Driedimensionale immunolokalisatie in maïsmeiocyten

Samenvatting

Dit immunolokalisatieprotocol in mannelijke maïsmeiocyten behoudt de driedimensionale integriteit van de cellen tijdens de meiose. Het maakt het mogelijk om de intracellulaire lokalisatie van maximaal drie onafhankelijke antilichamen in geconserveerd paraformaldehyde-gefixeerd materiaal dynamisch te volgen, naast DAPI, dat DNA kleurt.

Samenvatting

Tijdens meiotische profase I varieert de fysieke configuratie van chromosomen sterk tussen ontwikkelingsstadia, gelukkig maken deze stadia-specifieke configuraties de juiste identificatie van elk van deze klassieke meiotische stadia mogelijk, die respectievelijk leptoteen (bijv. de 'dunne draden'), zygoteen (bijv. de 'gekoppelde draden'), pachyteen (bijv. de 'dikke draden'), diploteen (bijv. de 'dubbele draden') en diakinese (bijv. de 'afstotingsbeweging') mogelijk maken. De visuele analyse van verschillende cytogenetische fenomenen die optreden tijdens profase I, zoals recombinatie, koppeling en synapse, vereist zeer betrouwbare immunolokalisatietechnieken. In tegenstelling tot traditionele spreading- en squashingtechnieken die alle subcellulaire en subnucleaire informatie onderdrukken, maakt de hier beschreven 3D-conserveringsprocedure het mogelijk om belangrijke meiotische eiwitten in hun oorspronkelijke subcellulaire locaties te behouden (cytoplasmatisch, nucleair en subnucleair: euchromatine, heterochromatine en nucleolair). Dit protocol beschrijft dus hoe meiotische helmknoppen efficiënt kunnen worden vastgelegd, meiocyten uit helmknoppen kunnen worden ontleed en vrijgegeven, en tegelijkertijd immunolokalisatie van drie belangrijke eiwitten in mannelijke meiocyten van maïs kunnen worden uitgevoerd.

Inleiding

Meiose is een belangrijk proces dat de overdracht van eigenschappen in modelplanten en gewassen reguleert; Daarom vergemakkelijken eenvoudige microscopiemethoden die consistente en getrouwe visualisatie van eiwitlokalisatie mogelijk maken, het begrip van hoe deze eigenschappen efficiënter kunnen worden overgedragen. Helaas is de visualisatie van de lokalisatie van eiwitten binnen meiocyten sterk gevariërd, afhankelijk van de gebruikte techniek ^1,2. Het doel van het protocol is dus om een eenvoudige, reproduceerbare methode te bieden die artefacten tijdens de observatie van meiocyten elimineert. Zo is het al lang erkend dat de waarneming van meiotische chromosomen een delicaat proces is dat wordt vergemakkelijkt door het verpletteren van de cellen door eenvoudige samendruk, hetzij door nog meer disruptieve verspreidingstechnieken ^3,4,5. Bij Arabidopsis thaliana gebruiken onderzoekers vaak verspreidingsmethoden waarbij Carnoy's fixatief (een 3:1 mengsel van ethanol en azijnzuur) wordt gebruikt, samen met diverse detergenten zoals Lipsol, Tween-20 en TritonX-100, evenals enzymmengsels met cellulase, pectinase en cytohelicasen, om cellen te breken en effectieve immunolokalisatie op de kleine chromosomen^{mogelijk te} maken ^1,2. Deze technieken transformeren een 3D-chromosoomconformatie in een 2D-conformatie, waardoor snelle waarneming van alle kunstmatig verspreide chromosomen in één afbeelding mogelijk is. Bepaalde kenmerken van chromosomen die deze zware behandelingen doorstaan, kunnen zichtbaar zijn; Ze slagen er echter vaak niet in het typische gedrag van cellen en chromosomen in vivo⁶ weer te geven. Snelle en zeer brede detectie van maximaal twee antilichamen is mogelijk met 2D-verspreidingstechnieken in verschillende plantensoorten, waaronder maïs 7,8,9,10,11.

Desalniettemin wordt ondanks het gemak van oude 2D-technieken nu erkend dat bepaalde fenomenen gevoelig zijn voor disruptieve methoden en niet kunnen worden waargenomen als de cel, kern of chromosomen beschadigd raken tijdens verspreiding of samendruk. Zo is de beweging van het RAD50-eiwit van het cytoplasma naar de kern tijdens het leptoteenstadium, of tijdens centromeerkoppeling (leptoneom/zygoneem), alleen vastgesteld in intacte 3D-meiocyten¹². Hier krijgen lezers een gedetailleerd 4-daags 3D-protocol aangeboden dat helmknoppen gebruikt die in 4% paraformaldehyde zijn gefixeerd om drie belangrijke eiwitten in mannelijke meiocyten van maïs te immunolokaliseren, waardoor hun structurele integriteit behouden blijft. In vergelijking met een vergelijkbare maïs 3D-immunolokalisatiemethodologie⁸ hebben we praktische notities en tips voor probleemoplossing toegevoegd voor onderzoekers. Dit protocol zal het werk van plantbiologen en plantenveredelaars ten goede komen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van verschillende meiotische processen, zoals de controle van meiotische recombinatie door het synaptonemale complex.

Protocol

VOORZICHTIG: Hanteer formaldehyde en acrylamide met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een chemische kap; Beide zijn toxisch (acrylamide is ook neurotoxisch vóór polymerisatie). Alle materialen die in de studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaalkundige Tabelle.

1. Fixatie van maïshelmknoppen om de intacte structuur van meiocyten te behouden

1. Gebruik maïsplanten in het V13-stadium met bloeiwijzen die nog in de stengel groeien. Tijdens de week van meiotische nog een vaste fixatie draag je handschoenen en druk je voorzichtig op de vergrote steel bij de bult om te bepalen of deze zacht genoeg is om open te snijden.
   OPMERKING: Dit protocol voor fixatie en immunolokalisatie kan worden gebruikt voor zowel maïs- als Arabidopsis thaliana-meiotische bloemknoppen (minder dan 400 μm). Maar in het geval van maïs, afhankelijk van het gebruikte ras en het seizoen (er groeit sneller in het voorjaar), duurt het ongeveer 8 weken vanaf het planten voor referentie inteeltlijn B73, maar slechts 6 weken voor de vroegbloeiende inteeltlijn A344.
2. Voorbereiding van buffers.
   OPMERKING: Bereid de volgende werkmiddelen de volgende werkmiddelen voor, doe dit zorgvuldig en label alle flessen correct.
   1. Bereid 100 mL 10x Buffer A (BA) zouten voor door 4,53 g PIPES (Piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonzuur) toe te voegen bij een eindconcentratie van 150 mM), 5,96 g KCl (eindconcentratie 800 mM), 1,17 g NaCl (eindconcentratie 200 mM), 0,74 g EDTA (eindconcentratie 20 mM), 0,19 g EGTA (eindconcentratie 5 mM) en 90 mL H2_O, eerst de pH aanpassen naar 6,8–7 met KOH, daarna het volume naar 100 mL.
   2. Tot slot filtersteriliseer je met een wegwerp Rapid-Flow steriele filterunit met een perie van 0,45 μm (houd op 4 °C maar vries niet in; je kunt het enkele maanden bewaren).
   3. Bereid je voor:
      -50 mM LEIDINGEN (pH aangepast naar 7 met KOH).
      - voorraden spermine in een concentratie van 0,4 M (voorheen opgelost in 50 mM PIJPEN, pH aanpassen naar 7 met KOH, aliquot van 50 μL bij -20 °C houden).
      - voorraden spermidine in een concentratie van 0,4 M (opgelost in 50 mM PIJPEN, met pH aangepast naar 7 met KOH, bevroren aliquoten van 125 μL bij -20°C).
      - voorraden Dithiothreitol (DTT) 1 M (opgelost in 0,01 M natriumacetaat, tot pH 5,2, bevroren aliquoten van 100 μL bij -20 °C).
      - sorbitol 2 M, gehouden op 4 °C.
3. Bereid 50 mL 2x Buffer A (BA) voor, op ijs, met 10 mL 10x Buffer A-zouten (gehouden op 4 °C), 50 μL spermine (0,4 M in 50 mM PIJPEN, met pH ingesteld op 7 met KOH), 125 μL spermidine (0,4 M in 50 mM PIJPEN, met pH aangepast op 7 met KOH), 100 μL DTT (1 M in 0,01 M natriumacetaat, pH 5,2) draait krachtig om op te lossen; en niet verhitten.
   1. Voeg vervolgens 16 mL 2 M sorbitol toe. Stel het uiteindelijke volume in op 50 mL met steriel water. Filtersteriliseer met een wegwerp Rapid-Flow steriel filter en bewaar bij 4 °C.
4. Bereid een vochtige kamer voor van 5–10 bevochtigde papieren handdoeken die in een plastic doos worden geplaatst. Controleer of het deksel goed afsluit. Verwijder overtollig water.
5. Plaats vervolgens in een bakje de volgende items: de vochtige kamer, een scheermesje, fijne pincetten (voorheen gesteriliseerd met 70% ethanol), een klein flesje steriel water en afplaktape. Breng de tray en inhoud naar de maïsplanten die gecontroleerd zijn in stap 1.1.
6. Gebruik een scheermesje om de hobbelige steel op het niveau van de bloeiwijze open te snijden. De hoofdtakken van de kwast, evenals de zijtakken van de bloeiwijze, kunnen worden gebruikt voor het oogsten van meiotische bloemstenen.
   OPMERKING: Deze kwasttakken bevatten de bloemstukken die interessant zijn om meiotische helmknoppen te verzamelen. Elke bloemstel bevat zes helmknoppen, en de drie bovenste, grotere worden meestal gebruikt voor analyse. De geschatte grootte en kleur van de helmknoppen correleren met elk meiotisch stadium. Bijna transparante helmknoppen van ongeveer 1 mm lang bevinden zich in het leptoteenstadium, doorschijnende helmknoppen van 1,5 mm in het zygotenestadium, witachtige helmknoppen van 2 mm in het pachyteenstadium, en gelige helmknoppen van > 2 mm lang kunnen meiocyten bevatten bij diploteen, tetraden en stuifmeelkorrels die de gametogenese afronden. Let op dat een andere correlatie tussen de lange fase kan variëren tussen genetische achtergronden van maïs, en dat omgevingsfactoren (bijv. hoge temperatuur) de meiotische progressie kunnen versnellen en deze relatie kunnen veranderen. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers een andere grootte-stadium correlaties valideren voor elk specifiek maïsgenotype en groeicondities (via acetocarmine-squashing, vgl. 1.6).
7. Gebruik fijne pincetten om de zijtakken van de bloeiwijzen zorgvuldig te ontleden en te verzamelen en wikkel ze in het keukenpapier van de vochtige kamer.
   OPMERKING: Met wat oefening is slechts een korte lineaire incisie van 3–4 cm in de steel nodig om de takken van de meiotische kwast te verwijderen. Je kunt deze incisie sluiten door hem drie tot vier keer in te wikkelen met standaard schilderstape, waardoor je later dezelfde plant kunt oogsten met de resterende ongedissecteerde bloeiwijze. Weefsel blijft groeien en kan later worden gebruikt voor bestuiving.
8. Houd de kamer op kamertemperatuur. Gebruik alleen die takken van de bloeiwijze die bloemstenen bevatten die helmknoppen dragen in het meiotische stadium. Zorg ervoor dat je de takken bedekt met de helft van de vochtige handdoeken, maar dompel ze niet onder in water.
9. Bevochtig opnieuw als de handdoeken uitdrogen. Sluit de doos tot de ontleding van de helmknoppen, bij voorkeur tot 30 minuten voor het begin van het verzamelen van een helmsten.
10. Met behulp van een verrekijkerstereomicroscoop met een gekalibreerde schaal verzamel je verse helmknoppen uit bloemstukken in 2 mL 1x BA in een petrischaal van 35 mm, zodat je de meiotische stadia nauwkeurig kunt identificeren met behulp van de proxy van de grootte en kleur van een andere helm.
    OPMERKING: Om het meiocytstadium in bemonsterde helmknoppen nauwkeurig te bepalen, wordt één van de drie gesynchroniseerde helmknoppen per bloemstel snel geanalyseerd met 3:1 ethanol-azijnzuurfixatie, acetocarminekleuring en traditionele pompoenmicroscopie¹³.
11. Bereid het 4% formaldehyde-fixatief voor in 1x BA en 0,0025% Tween-20
    OPMERKING: Voeg voor 3 mL 750 μL formaldehyde 16% toe, 750 μL H₂O, 1,5 mL 2x BA en 7,5 μL Tween-20 bij 1%.
12. Verwijder de oorspronkelijke BA-buffer en voeg de 3 mL van deze verse fixatieve oplossing toe aan de gestaged anthers en laat ze 45 minuten vastzetten in een nieuwe 35 mm petrischaal, afgesloten met parafilm om formaldehydeverdamping te voorkomen, en plaats deze vervolgens op een grotere Petrischaal die op een roterende shaker staat (ingesteld op 40–60 rpm), of 0,2 x g). Doe het op kamertemperatuur. Helmknoppen moeten lichtjes draaien voor goede fixatie. Ze drijven meestal aan het oppervlak.
13. Spoel met 3 ml 1x BA, doe het monster vervolgens over in een kleine petrischaal en plaats het op een roterende shaker (40–60 rpm) op kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
14. Met schone pincetten breng je de helmknoppen over in een kleine 35 mm petrischaal met verse 3 mL 1X BA. Sluit de Petrischaal stevig af met parafilm. Bewaar vervolgens het kleine petribakje in een petrischaaltje, bedek het met aluminiumfolie om het donker te houden, en zet het op 4 °C tot gebruik. Je kunt het indien nodig enkele maanden bewaren.

2. Het inbedden van maïsmeiocyten in polyacrylamide sandwichpads

DAG 1: 3D-dia's voorbereiden

1. Bereid 2 ml acrylamideoplossing door gelijke volumes (1:1) acrylamide en 2x BA te mengen. Voordat natriumsulfiet (NaS) en ammoniumpersulfaat (APS) wordt toegevoegd, wordt de acrylamideoplossing 5–10 minuten onder vacuüm ontmagnetiseerd.
2. Aliquot de acrylamide en 2x BA 1:1 verhouding mengen door 100 μL te pipetteren in 1,5 mL buizen.
   Het aantal buizen dat je voorbereidt hangt af van het aantal dia's dat je voorbereidt.
3. Maak 1 ml 1x BA.
4. Leg 2 cm x 2 cm stukjes parafilm over een petrischaal en plaats ze vervolgens onder een dissectiemicroscoop. Pipet 50 μL BA-oplossing met helmknoppen op parafilm. Knip de pipetpunt af met een schaar voor een gemakkelijkere levering bij de volgende toediening.
   1. Pipette 25 μL BA-oplossing op parafilm elders.
5. Gebruik een tang om helmknoppen vast te houden, snijd de punt van de helmknoppen af met een scalpel en knijp de meiocyten voorzichtig uit. Met een pipet wordt de meiocyten voorzichtig overgebracht naar de 25 μL BA-druppel en voorzichtig gemengd.
6. Pipette 10 μL van het meiocytenmengsel op een aparte deklaag.
7. Pipetteer snel 5 μL van 20% (0,2g/1mL) NaS en 5 μL 20% (0,2g/1mL) APS in een 1,5 mL buis met Acrylamide/2x Buffer A.
8. Snel pipetteer 5 μL van bovenstaande op een coverslip en meng met meiocyten. Plaats een dekking met poly-L-lysine bedekkingsdeksel bovenop, maar draai hem 45 graden. Het gebruik van slechts één poly-L-lysine-deklaag (commercieel verkregen of gemaakt door dekfolies enkele minuten in een poly-L-lysineoplossing in een petrischaal te dompelen en ze te laten drogen aan de rand van een nieuwe, schone petrischaal) helpt bij het vrijgeven van een volledige pad na polymerisatie. De deklaag wordt snel uit de oplossing gehaald en gedroogd voordat hij het gebruikt. Voor superresolutiemicroscopie moeten hoogpresterende coverslips met gestandaardiseerde dikte (≤170 nm)¹⁴ nm worden gebruikt.
9. Raak de coverslips 30–50 minuten niet aan om volledige polymerisatie van het monster bij kamertemperatuur mogelijk te maken (een sneller polymerisatieproces verkort de droogperiode van het pad, waardoor de resulterende kwaliteit minder optimaal is).
10. Herhaal stappen '2.6–2.9' voor elke dia die je wilt voorbereiden.
11. Haal alle dekfolies zorgvuldig uit elkaar met een scheermesje. Leg alle dekplaten, met de padzijde naar boven, op een polyacrylamide-pad (of het grootste deel van het pad) in een plaat met 6 putten.
12. Was elke deklaag met een maandverband met 2 ml 1x fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) gedurende 10 minuten. Herhaal deze wasbeurt één keer, voor een totale wastijd van 20 minuten bij kamertemperatuur.
13. Bereid 50 mL voor door 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M en 500 μL Triton te mengen.
14. Spoel elke deklaag af met een maandverband in 1 ml van deze 1x PBS, aangevuld met 1 mM EDTA en 1% Triton, gedurende 2 uur op kamertemperatuur.
15. Bereid een verse batch blokkingsbuffer voor met 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20 en 3% BSA (1 mL per dia). Voor 50 ml blokkeringsbuffer mengt u 44 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M, 5 mL 1% Tween-20 oplossing en 1,5 g BSA. BSA heeft de voorkeur boven donkey serum als blokkerend middel omdat het helpt om niet-specifieke signalen te minimaliseren bij het gebruik van meerdere primaire en secundaire antilichamen.

3. Immunolocalisaties

1. Bereid primaire antistoffen (of antilichamen) voor op de gewenste verdunning met behulp van blocking buffer. Combineer primaire antilichamen op basis van hun vermogen om verschillende signalen te produceren wanneer ze samen worden gebruikt. Ze moeten afkomstig zijn van verschillende organismen, zoals konijn, rat, cavia of kip, die herkend kunnen worden aan specifieke fluorescentie-gelabelde secundaire antistoffen. Het gebruik van ezel- of geitenantilichamen wordt vermeden omdat deze bedoeld zijn als secundaire antilichamen. We raden aan om een enkele soort secundair antilichaam te gebruiken (bijvoorbeeld geit in het experiment getoond in Figuur 1).
2. Voeg 50 μL van dit verdunde primaire antilichaam toe aan het midden van elke coverslip met een pad.
   Voeg water tussen putten toe om de verdamping te vertragen. Zet het bord in een vochtige kamer (een plastic doos met deksel). Vertrek 's nachts.

DAG 2: Wassen

3. Bereid 500 mL Wash Buffer voor (1x PBS + 0,1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Verwijder de oplossing van de nacht uit de holen door aspiratie met je pipet.
5. Was elke coverslip snel twee keer met een pad en 1 ml wasbuffer, en haal het daarna uit de putten.
6. Pipetteer nog eens 1 mL/deklaag met een pad en laat het 1 uur op kamertemperatuur staan.
   Herhaal het nog 7 keer. (in totaal 8 uur)
7. Voeg na de laatste wasbeurt water toe tussen putten, dek de plaat af en laat het een nacht in een vochtige kamer staan.

DAG 3: Secundair antilichaam, washes en montage van slides

8. Bereid de secundaire antilichamen voor door elk te verdunnen in een verhouding van 1:50 in blokkerende buffer.
   Aspiraat de wasoplossing. Doseer 50 μL van het verdunde secundaire antilichaam op het midden van elk pad met een pipet.
   OPMERKING: Elk secundair antilichaam moet worden gebruikt in combinatie met verschillende fluorescerende kleurstoffen met niet-overlappende emissiegolflengten. Zo moet één secundair antilichaam worden gelabeld met AlexaFluor488 (groen), het volgende met AlexaFluor555 (oranje) en het derde met AlexaFluor647 (ver rood), dat gecombineerd kan worden met DAPI (excitatie bij 461 nM, blauw). Andere fluorescerende kleurstoffen, zoals DyLight (van Dyomics GmbH), zijn ook bruikbaar. Bovendien mogen al deze secundaire antilichamen niet kruisreageren met andere soorten die in de mix van primaire antilichamen worden gebruikt. Zo moet het antikonijn-secundaire antilichaam kruisaangepast worden om selectief te zijn voor konijnenantilichamen en geen ratten- of cavia-antilichamen te herkennen. Hetzelfde geldt voor alle secundaire antistoffen. Een goed ontworpen experiment moet worden gebruikt om al deze vereisten gelijktijdig te valideren bij het uitvoeren van co-immunolokalisaties.
9. Voeg water tussen de putten toe, plaats een bord in de vochtige kamer en laat het 2 uur op kamertemperatuur staan.
10. Aspiraat de oplossing uit de putten.
11. Voer vier wasbeurten uit met 1 ml per put, elk 1 uur op kamertemperatuur (in totaal 4 uur).
12. Was elke bron met 1 ml 1x PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en herhaal dit proces nog twee keer. (30 min totaal)
13. Verdun DAPI in 1x PBS.
14. Beet met een eindconcentratie van 1 μg/mL DAPI (DAPI-poeder opgelost in water) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, en plaats 500 μL per put.
15. Haal ProLong™ Gold antifade uit de 4 °C vriezer zodat het kan ontdooien en kamertemperatuur bereikt.
16. Wash slides in 1x PBS voor 30 minuten op kamertemperatuur, met 1 mL per put. Doe het nog twee keer. (1 uur 30 min totaal)
17. Verwijder de laatste was.
18. Voeg vervolgens twee druppels ProLong™ Gold antifade toe in het midden van elk pad.
19. Bevestig de afdekkingen op elke glijbaan, label elke glijbaan, til de afdekkingen uit de put met fijne pincetten en plaats ze langzaam op de slede. Met fijne pincetten laat je langzaam een tweede deklaag zakken op de eerste. Verwijder met een vacuüm overtollige glycerol van de randen van dekfolies. Sluit de randen van dekfolies af met twee lagen nagellak.
20. Als de preparaten niet onmiddellijk onder een fluorescentiemicroscoop worden onderzocht. Bewaar ze in een vriezer van -20 °C, beschermd tegen licht, tot observatie. Laat later de dia's 1 uur op kamertemperatuur in een diadoos staan, horizontaal en in het donker, om condensatie te voorkomen.

DAG 4: Microscopische waarnemingen

21. Observeert de schuiving onder de juiste excitatiegolflengten en filters. Standaard confocale microscopie is voldoende, maar het is raadzaam een microscoop met een 60x objectief te gebruiken om driedimensionale beeldvorming van de hele cel mogelijk te maken met een z-stack elke 0,2 μm, met sequentiële beeldverwerving en deconvolutieverwerking met behulp van de Applied Precision SoftWoRx-software^® .

Resultaten

Met dit protocol kunnen we gelijktijdig de lokalisatiepatronen van de drie belangrijkste meiotische eiwitten in maïs observeren (Figuur 1). Het meiotische eiwit ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) is een homoloog van de alfa-Kleisin REC8-subeenheid van het meiotisch cohesincomplex. De ASYNAPTIC 1 (ASY1) is een cruciaal axiale element, terwijl de ZYPPER1 (ZYP1) het transversale element is van het synaptonemale complex¹⁵. DAPI-kleuring t...

Discussie

Dit protocol biedt een belangrijk voordeel ten opzichte van andere door essentiële driedimensionale gegevens over de belasting van meiotische chromosomale eiwitten te behouden. Deze kenmerken kunnen niet worden behouden met reguliere spreidingstechnieken ^1,2. Toch heeft dit protocol twee beperkingen: het is traag en technisch veeleisend vergeleken met reguliere smeertechnieken die binnen één dag worden uitgevoerd. Daarentegen ver...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Azijnzuur, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  en bis-acrylamide-oplossing, 29:1	Biorad	1610157
Aluminium vouw	Reynolds	U07211R0
Ammonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binoculaire stereomicroscoop	NA	NA
Rund serum albumine (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscoop	Olympus	NA
Gedestilleerd H2O	NA	NA
Disposable Filter Units met PES-filters van 0.45 μm poriën	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fijne pincet FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
geit (IgG H+L) sterk geadsorbeerd  anti-rat gelabeld met AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
geit (IgG H+L) sterk geadsorbeerd anti-konijn gelabeld met AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
geit (IgG H+L) sterk geadsorbeerd anti-guinea pig gelabeld met AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Handschoenen	Merck	Z412392
Kweekkamers / kas / of veld	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maïszaden	NA
Microscoop 22 x 22 mm-1,5 glas dekglasjes	Fisher Scientific	12-542-B
Microscoop 22 x 22 mm-H dekglasjes	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscoopglaasjes	Fisher Scientific	22-230-900
Microscoop schuifdoos	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipetten P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nagellak	Electron Microscopy Science	72180
Papierhanddoeken	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% oplossing	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Kunststof doos met deksel	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primaire antilichamen (rat anti-ZmAFD1, konijn anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petrischaal (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petrischaal regelmatige grootte	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0,5-10 uL) steriel	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) steriel	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) steriel	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Scheermesje - eenzijdig	Fisher Scientific	12-640
Schommelend platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum