogere reactiviteit aangeeft.
Bovendien werden globale chemische reactiviteitsdescriptoren—waaronder chemische hardheid (η), zachtheid (S), chemisch potentiaal (μ), elektronegativiteit (X) en de elektrophiliciteitsindex (w)—berekend uit de frontier orbitale energieën met behulp van de volgende standaard operationele vergelijkingen22:
(7)
(8)
(9)
(10)
De berekende elektronische eigenschappen en globale descriptoren werden systematisch vergeleken over de reeks heen om structuur-activiteitsrelaties (SAR's) vast te stellen die hun waargenomen α-glucosidase- en urease-remmende profielen weerspiegelen.
Daarnaast werden moleculaire elektrostatische potentiaalkaarten (MESP) gegenereerd en gevisualiseerd met VESTA om de ladingsverdeling over de geoptimaliseerde moleculaire kaders in kaart te brengen. De MESP-oppervlakken maakten het mogelijk elektrofiele (elektronendeficiënte, nucleofiele aanval bevoordeeld) en nucleofiele (elektronrijke, elektrofiele aanvalsbegunstigde) regio's te identificeren. Deze elektrostatische potentiaalverdeling werd uiteindelijk gecorreleerd met de specifieke niet-covalente bindingsinteracties, zoals waterstofbruggen en elektrostatische contacten, waargenomen in de moleculaire koppelingssimulaties.
ADME-analyse
Om de geneesmiddelgelijkheid en biofarmaceutische eigenschappen van de gesynthetiseerde triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten 8(a–c) en 9(d–f) te evalueren, werd een in silico absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) analyse uitgevoerd. De vereenvoudigde moleculair-input line-entry system (SMILES) representaties van alle gesynthetiseerde verbindingen, samen met de referentieremmers acarbose en thiourea, werden gegenereerd met een moleculair modelleringssoftwarepakket en ingediend bij de SwissADME-webserver23.
De berekende fysisch-chemische parameters omvatten molecuulgewicht (MW), lipofiliciteit (logP), topologisch polair oppervlak (TPSA), het aantal waterstofbindingsdonoren (HBD), het aantal waterstofbindingsacceptoren (HBA) en het aantal roteerbare bindingen (RB).
Farmacokinetische eigenschappen werden geëvalueerd door de gastro-intestinale (GI) absorptie en de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) te voorspellen. Daarnaast werden de verbindingen beoordeeld op naleving van Lipinski's regel van vijf en andere vastgestelde criteria voor geneesmiddelgelijkheid om hun orale biobeschikbaarheid te schatten. Ten slotte werd de synthetische toegankelijkheid (SA) score voor elke verbinding berekend op een schaal van 1 (makkelijk te synthetiseren) tot 10 (zeer moeilijk te synthetiseren). De voorspelde ADME- en geneesmiddelgelijkheidsprofielen van de gesynthetiseerde verbindingen werden vergeleken met die van de referentieremmers om hun potentieel als leidende kandidaten voor geneesmiddelontwikkeling te evalueren.
Resultaten
Chemie en karakterisering van gesynthetiseerde verbindingen
De doel-triazol- en oxadiazolgebaseerde acetamidederivaten werden gesynthetiseerd volgens het synthetische pad dat in Figuur 1 wordt getoond. De gewenste verbindingen werden verkregen in goede tot uitstekende opbrengsten (69%–87%) als witte tot gele kristallijne vaste stoffen. Hun zuiverheid werd bevestigd door TLC, smeltpuntbepaling en spectroscopische analyses. Representatieve NMR-spectra die de karakteristieke functionele groepen van de gesynthetiseerde verbindingen bevestigen, zijn weergegeven in Figuur 2. De spectra vertoonden de verwachte absorptiebanden die overeenkomen met de amidecarbonylgroepen (C=O), N–H, C=N, C–S en aromatische C–H functionele groepen, wat de succesvolle synthese van de doelderivaten ondersteunde.
Representatieve 1H NMR-spectra zijn weergegeven in Figuur 3. De spectra vertoonden karakteristieke resonanties voor het amide NH-proton, aromatische protonen, methyleenlinker en methylsubstituenten, die consistent waren met de voorgestelde structuren. Representatieve 13C NMR-spectra zijn weergegeven in Figuur 4. De waargenomen koolstofresonanties bevestigden de aanwezigheid van carbonyl-, aromatische, methyleen- en heterocyclische koolstofatomen die voor de gesynthetiseerde derivaten worden verwacht. Representatieve verbindingen waren onder andere 8a (87% opbrengst), 8c (ongeveer 80%–85% opbrengst) en 9e (69% opbrengst). Volledige fysisch-chemische karakteriseringsgegevens en NMR-spectra voor alle gesynthetiseerde verbindingen zijn verstrekt in Aanvullend Bestand 1.
α-Glucosidase-remming
De remmende activiteiten van de α-glucosidase van de gesynthetiseerde verbindingen worden samengevat in Tabel 1. Alle verbindingen remden α-glucosidase in verschillende mate. Verbinding 9e vertoonde de hoogste remmende activiteit, met een IC50-waarde van 27,29 ± 0,41 μM, gevolgd door verbinding 8a (33,15 ± 0,07 μM) en verbinding 8c (40,93 ± 0,59 μM). Verbindingen 8b, 9d en 9f vertoonden relatief zwakkere remming, met IC50-waarden van respectievelijk 108,19 ± 0,18 μM, 108,10 ± 0,03 μM en 94,44 ± 0,25 μM. Verbinding 9e vertoonde een grotere remmende potentie dan de referentie-inhibitor acarbose (IC50 = 38,25 ± 0,12 μM), terwijl verbinding 8a vergelijkbare activiteit vertoonde. De concentratieafhankelijke inhibitieprofielen worden weergegeven in Figuur 5.
Urease-inhibitiepotentiaal
De urease-remmende activiteiten van de gesynthetiseerde verbindingen worden samengevat in Tabel 1. Verbinding 8c vertoonde de sterkste urease-remming, met een IC50-waarde van 6,14 ± 1,06 μM, gevolgd door verbindingen 9e (8,14 ± 0,71 μM) en 8a (12,25 ± 0,42 μM). Deze verbindingen vertoonden een grotere remmende activiteit dan de referentie-remmer thioureum (IC50 = 21,25 ± 0,15 μM). Verbindingen 8b, 9d en 9f waren minder actief, met IC50-waarden variërend van 82,15 tot 103,05 μM. De overeenkomstige concentratieafhankelijke inhibitiecurves zijn weergegeven in Figuur 5.
BSA-binding
De fluorescentie-afkoelparameters worden samengevat in Tabel 2. Voor verbindingen 8a en 9e nam de Stern–Volmer-constante (Ksv) toe met toenemende temperatuur, terwijl de afschrikconstante (Kq) de maximale diffusiegecontroleerde limiet overschreed (2 × 1010 M⁻1 s⁻1), wat wijst op een gemengd statisch en dynamisch afschrikmechanisme. Daarentegen vertoonde verbinding 8c dalende Ksv-waarden bij toenemende temperatuur, terwijl Kq-waarden boven de diffusiegecontroleerde limiet bleven, wat wijst op overwegend statisch afkoelen. Thermodynamische analyse toonde negatieve ΔH- en ΔS-waarden voor verbinding 8a, wat suggereert dat waterstofbruggen en van der Waals-interacties de overhand hadden tijdens binding. Positieve ΔH- en ΔS-waarden verkregen voor verbindingen 8c en 9e gaven aan dat hydrofobe interacties de belangrijkste drijvende kracht waren. Bindingsaffiniteitsanalyse uitgevoerd bij 298 K toonde aan dat verbinding 8a de hoogste bindingsconstante vertoonde (Kb = 3,92 × 105 M⁻1), gevolgd door verbinding 8c (1,54 × 104 M⁻1) en verbinding 9e (6,78 × 101M⁻1). De fluorescentiespectra en Stern–Volmer-grafieken zijn gepresenteerd in Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8, Figuur 9, Figuur 10 en Figuur 11.
Dockinganalyse
De moleculaire koppelingsresultaten worden samengevat in Tabel 3. Het koppelingsprotocol werd gevalideerd door de co-gekristalliseerde liganden opnieuw te koppelen in hun respectievelijke bindingsplaatsen, wat RMSD-waarden ≤2,0 Å opleverde, waarmee de betrouwbaarheid van het koppelingsprotocol werd bevestigd (Aanvullende Figuur 1).
Op basis van de biologische activiteit en koppelingsscores werden verbindingen 8a, 8c en 9e geselecteerd voor gedetailleerde interactieanalyse. Vertegenwoordigende dockinghoudingen binnen de actieve site van α-glucosidase worden weergegeven in Figuur 12A–D. Compound 8a vertoonde de hoogste koppelscore (−7,165 kcal/mol), gevolgd door compounds 8c (−6,80 kcal/mol) en 9e. Deze verbindingen stelden waterstofbindingsinteracties vast met belangrijke katalytische residuen, waaronder D282, D404, D616, R600, S523 en H674.
Representatieve dockinghoudingen binnen de urease actieve site zijn weergegeven in Figuur 12E–H. Verbinding 8c heeft waterstofbruggen gevormd met A636, Q635 en R439, terwijl verbinding 9e een uitgebreid waterstofbruggennetwerk vormde met E493, D494, H593, R609 en A636. Verbinding 8a toonde ook gunstige interacties met katalytische locatieresiduen. Al met al ondersteunde de koppelingsanalyse de experimentele remmingsresultaten.
DFT-studies
De berekende kwantumchemische descriptoren worden samengevat in Tabel 4. De grensverdelingen van moleculaire orbitale banen en moleculaire elektrostatische potentiaalkaarten van de referentieverbindingen worden weergegeven in Figuur 13, terwijl de overeenkomstige analyses voor de gesynthetiseerde verbindingen zijn weergegeven in Figuur 14 en Figuur 15.
