Methodenartikel

Beoordeling van transductie-efficiëntie en celtargeting door celpenetrerende peptiden in de muizenlong

DOI:

10.3791/71217

⸱

16 juni 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geïntegreerde workflow om de transductie-efficiëntie en celspecificiteit van celpenetrerende peptiden te beoordelen, met behulp van het longgerichte peptide gecycliseerd R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) als voorbeeld. De workflow combineert gepaarde fractie FACS gevolgd door single-cell RNA-sequencing, flowcytometrie bij AT2-meldermuizen en confocale z-stack imaging om AT2-geassocieerde peptide-doelbetrokkenheid te bevestigen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celpenetrerende peptiden (CPP's) zijn korte peptiden (5–30 aminozuren) die celmembranen kunnen passeren en macromoleculaire ladingen kunnen afleveren zonder transfectie-reagentia. Het definiëren van in vivo cellulaire selectiviteit vereist echter validatie op celtypeniveau. Er wordt een geïntegreerde workflow gepresenteerd om de transductie-efficiëntie te beoordelen van een Cy5.5-gelabelde gecycliseerde CPP, cR11A, binnen alveolaire epitheliale type II (AT2) cellen na retro-orbitale intraveneuze injectie bij muizen. Longen werden 15 of 60 minuten na injectie geoogst en geanalyseerd met complementaire uitlezingen, waaronder gepaarde-fractie fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om Cy5.5⁺- en Cy5.5⁻-long-single-cel suspenties te isoleren, gevolgd door single-cell RNA-sequencing, flowcytometrie van long-single cells van Sftpc-CreERT2(+/−); LSL-GFP(+/−) AT2-meldermuizen om GFP⁺/Cy5.5⁺-gebeurtenissen te kwantificeren, en confocale z-stack beeldvorming van longcryosecties om colocalisatie van cR11A-Cy5.5 met AT2-geassocieerd signaal te bevestigen. Dit protocol levert consistent bewijs van celtypebetrokkenheid door gebruik te maken van meerdere complementaire uitlezingen en biedt een reproduceerbaar kader voor het evalueren van celspecifieke targeting van CPP's, met aanpassingen voor verschillende doelorganen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-penetrerende peptiden (CPP's) zijn 5–30 aminozuurpeptiden die celmembranen kunnen doorkruisen en de intracellulaire afgifte van macromoleculaire ladingen in een intacte, volledig functionele vorm kunnen faciliteren zonder de noodzaak van transfectiereagentia 1,2. Eerder onderzoek met in vitro en in vivo faagdisplay-combinatorische methoden identificeerde een 12-aminozuur harttargetingpeptide (APWHLSSQYSRT) die specifiek door cardiomyocyten wordt opgenomen binnen slechts 5 minuten 3,4. Om het transductiemechanisme te onderzoeken, werd een alanine-scan uitgevoerd, wat leidde tot de ontdekking van twee varianten, S7A en R11A (APWHLSSQYSAT), die onverwacht longverrijking in vivo vertoonden. en daarom long-targeting peptiden (LTP's)5 werden genoemd. Bovendien genereerden N-terminale lysine-toevoeging en kop-tot-staart cyclisatie een cyclische versie van R11A (cR11A) met aanzienlijk verbeterde serumstabiliteit en een duidelijk verhoogde intracellulaire opname vergeleken met zijn lineaire tegenhanger5.

LTP's hebben het potentieel om therapeutica nauwkeurig toe te dienen aan distale longepitheliale populaties, inclusief alveolaire epitheliale type II (AT2) cellen. Deze cellen zijn cruciaal voor het behouden van de homeostase van de tenside en dienen als voorlopers van alveolaire regeneratie6. Een grote uitdaging bij de ontwikkeling van LTP is echter de rigoureuze beoordeling van cellulaire selectiviteit in vivo. Biodistributie op orgaanniveau kan alleen geen echte cellulaire transductie onderscheiden van vasculaire signalen, extracellulaire retentie of fagocytaire clearance en moet daarom worden aangevuld met enkelcel-opgeloste metingen7. Om deze beperking aan te pakken, integreert deze workflow single-cell transcriptomische toewijzing, rapportage-gebaseerde flowcytometrie en confocale z-stack imaging om celtype-niveau bewijs te genereren van peptide-betrokkenheid buiten orgaanniveau fluorescentie of biodistributie-uitlezingen 8,9.

Het algemene doel van dit protocol is het bieden van een reproduceerbare, multi-readout workflow voor het valideren van de in vivo transductie-efficiëntie en celspecificiteit van Cy5.5-gelabelde cR11A in de distale long, met een focus op AT2-cellen na retro-orbitale injectie. Het protocol definieert peptide-geassocieerde celidentiteit met behulp van complementaire en onafhankelijke metingen, waaronder gepaarde fractie fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (Cy5.5⁺ versus Cy5.5⁻) gevolgd door single-cell RNA-sequencing om peptide-geassocieerde populaties in kaart te brengen, kwantitatieve opnamebeoordeling in AT2-reporterlongen via flowcytometrie, en confocale z-stack imaging van longcryosecties om colocalisatie van cR11A-Cy5.5 met AT2-geassocieerd signaal te bevestigen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere LTP's of afgiftevectoren en toegepast op de long- of andere orgaansystemen om de celspecificiteit van CPP's in ontwikkeling te beoordelen. Het is bijzonder geschikt voor toepassingen die celtype-niveau validatie van CPP-targeting in vivo vereisen in plaats van alleen de accumulatie op orgaanniveau.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bij de Mayo Clinic en goedgekeurd onder protocolnummer A00006842-22-R25. Alle inspanningen werden geleverd om dierenschade te minimaliseren en ethisch te omgaan met relevante nationale en institutionele regelgeving. De onderzoeksinstrumenten die voor dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaalkundige Tafel.

1. Dieren

  1. Gebruik volwassen C57BL/6J muizen van gemengd geslacht (6–8 weken oud) afkomstig van The Jackson Laboratory (stam #000664).
  2. Voor AT2-specifieke kwantificatie gebruik Sftpc-CreERT2(+/+) (Jax Strain #028054) gekruist met LSL-GFP(+/+) (Jax Strain #007906) om Sftpc-CreERT2(+/−) te genereren; LSL-GFP(+/−) AT2 reportermuizen.
  3. Huismuizen in individueel geventileerde kooien. Zorg ervoor dat alle dierenprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee.
  4. Voer tamoxifeninductie uit in Sftpc-CreERT2(+/−); LSL-GFP(+/−) muizen. Wanneer muizen ≥6 weken oud zijn, geef je 100 mg/kg tamoxifen opgelost in maïsolie via orale gavage gedurende drie doses verspreid over 7 dagen. Voer experimenten minstens 2 weken na de einddosis uit om maximale recombinatie-efficiëntie te garanderen.

2. Voorbereiding van reagens en apparatuur

  1. Bereid anesthesie voor (ketamine/xylazine werkmix).
    1. Bereid een werkoplossing van 5 mL voor: ketamine (1 mL van 50 mg/mL), xylazine (50 μL van 100 mg/mL) en steriele zoutoplossing (3,95 mL).
    2. Geef 1 μL/g lichaamsgewicht via .intraperitoneale injectie (einddosis: 10 mg/kg ketamine en 1 mg/kg xylazine).
  2. Bereid peptide voor (cR11A-Cy5.5).
    1. Verkrijg CPP's als gelyofilieerde poeders. Bewaar poeders tot 2 jaar bij −20 °C of als standaardoplossingen in DMSO bij −80 °C tot 6 maanden in lichtbeschermde buizen. Vermijd vries-dooicycli en minimaliseer de blootstelling aan licht. Bereid een 10 mM voorraadoplossing van cR11A-Cy5.5 voor in DMSO.
    2. Weeg de muis, bereken de dosis en verdun de voorraad tot 1 mg/kg in nucleasevrij water tot een eindvolume van 100 μL per muis.
  3. Maak een verteringsbuffer klaar (vers; op ijs leggen).
    1. Bereid een digestiebuffer voor met 2 mg/mL Dispase II, 0,1 mg/mL DNase I, DMEM/F12 en 1% (v/v) penicilline-streptomycine.
    2. Gebruik 3 ml per muis.
  4. Maak een niet-specifieke protease-enzym was-buffer voor (op ijs leggen).
    1. DMEM/F12 bevat 0,05 mg/mL DNase I en 1% (v/v) penicilline-streptomycine.
    2. Gebruik 10 ml per muis.
  5. Bereid een rode bloedcel voor de lysebuffer voor (houd op ijs).
    1. Verdun de lysisbuffer van 10× naar 1× met PBS.
    2. Gebruik 2 ml per monster.
  6. Maak een perfusiebuffer klaar.
    1. Gebruik ijskoude DMEM/F12 (10 mL per muis).
  7. Maak wasbuffer klaar.
    1. Gebruik DMEM/F12 met 2% FBS.
  8. Centrifuges voorkoelen tot 4 °C.

3. Retro-orbitale toediening van cR11A-Cy5.5

  1. Verdoof de muis met de werkoplossing ketamine/xylazine. Bevestig voldoende verdoving door het ontbreken van het onttrekken van ledematen als reactie op een knellende teen.
  2. Injecteer 100 μL cR11A-Cy5.5 (1 mg/kg) via een retro-orbitale intraveneuze injectie met een insulinespuit.
  3. Start de timer en houd de muis 15 of 60 minuten op een verwarmingskussen onder passende monitoring.

4. Longoogst en perfusie

  1. Euthanaceer de muis volgens goedgekeurde protocollen (bijv. CO₂-inademing gevolgd door cervicale dislocatie). Plaats de muis in rugligging en spuit de borst in met 70% ethanol.
  2. Open de thoracale holte om het hart en de longen bloot te leggen.
  3. Maak een incisie in het rechter atrium om drainage tijdens de perfusie mogelijk te maken.
  4. Steek een 26 G naald die is bevestigd aan een 10 mL spuit met ijskoude DMEM/F12 in de rechter ventrikel. Houd de rechter atriumincisie open gedurende de hele perfusie om drainage mogelijk te maken.
  5. Perfusie handmatig zonder spuitpomp door langzaam en gestaag 10 mL DMEM/F12 te injecteren gedurende ongeveer 1-2 minuten. Houd lage druk tijdens de injectie en voorkom zichtbare longoverinflatie of lekkage uit de ventrikelwand. Ga door tot de longen uniform bleek zijn.

5. Longinflatie en spijsvertering

  1. Canuleer de luchtpijp met een 20G IV-katheter en sluit vast met 3-0 zijden hechtingen. Geef 1 ml verteringsbuffer via een 1 ml spuit om de longen op te blazen.
  2. Ontleed de longen als één intacte eenheid en breng direct over in een voorgekoelde schaal van 100 mm op ijs.
  3. Verwijder de longlobben en plaats plaats deze in een 15 mL conische buis met 2 mL koude verteringsbuffer (één long per buis).
  4. Incubeer op 4 °C gedurende 20 uur op een roterende tuimelaar (10–15 tpm).
    OPMERKING: Raadpleeg Janas PP. et al.10 voor gedetailleerde methodologie.

6. Weefseldissociatie

  1. Plaats een 100 μm celfilter over een 50 mL conische buis en pre-nat met 1 mL niet-specifieke protease-enzym wasbuffer.
  2. Breng longweefsel over op de zeef en dissocieer voorzichtig met een steriele spuitzuiger.
  3. Spoel af met 10 ml niet-specifieke protease-enzym wasmiddel.
  4. Centrifugeer op 130 × g gedurende 15 minuten op 4 °C.
  5. Suss de pellet opnieuw in een 2 mL 1× RBC lysisbuffer voor 90 seconden bij kamertemperatuur.
  6. Afkoel de lysis met een 10 mL washbuffer.
  7. Filter door een 40 μm zeef en spoel af met een wasfilter.
  8. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  9. Resuspendeer cellen in 500–1.000 μL PBS + 2% FBS (≥1 × 106 cellen/mL).
  10. Voer door een 35 μm filterkap in een FACS-buis.
    OPMERKING: Raadpleeg Konishi S. et al.11 voor gedetailleerde methodologie.

7. Gepaarde-fractie FACS-sortering

  1. Sorteer met een flowcytometer.
  2. Gebruik PBS-geïnjecteerde longen als negatieve controle om de Cy5.5-poort te definiëren.
  3. Pas standaard gating toe: debris exclusion, singlets en Cy5.5⁺-cellen.
  4. Sorteer de populaties Cy5.5⁺ en Cy5.5⁻ in aparte buizen.

8. scRNA-seq monstervoorbereiding

  1. Houd gesorteerde monsters op ijs.
  2. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en stil opnieuw in 500 μL buffer.
  3. Ga alleen door als de levensvatbaarheid ≥80%.
  4. Bereid bibliotheken en sequencing voor waar nodig.

9. Flowcytometrie bij AT2 Reporter Muizen

  1. Bereid long-eencelsuspensies voor zoals beschreven in secties 5–6.
  2. Beits 30 minuten met een herstelbare levende/dode verf (1:1.000) (bescherm tegen licht).
  3. Was en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten op 4 °C.
  4. Filter en bewaar monsters op ijs.
  5. Verzamel gegevens op een flowcytometer.
  6. Voer gating uit om cellen te identificeren, singlets te selecteren, dode cellen uit te sluiten en GFP- en Cy5.5-populaties te definiëren.
    1. Kwantificeer GFP⁺/Cy5.5⁺-gebeurtenissen als percentage van GFP⁺-cellen.

10. Fixatie en cryobescherming

  1. Blaas de longen op met 1 ml 4% PFA en beveilig de luchtpijp.
  2. Fix 10 mL 4% PFA 's nachts bij 4 °C.
  3. Was met PBS (3×).
  4. Incubeer in 15% sucrose van de ene nacht.
  5. Overschakelen naar 30% sucrose voor ~48 uur.

11. Inbedding en cryosectie

  1. Maak cryo-mallen klaar met OCT, positioneer de longen en sluit in OCT in.
  2. Vries in met vloeibare stikstof. Winkel op ˗80 °C.
  3. Sectie bij 10 μm na evenwicht. Luchtdroog glijbanen 's nachts.

12. Beeldvorming en analyse

  1. Was secties met PBS (3×).
  2. Bevestig met DAPI-medium.
  3. Verkrijg confocale z-stacks.
  4. Gebruik de juiste beeldvormingsinstellingen.
  5. Voer 3D-reconstructie uit.
  6. Kwantificeer colocalisatie met consistente drempels.
    Optionele methoden:
    Deze optionele methoden zijn niet opgenomen in de representatieve workflow, maar kunnen worden opgenomen om uitputting of analyse van de CD45⁺-immuuncelpopulatie mogelijk te maken, die een groot deel van de longcellen12 vormt.
    OPMERKING: Gebruik CD45⁺-depletie of -uitsluiting wanneer de analyse gericht is op niet-immuun longpopulaties, omdat deze stappen immuuncelopnamesignalen verwijderen of scheiden en de cellulaire samenstelling van het monster veranderen. CD45-kleuring kan ook worden gebruikt om de CD45⁺-immuuncelpopulatie afzonderlijk te analyseren.

13. Verminder CD45+ celpopulatie

  1. Na weefseldissociatie (stap 6) gebruikt u ofwel een CD45-antilichaam dat is geconjugeerd aan een magnetische korrel (Miltenyi Biotech 130-052-301) of een CD45-antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor die compatibel is met Cy5.5, GFP en de levende/dode kleuring, bijvoorbeeld CD45-BV605 (BioLegend #103140). Beits 20 minuten op 4°C in het donker.
  2. Bij het uitvoeren van CD45-magnetische kraaluitputting, volg dan de instructies van de fabrikant voor het gebruik van de Lineage Depletion (LD)-kolom (Miltenyi Biotech 130-042-901) en ga door met Magnetic Cell Separation (MACS) (Miltenyi Biotech). Ga vervolgens verder met het sorteren van FACS met paar-fracties (stap 7).
  3. Als CD45-depletie wordt uitgevoerd met een fluorescerend geconjugeerd antilichaam, spoel dan eerst de celsuspensie met wash buffer om overtollig antilichaam te verwijderen. Ga dan verder met stap 7. Na het instellen van poorten om dubbelen en puin uit te sluiten (stap 7.3), voeg je een extra poort toe om de CD45+ populatie uit te sluiten. Ga dan verder naar stap 7.4.

14. Analyse van de CD45+ celpopulatie tijdens flowcytometrie

  1. Na stap 9.3 gebruik je een CD45-antilichaam dat geconjugeerd is aan een fluorofoor die compatibel is met Cy5.5, GFP en de levend/dood kleur, bijvoorbeeld CD45-BV605 (BioLegend #103140). Beits 20 minuten op 4°C in het donker.
  2. Was de celsuspensie met een washbuffer om overtollig antilichaam te verwijderen. Ga dan verder met stap 9.4. Na het instellen van poorten om dubbeltje en afval uit te sluiten (stap 9.6), voeg je een extra poort toe om de CD45+- populatie uit te sluiten voordat je gating om de GFP+- en Cy5.5+- populaties12 vast te stellen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle toepassing van dit protocol zou consistent bewijs moeten genereren uit drie complementaire uitlezingen: paired-fraction scRNA-seq, reporter-based flow cytometrie en confocale z-stack beeldvorming.

In de gepaarde-fractie scRNA-seq analyse werden Cy5,5⁻ en Cy5,5⁺ long-single-cell fracties teruggevonden na systemische toediening van cR11A-Cy5.5 en apart geanalyseerd. UMAP-visualisatie identificeerde belangrijke longcelpopulaties, waaronder immuun-, endotheel-, epitheel- en mesenchymale compartimenten (Figuur 1A, B). Hoewel immuuncellen de dominante populatie vormden in beide gesorteerde fracties, toonde de Cy5,5⁺-fractie een relatieve verrijking van niet-immuuncompartimenten, inclusief epitheelcellen (Figuur 1C). Epitheliale subsetanalyse toonde een grotere representatie van AT2-cellen in de Cy5,5⁺-fractie dan in de Cy5,5⁻-fractie, terwijl AT1-cellen laag bleven in beide fracties (Figuur 1D). Deze resultaten geven aan dat gepaarde-fractie scRNA-seq verrijking van AT2-cellen binnen de cR11A-Cy5.5–positieve longcelfractie kan identificeren.

Flowcytometrie werd gebruikt om het cR11A-Cy5.5-signaal binnen door de reporter gedefinieerde AT2-cellen te kwantificeren. Representatieve gating omvatte de selectie van totale cellen door FSC-A/SSC-A, twee opeenvolgende singletpoorten, live-cell gating en definitieve GFP versus. Cy5.5-analyse (Figuur 2A–E). In het controlemonster waren GFP⁺/Cy5,5⁺-gebeurtenissen minimaal, waarmee de achtergrondfluorescentiedrempel werd vastgesteld. Na toediening van cR11A-Cy5.5 steeg het aantal door de verslaggever positieve gebeurtenissen van GFP⁺/Cy5.5⁺ in deze representatieve dataset tot 7,99% na 15 minuten en 7,41% na 60 minuten na injectie (Figuur 2E). Deze resultaten ondersteunen detecteerbaar cR11A-Cy5.5-signaal in AT2-rapporterer-positieve cellen in vivo.

Confocale z-stack imaging biedt ruimtelijke validatie van peptide-geassocieerde fluorescentie in longweefselsecties. Een niet-rapporterende controle werd opgenomen om achtergrondfluorescentie te beoordelen en toonde minimaal signaal in de GFP- en Cy5.5-kanalen. In cR11A-Cy5.5-behandelde AT2-reporterlongen werd Cy5.5-fluorescentie gedetecteerd in de nabijheid van GFP⁺ AT2-reporter-positieve cellen, en het door Imaris gegenereerde colokalisatiekanaal identificeerde overlap tussen GFP- en Cy5.5-signalen (Figuur 3A). De colocalisatieanalyse van Imaris toonde respectievelijk 89,6% en 86,8% colocalisatie binnen het GFP⁺ AT2-compartiment na respectievelijk 15 minuten en 60 minuten (Figuur 3B).

Suboptimale resultaten kunnen bestaan uit hoge achtergrondfluorescentie van Cy5.5 in controlemonsters, slechte epitheelcelherstel, lage cellevensvatbaarheid of zwakke scheiding van GFP⁺/Cy5.5⁺-gebeurtenissen. Deze problemen wijzen meestal op een incomplete perfusie, overmatige weefselvernieling, onvoldoende compensatie of inconsistente beelddrempels.

figure-results-1
Figuur 1: Paired-fraction scRNA-seq identificeert verrijking van alveolair epitheel in de cR11A-Cy5.5–positieve longfractie. Long-single-cel suspensies werden gesorteerd in Cy5,5⁻- en Cy5,5⁺-fracties na retro-orbitale injectie van cR11A-Cy5.5, en elke fractie werd geanalyseerd met single-cell RNA-sequencing. (A) UMAP-plots tonen celtypeclusters in overeenkomende fracties van een representatieve muis. (B) De UMAP-overlay toont de verdeling van Cy5,5⁻- en Cy5,5⁺-cellen. De omcirkelde gebieden in (A) en (B) geven het epitheelcompartiment aan dat is gemarkeerd voor epitheeldeelanalyse. (C) Immuunpopulaties zijn in beide fracties zeer prominent aanwezig en vertegenwoordigen meer dan 80% van elk. In vergelijking met de Cy5,5⁻-fractie bevat de Cy5,5⁺-fractie een groter aandeel endotheel-, epitheel- en mesenchymale populaties, wat wijst op de opname van cR11A binnen deze populaties. (D) Binnen de epitheelpopulatie zijn AT2-cellen sterker vertegenwoordigd in de Cy5,5⁺-fractie dan in de Cy5,5⁻-fractie, terwijl AT1-cellen in beide fracties laag blijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Validatie van flowcytometrie van cR11A-Cy5.5 opname in AT2 reporterlongen. AT2-meldermuizen kregen cR11A-Cy5.5 toegediend via retro-orbitale intraveneuze injectie, en de longen werden 15 of 60 minuten na de injectie geoogst voor eencellige voorbereiding. Representatieve gating wordt getoond voor een PBS-voertuigcontrole (Ctrl) en cR11A-Cy5.5-behandelde monsters: (A) cellen werden geselecteerd door FSC-A/SSC-A, (B, C) singlets werden gegated door scatter-gebaseerde dubbelt-uitsluiting, (D) levende cellen werden geïdentificeerd door eliminatie van levensvatbaarheidskleurstoffen, en (E) GFP (AT2-melder) versus. Cy5.5 werd gebruikt om GFP⁺/Cy5.5⁺-gebeurtenissen te kwantificeren. In deze representatieve dataset waren GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2-gebeurtenissen ongeveer 8% na ongeveer 15 minuten en 60 minuten na toediening van cR11A-Cy5.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Confocale beeldvorming en Imaris colocalisatie-analyse van cR11A-Cy5.5 opname in AT2-reporterlongen. (A) Representatieve velden worden getoond voor een niet-rapporterende controle (Ctrl) en cR11A-Cy5.5-behandelde AT2-reporterlongen, geoogst 15 of 60 minuten na injectie voor cryosectie en confocale z-stack beeldvorming. GFP-signaal (groen) markeert AT2-cellen, en cR11A-Cy5.5-fluorescentie (rood) geeft peptide-geassocieerd signaal aan. Het "Coloc"-paneel toont pixels of objecten die door Imaris (geel) als gecolokaliseerd worden geclassificeerd, en samengevoegde beelden illustreren ruimtelijke overlap tussen de twee kanalen. De niet-rapporterende controle werd opgenomen om achtergrondfluorescentie in de GFP- en Cy5.5-kanalen te beoordelen. (B) Kwantificering van colocalisatie binnen het GFP⁺ AT2-compartiment toont aan dat 89,6% en 86,8% van het GFP-signaal gecolocaliseerd waren met cR11A-Cy5.5 na respectievelijk 15 minuten en 60 minuten. Deze gegevens wijzen op robuuste overlap met GFP⁺ AT2-cellen op beide tijdstippen, wat de voorkeursbetrokkenheid van het AT2-compartiment in vivo ondersteunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol identificeert peptidetargeting van specifieke celpopulaties met behulp van meerdere onafhankelijke metingen die op complementaire resoluties werken: transcriptome-niveau mapping (paired-fraction scRNA-seq), kwantitatieve gebeurtenisgebaseerde meting (reporter flow cytometrie) en ruimtelijke bevestiging (confocale z-stacks). Samen verminderen deze benaderingen veelvoorkomende ambiguïteiten die inherent zijn aan fluorescentie- of bulkbiodistributie-gebaseerde studies op orgaanniveau, zoals verwarrende vasculaire fluorescentie of extracellulaire retentie, evenals het onvermogen om peptide-geassocieerd signaal toe te wijzen aan specifieke longcelpopulaties7.

Verschillende stappen vereisen bijzondere aandacht. Perfusiekwaliteit heeft sterk invloed op achtergrondfluorescentie en downstream sorteerprestaties; voldoende perfusie wordt gekenmerkt door een uniforme, ivoorwitte uitstraling van alle longkwabben, terwijl onvolledige perfusie het Cy5.5-signaal in niet-doelcompartimenten kan verhogen. Voor weefseldissociatie wordt langdurige koude vertering (4 °C, 20 uur) gebruikt in plaats van typische verteringscondities (37 °C, 1–2 uur) om epitheelpopulaties te behouden en het herstel van fragiele cellen te verbeteren, met name alveolaire type I (AT1) cellen10. AT1-cellen gaan gemakkelijk verloren tijdens isolatie omdat hun grote, dunne morfologie ze zeer gevoelig maakt voor mechanische vertering. Naast standaard laboratoriumpraktijken, waaronder consistente vertering, compensatie, gating en drempelwaarde, helpt 3D-colocalisatieanalyse te bepalen of het peptidesignaal overlapt met het AT2-rapportsignaal in plaats van alleen te vertrouwen op tweedimensionale fluorescentie-overlap13.

Een CD45⁺ immuunceldepletiestap kan worden overwogen voorafgaand aan scRNA-seq of kwantificering van flowcytometrie. Immuuncellen vormen een groot deel van de longcelpopulaties en kunnen CPP's opnemen als onderdeel van een typische immuunrespons op vreemde deeltjes. Om de opname van CPP binnen niet-immuunpopulaties, inclusief endotheel-, epitheel- en mesenchymale compartimenten, nauwkeuriger te kwantificeren, kan CD45⁺-celdepletie de gevoeligheid verbeteren. Dit kan worden bereikt door middel van kraal-gebaseerde depletie vóór sortering of door CD45⁺-cellen uit te sluiten tijdens flowcytometrie-analyse12. Deze modificatie moet echter selectief worden gebruikt omdat het informatie over de opname van immuuncellen verwijdert en de cellulaire samenstelling van het geanalyseerde monster verandert.

Verschillende beperkingen van deze workflow moeten worden overwogen. Cy5.5-fluorescentie identificeert peptide-geassocieerd signaal, maar onderscheidt op zichzelf niet geïnternaliseerde peptiden van membraanadherent of pericellulair signaal. Gepaarde-fractie scRNA-seq wordt ook beïnvloed door weefseldissociatie, celherstel, sorteerdrempels en de relatieve abundantie van elke longcelpopulatie. Daarom kunnen zeldzame populaties zoals basale cellen of ionocyten ondervertegenwoordigd zijn of over het hoofd worden gezien. Rapportagemuisflowcytometrie biedt een sterkere celtype-toewijzing, maar vereist een geschikte rapportagelijn of een gevalideerd antistofpaneel. Daarnaast zou een voertuigcontrole met behulp van reportermuizen de achtergrondcolokalisatie binnen GFP⁺ AT2-cellen beter definiëren in beeldvormingstests. De interpretatie moet daarom gebaseerd zijn op concordant bewijs tussen scRNA-seq, flowcytometrie en confocale beeldvorming in plaats van op één enkele uitlezing.

Deze workflow is modulair en kan worden aangepast aan alternatieve fluoroforen, rapporteurmuislijnen, doseringsschema's of oogsttijdpunten. Voor studies die aanvullende cel- of orgaanspecifieke CPP's ontwikkelen, kan het gepaarde-fractie scRNA-seq-ontwerp worden toegepast met aanpassingen op andere organen (bijv. lever, nier of hersenen). Dit protocol biedt een efficiënte aanpak om peptide-geassocieerde populaties binnen één orgaan van hetzelfde dier te vergelijken, waardoor de interpreteerbaarheid verbetert en de variabiliteit tussen dieren wordt verminderd. Toekomstige toepassingen omvatten het screenen van extra CPP's, het testen van CPP–cargo conjugaaten, het vergelijken van lineaire en cyclische peptideontwerpen, en het toepassen van de workflow op ziektemodellen waarin weefselarchitectuur of de abundantie van doelcellen wordt veranderd.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NHLBI R01-subsidie HL153407, NIH-subsidie HL092961 en NHLBI F32-subsidie HL175907.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-mouse CD45-BV605 antibodyBioLegend103140Gebruikt voor identificatie of uitsluiting van CD45+ cellen
C57BL/6J muizenThe Jackson LaboratoryStrain #000664Wild-type muizen gebruikt voor experimenten
CD45 MicroBeads, muisMiltenyi Biotec130-052-301Gebruikt voor magnetische depletie van CD45+ cellen
CeltellerInvitrogenCountess 3; AMQAX2000Automatisch celtelling
CO2 incubatorThermo ScientificHeracell VIOS 160i; TSH160IDSCel incubatie
Confocale microscoopZeissLSM 980; 1872-551Gebruikt voor het verkrijgen van z-stack beelden
cR11A-Cy5.5 peptideMayo Clinic Proteomics CoreCustom synthese; geen catalogusnummerFluorescent gelabeld CPP gebruikt voor in vivo bezorging
CryostatenLeica BiosystemsLeica CM1950Gebruikt voor weefselsneden
Dispase IISigma-AldrichD4693-1GEnzym gebruikt voor longweefsel digestie
DMEM/F12Gibco11330-032Cel dissociatie en wasbuffer
DNase IRoche10104159001Vermindert DNA-gemedieerde celkluwen
FACS cel sorteerderBD BiosciencesBD FACSAria II, 4 laser systeemGebruikt voor het sorteren van Cy5.5+ en Cy5.5- cellen
FBSGibcoA52567-01Toegevoegd aan buffers om celviabiliteit te verbeteren
FlowJo softwareFlowJoVersie 10.10.0Flow cytometry data analyse
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVersie 10Statistische analyse en plotten
Imaris softwareOxford InstrumentsVersie 9.9.13D visualisatie en colocalisatie analyse
Geïncubeerde orbitale shakerThermo ScientificSolaris; 01-258-086Gebruikt voor weefsel digestie
KetamineWestWard (Hikma)NDC 0143-9508-01
LD KolommenMiltenyi Biotec130-042-901Gebruikt voor magnetische celscheiding (MACS)
LD KolommenMiltenyi Biotec130-042-901
Live/dead fixable gele dode celkleuringskitInvitrogenL34968Gebruikt voor levensvatbaarheidskleuring in flow cytometry
Live/dead fixable gele dode celkleuringskitInvitrogenL34968
LSL-GFP reporter muizenThe Jackson LaboratoryStrain #007906Cre-induceerbare GFP reporter lijn
LSL-GFP reporter muizenThe Jackson LaboratoryStrain #007906
MicrocentrifugeEppendorfEPP-5427RSample centrifugatie
MicrocentrifugeEppendorfEPP-5427R
Montagemedium met DAPIAbcamAB104139Nucleaire contrakleuring voor beeldvorming
Montagemedium met DAPIAbcamAB104139
Nuclease-vrij waterQiagen175034992
Orale sondevoerderBraintree ScientificN-PK 020
PBSGibco10010-023Algemene wasbuffer
PBSGibco10010-023
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122Voorkomt bacteriële besmetting
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122
Gekoelde centrifugeThermo ScientificST16R; TSST16RCel pelleting bij gecontroleerde temperatuur
Gekoelde centrifugeThermo ScientificST16R; TSST16R
SalineBaxter2F7124
Sftpc-CreERT2 muizenThe Jackson LaboratoryStrain #028054AT2-specifieke induceerbare Cre lijn
Sftpc-CreERT2 muizenThe Jackson LaboratoryStrain #028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter muizenIn-house kweekGenereerd door het kruisen van Sftpc-CreERT2(+/+) muizen met LSL-GFP(+/+) muizenGebruikt voor AT2-specifiek GFP-labeling
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter muizenIn-house kweekGenereerd door het kruisen van Sftpc-CreERT2(+/+)muizen met LSL-GFP(+/+)muizen
Zijde draadLookSP117
Single-cell RNA sequencing dienstMayo Clinic Genome Analysis Corehttps://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/servicesBibliotheek voorbereiding en sequencing
Single-cell RNA sequencing dienstMayo Clinic Genome Analysis Corehttps://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
TamoxifenSigma-AldrichT5648
Waterbad incubatorFisherbrandIsotemp GPD 28Temperatuurgestuurde incubatie
Waterbad incubatorFisherbrandIsotemp GPD 28
Xylazin (Rompun)DechraNADA #047-956

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Alveolaire epitheelcellensingle cell RNA sequencingflowcytometrieconfocale beeldvormingcel sorterencryosneden van de long

Gerelateerde artikelen