Vitamine C-geassisteerde fentonoxidatie verbetert de oxidatieve doding van Helicobacter pylori in vitro

Samenvatting

Deze studie onderzoekt hoe vitamine C het kinetische gedrag van een Fenton-reactie onder in vitro omstandigheden moduleert. Chemische kleurstofprobe- en bacteriële assays tonen aan dat gecontroleerde dosering van vitamine C het oxidatieve gedrag van de reactie verandert en geassocieerd is met verhoogde antibacteriële werking tegen Helicobacter pylori in een vereenvoudigd modelsysteem.

Samenvatting

Helicobacter pylori-infectie blijft een grote wereldwijde gezondheidslast, en de toenemende prevalentie van antibioticaresistentie onderstreept de noodzaak van alternatieve antibacteriële strategieën. Deze studie onderzocht of vitamine C-dosering de oxidatie van Fenton kon moduleren en de oxidatieve antibacteriële werking tegen H. pylori onder gedefinieerde zure in vitro omstandigheden kon versterken. De oxidatieve activiteit werd beoordeeld met behulp van Acid Orange 7-decolorisatie als indirecte chemische uitlezing en een terefthalzuurfluorescentietest als relatieve indicator voor de vorming van hydroxylradicalen in ijzerperoxide-reacties aangevuld met vitamine C. de antibacteriële werkzaamheid werd geëvalueerd door gestandaardiseerde H. pylori bloot te stellen suspenties in ureumhoudende zoutoplossing bij pH 3 naar waterstofperoxide en ferroïde met of zonder stapsgewijze vitamine C-supplement, gevolgd door kolonievormende eenheidstelling. Vitamine C-suppletie veranderde de oxidatieve uitmetingen en werd geassocieerd met grotere verminderingen van levensvatbare bacteriën vergeleken met conventionele Fenton-chemie. Rescue-experimenten met deferoxamine en thiourea verminderden de antibacteriële werking, wat de hypothese ondersteunt dat antibacteriële werking geassocieerd is met ijzergemedieerde en radicaalgerelateerde oxidatieve processen. Live/dead fluorescentiekleuring en scanning-elektronenmicroscopie leverden kwalitatieve visuele waarnemingen die overeenkwamen met de resultaten van de colony-forming unit (CFU) enumeratie. Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat gecontroleerde dosering van vitamine C Fenton-gebaseerde oxidatieve reacties kan moduleren en de antibacteriële werking tegen H. pylori kan versterken in een vereenvoudigd, zuur in vitro model.

Inleiding

H. pylori, een gramnegatieve bacterie met een spiraalvorm die behoort tot het geslacht Helicobacter, is via populatiegezondheidsstudies aangetoond een hoge prevalentie van infecties te hebben in geografische gebieden, geslacht en leeftijd, met een wereldwijde prevalentie van ongeveer 50^%. Het International Agency for Research on Cancer (IARC) heeft H. pylori geclassificeerd als een Groep 1 kankerverwekkend stof, waarmee de sterke connectie met maagkanker en mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel (MALT) lymfoom wordt benadrukt. Op dit moment is de klinische behandeling van H. pylori-infectie voornamelijk afhankelijk van farmacologische regimes. De meest uitgebreid bestudeerde middelen zijn protonpompremmers (PPI's), die de afscheiding van maagzuur onderdrukken; bismutverbindingen, die de effectiviteit van antibiotica vergroten; en antibiotica zoals amoxicilline, claritromycine en metronidazol. Monotherapie is echter onvoldoende gebleken voor volledige uitroeiing, wat heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van combinatieregimes, vaak aangeduid als triple therapy. Deze benadering bestaat doorgaans uit een PPI, claritromycine en ofwel amoxicilline of metronidazol, toegediend gedurende ongeveer^{twee weken}. Met de toenemende prevalentie van antibioticaresistente H. pylori-stammen is de effectiviteit van drievoudige therapie aanzienlijk afgenomen, wat heeft geleid tot de invoering van viervoudige therapie die een PPI, bismut en twee antibiotica^combineert. Desalniettemin zijn deze regimes nog steeds fundamenteel afhankelijk van antibiotica, en antibioticaresistentie blijft een grote uitdaging in het klinisch beheer ^4,5. Daarom heeft de verkenning van alternatieve, antibiotica-onafhankelijke antibacteriële strategieën groeiende belangstelling gewekt.

Naast de directe pathologische effecten is een infectie met H. pylori ook in verband gebracht met veranderingen in de homeostase van maagmicronutriënten. Klinische en epidemiologische studies hebben verminderde concentraties vitamine C in het maagsap en serum van geïnfecteerde personen⁶ gerapporteerd, wat mogelijk verband houdt met mucosale ontsteking, verminderde secretie of verhoogde oxidatieve consumptie ^7,8,9. Tegelijkertijd is H. pylori-infectie via meerdere mechanismen in verband gebracht met ijzertekort, waaronder een verminderde maagzuurgehalte, verminderde ijzeropname in de voeding en bacteriële concurrentie om het beschikbare^ijzer-10. Deze observaties benadrukken de complexe biochemische omgeving die gepaard gaat met een H. pylori-infectie en onderstrepen het belang van redox- en ijzergerelateerde processen bij zure maagaandoeningen.

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) hebben veel belangstelling gekregen voor antimicrobiële onderzoeken vanwege de oxidatieve eigenschappen van deze soorten. ROS verwijzen naar een klasse chemisch reactieve moleculen die worden gevormd tijdens de gedeeltelijke reductie van zuurstof, zoals superoxide-anion (O₂•⁻), waterstofperoxide (H₂O₂), singletzuurstof (¹O₂) en hydroxylradicalen (•OH), onder andere. In biologische systemen zijn ROS uitgebreid betrokken bij het normale fysiologische metabolisme en essentieel voor diverse cellulaire regulatieactiviteiten¹¹. Met name hebben talrijke studies aangetoond dat overmatige ROS bacteriële celmembranen kan verstoren door lipideperoxidatie, wat leidt tot veranderingen in membraanstructuur en functie, wat uiteindelijk resulteert in bacteriële inactivatie¹². Daarom hebben ROS-gebaseerde antimicrobiële benaderingen interesse gewekt als een potentiële mogelijkheid om niet-anti-antibacteriële effecten tegen H. pylori 13,14,15,16 te onderzoeken. Onder de verschillende ROS-generatiemethoden heeft de Fenton-reactie veel aandacht gekregen vanwege de zeer efficiënte radicaalproductie. De Fenton-reactie is een geavanceerd oxidatieproces¹⁷ waarbij ferrosionen (Fe²⁺) onder zure omstandigheden met H₂O₂ reageren om hydroxylradicalen (•OH) te produceren, die een sterk oxidatief potentieel hebben en intracellulaire biomoleculen kunnen oxideren.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Specifiek ondergaat H₂O₂ bij een pH van ongeveer 2,8–4,5 katalytische ontbinding door Fe²⁺, wat •OH genereert terwijl Fe²⁺ oxideert tot Fe³⁺. Fe³⁺ reageert vervolgens met H₂O₂ om Fe²⁺ te regenereren, waarmee een Fe²⁺/Fe³⁺ redoxcyclus wordt gecreëerd die continue ROS-productie¹⁸ in stand houdt. De reductie van Fe³⁺ naar Fe²⁺ verloopt echter relatief langzaam, wat de snelheidsbeperkende stap vormt en daardoor de algehele efficiëntie van de Fenton-reactie verlaagt. Studies geven aan dat het introduceren van een geschikt reductiemiddel in het Fenton-reactiesysteem de Fe²⁺-reductie tot Fe²⁺ kan versnellen, waardoor de ROS-generatie wordt verbeterd. Vitamine C heeft een contextafhankelijke redoxrol. In ijzerhoudende systemen kan het Fe²⁺-reductie bevorderen tot Fe²⁺ en zo de Fenton-cyclus ondersteunen, terwijl het bij hogere concentraties of onder andere reactieomstandigheden ook kan functioneren als antioxidant of radicaal^{scavenger 19}.

Op basis van deze achtergrond onderzoekt de huidige studie een vitamine C-geassisteerd Fenton-reactiesysteem als een chemisch afstembare methode om oxidatieve activiteit te moduleren onder gedefinieerde zure in vitro omstandigheden^20,21. Vitamine C werd gebruikt als reducerend middel om Fe²⁺-regeneratie te bevorderen en zo het effectieve oxidatieve gedrag van de Fenton-reactie te veranderen. Het hier gebruikte experimentele systeem was een vereenvoudigd zuurzout-ureummodel en was niet bedoeld om het fysiologische maagmicro-milieu, dat slijm, buffercomponenten, gastheercellen, immuunfactoren en diverse organische substraten bevat, volledig te reproduceren. Binnen dit gecontroleerde model werd oxidatieve activiteit gekarakteriseerd met chemische uitlezingen en geëvalueerd parallel aan bacteriële fenotypische reacties, wat een experimentele basis bood voor het onderzoeken van ROS-geassocieerde antibacteriële effecten tegen H. pylori in vitro.

Protocol

Ethische verklaring
Deze studie was een in vitro bacteriële studie en betrof geen menselijke deelnemers, dierlijke proefpersonen of door patiënten afgeleide materialen. Daarom waren goedkeuring van de institutionele beoordelingscommissie en goedkeuring van dierenethiek niet vereist.

Evaluatie van AO7-afbraak in het vitamine C-ondersteunde Fenton-systeem
Om het effect van vitamine C op het waarneembare oxidatieve gedrag van de Fenton-reactie te beoordelen, werd de afbraak van Acid Orange 7 (AO7) gebruikt als een indirecte chemische meting van oxidatieve activiteit. Deze test kwantificeert niet specifiek individuele reactieve zuurstofsoorten. Ik bereidde 100 mL AO7-oplossing bij 5 mg/L en stelde de oplossing bij op pH 3. H₂O₂ en FeSO₄ toegevoegd aan de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 2,2 mM en 0,055 mM. Vitamine C toegevoegd, hetzij als enkele bolus bij het initiëren van de reactie of in een doseringsschema in drie stappen. Voor het dosis-respons-experiment werden Vc: Fe²⁺ molaire verhoudingen van 0, 0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 en 8 gebruikt, wat overeenkomt met de uiteindelijke vitamine C-concentraties van respectievelijk 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 en 0,440 mM, wanneer FeSO₄ wordt gebruikt bij 0,055 mM. Voor de drie-stap toevoegingsvoorwaarde werd dezelfde totale hoeveelheid vitamine C gedeeld in drie gelijke aliquots en één aliquot toegevoegd 3, 5 en 7 minuten na het starten van de reactie. Bijvoorbeeld, bij een Vc:Fe²⁺-verhouding van 0,48, werd vitamine C toegevoegd bij 0,0088 mM per aliquot, wat een uiteindelijke totale concentratie van 0,0264 mM opleverde.

De reactieoplossing continu 10 minuten in het donker geroerd terwijl de temperatuur onder de 30 °C bleef. Voor en na de reactie heb ik 2 ml monsters verzameld. De absorptie werd gemeten bij 483 nm met een UV-Vis spectrofotometer, en de AO7-degradatiesnelheid berekend met behulp van Vergelijking 1:

Degradatiesnelheid (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100% (1)

Hier vertegenwoordigt A₀ de absorptie van het monster vóór de reactie, terwijl A₁ de absorptie van het monster na de reactie vertegenwoordigt.

Beoordeling van •OH-geassocieerd fluorescentiesignaal met behulp van een TA-sonde
Om hydroxylradicalen-geassocieerde fluorescentiesignalen te beoordelen onder dezelfde zure in vitro omstandigheden als in de antibacteriële experimenten, werd een celvrij chemisch systeem opgezet met dinatriumtereftalaat (TA, 1 mM) als fluorescentieprobe. Deze assay werd gebruikt als een relatieve indicator van •OH-geassocieerde productvorming en werd niet geïnterpreteerd als een absolute kwantificering van hydroxylradicaalgeneratie. Zeven groepen werden opgenomen: (1) blanco (1 mM TA alleen in reactiebuffer), (2) alleen H₂O₂, (3) Fe²⁺ alleen, (4) Vc alleen (stapsgewijs adderen), (5) conventionele Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) vitamine C-ondersteunde Fenton met bolus Vc-toevoeging (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, bolus), en (7) Vc-ondersteunde Fenton met stapsgewijze Vc-toevoeging (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, stapsgewijs). In de stapsgewijze toevoegingsvoorwaarde werd Vc geïntroduceerd 3, 5 en 7 minuten na reactiestart in gelijke aliquoten, terwijl de bolusvoorwaarde dezelfde totale hoeveelheid Vc kreeg als een enkele toevoeging.

Aliquots werden verzameld over een reactieperiode van 10 minuten, onmiddellijk gealkaliniseerd met NaOH om verdere radicale reacties te dempen en fluorescentie te stabiliseren, en opgeslagen bij 4 °C vóór de meting. De fluorescentieintensiteit van het TA-afgeleide product werd gemeten met een microplaatlezer (Ex/Em: 315/425 nm). Radicaalgeneratie werd uitgedrukt als fluorescentieintensiteit na blankaftrekking en gebruikt als een relatieve indicator van radicaalgeneratie. Er werden minstens drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd, en de gegevens werden gepresenteerd als tijdsverloopprofielen en eindpuntvergelijkingen na 10 minuten.

Evaluatie van antibacteriële prestaties door kolonietelling
H. pylori-stammen werden opgeslagen bij −80 °C in een hersenhartinfusie (BHI) bouillon met 25% glycerol. De primaire stam die werd gebruikt voor de hoofd-kolonie-telling, reddingsassay, matrix-interferentie-assay, levende/dode fluorescentiekleuring en scanning-elektronenmicroscopie-analyse was H. pylori G27. Voor elk experiment werden bacteriën gestreept op Columbia bloedagarplaten en 3 dagen geïncubeerd bij 37 °C onder microaerofiele omstandigheden bestaande uit 5% O₂, 10% CO₂ en 85% N₂²².

Kolonie-tellingstest in de primaire stam
Er werd gebruik gemaakt van colony-forming unit (CFU) enumeratie om antibacteriële werking onder verschillende behandelomstandigheden te evalueren. Omvatte de volgende groepen: onbehandelde controle, alleen H₂O₂, alleen vitamine C, conventionele Fenton-reactie en vitamine C-geassisteerde Fenton-reactie. Als een Fe²⁺-alleen groep niet in het oorspronkelijke experiment is opgenomen, vermijd dan het interpreteren van de primaire test als volledig scheidend van ijzer-only effecten van Fenton-reactie-gemedieerde oxidatieve effecten. Geoogst gekweekte H. pylori en de bacteriën opnieuw opschorst in fysiologische zoutoplossing. De optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) aangepast naar 0,5, en de suspensie overgezet in fysiologische zoutoplossing met 3 mM ureum, aangepast aan pH 3. H₂O₂, FeSO₄ en vitamine C toegevoegd volgens de toegewezen behandelgroep. Definitieve concentraties van 2,2 mM H₂O₂ en 0,055 mM FeSO₄ gebruikt. Voor vitamine C-ondersteunde Fenton-behandeling werd vitamine C toegevoegd in drie gelijke aliquots na 3, 5 en 7 minuten, met een uiteindelijke totale concentratie van 0,0264 mM.

Na 10 minuten behandeling werd elk monster onmiddellijk 100 keer verdund in fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS, pH 7,4) om de zure suspensie te neutraliseren en de overdracht van restoxidanten en ijzer in de plateringsstap te verminderen. De verdunde bacteriële suspensie werd geplateerd op Columbia bloedagarplaten en 3 dagen geïncubeerd bij 37 °C onder microaerofiele omstandigheden van 5% O₂, 10% CO₂ en 85% N₂. Geteld CFU's en berekende antibacteriële activiteit als log₁₀ CFU-reductie ten opzichte van de onbehandelde controle met behulp van Vergelijking 2:

log₁₀ CFU-reductie = log₁₀(_CFU-controle) − log10(_{CFU-behandeld}) (2)

Reddingstest
Om te onderzoeken of de antibacteriële activiteit van het vitamine C-geassisteerde Fenton-systeem geassocieerd was met ijzerbeschikbaarheid en radicaalgerelateerde processen, werden reddingsexperimenten uitgevoerd met deferoxamine (DFO) als ijzerchelator en thioureum als hydroxylradicaalverwijderaar. DFO of thiourea werd 5 minuten voor de toevoeging van FeSO₄ en H₂O₂ aan de bacteriële suspensie toegevoegd. DFO en thiourea werden gebruikt bij eindconcentraties van respectievelijk 100 μM en 5 mM.

Zes experimentele groepen werden opgenomen: onbehandelde controlegroep, vitamine C-geassisteerde Fenton, vitamine C-geassisteerde Fenton met DFO, vitamine C-geassisteerde Fenton met thiourea, alleen DFO en alleen thioureum. Alle andere experimentele parameters, waaronder pH, zoutoplossing/ureumachtergrond, H₂O₂-concentratie, FeSO₄-concentratie, doseringsschema van vitamine C, behandelingsduur, verdunning/neutralisatie vóór het plateren en incubatiecondities, waren identiek aan die gebruikt in de primaire kolonie-telling. De antibacteriële activiteit werd gekwantificeerd door CFU-enumeratie en uitgedrukt als log₁₀ CFU-reductie ten opzichte van de onbehandelde controle.

Multistrainvalidatie
Om beperkte kruis-ondersteuning te bieden voor het antibacteriële effect dat in de primaire stam werd waargenomen, werd de kolonie-tellingstest verder toegepast op twee extra H. pylori-referentiestammen , ATCC 43504 en ATCC 26695. Voor elke stam werden drie experimentele groepen opgenomen: onbehandelde controlegroep, conventionele Fenton-reactie en vitamine C-geassisteerde Fenton-reactie met stapsgewijze toevoeging van vitamine C. De experimentele omstandigheden en procedures waren identiek aan die gebruikt bij de primaire kolonie-telling. De antibacteriële activiteit werd uitgedrukt als log₁₀ CFU-reductie ten opzichte van de onbehandelde controle voor elke stam. Elk experiment werd uitgevoerd met n = 3 onafhankelijke biologische replicata, en de gegevens werden gepresenteerd als individuele datapunten met gemiddelde ± standaarddeviatie.

Matrixinterferentie-assay
Om te evalueren of organische matrixcomponenten de antibacteriële activiteit van het vitamine C-geassisteerde Fenton-systeem konden verminderen, werd een eiwitinterferentiemodel ontwikkeld met behulp van runderserumalbumine (BSA). BSA werd opgenomen bij de uiteindelijke concentraties van 0, 1 en 3 g· L⁻¹. Bij elke BSA-concentratie werden drie experimentele groepen opgenomen: (1) onbehandelde controle, (2) conventionele Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂), en (3) vitamine C-geassisteerde Fenton met stapsgewijze toevoeging van vitamine C. De assay werd uitgevoerd met de primaire stam volgens hetzelfde protocol als beschreven in de primaire kolonie-telassay, met identieke pH-condities, zoutoplossing/ureumachtergrond, reagentia-concentraties, behandelingsduur (10 min) en platingprocedures. De antibacteriële activiteit werd uitgedrukt als log₁₀ CFU-reductie ten opzichte van de onbehandelde controle bij elke BSA-concentratie. Elk experiment werd minstens drie keer onafhankelijk uitgevoerd. De primaire vergelijking richtte zich op de vraag of de verbeterde Fenton-conditie superieur was, of in ieder geval niet zwakker dan, de conventionele Fenton-conditie onder eiwithoudende omstandigheden.

Bacteriële levende/dode fluorescentiekleuring
Na behandeling werd de bacteriële suspensie 100 keer verdund in PBS zoals hierboven beschreven om de resterende zure en oxidatieve overdracht te verminderen. Centrifugeerde de suspensie op 1.800 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooide het supernatant weg. De bacteriële pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 200 μL fysiologische zoutoplossing. SYTO9 en propidiumjodide (PI) toegevoegd aan de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 6 μM en 30 μM. De suspensie 20 minuten in het donker op kamertemperatuur laten incuberen. 5–10 μL van de gekleurde bacteriële suspensatie op een schoon glazen schuilstuk geplaatst en het bedekt met een dekmantel. Verkregen fluorescentiebeelden met een fluorescentiemicroscoop met groene en rode fluorescentiekanalen onder identieke belichtingsinstellingen voor alle behandelgroepen. Voor elke groep werden minstens drie willekeurig geselecteerde velden veroverd. Ik gebruikte de beelden als kwalitatief visueel bewijs van levende/dode kleurpatronen in plaats van als een kwantitatieve meting van de levensvatbaarheid van bacteriën.

Bacteriële morfologieanalyse met scanning-elektronenmicroscopie
Na behandeling werden de bacteriële monsters verzameld en vastgezet in 2,5% glutaraldehyde, bereid in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) bij 4 °C gedurende 12 uur. Na fixatie werden de monsters gewassen met fosfaatbuffer om het resterende fixatiemiddel te verwijderen. De monsters werden vervolgens sequentieel gedehydrateerd in gegradueerde ethanoloplossingen van 50%, 70%, 90% en 100%. Na uitdroging werd critical point droog uitgevoerd. De gedroogde monsters werden op SEM-stompjes gemonteerd en met een dunne goudlaag van ongeveer 10 nm gesputtercoat. De bacteriële morfologie werd onderzocht met behulp van scanning-elektronenmicroscopie bij een versnellingsspanning van 5 kV. Representatieve beelden werden gemaakt bij lage en hoge vergroting voor elke behandelgroep. SEM-beelden werden gebruikt als kwalitatieve morfologische waarnemingen in plaats van als kwantitatief bewijs van een gedefinieerd schademechanisme.

Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 10.0. Alle kwantitatieve experimenten werden uitgevoerd met n = 3 onafhankelijke biologische replicata, en de gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voor TA-fluorescentietests werden statistische vergelijkingen tussen meerdere behandelgroepen uitgevoerd met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Voor kolonie-tellingsassays in de primaire stam met meerdere behandelomstandigheden werden statistische vergelijkingen uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Voor reddingstests werden vergelijkingen tussen groepen uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest, met de vitamine C-geassisteerde Fenton-groep als referentie. Voor beperkte kruis-stam validatie-experimenten werden log₁₀ CFU-reducties vergeleken tussen de conventionele Fenton- en vitamine C-ondersteunde Fenton-groepen binnen elke stam met behulp van een ongepaarde tweezijdige t-test. Voor matrix-interferentie-assays werd tweerichtings-ANOVA uitgevoerd met behandeling en BSA-concentratie als factoren, inclusief de interactieterm. Paargewijze vergelijkingen tussen behandelingen bij elke BSA-concentratie werden uitgevoerd met behulp van Šídáks meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05. Significantieniveaus worden aangegeven als *p < 0,05, ** P < 0,01, ***P < 0,001 en ****p < 0,0001.

Resultaten

Evaluatie van AO7-afbraak in het vitamine C-ondersteunde Fenton-systeem
AO7-afbraak werd gebruikt als chemische probe om te onderzoeken hoe vitamine C het waarneembare oxidatieve gedrag van de Fenton-reactie onder zure omstandigheden beïnvloedt. Bij afwezigheid van vitamine C resulteerde het conventionele Fenton-systeem in gedeeltelijke AO7-afbraak gedurende de reactieperiode van 10 minuten. Toen vitamine C werd geïntroduceerd, nam de mate van kleurstofafbraak toe, wa...

Discussie

De huidige studie onderzocht of vitamine C-dosering het oxidatieve gedrag en de antibacteriële uitmetingen van een op Fenton gebaseerd systeem onder gedefinieerde zure in vitro omstandigheden kon moduleren. Tussen de chemische en microbiologische assays veranderde stapsgewijze vitamine C-suppletie het waarneembare reactiegedrag en werd het geassocieerd met een grotere antibacteriële werking tegen H. pylori dan de conventionele Fenton-reactie onder de geteste omstandighe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	Gebruikt als modelkleurstof voor de AO7-degradatietest.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Gebruikt voor de matrix-interferentietest.
Brain Heart Infusion (BHI) bouillonpoeder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Gebruikt voor bacteriecultuur en cryoconservierung.
Columbia bloedagar platen (5% schapenbloed)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Gebruikt voor bacteriecultuur en CFU-telling.
Kritische puntdroger (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Gebruikt voor SEM-monstervoorbereiding na gegradeerde ethanoldehydratie.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Gebruikt als ijzerchelator in de reddingstest.
Dinatriumtereftalaat	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	Gebruikt als TA-fluorescentieprob voor •OH-geassocieerde signaaldetectie.
Ethanol, absoluut	Sigma-Aldrich	E7023	Gebruikt om de gegradueerde ethanolserie voor SEM-monsterdehydratie te bereiden.
Fluorescentiemicroscoop (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Gebruikt voor fluorescentiebeeldvorming van levende/dode cellen.
Glutaraldehyde-oplossing	Sigma-Aldrich	G5882	Gebruikt voor fixatie van bacteriemonsters vóór SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Gebruikt voor bacterieconservierung in BHI-bouillon.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	Gebruikt voor statistische analyse en grafieken.
Helicobacter pyloristam ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Aanvullende referentiestam gebruikt voor beperkte cross-strain validatie.
Helicobacter pylori stam ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Aanvullende referentiestam gebruikt voor beperkte cross-strain validatie.
Helicobacter pylori stam G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Primaire stam gebruikt voor kolonietelling, reddingstest, matrix-interferentietest, levende/dode kleuring en SEM.
Waterstofperoxide-oplossing	Sigma-Aldrich	H1009	Gebruikt als peroxide-substraat in Fenton-reactietests.
IJzer(II)sulfaatmonohydraat (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Gebruikt als ijzerionenbron in de Fenton-reactie.
Microplaatlezer (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	Gebruikt om TA-afgeleide fluorescentie te meten (Ex/Em = 315/425 nm).
Fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS), pH 7,4	Sigma-Aldrich	P4417	Gebruikt voor verdunning/neutralisatie na behandeling voordat geplateerd en monsters gewassen worden.
Fysiologische zoutoplossing (0,9% natriumchloride-oplossing)	Millipore	567442	Gebruikt voor bacteriesuspensie en bereiding van het zure zoutoplossing-ureummodel.
Scanning elektronenmicroscoop (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Gebruikt voor analyse van bacteriemorfologie.
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Gebruikt om TA-testaliquots te alkaliseren en fluorescentie te stabiliseren.
Sputtercoater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	Gebruikt om de dunne goudcoating aan te brengen vóór SEM-beeldvorming.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacteriële Dubbele Kleuringskit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Gebruikt voor fluorescentie-gebaseerde levende/dode bacteriekleuring.
Thioureum	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Gebruikt als radicaalvangstmiddel in de reddingstest.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Gebruikt om het zure zoutoplossing-ureummodel te bereiden.
UV-Vis spectrofotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	Gebruikt om AO7-absorptie bij 483 nm te meten.
Vitamine C (L-ascorbinezuur)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Gebruikt als reductiemiddel in het vitamine C-ondersteunde Fenton-systeem.