Onder de gesynthetiseerde verbindingen vertoonde 9e de kleinste HOMO–LUMO-energiekloof (0,14302 a.u.), gevolgd door 8c (0,14831 a.u.) en 8a (0,15788 a.u.). De moleculaire elektrostatische potentiaalkaarten identificeerden elektronenrijke en elektronendeficiënte gebieden die kunnen bijdragen aan intermoleculaire interacties. De berekende globale reactiviteitsdescriptoren, waaronder ionisatiepotentiaal, elektronaffiniteit, elektronegativiteit, chemisch potentiaal, hardheid, zachtheid en elektrophiliciteitsindex, zijn vermeld in Tabel 4. Verbindingen van de 9-serie vertoonden lagere HOMO–LUMO-gaps en een hogere elektrofiliciteit dan de overeenkomstige 8-reeks afgeleiden.
ADME-analyse
De voorspelde farmacokinetische eigenschappen worden samengevat in Tabel 5. Alle gesynthetiseerde verbindingen voldeden aan de belangrijkste criteria voor geneesmiddelgelijkheid. De 9-serie afgeleiden vertoonden geen Lipinski-overtredingen, terwijl elke verbinding in de 8-serie één overtreding vertoonde. Van alle verbindingen werd voorspeld een hoge gastro-intestinale absorptie, geen doorlatendheid van de bloed-hersenbarrière en acceptabele hoeveelheden waterstofbinding donor- en acceptoraantallen te hebben. Biobeschikbaarheidsscores werden consequent voorspeld op 0,55. Synthetische toegankelijkheidsscores varieerden van 5,70 tot 6,39, wat wijst op matige synthetische complexiteit.
BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:
De datasets en ondersteunend materiaal die tijdens deze studie zijn gegenereerd, zijn gedeponeerd in de Zenodo-repository en zijn openbaar beschikbaar op https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952.
Figuur 1: Synthetische route voor de bereiding van triazol- en oxadiazolgebaseerde paracetamidederivaten. Reactieschema dat de synthese van tussenproducten en eindverbindingen 8(a–c) en 9(d–f) illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: NMR-spectra van verbinding 8a. (A) 1H NMR-spectrum van verbinding 8a. (B) 13C NMR-spectrum van verbinding 8a. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: NMR-spectra van verbinding 8c. (A) 1H NMR-spectrum van verbinding 8c. (B) 13C NMR-spectrum van verbinding 8c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: NMR-spectra van verbinding 9e. (A) 1H NMR-spectrum van verbinding 9e. (B) 13C NMR-spectrum van verbinding 9e. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Remmende activiteiten van de gesynthetiseerde verbindingen tegen α-glucosidase en urease. (A) Percentage remming van α-glucosidase en urease door verbindingen 3, 4, 8(a–c) en 9(d–f) vergeleken met respectievelijk de referentieremmers acarbose en thiourea. (B) IC50-waarden van dezelfde verbindingen tegen α-glucosidase en urease. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). De statistische significantie werd bepaald ten opzichte van de overeenkomstige referentie-remmer (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001; ns = niet significant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fluorescentie-afschrikanalyse van runders serumalbumine (BSA) door verbinding 8a. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 8a bij 298 K. (B) Stern–Volmer-plots verkregen bij 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische plot van log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Fluorescentie-afschrikningsanalyse van rundereserumalbumine (BSA) met verbinding 8b. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 8b bij 298 K. (B) Stern–Volmer-plots verkregen bij 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische plot van log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Fluorescentie-afkoelingsanalyse van runderenserumalbumine (BSA) met verbinding 8c. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 8c bij 298 K. (B) Stern–Volmer-plots verkregen bij 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische plot van log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Fluorescentie-afkoelingsanalyse van boviene serumalbumine (BSA) door verbinding 9d. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 9d bij 298 K. (B) Stern–Volmer-grafieken verkregen op 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische plot van log[(F₀ − F)/F] versus logaritmiek Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Fluorescentie-afkoelingsanalyse van runderserumalbumine (BSA) door verbinding 9e. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 9e bij 298 K. (B) Stern–Volmer-plots verkregen bij 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische plot van log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Fluorescentie-afkoelingsanalyse van runderenserumalbumine (BSA) door verbinding 9f. (A) Fluorescentie-emissiespectra van BSA (3,33 × 10⁻6 M) na incrementele toevoeging van verbinding 9f bij 298 K. (B) Stern–Volmer-grafieken verkregen bij 298, 308 en 313 K. (C) Dubbel-logaritmische grafiek van log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Bindingsmodi van de referentieremmers en geselecteerde gesynthetiseerde verbindingen binnen de α-glucosidase- en urease-actieve sites. (A) Bindingspositie van acarbose binnen de actieve plaats van α-glucosidase. (B) Bindende houding van verbinding 8a. (C) Bindende houding van verbinding 8c. (D) Bindende houding van verbinding 9e. (E) Bindende houding van thioureum binnen de urease actieve plaats. (F) Bindende houding van verbinding 8a. (G) Bindende houding van verbinding 8c. (H) Bindende houding van verbinding 9e. Waterstofbruggen worden weergegeven door gele stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Frontier moleculaire orbitalen en moleculaire elektrostatische potentiaal (MEP) kaarten van de referentieremmers. (A) Acarbose. (B) Thiourea. De hoogst bezette moleculaire orbitaal (HOMO), de laagst onbezette moleculaire orbitaal (LUMO) en MEP-oppervlakken worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 14: Frontier moleculaire orbitalen en moleculaire elektrostatische potentiaal (MEP) kaarten van de triazoolderivaten. (A) Verbinding 8a. (B) Verbinding 8b. (C) Verbinding 8c. De HOMO-, LUMO- en MEP-oppervlakken worden voor elke verbinding weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 15: Frontier moleculaire orbitalen en moleculaire elektrostatische potentiaal (MEP) kaarten van de oxadiazolderivaten. (A) Verbinding 9d. (B) Verbinding 9e. (C) Verbinding 9f. De HOMO-, LUMO- en MEP-oppervlakken worden voor elke verbinding weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Codes | Urease | α-Glucosidase | ||
| Remming (%) bij 0,5 mM | IC50 (μM) | Remming (%) bij 0,5 mM | IC50 (μM) | |
| 3 | 67,54 ± 1,03 | 41.51 ± 0.01 | 63.09 ± 0.25 | 79.12 ± 0.43 |
| 4 | 62,51 ± 0,42 | 45.14 ± 0.14 | 65,26 ± 0,55 | 70,28 ± 0,42 |
| 8a | 95,22 ± 1,55 | 12.25 ± 0.42 | 95,01 ± 0,57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62.64 ± 1.01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99,39 ± 0,27 | 06.14 ± 1.06 | 90,51 ± 0,01 | 40,93 ± 0,59 |
| 9d | 47.51 ± 1.01 | 103,05 ± 0,54 | 39.08 ± 0.25 | 108,10 ± 0,03 |
| 9e | 98,57 ± 0,04 | 08.14 ± 0.71 | 91,55 ± 0,34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9f | 58,07 ± 1,68 | 85.15 ± 0.12 | 43,15 ± 0,42 | 94,44 ± 0,25 |
| Thiourea | 96.24 ± 0.16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| Acarbose | - | - | 92.23 ± 0.14 | 38.25 ± 0.12 |
Tabel 1: Remmende activiteiten van de gesynthetiseerde verbindingen tegen α-glucosidase en urease. IC50-waarden en remmingspercentage van verbindingen 8(a–c) en 9(d–f) vergeleken met de referentieremmers acarbose en thiourea. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Afkortingen: IC50 = halfmaximale remmende concentratie; SD = standaarddeviatie.
| Compound | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol. K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3,92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6,49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6,95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2.41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1,44 x105 | 1.04 | 4,84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6,78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7,93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4.69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2,99 x105 | 1.41 | 1,67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1.54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1,53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
Tabel 2: Bindingsconstanten en thermodynamische parameters voor de interacties van geselecteerde verbindingen met rundereserumalbumine (BSA). Bindingsconstante (Kb), aantal bindingsplaatsen (n), Stern–Volmer-afschrikconstante (Ksv), bimoleculaire afschriksnelheidsconstante (Kq), Gibbs-vrije energie (ΔG), enthalpieverandering (ΔH) en entropieverandering (ΔS) voor verbindingen 8a, 8c en 9e, bepaald op 298, 308 en 313 K. Afkortingen: BSA = rundereserumalbumine; Kb = bindingsconstante; n = aantal bindingsplaatsen; Ksv = Stern–Volmer-afkoelconstante; Kq = bimoleculaire afschriksnelheid constant; ΔG = Gibbs vrije energie; ΔH = enthalpieverandering; ΔS = entropieverandering.
| Verbindingen | Alfa Glucosidase (kcal/mol) | Urease (kcal/mol) |
| Acarbose | −6,90 | - |
| Thiourea | - | −5,80 |
| 3 | −4.35 | −4,50 |
| 4 | −4,10 | −4,30 |
| 8a | −7,165 | −7,624 |
| 8b | −5,20 | −5.45 |
| 8c | −6,80 | −7.10 |
| 9d | −5.10 | −5,35 |
| 9e | −6,70 | −7,30 |
| 9f | −5,00 | −5,25 |
Tabel 3: Moleculaire koppelingsscores van de gesynthetiseerde verbindingen tegen α-glucosidase en urease. Koppelingsscores (kcal/mol) van verbindingen 8(a–c) en 9(d–f), samen met de referentieremmers acarbose en thiourea, tegen α-glucosidase en urease. Afkortingen: kcal/mol = kilocalorieën per mol.
| Ligand | Dipoolmoment (Debye) | HOMO | LUMO | Energie | Ionisatie | Elektronaffiniteit (eV) | Elektro- Negativiteit χ (eV) | Elektro- chemische potentiaal μ (eV) | Hardheid η (eV) | Zachtheid | Elektro- Philicity |
| (A.U.) | (A.U.) | Gap (ΔEGap) | Potentiaal (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| Acarbose | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| Thiourea | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
Tabel 4: Dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT) descriptoren van de gesynthetiseerde verbindingen. Berekende kwantumchemische descriptoren van verbindingen 8(a–c) en 9(d–f), samen met de referentieverbindingen acarbose en thiourea, inclusief HOMO- en LUMO-energieën, HOMO–LUMO-energiekloof (ΔE), ionisatiepotentiaal (IP), elektronaffiniteit (EA), elektronegativiteit (χ), chemisch potentiaal (μ), chemische hardheid (η), chemische zachtheid (S), dipoolmoment (D) en elektrophiliciteitsindex (ω). Afkortingen: DFT = dichtheidsfunctionaaltheorie; HOMO = hoogst bezette moleculaire orbitaal; LUMO = laagste onbezette moleculaire orbitaal; ΔE = HOMO–LUMO energiegap; IP = ionisatiepotentiaal; EA = elektronaffiniteit; χ = elektronegativiteit; μ = chemisch potentiaal; η = chemische hardheid; S = chemische zachtheid; D = dipoolmoment; ω = elektrofiliciteitsindex.
| Compound | HA | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | Consensus LogP | GI-absorptie | BBB-permeabiliteit | Lipinski-overtredingen | Biobeschikbaarheidsscore | SA Score |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | Hoog | Nee | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | Hoog | Nee | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | Hoog | Nee | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | Hoog | Nee | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | Hoog | Nee | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | Hoog | Nee | 0 | 0.55 | 5.73 |
Tabel 5: Voorspelde absorptie-, distributie-, metabolisme- en uitscheidingseigenschappen (ADME) van de gesynthetiseerde verbindingen. Voorspelde fysisch-chemische, farmacokinetische en geneesmiddelgelijkheidseigenschappen van verbindingen 8(a–c) en 9(d–f) werden gegenereerd met behulp van de SwissADME-webserver. Afkortingen: ADME = absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding; MW = molecuulgewicht; LogP = octanol/water-partitioncoëfficiënt; TPSA = topologisch polair oppervlakte; RB = roteerbare obligaties; HBA = waterstofbindingsacceptor; HBD = waterstofbindingsdonor; GI = gastro-intestinaal; BBB = bloed-hersenbarrière; SA = synthetische toegankelijkheid.
Aanvullende Figuur 1: Dockingvalidatie door herkoppeling van native liganden. (A) Superpositie van de co-gekristalliseerde ligand (referentiepose) en hergekoppelde acarbose binnen de actieve site van α-glucosidase (PDB ID: 5NN8), wat een nauwe uitlijning van bindingsconformaties aantoont. (B) Bindingshouding van thioureum binnen de actieve plaats van urease (PDB ID: 4H9M), gebruikt voor dockingvalidatie van het ureasesysteem, waarbij het behoud van belangrijke interacties binnen de katalytische pocket wordt getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Fysicochemische karakteriseringsgegevens en volledige 1H en 13C NMR-spectra van verbindingen 3, 4, 8(a–c) en 9(d–f).Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie synthetiseerde een reeks triazol- en oxadiazolgebaseerde acetamidederivaten en evalueerde hun structurele, biologische, computationele en farmacokinetische eigenschappen. Spectroscopische karakterisering met HRMS, elementaire analyse, 1H NMR en 13C NMR bevestigden de succesvolle synthese van de doelmoleculen. De waargenomen chemische verschuivingen, koppelingspatronen en koolstofresonanties waren consistent met de voorgestelde structuren. Karakteristieke AMIDE-NH-signalen, methyleenresonanties, aromatische protonverdelingen en quaternaire koolstofsignalen bevestigden verder de succesvolle opname van de gesubstitueerde acetamidegroepen in zowel de triazool- als oxadiazol-scaffolds. De over het algemeen hoge synthetische opbrengsten die voor deze derivaten worden behaald, tonen de efficiëntie van de synthetische route aan en suggereren dat deze heterocyclische kaders vatbaar zijn voor verdere structurele aanpassingen.
Er werd een duidelijke invloed van het substituentpatroon op de urease-remmende activiteit waargenomen. Verbinding 8c, met een substituent van 2,6-dimethyl, vertoonde de hoogste urease-remmende activiteit, gevolgd door verbindingen 8a (2,3-dimethyl) en 9e (2,5-dimethyl), waarmee deze moleculen als veelbelovende leadkandidaten werden geïdentificeerd. Een vergelijkbare trend werd waargenomen tegen α-glucosidase, waarbij verbinding 9e de sterkste remming vertoonde, terwijl verbindingen 8a en 8c ook aanzienlijke activiteit vertoonden. Omdat verbindingen 8a en 8c alleen verschillen in de posities van de methylsubstituenten op de aromatische ring, terwijl verbinding 9e verschilt in zowel substitutiepatroon als heterocyclisch steiger, suggereren deze bevindingen dat zowel het methylsubstitutiepatroon als de architectuur van het steiger bijdragen aan de biologische activiteit binnen deze reeks. De superieure activiteit van verbinding 8c kan een gunstigere oriëntatie binnen de enzymactieve plaats weerspiegelen, terwijl de sterke activiteit van verbinding 9e een extra bijdrage van de oxadiazol-scaffold samen met het 2,5-dimethylsubstitutiepatroon suggereert. Deze observaties zijn consistent met eerdere rapporten die aangeven dat sterische effecten die ontstaan door fenylsubstitutie de binding aan actieve plaatsen kunnen beïnvloeden in triazol- en oxadiazol-gebaseerde enzymremmers 24,25,26,27. Desalniettemin zal het vaststellen van een definitieve structuur-activiteitrelatie evaluatie vereisen van een grotere reeks regioisomere afgeleiden.
Analyse van de interacties tussen de meest actieve verbindingen en runderserumalbumine (BSA) door fluorescentieafschikking en thermodynamische analyse toonde aan dat verbindingen 8a en 9e een gemengd statisch/dynamisch afschrikmechanisme volgden, terwijl verbinding 8c overwegend statisch afschrikken vertoonde. Thermodynamische parameters gaven aan dat binding van verbinding 8a voornamelijk werd veroorzaakt door waterstofbruggen en van der Waals-interacties, terwijl hydrofobe interacties de overhand hadden bij de binding van verbindingen 8c en 9e. Verbinding 8a vertoonde de sterkste affiniteit voor BSA, met een bindingsconstante van 3,92 × 105 M⁻1 en een gunstige negatieve Gibbs vrije binding van de energie. Deze bevindingen wijzen op stabiele vorming van eiwit-ligandencomplexen en suggereren het potentieel voor albumine-gemedieerd transport onder fysiologische omstandigheden.
De experimentele bevindingen werden verder ondersteund door moleculaire dockingstudies, die aantoonden dat verbindingen 8a, 8c en 9e gunstige bindingsconformaties aannamen binnen de actieve sites van zowel α-glucosidase als urease. Deze verbindingen vormden waterstofbruggen met belangrijke residuen, waaronder D282, A284, D404, R600, D616 en H674 in α-glucosidase en A636, Q635, R439 en A440 in urease. Vergelijkbare interacties zijn eerder gerapporteerd voor structureel verwante enzymremmers28,29. Het grootste verschil tussen dockingscore en experimentele activiteit werd waargenomen voor verbinding 8a, die de gunstigste dockingscore vertoonde tegen α-glucosidase (−7,165 kcal/mol), terwijl verbinding 9e de grootste in-vitro inhibitiepotentie vertoonde (IC50 = 27,29 μM). Dit verschil is niet onverwacht omdat dockingscores de binding van liganden binnen een relatief rigide eiwitstructuur schatten en geen rekening houden met factoren zoals ligandoplosbaarheid, conformationele flexibiliteit, desolvatie, eiwitdynamiek of andere oplossingsfase-effecten die experimenteel bepaalde IC50-waarden beïnvloeden. Daardoor vertegenwoordigen verschillen tussen voorspelde bindingsaffiniteit en gemeten biologische activiteit een erkende beperking van moleculaire koppeling in plaats van een tegenstelling tussen computationele en experimentele resultaten. Over het algemeen identificeren de gegevens van koppeling en enzymremming consequent verbindingen 8a, 8c en 9e als de meest veelbelovende derivaten in deze serie.
De elektronische eigenschappen van de meest actieve verbindingen werden verder onderzocht door frontier molecular orbital (FMO) en moleculaire elektrostatische potentiaal (MEP) analyses. Verbindingen met lagere HOMO–LUMO-energieverschillen vertoonden over het algemeen een grotere elektronische reactiviteit, wat consistent is met eerdere DFT-studies van structureel verwante triazol- en oxadiazol-gebaseerde afgeleiden30. Onder de gesynthetiseerde verbindingen vertoonden 8a, 8c en 9e relatief kleine HOMO–LUMO-energieverschillen, wat wijst op gunstige elektronenoverdrachtseigenschappen. Hun MEP-kaarten toonden verschillende elektronenrijke en elektronendeficiënte regio's, waarbij verbindingen 8c en 9e bijzonder uitgesproken nucleofiele gebieden vertoonden die mogelijk bijdragen aan hun gunstige enzyminteracties en biologische activiteiten. Globale reactiviteitsdescriptors ondersteunden de experimentele en computationele bevindingen verder. Verbinding 9e vertoonde een gunstige combinatie van ionisatiepotentiaal, elektronaffiniteit, zachtheid en elektrofiliciteitsindex, terwijl verbindingen 8a en 8c relatief hoge zachtheidswaarden vertoonden die consistent zijn met hun sterke remmende activiteiten. De grotere elektrofiliciteit en zachtheid die zijn waargenomen voor de 9-reeks, met name verbinding 9e, kunnen bijdragen aan sterkere interacties met katalytische residuen en verhoogde biologische activiteit.
In silico ADME-profilering van verbindingen 8(a–c) en 9(d–f) voorspelde gunstige farmacokinetische eigenschappen, waaronder hoge gastro-intestinale opname, acceptabele geneesmiddelgelijkheid en bevredigende orale biobeschikbaarheid. Er werden geen grote ADME-aansprakelijkheden vastgesteld binnen de geëvalueerde parameters. Gezamenlijk ondersteunen de in vitro biologische data, BSA-bindingsanalyse, moleculaire koppeling, DFT-berekeningen en in silico ADME-voorspellingen het voortgezet onderzoek van deze triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten als duale urease- en α-glucosidase-remmers.
Gezamenlijk identificeren deze bevindingen verbindingen 8a, 8c en 9e als veelbelovende kopkandidaten voor de ontwikkeling van triazol- en oxadiazol-gebaseerde acetamidederivaten gericht op urease en α-glucosidase. De gecombineerde spectroscopische, biologische, BSA-binding, moleculaire docking, DFT- en ADME-gegevens vormen een sterke basis voor toekomstige studies. Verdere onderzoeken moeten moleculaire dynamica-simulaties omvatten om de stabiliteit van eiwit en ligand over tijd te evalueren, enzymkinetische studies om het remmechanisme te bepalen, en uitbreiding van de BSA-bindingsanalyse naar de overige derivaten. Ten slotte zullen in vivo-studies noodzakelijk zijn om de veelbelovende in vitro - en in silico-bevindingen te valideren en om het therapeutische potentieel van deze verbindingsreeks verder te beoordelen.
Openbaarmakingen
De auteur verklaart dat er geen belangenconflict is
Dankbetuigingen
De auteur spreekt zijn waardering uit aan de Faculteit Klinische Farmacie van de Al Baha Universiteit, Saoedi-Arabië.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1-Naphthylamine | Merck | 106148 | Aromatisch amine gebruikt voor de bereiding van gesubstitueerde analogen |
| 2,5-Dimethylaniline | Sigma-Aldrich | D146706 | Aromatisch amine gebruikt voor synthese van gesubstitueerde derivaten |
| 3,4-Dimethylaniline | Alfa Aesar | A15416 | Aromatisch amine gebruikt voor de bereiding van structurele analogen |
| Benzoic Acid | Sigma-Aldrich | 242381 | Uitgangsmateriaal voor synthese van benzohydrazide tussenproduct |
| Bromoacetyl Bromide | Sigma-Aldrich | B17601 | Elektrofiel reagens gebruikt bij de synthese van bromoacetamide tussenproducten |
| Carbon Disulfide | Sigma-Aldrich | 289116 | Belangrijk reagens voor cyclisatie naar oxadiazool-ringsysteem |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Oplosmiddel gebruikt in extractie- en zuiveringsprocessen |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Pools aprotisch oplosmiddel gebruikt in derivatisatie- en substitutiereacties |
| Diphenylamine | Sigma-Aldrich | D23802 | Aromatisch amine gebruikt bij de synthese van derivaatverbindingen |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Gebaat om ligandionisatietoestanden bij pH 7,0 te genereren; RRID: N/A |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Reactieoplosmiddel voor esterificatie en hydrazidevorming |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989 | Poolse mobiele fasecomponent in TLC-analyse en extractie |
| Gaussian 09, Revision D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (software) | Software gebruikt voor DFT-berekeningen (HOMO-LUMO, MESP, globale reactiviteitsdescriptoren); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (software) | Gebaat voor visualisatie van geoptimaliseerde structuren en orbitale energieën; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Dockingsoftware gebruikt voor receptorrastergeneratie en extra-precisie (XP) moleculaire docking; RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, version 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (software) | Gebaat voor IC50 regressieanalyse en statistische evaluatie van enzymremmingsgegevens; RRID:SCR_002798 |
| Hydrazine | Sigma-Aldrich | 225819 | Reagens gebruikt voor omzetting van ester in benzohydrazide |
| L(+)-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Reagens gebruikt in biologische evaluatiestudies |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Gebaat voor ligandstructuuroptimalisatie en generatie van 3D-conformeren; RRID:SCR_016746 |
| Lithium Hydride | Sigma-Aldrich | 201049 | Katalysator gebruikt voor activering van thiolgroep in substitutiereacties |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Molecuulmodelleringssuite gebruikt voor voorbereiding en visualisatie van eiwit/ligandstructuur; RRID:SCR_016748 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Oplosmiddel gebruikt in zuiverings- en biologische testvoorbereidingen |
| n-Hexane | Merck | 104391 | Non-polaire mobiele fasecomponent in TLC-analyse |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (krachtveld) | Krachtveld gebruikt voor energieminimalisatie van eiwit- en ligandstructuren; RRID: N/A |
| Phenyl Isothiocyanate | Merck | 807028 | Reagens gebruikt bij de synthese van triazoolderivaten |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Gebaat voor receptorstructuurverfijning vóór docking; RRID:SCR_016749 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Base gebruikt voor pH-aanpassing en reactieneutralisatie |
| Sulfuric Acid | BDH | 10276 | Zure katalysator gebruikt in veresteringsstap onder refluxomstandigheden |
| Trimethylamine | Riedel-de Haen | 22129 | Organische base gebruikt tijdens synthese van gesubstitueerde derivaten |
| VESTA, version 3.5.8 | Momma & Izumi (ontwikkelaars); vrij verspreid | N/A (software) | Gebaat voor visualisatie van moleculaire elektrostatische potentiaal (MESP) en HOMO-LUMO oppervlaktekaarten; RRID: N/A |
Referenties
- Siddiqui SZ, et al. BSA binding, molecular docking, and in vitro biological screening of new 1,2,4-triazole heterocycles bearing an azinane nucleus. Pak J Pharm Sci. 2020;33(1):149-160.
- Khalilullah H, Ahsan MJ, Hedaitullah M, Khan S, et al. 1,3,4-Oxadiazole: A biologically active scaffold. Mini Rev Med Chem. 2012;12(8):789-801.
- Wang JJ, Sun W, Jia WD, Bian M, et al. Research progress on the synthesis and pharmacology of 1,3,4-oxadiazole and 1,2,4-oxadiazole derivatives: A mini review. J Enzyme Inhib Med Chem. 2022;37(1):2304-2319.
- Glomb T, Świątek P. Antimicrobial activity of 1,3,4-oxadiazole derivatives. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6979.
- Glomb T, Szymankiewicz K, Świątek P. Anti-cancer activity of derivatives of 1,3,4-oxadiazole. Molecules. 2018;23(12):3361.
- Aggarwal R, Sumran G. An insight into the medicinal attributes of 1,2,4-triazoles. Eur J Med Chem. 2020;205:112652.
- Strzelecka M, Świątek P. 1,2,4-Triazoles as important antibacterial agents. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(3):224.
- Kumar S, Khokra SL, Yadav A. Triazole analogues as potential pharmacological agents: A brief review. Future J Pharm Sci. 2021;7(1):106.
- Raza A, et al. Deep learning in drug discovery: A futuristic modality to materialize large datasets for cheminformatics. J Biomol Struct Dyn. 2023;41(18):9177-9192.
- Liu SK, et al. Discovery of new α-glucosidase inhibitors: Structure-based virtual screening and biological evaluation. Front Chem. 2021;9:639279.
- Lebovitz HE. Alpha-glucosidase inhibitors. Endocrinol Metab Clin North Am. 1997;26(3):539-551.
- Rego YF, et al. A review on the development of urease inhibitors as antimicrobial agents against pathogenic bacteria. J Adv Res. 2018;13:69-100.
- Daud S, et al. Design, synthesis, in vitro evaluation, and docking studies of ibuprofen-derived 1,3,4-oxadiazole derivatives as dual α-glucosidase and urease inhibitors. Med Chem Res. 2022;31(2):316-336.
- Chapdelaine P, Tremblay RR, Dubé JY. p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside as a substrate for measurement of maltase activity in human semen. Clin Chem. 1978;24(2):208-211.
- Manoharan A, et al. N-Acetylcysteine prevents catheter occlusion and inflammation in catheter-associated urinary tract infections by suppressing urease activity. Front Cell Infect Microbiol. 2023;13:1216798.
- Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed. Springer; New York, NY; 2006.
- Atkins P, de Paula J, Keeler J. Atkins' Physical Chemistry. 11th ed. Oxford University Press; Oxford, UK; 2018.
- DeLano WL. PyMOL: An open-source molecular graphics tool. CCP4 Newsl Protein Crystallogr. 2002;40:82-92.
- Discovery Studio Visualizer, Version 2.0. Accelrys Software Inc.; San Diego, CA; 2005.
- Tirado-Rives J, Jorgensen WL. Performance of B3LYP density functional methods for a large set of organic molecules. J Chem Theory Comput. 2008;4(2):297-306.
- Takano Y, Houk KN. Benchmarking the conductor-like polarizable continuum model (CPCM) for aqueous solvation free energies of neutral and ionic organic molecules. J Chem Theory Comput. 2005;1(1):70-77.
- Parr RG, Szentpály LV, Liu S. Electrophilicity index. J Am Chem Soc. 1999;121(9):1922-1924.
- Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7(1):42717.
- Wang YN, et al. Synthesis and biological evaluation of triazolones/oxadiazolones as novel urease inhibitors. Bioorg Med Chem. 2024;102:117656.
- Mehdi K, et al. Molecular docking and in vitro studies of synthesized oxadiazole derivatives as urease inhibitors. J Math Fundam Sci. 2025;57(1):1-23.
- Aziz M, et al. Phytochemical, pharmacological, and in silico molecular docking studies of Strobilanthes glutinosus Nees: An unexplored source of bioactive compounds. S Afr J Bot. 2022;147:618-627.
- Khan KM, et al. Biochemical, toxicological, and in silico aspects of Trillium govanianum Wall. ex D. Don (Trilliaceae): A rich source of natural bioactive compounds. Chem Biodivers. 2024;21(1):e202301375.
- Bibi H, et al. Isolation and characterization of bioactive constituents from Withania coagulans Dunal with antioxidant and multifunctional enzyme inhibition potential, supported by docking, molecular dynamics, and DFT studies. RSC Adv. 2025;15(56):48566-48584.
- Khurm M, Guo Y, Wu Q, Zhang X, et al. Conocarpus lancifolius (Combretaceae): Pharmacological effects, LC-ESI-MS/MS profiling and in silico. attributes. Metabolites. 2023;13(7):794.
- Abdo MA, Badawy SA, Fadda AA, Elmorsy MR. Design, synthesis, structural characterization, and antioxidant potential of novel triazole- and oxadiazole-based hydrazide-hydrazone derivatives: spectroscopic, DFT, and molecular docking studies. BMC Chem. 2025;19:192.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen