Kwantitatieve micro-CT-analyse van longparenchymale en luchtwegremodellering in een fretmodel van pulmonale fibrose

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van micro-CT om de kenmerken van bleomycine-geïnduceerde longfibrose in een fretmodel kwantitatief te beoordelen. Dit fretmodel toont een sterk translationeel potentieel voor het begrijpen van pulmonale fibrose en het testen van nieuwe therapieën.

Samenvatting

Longfibrose (PF) is een chronische en progressieve longziekte die wordt gekenmerkt door herhaald alveolair letsel dat leidt tot parenchymale verdikking, littekenvorming en ademhalingsstoornissen. Huidige knaagdiermodellen, met name die welke bleomycine (BLEO) gebruiken, hebben beperkte translationele relevantie voor humane idiopathische pulmonale fibrose (IPF) vanwege anatomische verschillen zoals het ontbreken van respiratoire bronchiolen. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een grootdiermodel ontwikkeld van pulmonale fibrose bij fretten, die respiratoire bronchiolen bezitten die lijken op die bij mensen. Drie maanden oude wildtype-fretten kregen intratracheale installatie van BLEO. De longen werden 8 weken na de behandeling geoogst voor micro-computertomografie (micro-CT) en histologische evaluatie. Vanwege de beperkte ruimtelijke resolutie van multidetector CT (MDCT) bij het visualiseren van de kleine luftwegen van de fret, werden verwijderde longen ex vivo gefotografeerd met een micro-CT-scanner bij gecontroleerde luchtwegdrukken (0 cmH₂O en 25 cmH₂O) om uitademings- en inademingscondities te simuleren.

Micro-CT-beeldvorming toonde duidelijke structurele verschillen aan tussen normale en met BLEO behandelde frettenlongen. Normale longen vertoonden een lage attenuatie en behouden architectuur, terwijl met BLEO behandelde longen een duidelijk verhoogde verzwakking vertoonden die consistent is met fibrose. Kenmerken die kenmerkend zijn voor menselijke fibrotische longziekte, waaronder honingraat met cystische ruimtes, verdikte interlobulaire septa en glasopaciteiten die wijzen op vroege fibrotische of inflammatoire veranderingen, waren zichtbaar. Met behulp van kwantitatieve micro-CT-analyse werd waargenomen dat de luchtwegen in BLEO-behandelde fretlongen significant verminderde radiale expansie, longitudinale uitrekking en volumeverandering vertoonden bij beide toegepaste luchtdrukken. Bovendien toonde generatie-gematchte analyse een significante verdikking van luchtwegwanden in gebieden met visueel zichtbare fibrose. Histologische beoordeling, waaronder Masson's tricchrome kleuring, bevestigde uitgebreide collageenafzetting en fibrose.

Deze studie toont aan dat met BLEO behandelde fretten radiologische, mechanische en histopathologische kenmerken ontwikkelen die lijken op menselijke pulmonale fibrose. Bovendien maakt micro-CT een hoogresolutiebeoordeling mogelijk van fibrotische distributie, luchtwegdynamiek en longvolumeveranderingen. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van de fret als translationeel model voor het bestuderen van PF-pathogenese en het evalueren van nieuwe therapeutische strategieën.

Inleiding

Longfibrose (PF) is een chronische en progressieve interstitiële longziekte waarbij herhaalde alveolaire beschadiging leidt tot parenchymale verdikking, fibrose en progressieve respiratoire disfunctie¹. Longfibrose kan worden veroorzaakt door verschillende blootstellingen, waaronder medicijnen, omgevingstoxines, infecties, onderliggende auto-immuunziekten, of het kan idiopathisch^zijn. Hoewel medicijnen zijn ontwikkeld om de voortgang van de ziekte te vertragen, vooral bij patiënten met idiopathische pulmonale fibrose (IPF), blijft pulmonale fibrose ongeneeslijk, met een overlevingskans van 3–5 jaar na^{diagnose 1,2}. In de meeste gevallen is de enige definitieve behandeling een longtransplantatie; Daarom is er een dringende behoefte om nieuwe en effectievere therapeutische opties te ontwikkelen.

Bleomycine is een medicijn dat vaak bij mensen wordt gebruikt voor de behandeling van maligniteit; het gebruik ervan wordt echter beperkt door pulmonale toxiciteit, die snel kan overgaan in pulmonale fibrose³. Na de ontdekking van deze bijwerking werd bleomycine gebruikt in onderzoek om diermodellen van pulmonale fibrose te ontwikkelen. Muizen zijn hiervoor vaak gebruikt ^4,5,6 met verschillende methoden van Bleomycine-toediening, waaronder IV en intratracheale instillatie ^7,8. Hoewel fibrose zich ontwikkelt in deze modellen, omvat geen van hen alle kardinale kenmerken van pulmonale fibrose die bij mensen^{wordt gezien 8}. Knaagdiermodellen van pulmonale fibrose weerspiegelen geen belangrijke kenmerken van gevorderde ziekte, waaronder honingraatcystvorming en bronchiolisatie van de distale alveoli⁹. Daarnaast hebben studies aangetoond dat door bleomycine veroorzaakte longschade spontaan begint te verdwijnen bij knaagdieren ongeveer 28 dagen na bleomycinebehandeling¹⁰ dagen. Bovendien heeft geen van de middelen die in deze modellen fibrose remmen, een gelijkwaardig effect bij mensen gehad, waardoor onze therapeutische opties^{beperkt zijn}.

Huisfretten (Mustela putorius furo) worden steeds vaker gebruikt in respiratoirbiomedisch onderzoek vanwege hun anatomische overeenkomsten met het menselijke ademhalingssysteem¹². Daarnaast zijn ze vatbaar voor vergelijkbare respiratoire pathogenen die mensen infecteren, waaronder respiratoire syncytiale virus (RSV) en influenza, wat hun fysiologische overeenkomsten¹² aantoont. Frettenmodellen van bleomycine tonen bronchiolisatie, de vorming van fibrotische foci en de aanwezigheid van aberrante basaloid-achtige (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺) cellen⁹ aan. Een enkele dosis bleomycine veroorzaakte langdurige longfibrose bij fretten, met beperkende fysiologie en fibrotische longafwijkingen die minstens 22 weken^aanhielden. Deze bevinding verschilt aanzienlijk van het veelgebruikte muisbleomycinemodel, waarbij fibrose over het algemeen zelfbeperkend is en na ongeveer 28 dagen begint te verdwijnen, met aanzienlijke regressie na 6–8 weken, wat suggereert dat het fretmodel de chronische en progressieve aard van menselijke pulmonale fibrose beter kan recapituleren. Bovendien zijn fretten recentelijk gebruikt in onderzoek naar taaislijmziekte, een systemische aandoening die het meest het ademhalingssysteem treft, vanwege hun gelijkenis met mensen¹⁴. Daarom kunnen deze dieren betere modellen voor PF zijn dan eerdere knaagdiermodellen.

Deze huidige studie was bedoeld om een diermodel van pulmonale fibrose te ontwikkelen dat meer lijkt op de menselijke conditie. We gaven intratracheale bleomycine aan tamme fretten. Na 8 weken vertoonden deze fretten radiografische en histologische veranderingen vergelijkbaar met die waargenomen bij mensen met pulmonale fibrose.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Michigan State University (Animal protocol approval nr. PROTO202300066). Dierenverzorgings- en experimentele protocollen zijn goedgekeurd door Michigan State University en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele normen voor ethisch gebruik van dieren in onderzoek.

1. Bronchoscopische installatie van bleomycine bij fretten

1. Koop mannelijke fretten die in de leeftijdscategorie van 3–4 maanden zijn. Het gemiddelde gewicht van een mannelijke fret op deze leeftijd zou ongeveer 0,9–1,6 kg moeten zijn. Houd de dieren onder 21 °C met 40%–50% luchtvochtigheid.
2. Dien 3%–5% isoflurangas toe aan de fret met behulp van een precisie-verdamper-anesthesiemachine.
3. Houd de anesthesie door de neus van de fret te bedekken met een neuskegel en blijf isoflurangas toedienen in een concentratie van 3%–5%.
4. Wanneer de fret voldoende gesedeerd en liggend is, start je de bronchoscopie met een bronchoscoop met een buitendiameter van 2,7 mm.
5. Geef via het werkkanaal een mengsel van bleomycine (2 U/kg lichaamsgewicht) en zoutoplossing in de distale luchtpijp om diffuse verspreiding van de bleomycine mogelijk te maken. Zorg ervoor dat het totale volume niet meer dan 1 ml bedraagt. Breng de fretten terug naar hun respectievelijke woonunits en houd het 8 weken in de gaten.
   OPMERKING: De installatie mag niet langer dan twee minuten duren.
6. Dien isofluraan toe met een precisie-vaporizer-gasanesthesiemachine. Bedek de neus van de fret met een neuskegel en geef 1%–5% isofluraan totdat de fret ligt liggen. Ga door met blootstelling aan gasen totdat de schijnbare klinische dood kan worden bevestigd. Geef een intraveneuze euthanasieoplossing in een dosis van 90 mg/kg en monitor de vitale functies totdat de dood is bevestigd.
7. Oogst de longen 8 weken na behandeling voor micro-computertomografie (micro-CT) en histologische evaluatie.

2. Hoogresolutie micro-CT beeldvorming van frettenlongen

1. Bereid verwijderd longweefsel voor voor beeldvorming door overtollig weefsel en bloed via de incisie in de inferieure vena cava te verwijderen om bloedafvoer mogelijk te maken. Voer de CT direct uit nadat de longen zijn voorbereid.
2. Verkrijg tomografische micro-CT-beelden met een micro-CT-systeem met de volgende beeldinstellingen: 90 keV, 88 μA, vermogensinstelling met een 60 μm koperen en 500 μm aluminium röntgencollimatorfilter, met een 72 mm gezichtsveld (FOV) bij 144 μm isotrope beeldresolutie.
3. Verkrijg in totaal 5 beelden op 18 seconden standaard gangtijden met behulp van een geautomatiseerd stitching-protocol om dubbele slices te overlappen, te borduren en te verwerpen om een definitief gestitched beeld te maken voor luchtwegpipeline-analyse; dit resulteert in een cilindrische diameter FOV x 186 mm totale geborduurde beelddiepte (Z-vlak) met een voxelresolutie van 144 μm, waardoor het volledige vastleggen van het gehele ex vivo ferret-longblok mogelijk is.
   1. Herhaal dit beeldvormingsprotocol voor elke set ex vivo ferretlongen bij zowel 0 cmH₂O als 25 cmH₂O longdruk.
   2. Gebruik een drukmeetsysteem dat direct op de long is aangesloten om de luchtwegdruk tijdens beeldvorming nauwkeurig te regelen en te behouden.
   3. Koppel de drukmeter aan een gereguleerde luchtstroombron om continue aanpassing van de intrapulmonale druk mogelijk te maken.
   4. Stel het systeem vóór de beeldvorming in op het gewenste drukniveau (0 cmH₂O of 25 cmH₂O) en blaas de long op met een constante luchtstroom.
   5. Gebruik tijdens het beelden de drukmeter om realtime feedback te geven over de luchtwegdruk en om kleine drukfluctuaties te compenseren met behulp van de luchtstroombron.

3. Beeldverwerking en segmentatie

1. Laad de gereconstrueerde micro-CT-beeldvolumes in DICOM-formaat, die worden omgezet naar een neuroimaging informatics technology initiative (NIfTI)-formaat, in de luchtwegsegmentatiepijplijn.
2. Definieer het interessegebied (ROI) in het micro-CT-beeld door axiale sneden aan het bovenste uiteinde handmatig bij te snijden om de buis en andere tracheale inserts uit te sluiten (zie Figuur 1A).
3. Voer luchtwegsegmentatie uit met behulp van het geautomatiseerde Freeze-and-Grow-algoritme^15,16 beschreven in de volgende belangrijke stappen.
   1. Plaats een zaad in de luchtpijp op de bovenste axiale beeldsnede binnen de ROI; een lege beeldarray met invoerbeeldgrootte creëren om het initiële confident luchtwegvolume (CAV) weer te geven met alle voxels toegewezen aan '0'; en voeg de zaadvoxel toe aan CAV door de waarde op '1' te zetten.
   2. Stel een initiële conservatieve micro-CT intensiteitsdrempel in t = -1000 HU voor segmentatie van het luchtweglumen.
   3. Maak een lege afbeeldingsarray met invoerbeeldgrootte om het verboden volume (FV) te representeren met alle voxels geïnitialiiseerd op '0'.
   4. Herhaal iteratieve segmentatie totdat de convergentie van luchtweglumensegmentatie is gedefinieerd door een van de twee vlaggen: 1) het volledige drempelbereik (-1000 tot -600 HU) is gecontroleerd, of 2) alle '0'-voxels die aan '1'-voxels in het CAV-beeld grenzen, zijn in de FV-afbeelding als '1' gemarkeerd.
      1. Bereken CAV centerline boom¹⁷ en identificeer eindpunten van de terminale tak¹⁸.
      2. Pas binaire drempeling toe op het micro-CT-beeld bij de huidige waarde t en bereken het nieuwe lumen-verbonden volume¹⁸ met CAV als seeds over het drempelgebied (voxelwaarde ≤ t), terwijl FV wordt uitgesloten.
      3. Voor elk CAV-eindpunt bereken je de bijbehorende voxels binnen het nieuwe lumenvolume, met uitzondering van CAV die dichter bij dat eindpunt liggen dan bij andere CAV-eindpunten.
      4. Detecteer het CAV-eindpunt met een groot volume aan bijbehorende voxels (>150 voxels, gelijk aan 0,5 mm³) als potentiële leklocaties in het nieuwe lumenvolume.
      5. Bevestig een mogelijke lumenlekkage met behulp van de geautomatiseerde criteria gedefinieerd in Nadeem et ^al.15.
      6. Verwijder eventuele lekkages in het lumenvolume door het subboomvolume distaal van de lekwortels te verwijderen, en voeg voxels toe rond lekwortels om FV te versterken met behulp van de eerder beschreven algoritmen¹⁵.
      7. Wijs het door lek verwijderde lumenvolume toe om de CAV bij te werken met behulp van de eerder beschreven algoritmen¹⁵.
      8. Verhoog de drempel t met '1'.
      9. Ga naar stap 3.3.4.
4. Voer de berekening uit van een luchtweg-middenlijnboom van één voxel met behulp van een eerder gevalideerd geautomatiseerd algoritme¹⁷ dat in de volgende belangrijke stappen wordt beschreven.
   1. Voer de gesegmenteerde luchtwegboom in als een binaire NIfTI-afbeelding.
   2. Bereken de initiële luchtweg-middenlijnboom met behulp van een mediaal geprefereerde minimumkostenpadbenadering¹⁷ , beschreven in de volgende hoofdstappen.
      1. Maak een lege skeletafbeeldingsarray met invoerbeeldgrootte waarbij alle voxels aan '0' worden toegewezen; Voeg het geautomatiseerde seed van stap 3.3.1 toe als de initiële skeletvoxel met waarde '1'.
      2. Maak een lege beeldarray met de invoerbeeldgrootte waarbij alle voxels aan '0' worden toegewezen om het gemarkeerde luchtwegvolumebeeld weer te geven.
      3. Identificeer de voxel in het ongemarkeerde luchtwegvolume dat het verst van het huidige skelet ligt en bereken het mediaal voorkeurs-minimumkostenpad dat dit punt verbindt met het huidige skelet met het eerder beschreven algoritme¹⁷.
      4. Voeg het resulterende pad toe als een nieuwe skelettak aan de skeletbeeldarray en werk het door de luchtweg gemarkeerde volume bij door lokale schaaladaptieve dilatatie langs de tak toe te passen, zoals eerder beschreven¹⁷.
      5. Herhaal stappen 3.4.2.3–3.4.2.4 totdat het gemarkeerde luchtwegvolume is gevuld.
   3. Snoei ongewenste topologische takken terwijl je de werkelijke luchtwegmiddenlijnen bewaart met behulp van een lokale schaalgebaseerde selectiestrategie op de lengte van de tak, zoals eerder beschreven¹⁷.
   4. Elimineer eenvoudige punten¹⁹ in de middenlijn van de luchtweg die geen vertakkingseindpunten zijn (d.w.z. die grenzend aan meer dan één middenlijnvoxel) om topologische consistentie te waarborgen en een enkelvoudig voxel-dikke middenlijn te behouden.
5. Voer segmentatie van longparenchym uit in microbeelden van frettenlongen bij 0 cmH₂O.
   1. Handmatig afbakense longparenchym op elke vijfde coronale beeldsnede met behulp van computationele algoritmen en grafische interfaces die zijn ingebed in ITK-SNAP²⁰.
      OPMERKING: Het micro-CT intensiteitscontrast tussen het longparenchym en de omliggende achtergrond bij de inflatie van 25 cmH₂O was onvoldoende, waardoor een betrouwbare segmentatie van het longvolume onmogelijk werd.
   2. Pas beeldinterpolatie toe om een segmentatie van longparenchym te genereren bij tussenliggende beeldsneden.
   3. Voer een secundaire kwaliteitscontrole uit om structurele continuïteit van parenchymale segmentatie langs zowel axiale als sagittale richtingen te waarborgen.
   4. Sluit luchtweglumen en wandgebieden uit van het longparenchym met behulp van een lokale schaalgebaseerde dilatatie van het lumenvolume, en trek vervolgens het verwijdde volume af van het longparenchym.
6. Kwantificeer mechanische metingen van luchtwegen²¹.
   1. Kwantificeer de door ademhaling gerelateerde radiale expansie van individuele luchtwegen door veranderingen te meten in ruimtelijk gematchte luchtweglumen dwarsdoorsnede-oppervlakte (CSA) tussen inspiratorische (25 cmH₂O-inflatie) en uitademingsvolume (0 cmH₂O-inflatie). Bereken de radiale expansie bij een luchtwegtak b, aangeduid met Δ_air-R(b), als:
      (1)
      waarbij CSA_ins(b) en CSA_exp(b) de luchtweglumen CSA aangeven bij de inademings- en uitademingslongvolumes. CSA bij b wordt berekend met behulp van radiale lijntracering en lokaal adaptieve half-max methoden over de centrale helft van de tak b²².
   2. Kwantificeer ademhalingsgerelateerde longitudinale uitrekking van individuele luchtwegen als volgt:
      (2)
      waarbij L_ins(b) en L_exp(b) de geodetische padlengtes van de luchtwegtak b bij respectievelijk inspiratorische en uitademende longvolumes aanduiden. De geodetische padlengte van een tak wordt berekend door het middenlijnpad van de carina naar het distale eindpunt van de tak²¹ te volgen.
7. Kwantificeer intensiteitsgebaseerde metingen van longparenchym.
   1. Visualiseer ruimtelijk de micro-CT intensiteitsverdeling van het longparenchym bij gezonde en fibrotische fretten door een "look-through 3D volumeweergave" van het longparenchymvolume te genereren in de context van de luchtwegboom. Bereik het look-through-effect met micro-CT intensiteitsgedefinieerde transparantiemapping en kleurcodering. Pas dezelfde transparantiemapping en kleurcoderingsschalen toe op zowel gezonde als fibrotische fretlongen. De volgende stappen worden toegepast om de look-through 3D-volumeweergave te genereren.
      1. Gebruik 3D Slicer²³ om het driedimensionale (3D) NIfTI-beeld van luchtwegsegmentatie bij 0 cmH₂O inflatie te openen als een "segmentatie".
      2. Genereer een 3D-luchtwegrepresentatie met behulp van de Segmentatiesmodule . Selecteer het luchtwegvolume als ingang en klik in het tabblad Representaties op Creëren onder de optie Gesloten oppervlak .
      3. Importeer het micro-CT intensiteitsbeeld met gescheiden longparenchym in 3D Slicer als Volume. Op deze afbeelding zijn de oorspronkelijke micro-CT intensiteitswaarden behouden voor longvoxels, terwijl alle niet-longvoxels een waarde van -2000 HU hebben toegewezen.
      4. Configureer kleur- en transparantiemapping voor longparenchymale intensiteiten met behulp van de Volume Rendering-module . Kaartintensiteitswaarden van -1500 HU, -600 HU, 0 HU en 1500 HU naar zwart, groen, geel en rood, met dichtheden van respectievelijk 0, 0,15, 0,3 en 1.
   2. Gebruik het algoritme dat in deze studie is ontwikkeld om het aandeel ziek weefsel binnen het longparenchym te schatten door de waargenomen intensiteitsverdeling uit micro-CT-beeldvorming te analyseren. De methode gaat ervan uit dat de intensiteitswaarden van gezonde parenchymale gebieden een Gaussische verdeling volgen. Daarentegen vervormen fibrotische gebieden, met karakteristiek hogere intensiteiten, de Gaussianiteit van de rechterzijde van het waargenomen histogram. Voltooi deze taak in de volgende stappen.
      1. Bereken het histogram voor een geïsoleerd longparenchymalbeeld in stap 3.7.1.3 met 50 bins over het intensiteitsbereik van -1500 HU tot 500 HU.
      2. Bereken het gemiddelde van de doel-Gaussische verdeling als de modus van het histogram en leid de standaarddeviatieparameter af met behulp van de intensiteitswaarden links van de modus op het histogram.
      3. Kwantificeer het volume van fibrotisch weefsel als het overtollige oppervlak aan de rechterkant van het waargenomen histogram dat boven de verwachte Gaussische verdelingscurve ligt, gedefinieerd door de gemiddelde en standaarddeviatieparameters verkregen in stap 3.7.2.2.
      4. Bereken de fractie van het zieke weefsel als de verhouding van het fibrotische weefselvolume tot het totale aantal histogrammen dat het volume van de parenchymale regio vertegenwoordigt.

Resultaten

Van de vijf fretten werden de verwijderde longen van één gezonde fret en één fibrotische fret gefotografeerd met een micro-CT-scanner bij gecontroleerde luchtwegdrukken van 0 cmH₂O en 25 cmH₂O om respectievelijk uitademings- en inademingslonginflaties te simuleren.

Figuur 1 illustreert de tussenresultaten van de beeldverwerkingspijplijn voor het micro-CT-beeld (Figuur 1A) van een ex vivo ferretlong bij 0 cmH₂O druk. Figuur 1B toont tussentijdse resultaten van segmentatie van het luchtwegvolume over iteraties en bijbehorende drempelparameters op een micro-CT-beeld van een uitgesneden fretlong opgeblazen tot 0 cmH₂O. Figuur 1B toont de effectiviteit van het FG-algoritme bij het vastleggen van kleinere luchtwegen via parameterrelaxatie in latere iteraties. Figuur 1C illustreert de resultaten van detectie van boomen in de middellijn van de luchtweg, vóór en na het snoeien van valse takken.

Er werd waargenomen dat na de vijfde generatie het aantal gedetecteerde luchtwegen in de fibrotische longen aanzienlijk lager is dan bij de overeenkomende generatie in de gezonde long (Figuur 2A). Specifiek werden 161 luchtwegtakken vastgesteld in de gezonde long na de vijfde generatie, terwijl slechts 91 luchtwegen werden aangetroffen in de fibrotische longen over de overeenkomstige generaties. Over het algemeen waren de luchtwegwanden in de fibrotische longen dikker dan in de gezonde long (Figuur 2B). De computationele analyse toonde een significante toename aan in de genormaliseerde luchtwegwanddikte met lumendiameter in gebieden met visueel zichtbare fibrose vergeleken met gematchte gebieden in de gezonde long.

Fibrotische longen vertoonden kleine, dikkewandige cystische luchtruimtes die consistent zijn met honingkam, verdikking van interlobulaire septa en gebieden met glasdichtheid in het gemalen glas. Grondglasopaciteiten verwijzen naar gebieden van de long waar verdikt longweefsel en gedeeltelijk gevulde luchtruimtes ervoor zorgen dat het gebied op CT-beelden wazig en grijs lijkt. Er werd waargenomen dat fibrotische longen hogere CT-intensiteitswaarden hadden in het parenchym dat overeenkomt met fibrotische gebieden. Figuur 3A toont een "look-through 3D volumeweergave" van het gesegmenteerde longparenchymvolume samen met de gesegmenteerde luchtwegboom. De micro-CT-intensiteitswaarden boven het parenchym in de fibrotische fretlongen (-502 ± 238 HU) waren significant hoger (p < 0,001) dan die in de gezonde fretlong (-588 ± 167 HU). De regionale intensiteitsverhogingsanalyse (Figuur 3B) toonde aan dat de fibrotische long een parenchymast volume van 27,8% heeft met verhoogde CT-intensiteit (aangegeven door het paarse gebied in het histogram). Ter vergelijking: de gezonde long heeft slechts 1,24% van zijn parenchymaste volume met verhoogde CT-intensiteit.

Een visuele vergelijking van de luchtwegmechanica tussen normale en zieke longen illustreert de verdeling van ademhalingsmechanische biomarkers in gezonde en fibrotische ferretlongen over luchtwegtakken (Figuur 4). Er werd een radiale uitzetting van de luchtweg van 66,8% van ± 9,8% waargenomen in de gezonde fretlongen, wat significant hoger was (p < 0,001) dan in de fibrotische fretlongen (32,4% ± 7,6%). Er werd ook een significant verschil (p < 0,001) in longitudinale luchtwegrek waargenomen tussen gezonde (35,7% ± 5,3%) en fibrotische (16,0% ± 4,9%) fertlongen.

Representatieve CT-beelden werden gemaakt met een micro-CT-scanner bij twee verschillende luchtwegdrukken (0 cmH₂O en 25 cmH₂O) voor elke long. Figuur 5 illustreert de verschillen tussen normale (Figuur 5B,C) en BLEO-behandelde frettenlongen (Figuur 5E,F). In de normale longen tonen de CT-scans een typische longarchitectuur met lage attenuatie en geen tekenen van fibrose (Figuur 5B,C). Daarentegen vertonen de met BLEO behandelde frettenlongen significante pathologische veranderingen, waaronder verhoogde longverzwakking, wat wijst op weefselfibrose (Figuur 5E, F). Daarnaast wordt opvallend honingraat waargenomen, gekenmerkt door cystische ruimtes en verdikte interlobulaire septa (Figuur 5E,F). Doorgewinterde glasopaciteiten (GGO), die gebieden van ontsteking of vroege fibrotische veranderingen vertegenwoordigen, zijn ook zichtbaar in de met BLEO behandelde longen (Figuur 5E, F).

Histologische analyse (Figuur 6) bevestigde aanzienlijke weefselremodellering en fibrose in bleomycine-behandelde fretlongen. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE) toonde een behouden alveolaire architectuur aan in normale longen (Figuur 6A, C), terwijl fibrotische longen uitgebreide structurele vervorming, verhoogde cellulariteit, verdikking van de luchtwegwand en prominente fibrotische laesies vertoonden (Figuur 6B, D). Massons tricroomkleuring toonde verder minimale collageenafzetting in de luchtwegen en het parenchym van normale longen (Figuur 6E, G), terwijl fibrotische longen een duidelijke ophoping van collageen vertoonden in zowel de luchtwegen (Figuur 6F) als de parenchymale gebieden (Figuur 6H). Kwantitatieve beeldanalyse (Figuur 6I, J) bevestigde een significante toename van het collageen-positieve gebied in fibrotische longen vergeleken met normale controles in zowel de luchtweg als het parenchymale compartiment (P < 0,0001), wat wijst op uitgebreide extracellulaire matrixafzetting en progressieve weefselremodellering.

Figuur 1: CT-beeldverwerking en segmentatie. (A) Selectie van het interessegebied (ROI) in een micro-CT-beeld. De cropping line werd handmatig geselecteerd om de buis en andere tracheale inserts die werden gebruikt om de verwijderde fretlongen op te blazen, uit te sluiten. (B) Tussentijdse resultaten van segmentatie van luchtwegbomen in een micro-CT-afbeelding van een uitgesneden fretlong, opgeblazen op 0 cmH₂O met behulp van het freeze-and-grow (FG) algoritme. (C) Resultaten van de detectie van de middenlijn vóór en na het snoeien van valse skelettakken die zijn aangebracht op het segmentatievolume van de luchtweg, gebaseerd op een micro-CT afbeelding van een 0 cmH₂O. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Computationele analyse van het genereren van luchtwegbomen. (A) Het aantal luchtwegen dat in de gezonde versus fibrotische longen wordt gedetecteerd. (B) Verschillen in de dikte van de luchtwegwand bij gezonde versus fibrotische longen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Visualisatie van kleurgecodeerde micro-CT-intensiteit. (A) Een doorzichtige 3D-visualisatie van kleurgecodeerde micro-CT-intensiteitsverdelingen over het parenchym voor gezonde en fibrotische fretlongen bij 0 cmH2O-inflatie. (B) Micro-CT intensiteitshistogrammen van gezonde en fibrotische fertlongen, waarbij het histogramgebied paars aangeeft dat gebieden met verhoogde CT-intensiteiten aangeeft op basis van Gaussische modellering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Luchtweg-respiratorische mechanische biomarkers voor gezonde en fibrotische fretlongen. Voor elke biomarker (A toont luchtwegradiale uitzetting, B toont longitudinale luchtwegrek) werd een genormaliseerd kleurcoderingsschema toegepast dat het bereik van μ_x ± 3σ_{x besloeg}, waarbij het gemiddelde (μ_x) en de standaardafwijking (σ_x) van elke metriek werden berekend over alle takken in de gezonde fretlong. Zie tekst voor kwantitatieve vergelijkende resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Micro-CT-beeldvorming toont uitgebreide structurele remodellering en verlies van belucht longvolume in bleomycine-geïnduceerde fibrotische fretlongen. (A–F) Representatieve micro-CT-beelden genomen bij een inflatiedruk van 25 cm H₂O vergelijken gezonde controlefretten (A–C) met bleomycine-behandelde fibrotische fretten (D–F). Driedimensionale (3D) volume-rendered reconstructies (A,D) tonen behouden longarchitectuur en homogene expansie in gezonde longen (A), terwijl fibrotische longen (D) verminderde longexpansie en duidelijke parenchimale vervorming vertonen. Transversale (B,E) en coronale (C,F) CT-secties benadrukken de verschillen tussen groepen verder. Gezonde longen vertonen uniform belucht parenchym met normale luchtwegvertakkingen en minimale weefseldichtheid (B,C). Daarentegen vertonen fibrotische longen uitgebreide bilaterale subpleurale en basilaire overheersende opacificatie, verhoogde parenchymale dichtheid, architectonische vervorming en cystische luchtruimvergroting die consistent zijn met honingraatachtige remodeling (rode pijlen) (E,F). Gele stippellijnen markeren de longgrenzen. Deze beeldvormingsbevindingen wijzen op ernstige fibrotische remodellering en een aanzienlijke vermindering van functioneel belucht longvolume na blootstelling aan bleomycine bij fretten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Validatie van door BLEO geïnduceerde frettenlongfibrose. (A–H) Representatieve brightfield-hematoxyline- en eosine-gekleurde secties tonen verschillen aan tussen normale longen (A,C) en fibrotische longen (B,D). Low-magnified HE beelden tonen een behouden alveolaire architectuur in normale longen (A) en uitgebreide weefselremodellering en fibrotische laesies in fibrotische longen (B). Beelden met hogere vergroting van HE benadrukken verder de normale alveolaire structuur in normale longen (C) en verhoogde cellulariteit, verdikking van de luchtwegwand en architectonische vervorming in fibrotische longen (D). Representatieve brightfield-beelden van longdoorsneden van fret, gekleurd met Masson's tricroom, tonen minimale collageenafzetting in normale longwegen (E) en parenchym (G), en een verhoogde collageenafzetting (blauw) in de fibrotische longwegen (F) en parenchym (H). (I,J) Kwantificering van het collageen-positieve gebied toonde significant verhoogde collageenafzetting in fibrotische longen vergeleken met normale longen in zowel luchtweggebieden (I) als longparenchym (J). P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze studie beschrijft een protocol waarbij intratracheale bleomycine toegediend wordt bij fretten gecombineerd met hoogresolutie ex vivo micro-computertomografie (micro-CT) om structurele en mechanische kenmerken van pulmonale fibrose te karakteriseren. Micro-CT kan kleine luchtwegen detecteren tot 0,2 mm en volumes, luchtwegdikte, dichtheid en morfologie meten. Toegenomen weefseldichtheid, volumeverlies en regionale heterogeniteit komen nauw overeen met de histopathologie. Het primaire doel was om haalbaarheid vast te stellen en aan te tonen dat dit grootdiermodel, samen met geavanceerde beeldvormingsanalyse, radiologische, luchtweg- en histopathologische kenmerken kan vastleggen die lijken op menselijke longfibrose. Verschillende stappen in het protocol zijn cruciaal voor reproduceerbaarheid en interpreteerbaarheid. Ten eerste maakt bronchoscopisch geleide intratracheale bleomycine instillatie diffuse longblootstelling mogelijk, terwijl proximale luchtwegophoping wordt geminimaliseerd, een bekende beperking van kleine diermodellen ^4,7,11. Deze aanpak vermindert waarschijnlijk de variabiliteit in regionale verdeling van letsel, wat vooral belangrijk is bij grotere longen met complexere luchtwegvertakkingen. Ten tweede geeft het kiezen van een tijdstip van 8 weken na de installatie de voorkeur aan gevestigde fibrose boven acute ontsteking. In muismodellen lost bleomycine-geïnduceerde fibrose vaak gedeeltelijk op na verloop van tijd, waardoor de translationele relevantie ^4,8,11 wordt beperkt. Daarentegen vertoonden de ferretlongen in deze studie aanhoudende radiologische en histologische fibrotische kenmerken.

Gecontroleerde longinflatie tijdens ex vivo beeldvorming vormt een ander cruciaal element. Beeldvorming bij gestandaardiseerde luchtwegdrukken (0 cmH₂O en 25 cmH₂O) maakte het mogelijk om de radiale uitzetting en longitudinale uitrekking van de luchtweg te kwantificeren, waardoor de verstorende effecten van variabel longvolume en compliance werden verminderd. Deze luchtwegmechanische biomarkers, afgeleid met behulp van geautomatiseerde, generatie-gematchte algoritmen, bieden objectieve metingen van luchtwegdisfunctie die moeilijk te beoordelen zijn met alleen conventionele histologie^15,21.

Verschillende protocolwijzigingen kunnen de robuustheid verder vergroten. Bleomycinedosering kan worden getitreerd of in herhaalde lage doses worden toegediend om chronisch epitheelletsel beter te modelleren, wat centraal staat in de huidige paradigma's van pulmonale fibrose^{pathogenese 1,3}. Segmentale instillatiestrategieën kunnen vergelijkingen binnen dieren mogelijk maken tussen fibrotische en relatief bewaarde regio's. Vanuit beeldvormingsperspectief is zorgvuldige standaardisatie van luchtwegdruk, fixatiecondities en temperatuur essentieel om weefselvervorming tijdens ex vivo scanning te minimaliseren. Ernstige fibrose kan de geautomatiseerde luchtwegsegmentatie bemoeilijken door wegverlamming en hoge weefseldichtheid; Daarom blijven adaptieve drempelmethoden en handmatige kwaliteitscontrole essentiële aanvullingen op geautomatiseerde pijpleidingen¹⁵.

Deze methode heeft verschillende beperkingen. Het meest opvallend is dat het kleine aantal dieren dat met micro-CT wordt gefotografeerd de statistische inferentie beperkt, en de bevindingen moeten als beschrijvend worden geïnterpreteerd. Dit werk was opgezet als een pilotstudie om de haalbaarheid te bepalen van het karakteriseren van een bleomycine-geïnduceerd fretmodel van pulmonale fibrose met behulp van kwantitatieve micro-CT. Toekomstige studies met grotere cohorten zullen nodig zijn om deze bevindingen te valideren en de statistische kracht te verbeteren. De beschrijving toont echter een duidelijk verschil in de biomarkers en metingen van beeldvorming.

Bovendien blijft bleomycine-geïnduceerde fibrose, hoewel het veel wordt gebruikt, een toxine-gedreven letselmodel en reproduceert het niet volledig de multifactoriele etiologie van idiopathische pulmonale fibrose, waaronder veroudering, genetische vatbaarheid en omgevingsblootstellingen ^3,6,11. Beeldvorming werd ex vivo uitgevoerd, waardoor directe beoordeling van gasuitwisseling, vasculaire bijdragen en longitudinale ziekteprogressie werd uitgesloten. Desalniettemin biedt ex vivo micro-CT een superieure ruimtelijke resolutie en maakt het gedetailleerde driedimensionale analyse van kleine luchtwegen mogelijk, wat momenteel niet mogelijk is met klinische multidetector-CT bij fretten.

Ondanks deze beperkingen biedt dit protocol verschillende voordelen ten opzichte van bestaande modellen. Fretten bezitten respiratoire bronchiolen en luchtwegvertakkingen die meer lijken op die van mensen dan op die van knaagdieren, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor het bestuderen van luchtweggerichte aspecten van fibrose ^6,12. De combinatie van een mensrelevante luchtweganatomie met micro-CT-gebaseerde kwantitatieve beeldvorming maakt gelijktijdige beoordeling van parenchymaldichtheid, luchtwegwanddikte, luchtwegverlies en aangetaste luchtwegmechanica mogelijk. Deze kenmerken weerspiegelen radiologische patronen die zijn waargenomen bij humane fibrotische longziekten, waaronder honingkam, septumverdikking en regionale heterogeniteit ^1,2.

Hoge resolutie computertomografie (HRCT) is een hoeksteenvormingsmethode voor de diagnose en longitudinale monitoring van idiopathische pulmonale fibrose (IPF) in de klinische praktijk. HRCT is gebaseerd op principes vergelijkbaar met micro-computertomografie (micro-CT) en is geoptimaliseerd om parenchymale longafwijkingen op te sporen, terwijl de blootstelling aan straling voor patiënten wordt geminimaliseerd²⁴. Belangrijk is dat vooruitgang in HRCT de diagnostische nauwkeurigheid heeft verbeterd tot het punt dat chirurgische longbiopsie vaak niet langer nodig is voor IPF-diagnose wanneer karakteristieke beeldvormende kenmerken aanwezig zijn²⁵. Kenmerkende radiografische bevindingen van IPF, waaronder architectonische vervorming, traction bronchiectase, honingkam en cystische luchtruimtes, kunnen met HRCT bij patiënten worden geïdentificeerd. In overeenstemming met deze klinische observaties toont ons fretmodel een vervorming van de luchtwegen en cystische luchtruimtevorming aan die met micro-CT kunnen worden gedetecteerd, wat een beeldvormingsfenotype biedt dat sterk overeenkomt met menselijke ziekten.

Naast HRCT is endobronchiale optische coherentietomografie (EB-OCT) naar voren gekomen als een waardevolle beeldvormingsmethode voor IPF-beoordeling²⁶. EB-OCT is een minimaal invasieve techniek die lichtgolven gebruikt om hoogresolutie, driedimensionale beelden van de perifere long in vivo te genereren via een standaard bronchoscoop²⁶. Net als HRCT heeft EB-OCT veelbelovend getoond voor het identificeren van fibrotische remodellering zonder de noodzaak van een chirurgische biopsie. Het vermogen van ons fretmodel om structurele afwijkingen te ontwikkelen die met CT-beeldvorming kunnen worden gedetecteerd, suggereert dat het ook goed geschikt kan zijn voor toekomstige evaluaties met opkomende klinische beeldvormingsmodaliteiten zoals EB-OCT.

Belangrijk is dat veel therapieën die fibrose in knaagdiermodellen verminderen, geen vergelijkbare effectiviteit bij mensen hebben aangetoond¹¹. De hier beschreven aanpak kan helpen deze translationele kloof te overbruggen door gevoelige, ruimtelijk opgeloste beeldvormingsbiomarkers te bieden die zowel structuur als functie weerspiegelen. Dergelijke biomarkers zouden kunnen worden gebruikt om de therapeutische respons te evalueren voorbij de wereldwijde collageenbelasting, waarbij regionale verbeteringen in de luchtwegmechanica of parenchymale remodellering worden vastgelegd.

Samenvattend stelt deze studie een haalbaar protocol vast voor het modelleren van pulmonale fibrose bij fretten en voor het kwantitatief beoordelen van ziektegerelateerde structurele en mechanische veranderingen met behulp van micro-CT. Hoewel het nog preliminair is, benadrukt de aanpak het potentieel van het combineren van grootveemodellen met geavanceerde beeldvormingsanalyses om de relevantie van de translatie te vergroten, het mechanistische begrip van pulmonale fibrose te vergroten en preklinische evaluatie van nieuwe therapeutische strategieën te ondersteunen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Oogzalf
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI