Een semi-geautomatiseerde methode om groepsverschillen te detecteren in het aantal dopaminerge neuronen van de protocerebrale voorste mediale cluster in de Drosophila-hersenen

Samenvatting

Dit protocol biedt een semi-geautomatiseerde methode om het aantal dopaminerge neuronen te kwantificeren in het grote Drosophila protocerebrale anterieure mediale cluster. Deze benadering, specifiek ontworpen om verschillen tussen experimentele en controlegroepen te detecteren en te vergelijken, vermindert de afhankelijkheid van handmatig tellen en biedt een praktisch hulpmiddel voor groepsanalyses op groepsniveau.

Samenvatting

Drosophila melanogaster dient als een krachtig modelorganisme voor het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), voornamelijk door de analyse van dopaminerge (DA) neurondegeneratie en bijbehorende voortbewegingstekorten. Historisch gezien was kwantificatie van verlies van DA-neuronen in de vliegenhersenen beperkt tot kleinere, gemakkelijk aftelbare clusters, waaronder protocerebrale posterieure mediale (PPM) clusters en protocerebrale posterieure laterale (PPL) clusters. Daarentegen vormt het aanzienlijk grotere protocerebrale anterieure mediale (PAM) cluster, bestaande uit meer dan 100 neuronen, een aanzienlijke uitdaging voor handmatig tellen, wat leidt tot ondervertegenwoordiging in kwantitatieve studies. Tot op heden vertrouwen gerapporteerde onderzoeken nog steeds op arbeidsintensieve handmatige tellingen via confocale Z-stacks, die tijdrovend zijn en gevoelig voor variabiliteit. Om deze methodologische kloof aan te pakken, hebben we een semi-geautomatiseerde beeldanalysepijplijn ontwikkeld met behulp van de open-source tool Labkit. Dit protocol maakt efficiënte groepsrelatieve kwantificatie van tyrosinehydroxylase (TH)-positieve neuronen in de PAM-cluster binnen dezelfde experimentele batch mogelijk. De methode begint met standaard immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming, gevolgd door een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding voor segmentatie en analyse. Deze aanpak pakt de bottleneck van PAM-clusterkwantificatie aan en biedt een praktische workflow om intergroepverschillen in DA-neuronkwetsbaarheid in modellen van neurodegeneratie te detecteren. De relatieve schaarste van PD-studies op het PAM-cluster weerspiegelt een historische technische barrière in plaats van een gebrek aan biologische relevantie. Door deze barrière te overwinnen, opent onze methode de deur naar systematisch onderzoek naar de kwetsbaarheid van PAM-neuronen bij PD en de mogelijke link met niet-motorische symptomen.

Inleiding

De azijnvlieg, Drosophila melanogaster, is een populair modelorganisme voor het onderzoeken van de genetische en moleculaire onderliggende eigenschappen van neurodegeneratieve ziekten, met name de ziekte van Parkinson (PD)¹. De geconserveerde neuronale signaalroutes, geavanceerde genetische toolkit en korte levensduur maken het uitzonderlijk geschikt voor het bestuderen van leeftijdsafhankelijke neuronale kwetsbaarheid en voor het uitvoeren van genetische en farmacologische screenings^met hoge doorvoer ^2,3. Centraal in deze onderzoeken staat de analyse van dopaminerge (DA) neuronen, waarvan selectieve degeneratie een pathologisch kenmerk is van PD⁴. In de Drosophila-hersenen zijn DA-neuronen georganiseerd in discrete, genetisch identificeerbare clusters ^5,6. Het progressieve verlies van DA-neuronen binnen specifieke clusters, zichtbaar met TH-immunokleuring en gekwantificeerd via microscopie, dient als primaire functionele uitlezing voor het beoordelen van ziekteprogressie en neuroprotectieve interventies in experimentele modellen ^7,8. Daarom is betrouwbare kwantificering van verlies van DA-neuronen essentieel om de kracht van Drosophila-genetica te vertalen naar betekenisvolle PD-onderzoeksresultaten.

Conventioneel richt kwantitatieve analyse van verlies van DA-neuronen zich op tyrosinehydroxylase (TH) immunokleuring van kleine clusters, waaronder protocerebrale posterieure mediale (PPM) clusters en protocerebrale posterieure laterale (PPL) clusters, waarbij elk cluster minder dan 10 cellen bevat die gemakkelijk door oog⁷ geteld kunnen worden. Handmatige enumeratie via confocale Z-stacks is, hoewel arbeidsintens, de gevestigde methode voor deze clusters in veel PD-studies met Drosophila ^9,10,11. Daarentegen vormt handmatig tellen van het protocerebrale anterieure mediale (PAM) cluster, de grootste DA-neurongroep in de vliegenhersenen, bestaande uit meer dan 100 cellen, een langdurige methodologische bottleneck en sluit de opname ervan uit in de meerderheid van PD-studies ^9,10,11. Ondanks de cruciale rol van PAM-neuronen in leer-, geheugen- en motivatiecircuits, heeft deze beperking ertoe geleid dat ze relatief ondervertegenwoordigd zijn in kwantitatieve analyses van neurodegeneratie 12,13,14,15. Opmerkelijk is dat zelfs recente onderzoeken blijven vertrouwen op deze inefficiënte handmatige teltechniek, wat een aanhoudende en onvervulde behoefte aan een gestandaardiseerde, geautomatiseerde oplossing binnen het veld¹³ onderstreept.

Om deze kritieke kloof aan te pakken, hebben we een semi-geautomatiseerde beeldanalysepijplijn ontwikkeld die efficiënte groepsrelatieve kwantificering van TH-positieve (TH⁺) neuronen in het PAM-cluster binnen een experiment mogelijk maakt. Dit protocol maakt gebruik van de open-source, machine learning-gebaseerde plugin Labkit binnen het Fiji/ImageJ-platform en 3D-beeldverwerkingssoftware^16,17. De kernworkflow vereist dat de gebruiker een representatieve subset van afbeeldingen annoteert om een pixelclassificatiemodel te trainen, dat vervolgens wordt toegepast op batchverwerking van experimentele TH-kleuringsdatasets, gevolgd door het creëren en classificeren van nucleusvlekken ten opzichte van de TH⁺-regio. Deze aanpak balanceert automatisering met deskundig toezicht: het vermindert de last en variabiliteit van volledig handmatige tellingen, terwijl de input van onderzoekers behouden blijft voor het sturen van het algoritme en het beoordelen van resultaten.

Het doel van dit artikel is om onderzoekers een stapsgewijs protocol te bieden voor efficiënte relatieve kwantificatie van PAM-cluster DA-neuronen voor groepsrelatieve vergelijkingen binnen een experiment. We demonstreren de volledige workflow, van hersendissectie, immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming tot de gedetailleerde beeldanalyse-pijplijn met behulp van de semi-geautomatiseerde methode. Door deze belangrijke kwantitatieve stap te standaardiseren, wil dit protocol de onderzoeksgemeenschap in staat stellen de grote PAM-cluster consequent in hun analyses te integreren. Deze semi-geautomatiseerde methode is specifiek ontworpen voor de PAM-cluster en is niet toepasbaar op andere dopaminerge clusters of op TH-positieve neuronen in de ooglobben. Deze methode kan batch-niveau studies van de kwetsbaarheid van PAM-cluster DA-neuronen vergemakkelijken en verdere onderzoeken naar synaptische plasticiteit, neurodegeneratie en therapeutische screening met behulp van het Drosophila-model .

Protocol

1. Monstervoorbereiding en confocale beeldvorming

1. Vliegenhouderij en verzameling
   1. Kruisoudervliegen van de gewenste genotypen genereren experimentele nakomelingen. Na de eclosie verzamel je 20–30 vliegen per vers voedingsbuisje. Vliegen onderhouden volgens het experimentele ontwerp van de gebruiker totdat de gewenste experimentele leeftijd is bereikt.
2. Voorbereiding op dissectie
   1. Bereid een dissectieschaal door het deksel van een 30 mm petrischaal tot de helft te vullen met Sylgard siliconenelastomeer. Vul de schaal met 1x fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS). Aliquot 450 μL fixatief met 1x PBS en 4% paraformaldehyde (PFA) in een 0,6 mL microcentrifugebuis, plaats vervolgens de buis op ijs.
   2. Verdoof 10–20 vliegen met een puls CO₂ van 5–10 seconden, en breng ze vervolgens direct over op een 60 mm petrischaal die op ijs is geplaatst om immobiliteit te behouden.
      VOORZICHTIG: PFA is giftig en vermoedelijk kankerverwekkend. Hanteer het in een afzuigkap met handschoenen, labjas en veiligheidsbril. Verwijder afval volgens de richtlijnen voor institutionele gevaarlijke stoffen.
3. Vliegenhersendissectie en fixatie
   1. Pak een vlieg bij de vleugelwortel met een tang en dompel hem met de buikzijde omhoog in de met PBS gevulde dissectieschaal. Doorboor de thorax met een fijne dissectiepin om de vlieg op het Sylgard-pad te verankeren.
   2. Oriënteer het lichaam horizontaal (bijvoorbeeld hoofd links, buik rechts). Houd de neusbasis vast met één tang terwijl je met de andere de hele neus verwijdert, waardoor er een opening ontstaat tussen de samengestelde ogen.
   3. Pak de blootgestelde oogranden vast met twee tangen en trek ze heel langzaam symmetrisch uit elkaar, waardoor de hersenen zichtbaar worden terwijl de verbinding met het ventrale zenuwkoord behouden blijft.
   4. Verwijder de luchtpijpzakken en het vetlichaam rondom de hersenen. Snijd het ventrale zenuwkoord door om de hersenen vrij te maken en deze op de schaal te laten zakken met de voorzijde naar boven gericht.
      OPMERKING: Als de bezinkte hersenhelft de ventrale helft hoger laat liggen dan de dorsale helft (Figuur 1B,C), gebruik dan een tang om het verhoogde deel voorzichtig te drukken.
   5. Prenateer een P10-pipettip met 0,1% Triton X-100 om te voorkomen dat de dissecte hersenen aan de binnenwand van de tip blijven hechten. Met deze voorbevochtigde tip plaats je elk gedissect brein in de buis met het fixatievoog, en ga je vervolgens verder met de volgende dissectie. Nadat alle hersenen zijn overgebracht, keer je de buis 5 keer om en leg je hem 30 minuten horizontaal op ijs. Incubeer de buis op kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur met roeren.
   6. Laat de hersenen 1 minuut naar de bodem zakken. Was de hersenen 3 x 10 minuten met een wasoplossing die 1x PBS en 0,1% Triton X-100 (PBST) bevat, met agitatie. Bewaar de hersenen in PBS met 0,1% natriumazide bij 4 °C of ga over met immunokleuring.
4. Immunokleuring
   1. Kleur hersenen in 300 μL primaire antilichaamkleuringsoplossing met 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Normal Goat Serum, 0,1% natriumazide en konijnenanti-TH-antilichaam (1:500 verdunning) gedurende 2 dagen bij 4 °C met agitatie. Was de hersenen 3 x 10 minuten met PBST.
   2. Kleur de hersenen met een secundaire antilichaamoplossing met 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Normal Goat Serum, 0,1% natriumazide en anti-konijn Alexa Fluor 635 gedurende 2 dagen bij 4 °C. Was de hersenen één keer met PBST.
   3. Incubeer hersenen in PBST aangevuld met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1:1.000 verdunning) gedurende 2 uur bij RT, en was daarna de hersenen 2 uur in PBST. Bewaar hersenen 's nachts op 4 °C of ga verder met het monteren.
5. Montage
   1. Laad 0,5 mL montage in een 1 mL spuit met een fijne naald. Creëer een montagekamer door twee parallelle stroken transparant lijmtape op een glazen glijbaan te bevestigen, waarbij een opening van 3 mm overblijft (Figuur 1A,D).
      VOORZICHTIG: Scherpe naalden vormen een steekgevaar. Altijd voorzichtig hanteren, sluit het opnieuw af met een eenhandige scheptechniek indien nodig, en gooi gebruikte naalden direct weg in een goedgekeurde pot voor scherpe voorwerpen.
   2. Breng de hersenen over in een schoon petrienschaaltje met een afgeknotte P200-tip. Verwijder overtollig vocht rondom de hersenen en geef 10 μL mountant op de hersenen. Meng voorzichtig de hersenen met de mountant.
   3. Verspreid drie druppels mountant langs de opening op de glijbaan en verspreid ze gelijkmatig over de opening. Plaats en plaats de hersenen langs de centrale lijn van de opening met een P10-pipet (Figuur 1A).
   4. Plaats de hersenen gelijkmatig langs de middenlijn van de spleet, met de voorzijde naar boven gericht. Bedek de opening langzaam met een dekmantel. Druk met je duimen drie seconden dicht bij de randen van de deklaag om stevig contact te garanderen.
   5. Leg de dia horizontaal in een diamap om hem 's nachts in het donker bij RT uit te harden, daarna bij 4 °C voor langdurige opslag.
6. Confocale beeldvorming
   1. Zet het confocale microscoopsysteem aan en wacht 15 minuten op laserstabilisatie. Lokaliseer de hersenen in een helder veld met een 10x objectieflens, schakel dan over op een 100x olie-immersieobjectief en navigeer live naar het PAM-cluster in livebeeld.
   2. Pas fase XY aan om één PAM-cluster in het beeldvormingscentrum te vinden. Bekijk de preview via Z om de grenzen en oriëntatie te bevestigen. Pas de digitale zoom en oriëntatie aan totdat de PAM-cluster het beeldframe langs de diagonaal past.
   3. Stel de boven- en onderpositie van de stapel in. Stel de Z-stapgrootte in op 0,34 μm en de beeldresolutie op 512 x 512. Zet het pinngat op automatische modus. Stel de display-lookup tabel (LUT) in op verzadigingsindicator.
   4. Pas het laservermogen en de detectorversterking van het TH-kanaal aan totdat een minimale hoeveelheid verspreide, discrete puncta binnen PAM-neuronen verzadigd is. Pas de instellingen van het DAPI-kanaal aan om een helder, helder nucleair signaal zonder verzadiging te verkrijgen.
      OPMERKING: De optimale zoomfactor varieert. Verschillen in weefselkrimp kunnen optreden tussen experimentele batches en tussen individuele hersenen binnen dezelfde batch.
   5. Verkrijg en sla afbeeldingen op in raw-formaat met 12-bit of 16-bit in de invoermap (bijv. D:\Confocal\images). Keer terug naar live view, reset de zoom en blader langs de opening om het volgende brein te vinden zonder over te schakelen op lagere vergroting.
      OPMERKING: Sla de primaire databestanden op dit stadium niet op, exporteer of converteer ze niet naar een verwerkt .tif-formaat. Het behouden van de oorspronkelijke ruwe metadata is essentieel voor de daaropvolgende beeldverwerking.

2. Beeldverwerking en kwantificatie

1. Afbeeldingsbestandsconversie en TH-kanaalsplitsing
   1. Converteer ruwe afbeeldingen die zich in de invoermap bevinden naar een formaat dat compatibel is met de 3D-beeldanalysesoftware met behulp van de bijbehorende bestandsconverter (Table of Materials). Plaats de geconverteerde bestanden in de geconverteerde map (bijv. D:\Confocal\converted)
   2. Open Fiji en navigeer naar Bestand | Nieuw | Script. Klik in de scripteditor op Bestand | Open om macrobestand ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm te laden (Supplemental File 1). Klik op Run onderaan het editorvenster (als de knop verborgen is, klik dan op het kleine driehoekige icoon om het te tonen).
   3. Klik in het configuratiemenu op Bladeren en selecteer de geconverteerde map. Selecteer onder Naamgevingsconventie optie 3. Selecteer onder Channel to export de kanaalindex die overeenkomt met TH. Klik op OK om het TH-kanaal batch-splitsen; de geëxporteerde TH-stacks worden automatisch opgeslagen in een map die eindigt met ChannelSplitOut.
2. Training van de Labkit-classifier
   1. Voorbereiding van de trainingsdataset
      1. Selecteer 20 representatieve stacks die een reeks signaalintensiteiten en achtergrondvariaties van samples uit de TH-stackmap vastleggen. Kopieer de geselecteerde bestanden naar de selectiemap (bijv. D:\Confocal\selection).
      2. Voer de Fiji-macro ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm uit (Supplemental File 2). Selecteer bij aanvraag de map met de trainingsafbeeldingen. De macro knipt elke stack tot hetzelfde aantal Z-slices en concateneert de stacks tot een time-lapse TIFF-bestand voor training.
   2. Interactieve training van pixelclassifier
      1. Start Labkit via Fiji Plugins | Labkit | Open de huidige afbeelding met Labkit (materiaaltabel). Klik in de werkbalk op de 3D Box-knop om over te schakelen naar Slice View-modus voor navigatie door Z-slices (schuifregelaar aan de rechterkant) en over samples (schuifregelaar onderaan).
      2. Druk op S om het Brightness and Contrast-paneel te openen en de Max-schuif aan te passen voor optimale visualisatie van TH⁺ neuronen. Stel een geschikte penseelgrootte in (bijvoorbeeld 5 pixels). Klik op Instellingen om het gereedschapspaneel uit te breiden. Houd de standaard weergavemodi (Fused, Source, Nearest).
      3. Klik op Tekenen. In het Labeling-paneel selecteer je Achtergrond en teken je een paar niet-cellulaire regio's; Highlight Foreground en teken op het binnenste van een paar TH⁺ neuronen.
      4. Zoom in en uit het veld met Ctrl + Shift + Scroll. Navigeer naar andere Z-slices met de verticale schuifregelaar en naar andere trainingsvoorbeelden met de onderste schuifregelaar. Herhaal het trekken meerdere keren om robuuste classifiertraining te garanderen.
      5. Klik op de pixelclassificatie. Klik op de Start Training-driehoek om training en luie voorspelling te starten, die later realtime segmentatiefeedback geeft terwijl je navigeert tussen samples, slices of posities (rechtsklik en slepen) op elk moment.
      6. Klik op Teken om corrigerende annotaties toe te voegen waar voorspelling onnauwkeurig is, met optionele schakel voor de zichtbaarheid van voorspelling en label in het Bronnen-paneel en opnieuw trainen. Itereer totdat de classifier betrouwbaar onderscheidt tussen TH⁺ neuronen en achtergrond, en sla de classifier dan op via Segmentation | Sla Classifier op voordat je Labkit sluit.
3. Batch Labkit segmentatie
   1. Open een willekeurige afbeelding uit de TH-stackmap in Fiji. Start Labkit en klik op Verwijderen Alles, laad vervolgens de vooraf getrainde classifier via Segmentatie | Open de classifier om het beeld te segmenteren. Inspecteer de kwaliteit visueel om de generaliseerbaarheid van classifiers te valideren, en sluit dan het venster.
   2. Herhaal 2.3.1 op verschillende andere willekeurige afbeeldingen. Sluit het raam na elke inspectie, behalve de laatste.
   3. Maak een Labkit-uitvoermap aan (bijv. D:\Confocal\LabkitOut). Begin met batchverwerking via Others > Batch Segment Images. Stel Input Directory in op de TH-stackmap en Output Directory op de Labkit-outputmap, en klik dan op OK om batchverwerking te starten.
   4. Voor toekomstige experimenten met hetzelfde TH-antilichaam en vergelijkbare confocale instellingen, sla 2.2 over en hergebruik de vorige classifier.
      OPMERKING: We bieden ook een vooraf getrainde classifier voor testdoeleinden (Supplemental File 3).
4. DAPI-spotcreatie en TH⁺ Neuronkwantificatie
   1. Plaats XT_Jove_Labkit_TH.m (Supplemental File 4) in een scriptmap (bijv. D:\scripts). Open 3D-software en navigeer naar Bestand | Voorkeuren, selecteer dan Aangepaste Tools. Klik in het XTension-mappaneel op Toevoegen... om de scriptmap te selecteren en op OK te klikken.
   2. Voor elk geconverteerd bestand voert het script automatisch de volgende opeenvolgende bewerkingen uit.
      OPMERKING: Deze verklarende sectie bevat geen acties voor de gebruiker, maar is essentieel om door te gaan naar de volgende stappen.
      1. Het DAPI-kanaal wordt verwerkt met achtergrondsubtractie en Gaussian Filter om geoptimaliseerde DAPI-spotidentificatie te vergemakkelijken.
      2. Het segmentatiemasker van de Labkit wordt verfijnd door denoisatie en gatenvulling en als maskerkanaal aan de dataset bevestigd. Een verfijnd TH-oppervlak wordt opgebouwd uit het maskerkanaal. Het TH-oppervlakteobject genereert verder een verfijnd masker om het maskerkanaal te overschrijven.
      3. Er wordt een afstandstransformatiekanaal gemaakt van het TH-oppervlak, waarbij voxels binnen het oppervlak op 0 worden gezet en voxels buiten het oppervlak drijvendekommagewaarden krijgen die hun Euclidische afstand tot het dichtstbijzijnde TH-oppervlak weergeven.
      4. Gebruik het intensiteitsprofiel van elk DAPI-punt in het afstandstransformatiekanaal als metriek voor TH⁺ -neuronidentificatie. DAPI-spots die binnen of nabij TH⁺ gebieden liggen, hebben lage afstandswaarden. Dit criterium helpt valse negatieven te redden, zoals echte DA-neuronkernen die net buiten maar direct naast een onvolmaakte, door Labkit voorspelde voorgrondregio liggen.
   3. Handmatige optimalisatie van kwaliteit voor het creëren van DAPI-spoten
      1. Open een willekeurige steekproef uit de omgezette map in 3D-software. Navigeer naar Bewerken | Beeldeigenschappen en verifieer of de Voxelgrootte Z in het coördinatenpaneel 0,340 μm is. Zo niet, verander het handmatig naar 0,340 μm.
      2. Pas achtergrondaftrekking toe op het DAPI-kanaal door te klikken op Beeldverwerking | Drempel | Achtergrondaftrekking. In het dialoogvenster vink je alleen het DAPI-kanaal aan, stel je Filterbreedte in op 3 en klik je op OK. Herhaal deze stap nog een keer en voer dan een derde herhaling uit met een filterbreedte van 1.
      3. Pas Gaussische gladmaking toe door op Beeldverwerking | te klikken Gladstrijken | Gaussisch filter. Vink alleen het DAPI-kanaal aan, stel Filterbreedte in op 0,2 en klik op OK.
      4. Klik in de Surpass-scène op Voeg nieuwe plekken toe om de Spots creatiewizard te starten. Selecteer het DAPI-kanaal en voer een geschatte XY-diameter van 1,2 μm in. Volg de wizard en voeg een "Quality above"-filter toe en verfijn de drempel totdat deze robuust een nauwkeurige enkele plek voor elke kern oplevert.
      5. Herhaal stappen 2.4.3.1–2.4.3.4 over meerdere willekeurig geselecteerde steekproeven en bepaal de drempelwaarde(n) die betrouwbaar werken over de steekproeven.
   4. Open het script XT_Jove_Labkit_TH.m (Supplemental File 4) in de teksteditor om de volgende door de gebruiker gedefinieerde parameters aan te passen.
      1. Stel ims_Folder in op het pad van de geconverteerde map; stel LabkitOut_Folder in op het pad van de Labkit-uitvoermap. Stel Ch_DAPI in op de DAPI-kanaalindex voor alle bestanden in de geconverteerde map (bijv. 1 als DAPI het eerste kanaal is, 2 als DAPI het tweede kanaal is).
      2. Stel reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ in. Als de voxelgroottes correct zijn in Afbeeldingseigenschappen (zie stap 2.4.3.1), laat de antwoorden dan lege haakjes []. Anders voer handmatig geschikte waarden in (bijv. 0,130, 0,130, 0,340, respectievelijk) die op alle bestanden in de geconverteerde map worden toegepast.
   5. Maak de parameters voor het creëren van spotjes af.
      1. Pas meerdere versies van parameters aan in de SpotsParameterAss-celarray , waarbij elke rij één versie specificeert. Dit omvat het definiëren van de geschatte XY-diameter (μm) voor DAPI-spotdetectie in het linkerdeel van elke rij, en het definiëren van een filterstring bestaande uit criteriafilter(s) in het rechterdeel van elke rij, met de kwaliteitsdrempel(s) uit stap 2.4.3.4 en/of de intensiteitsdrempel op het verfijnde maskerkanaal uit stap 2.4.2.2 of het afstandsgetransformeerde kanaal uit stap 2.4.2.3.
      2. Stel "Intensity Center Ch=aSizeC+1" in boven 0,5 om alleen plekken te behouden waarvan het geometrische centrum binnen het verfijnde TH-maskerkanaal van 2.4.2.2 valt (voxelwaarde > 0,5). Dit is het meest directe en strenge criterium voor TH⁺ DAPI spotfiltering.
      3. Stel "Intensity Mean Ch=aSizeC+2" in onder [drempel] om plekken te behouden waarvan de gemiddelde intensiteit in het afstandstransformatiekanaal van stap 2.4.2.3 onder een gespecificeerde drempel ligt. Lagere drempels selecteren plekken die zich binnen of extreem dicht bij het TH-oppervlak bevinden; hogere drempels bevatten plekken die steeds verder weg liggen. Dit maakt empirische kalibratie van de acceptabele nabijheid voor TH⁺ toewijzing mogelijk.
      4. Vooraf geconfigureerd voorbeeld:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensity Center Ch=aSizeC+1" boven 0,5'];
         1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteitsgemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0,0001'];
         1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteitsgemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0,001'];
         1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteitsgemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0,01'];
         ... Meer filtercombinaties worden in script aangeboden.
         };
      5. Voor toekomstige experimenten met dezelfde TH-antilichaam- en confocale instellingen, hergebruik de eerdere parametercombinaties. Verwijder die slechte combinaties die spotaantallen opleveren die aanzienlijk afwijken van de werkelijke getallen, waardoor de onnodige rekenkracht wordt verminderd.
   6. Batch spot-creatie
      1. Sla alle bovenstaande wijzigingen in het script op XT_Jove_Labkit_TH.m. Open een nieuw 3D-softwarevenster. Klik op menu Beeldverwerking | PAM_TH_processing het script in batch uitvoeren.
      2. Let eerst enkele minuten op dat voor elke filtercombinatie het script een Spots-object aanmaakt dat de parameters weerspiegelt, en dat bestanden uit de geconverteerde map worden verwerkt en opgeslagen als kopieën in een nieuwe uitvoermap met het achtervoegsel "verwerkt". Laat de computer dan onbeheerd achter.
      3. Na voltooiing wordt er een spreadsheet gemaakt. Let op de eerste kolom met bestandsnamen, en de daaropvolgende kolommen met DAPI-vlekken die overeenkomen met elke filtercombinatie, met kolomkoppen die de geschatte XY-diameter en gebruikte filterstring aangeven.
   7. Nabewerkingsvalidatie
      1. Nadat stap 2.4.6 is voltooid, open je handmatig een paar willekeurige bestanden uit de map "verwerkt" en bekijk je de verschillende Spots-objecten in overlay met het originele TH-kanaal. Op basis van visuele inspectie selecteer je één of twee optimale filters die de meest nauwkeurige weergave van de werkelijke TH⁺ neuronentellingen opleveren. Exporteer de overeenkomstige kolommen uit de spreadsheet voor downstream statistische analyse en het opstellen van cijfers.
      2. Om spot-count fouten in de voorkeursfiltercombinaties te corrigeren, selecteer je het bijbehorende Spots-object(en) in de Surpass-scène en klik je op het tabblad Bewerken . Verwijder foutieve plekken handmatig of voeg gemist plekken toe door op Shift te drukken en op het scherm te klikken. Sla de updates op met Store als/Export als/Save as om het bijbehorende bestand in de "verwerkte" map met dezelfde bestandsnaam over te schrijven.
         OPMERKING: Verwijder, voeg geen Spots toe, hernoem niet, doe geen Spots of sleep/herpositioneer—bewerk alleen de gewenste vlekken. Er zijn geen wijzigingen aan het script nodig; Voer het script eenvoudig opnieuw uit om direct een bijgewerkte spreadsheet te genereren met handmatige verfijningen. Voor consistentie laat je ofwel geen bewerking, of bewerk je het gewenste Spots-object(en) voor alle monsters in een experiment.

Resultaten

De ruwe gegevens die met de software zijn verzameld, zijn opgeslagen in een openbare repository en zijn toegankelijk op de volgende DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Om het gebruik van deze semi-geautomatiseerde kwantificatiepijplijn te demonstreren, pasten we deze toe op een goed gevestigd Drosophila-model van PD met panneuronale expressie van menselijke α-synucleïne (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Besturingsvliegen huisvestten alleen de nSyb-QF2 driver. Beide genotypen werden 3 weken oud bij 29 °C, waarna de hersenen werden ontleed, geïnomineerd op TH en gefotografeerd voor het PAM-cluster. Zoals getoond in Figuur 3E, detecteerde de semi-geautomatiseerde pijplijn een significante vermindering van het aantal PAM TH⁺-neuronen bij α-synucleïne-expressieve vliegen vergeleken met controles (Student's t-test, p < 0,0001), wat aantoont dat de methode genotype-afhankelijke verschillen binnen dezelfde experimentele batch kan vastleggen. De volgende secties beschrijven de montageconfiguratie (Figuur 1), de Labkit-trainingsinterface (Figuur 2) en de beeldverwerkingsstappen (Figuur 3) die deze kwantificatie mogelijk maken.

Figuur 1 illustreert de montageconfiguratie van gedissecte Drosophila-hersenen en de impact daarvan op de beeldvorming van PAM-clusters. Na de dissectie vertonen hersenen af en toe buiging of kanteling van het weefsel naast het doorgesneden ventrale zenuwstreng. Deze opheffing aan het ventrale deel van de hersenen verandert het perspectief onder de stereoscoop, wat leidt tot een veranderde projectie van de stereotiepe groef in de dorsale contour en een verschil in het relatieve perspectief van de ventrale herkenningspunten. (Figuur 1B,C). Deze vervorming treedt vaak op op het moment dat de hersenen van het lichaam loskomen. Dergelijke vervorming beïnvloedt de oriëntatie van de PAM-cluster tijdens het monteren, wat de vereiste Z-stackdiepte beïnvloedt (Figuur 1C,D). Onder optimale montageomstandigheden zorgt de enkellagige Scotch tape-spacer voor een adequate compressie op het centrale hersengebied, waardoor het dorsaal gelegen PAM-cluster een horizontale oriëntatie direct naast de coverslip aanneemt. Deze configuratie levert Z-stacks van 15–25 sneden op intervallen van 0,34 μm op (Figuur 1D). In de andere situatie behoudt de PAM-cluster een gekantelde positie, waardoor diepere Z-stacks noodzakelijk zijn (Figuur 1D). Evenzo zorgt het gebruik van een dubbellaagse tapespacer niet voor voldoende compressie, waardoor de PAM-cluster in zijn eigene, gekantelde conformatie blijft en de Z-stackdiepte eveneens toeneemt (Figuur 1D). Figuur 1E toont representatieve laterale projectiebeelden van TH-gekleurde Z-stacks onder zowel optimaal gepositioneerde als gekantelde omstandigheden.

Figuur 2 toont de Labkit-gebruikersinterface en een representatieve trainingsworkflow. Met slechts een paar spaarzame krabbelaantekeningen op één sample (Figuur 2A) produceert de initiële pixelclassifier al een opmerkelijk redelijke segmentatie (Figuur 2B). Het is echter cruciaal te benadrukken dat zo'n minimale annotatie onvoldoende is voor robuuste, generaliseerbare prestaties over een gehele dataset. Aanzienlijk meer iteratieve labeling—die meerdere Z-slices, monsters en kleurvariaties omvat—is vereist om een classifier te genereren die TH⁺ -neuronen betrouwbaar segmenteert over de volledige dataset. Opvallend is dat de meerdere trainingsbeelden zijn aaneengesloten langs de tijds- (kader)dimensie in plaats van gestapeld langs de Z-as. Dit ontwerp behoudt de ruimtelijke integriteit van elk individueel hersenvolume, waardoor 3D-filterkernen uitsluitend binnen – en niet dwars – biologische monsters opereren. Als monsters in plaats daarvan verticaal in één dikke Z-stack zouden worden gestapeld, zouden Z-sneden aan de grenzen tussen aangrenzende monsters ruimtelijk aaneengesloten worden, waardoor voxels van verschillende hersenen als naburige structuren worden behandeld, wat het risico op onnodige handmatige correcties zou vergroten (Figuur 2C). Concatenatie langs de tijdsas voorkomt dergelijke kruismonsterbesmetting, terwijl efficiënte, meervoudige testtraining in één Labkit-sessie mogelijk blijft.

Figuur 3 illustreert de nabehandelingspijplijn en de uiteindelijke kwantificatie. Ruwe Labkit segmentatiemaskers (Figuur 3A) bevatten talrijke kleine vals-positieve vlekken en interne gaatjes. Na het toepassen van morfologische dedoisatie- en gatenopvullingsoperaties (Figuur 3B) wordt een gladde TH-oppervlakte geconstrueerd en gebruikt om een verfijnd binair masker te genereren (Figuur 3C). De verbetering die door deze verfijning is bereikt, wordt weergegeven als een overlay die de initiële en uiteindelijke maskers vergelijkt (Figuur 3D, boven). Opmerkelijk is dat sommige TH-rijke neurietgebieden af en toe in het uiteindelijke masker worden behouden; deze gebieden zijn echter vrijwel altijd vrij van DAPI-gekleurde kernen en dragen daarom verwaarloosbaar bij aan het uiteindelijke aantal neuronen. Gevorderde gebruikers kunnen de morfologische parameters in het meegeleverde batchverwerkingsscript verder aanpassen om de eliminatie van dergelijke residuele artefacten fijn af te stemmen. Figuur 3D (onder) toont de uiteindelijke DAPI-vlekken (magenta) die over het TH-kanaal (groen) zijn gelegd vanuit een maximale intensiteitsprojectie. Figuur 3D toont ook een zeldzaam type vals-positief dat af en toe in onze pijplijn wordt waargenomen: een DAPI-gekleurde kern die zich bevindt in een TH-rijke neurietregio kan ten onrechte worden geclassificeerd als een TH⁺-vlek wanneer het neurietsignaal sterk overlapt met de kern. Echter, zoals weergegeven in Figuur 3C, zijn DAPI-positieve kernen in de nabijheid van neurieten over het algemeen schaars. Bovendien blijven de weinige DAPI-signalen die nabij zulke neurietgebieden aanwezig zijn, vaak correct geclassificeerd als echte negatieven (d.w.z. niet geteld als TH⁺), omdat ze niet verkeerd worden geïdentificeerd door de pijpleiding. Figuur 3E toont het praktische nut van de methode: 3 weken oude nSyb-QF2>SNCA-vliegen vertonen een significante vermindering van PAM TH⁺ neuronentellingen vergeleken met nSyb-QF2-controles over meerdere filters (Student's t-test, p< 0,0001). Hoewel de absolute spottellingen kunnen variëren tussen verschillende filtercombinaties en de methode geen perfecte nauwkeurigheid voor één spot bereikt, blijft het relatieve verschil tussen experimentele en controlegroepen robuust. Voor meerdere geteste filters blijft het statistische resultaat van groepsvergelijking grotendeels behouden tussen filters binnen dezelfde experimentele batch. Daarom moet de output worden geïnterpreteerd als een vergelijkende uitlezing binnen de batch in plaats van als een foutloze absolute telling van PAM-neuronen.

Figuur 1. Drosophila hersendissectie en montageconfiguratie. (A) Schematisch diagram van de hersenmontage. Gele balken stellen Scotch tape afstandhouders voor. Een vergroot hersenschema geeft de geschatte locatie van het PAM-cluster aan (paars). (B) Laterale dwarsdoorsnedeschema's die overeenkomen met het stippelvlak in A die twee veelvoorkomende hersenmorfologieën na dissectie weergeven: optimaal gepositioneerd (boven) en gekanteld (onder). (C) Twee dissecte vliegenhersenen bekeken onder een stereoscoop: optimaal gepositioneerd (links) versus gekanteld (rechts). Gele pijlen geven de stereotiepe groef langs de dorsale contour aan. Blauwe stippellijnen verbinden twee overeenkomstige herkenningspunten aan de linker- en rechterzijde van de ventrale helft. Blauwe pijlen benadrukken de resulterende verschuiving in het relatieve perspectief van deze ventrale herkenningspunten. Schaalbalk = 500 μm. (D) Schematische illustratie die laat zien hoe hersenmorfologie en dikte van de tapespacer (enkel- versus dubbellaag) de verticale positionering van het PAM-cluster beïnvloeden en daarmee de vereiste Z-stackdiepte. (E) Representative laterale aanzichten (Y-projectie) van TH-gekleurde confocale Z-stacks vanuit optimaal gepositioneerde (bovenste) en vervormde (onderste) montageomstandigheden. Schaalbalk = 5 μm. Afkorting: PAM = protocerebraal anterior mediaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Labkittraining en interactieve segmentatie. (A) Labkit grafische gebruikersinterface. Annotaties (krabbels) worden weergegeven in twee klassen: voorgrond (rood) en achtergrond (blauw). (B) Segmentatieresultaat dat direct na training wordt gegenereerd op de krabbels die in A worden getoond. Rood geeft de kleur van de voorgrond aan; Blauw geeft de achtergrondkleur aan. Schaalbalk = 5 μm. (C) Kruispraat tussen aangrenzende Z-sneden. Enkelvoudige plaatjes van fluorescerende, eiwitgelabelde mitochondriën uit verschillende vliegenhersenen werden langs de Z-as geconcateneerd. Slices 1 en 3 zijn identieke kopieën van hetzelfde beeld, terwijl slices 2 en 4 afkomstig zijn uit verschillende hersenen. Gele pijlen, voorspelling sijpelt door van stuk 2 naar snee 1. Groene pijlen, voorspelling sijpelde door van stuk 4 naar stuk 3. Schaalbalk = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Nabehandeling van Labkit-segmentatiemaskers en TH⁺ neuronkwantificatie. (A) Rauw Labkit binair masker (cyaan, boven) en overlay met het originele TH-kanaal (onder). Let op overvloedige kleine vlekken en onvolledige vulling van neuronale cellichamen. (B) Masker na morfologisch denoisatie en gatopvulling (magenta, boven); overlay met TH-kanaal (onder). (C) Verfijnde binaire maskering (rood, boven) van een gladgemaakt TH-oppervlak voor B en hermaskering; overlay met TH-kanaal (onder). (D) Bovenkant: Overlay van ruwe (cyaan) en verfijnde (rode) maskers, waarbij gebieden worden gemarkeerd die door nabewerking zijn gecorrigeerd. Lager: Maximale intensiteitsprojectie met de laatste DAPI-vlekken (magenta) gesuperponeerd op het TH-kanaal (groen). Let op dat de twee vlekken in de rechterbovenhoek afkomstig zijn van de contralaterale PAC-cluster. Filter 4 werd gebruikt voor illustratie. (E) Kwantitatieve validatie in een Parkinson-model met meerdere filtercombinaties. Drie weken oude nSyb-QF2>SNCA (PD-model) vliegen vertonen een significante vermindering van het aantal PAM TH⁺ neuronen vergeleken met nSyb-QF2 controles in meerdere filters (boven). Ruwe data wordt geleverd in een spreadsheet (onderaan). filter 1: 1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" onder 0.0001']; filter 2: 1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5, "Intensiteit Gemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0,001']; filter 3: 1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensity Mean Ch=aSizeC+2" onder 0.01']; filter 4: 1.2, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteit Gemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0.05']; filter 5: 0,6, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteit Gemiddelde Ch=aGrootteC+2" onder 0,001']; filter 6: 0,6, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteit Gemiddelde Ch=aGrootteC+2" onder 0,01']; filter 7: 0,9, ['"Kwaliteit" boven 94,5,"Intensiteit Gemiddelde Ch=aSizeC+2" onder 0,01']; n = 57 hersenen (controle), n = 65 hersenen (PD); T-test van de leerling, p < 0,0001 (****). Vliegen werden gekweekt bij 29 °C. Schaalbalken = 5 μm (A–D). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend Dossier 1. Fiji macro om het TH-kanaal te splitsen uit geconverteerde afbeeldingsbestanden en de uitvoerstacks op te slaan.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2. Fiji-macro om trainings-Z-stacks te croppen tot een gemeenschappelijke Z-slice-diepte en deze samen te voegen tot een time-lapse TIFF-bestand voor Labkit-classifiertraining.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3. Vooraf getrainde Labkit-classifier gebruikt voor het testen van de PAM TH-segmentatieworkflow.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 4. MATLAB-script voor batchverwerking van Labkit-maskers, het genereren van DAPI-spots, het toepassen van filtercombinaties en het exporteren van TH⁺ neuronentellingen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Kwantificering van DA-neuronen in het Drosophila PAM-cluster is historisch gezien een formidabele uitdaging geweest. Hier presenteren we een semi-geautomatiseerde workflow die machine learning-gebaseerde pixelclassificatie integreert met beeldanalysesoftware om dit langlopende probleem aan te pakken. Deze methode maakt batch-niveau detectie mogelijk van variaties in TH^+- neuronen in de PAM-cluster binnen groepen binnen hetzelfde experiment, wat vergelijkende studies in Parkinson's disease-modellen¹⁸ ondersteunt.

Bij het selecteren van het optimale filter voor een bepaald experiment kunnen gebruikers ofwel het filter kiezen dat het beste overeenkomt met visuele inspectie van de ruwe beelden, of verwijzen naar het gerapporteerde bereik en/of gemiddelde van wildtype PAM-neuronen in de literatuur^12,13. Toch is voorzichtigheid geboden: slechts twee studies hebben PAM clustertellingen gerapporteerd, geen van beide is PD-gerelateerd, en de gerapporteerde waarden tonen aanzienlijke inconsistentie. Bovendien kan de standaardafwijking toenemen met de leeftijd, wat kruisvergelijkingen verder bemoeilijkt. Daarom moet literatuurgebaseerde referentie alleen als ruwe richtlijn worden gebruikt, niet als absolute norm. We erkennen dat deze pijplijn geen foutloze absolute tellingen oplevert (Figuur 3D). Zolang vergelijkingen beperkt blijven tot groepen binnen dezelfde experimentele batch (d.w.z. data niet over verschillende batches in één plot worden gebundeld), kan de methode worden gebruikt om relatieve verschillen tussen genotypen of behandelingscondities binnen een batch te detecteren.

Uit onze ervaring moeten AF488-geconjugeerde secundaire antilichamen worden vermeden vanwege een hoge achtergrond, en AF546 vanwege een hogere signaaldemping langs de Z-as. We ontdekten ook dat grondige DAPI-incubatie en -washing cruciaal zijn voor het bereiken van een hoge signaal-ruisverhouding en duidelijke nucleaire signalen, wat direct invloed heeft op de prestaties van geautomatiseerde segmentatie. DAPI is voor deze toepassing te verkiezen boven Hoechst, omdat de voorkeurskleuring van heterochromatine helderdere en scherper gedefinieerde nucleaire vlekken oplevert, wat nauwkeurigere detectie mogelijk maakt.

Probleemoplossingsdiscussie voor veelvoorkomende faalmodi

Vlekken door kleuring. Dissectievaardigheid is een belangrijke factor voor datakwaliteit. De PAT-cluster bevindt zich oppervlakkig en wordt gemakkelijk beschadigd bij het verwijderen van de twee tracheale zakken en het vetlichaam dorsaal in dit gebied. Een tang moet voorzichtig worden behandeld om piercing of compressie van het PAM-gebied te voorkomen. Ventrale vervorming treedt vaak op op het moment dat het ventrale zenuwkoord wordt doorgesneden, waardoor de hersenen kantelen of krommen wanneer ze op een glazen preparaat worden geplaatst; deze vervorming kan na PFA-incubatie permanent worden gefixeerd. Gebruikers moeten experimenteren met tanghoeken tijdens het doorsnijden om een optimale techniek te vinden. Als er na dissectie kanteling wordt waargenomen, kan zachte druk op het verhoogde gebied de vervorming omkeren (acceptabel als het samengeperste gebied niet het interessegebied is).

Segmentatiefouten. Slechte segmentatie ontstaat meestal door onvoldoende diverse trainingsdata. De Labkit-classifier moet worden getraind op een representatieve set beelden die het volledige spectrum van kleurkwaliteit binnen de batch beslaan, inclusief beste, gemiddelde en slechtste. Tijdens iteratieve correctie geef je prioriteit aan het annoteren van valse positieven en vals-negatieven waar je zeker van bent. Vermijd het corrigeren van ambigue of onzekere gebieden, omdat dit de classifier kan misleiden en de prestaties kan verslechteren.

Spotdetectiefouten. Parameteroptimalisatie vereist systematische verkenning van een kleine subset van representatieve steekproeven. Test verschillende geschatte spotdiameters en kwaliteitsfilterdrempel, of zelfs filtertypes buiten het "Quality above"-filter dat in dit protocol wordt gebruikt. De spot-creatiewizard biedt verschillende filteropties (bijv. intensiteit). Gebruikers worden aangemoedigd filterdrempels en -typen aan te passen aan hun specifieke dataset en empirische afstemming uit te voeren vóór batchverwerking.

Waarom blijft handmatig tellen van PAM-clusterneuronen uitzonderlijk moeilijk? Het PAM-cluster vertoont unieke anatomische en kleuringskenmerken die traditionele handmatige telmethoden onvoldoende maken. Ten eerste labelt TH-immunofluorescentie in het cytosol van Drosophila dopaminerge neuronen voornamelijk een dunne cytoplasmatische ring rond een grote, ongekleurde nucleaire leegte. Daardoor vertonen de door DAPI gekleurde kern en het TH⁺ cytoplasmatisch compartiment minimale ruimtelijke overlap. Dit fundamentele gebrek aan colocalisatie sluit de directe classificatiestrategie van "DAPI-spot binnen TH-masker" uit. Ten tweede bestaat het PAM-cluster uit meer dan 100 dicht opeengepakte neuronen die zijn gerangschikt in een driedimensionale, druifachtige architectuur. Terwijl men door confocale Z-stacks navigeert, verschijnen en verdwijnen neuronen geleidelijk—sommige komen het vlak binnen, andere verlaten het vlak—wat een hoge cognitieve belasting en aanzienlijke variabiliteit tussen waarnemers oplevert. De meest recente studie die PAM DA-neuronen kwantificeerde, maakte gebruik van handmatig tellen met behulp van de cell-counter plugin van ImageJ. Hoewel deze aanpak volledig geschikt is voor kleinere clusters zoals PPM1/2 of PPL1, wordt deze aanpak onbetaalbaar arbeidsintensief wanneer deze wordt toegepast op de PAM-cluster, vooral in studies die tientallen of honderden monsters vereisen.

Waarom is de random forest-architectuur van Labkit bijzonder geschikt voor segmentatie van TH-neuronen? Labkit implementeert een willekeurige, bosgebaseerde pixelclassifier die uitzonderlijk goed is aangepast aan de specifieke uitdagingen van TH-gekleurde PAM-clusterbeelden. Het algoritme berekent een uitgebreide featurevector voor elke pixel door een cascade van transformatiefilters toe te passen, waaronder Gaussische blur, verschil van Gaussiaanse gradiënt, Gaussiaanse gradiëntgrootte, Laplaceiaan van Gaussische en Hessische eigenwaarden — elk geëvalueerd op meerdere sigma-schalen (1, 2, 4, 8). Deze multi-scale feature-extractie vangt effectief de textuur- en randkenmerken die het nucleaire interieur onderscheiden van de extracellulaire achtergrond. Belangrijk is dat, omdat willekeurige bossen vele malen minder trainingsdata vereisen dan deep learning-benaderingen, gebruikers de classifier iteratief kunnen verfijnen met spaarzame krabbelannotaties op slechts 20–40 representatieve afbeeldingen. Elke iteratie voegt nieuwe beslissingsbomen toe aan het ensemble, die gezamenlijk stemmen om elke pixel te classificeren. Dit proces houdt inherent rekening met batch-tot-batch variabiliteit in kleurings- en beeldvormingscondities—een cruciaal voordeel gezien de biologische variabiliteit die inherent is aan genetische kruisingen en verouderingsstudies van Drosophila . Met deze benadering kan TH⁺ neuronverlies in α-synucleïne-expressieve Parkinson-modellen worden gedetecteerd, en kunnen de effecten van genetische versterkers en suppressors op het aantal PAM-clusterneuronen binnen een experimentele batch worden vergeleken.

Belangrijk is dat voor het trainingsdoel de bijgesneden stapels langs de tijdsdimensie worden gekoppeld in plaats van langs de Z-as. Deze ontwerpkeuze is cruciaal voor optimale classifier-training. Labkit's 3D-pixelclassificatie houdt rekening met voxelinformatie over opeenvolgende Z-slices, wat essentieel is voor het nauwkeurig onderscheiden van de dunne, cytoplasmatische TH-ring die de morfologie van de PAM-neuronen definieert. Als de individuele monsters in plaats daarvan verticaal in één enkele, ultradikke Z-stack zouden worden gestapeld, zouden de Z-slices aan de grenzen tussen aangrenzende samples ruimtelijk aaneengesloten worden in de stack. Daardoor zouden voxels die tot verschillende biologische monsters behoren worden behandeld als naburige structuren binnen hetzelfde driedimensionale volume. Tijdens interactieve training kan een krabbel die dicht bij zo'n grens wordt getekend per ongeluk kenmerken van twee verschillende monsters tegelijk vastleggen, waardoor de classifier (Figuur 2B, pijlen) in verwarring raakt. Bovendien kunnen vals-positieve signalen afkomstig van één monster projecteren in het volume van het aangrenzende monster, wat resulteert in foutieve correctieve krabbels die zich voortplanten via latere trainingsiteten en beslissingsbomen genereren die biologisch betekenisloze regels coderen. Het samenvoegen van monsters langs de tijdsas behoudt de ruimtelijke integriteit van elk individueel volume, waardoor de 3D-filterkernen uitsluitend binnen – niet dwars – biologische monsters kunnen werken, terwijl efficiënte, multi-sample training in één Labkit-sessie mogelijk is.

Methodologische overwegingen en beperkingen

Verschillende belangrijke kanttekeningen verdienen discussie. Ten eerste is dit protocol specifiek geoptimaliseerd voor de PAM-cluster en kan het niet generaliseren naar andere DA-clusters (bijv. PPM1/2/3, PPL1) of naar TH^+- neuronen in de ooglobben. De PAM-regio profiteert van relatief geringe DAPI-dichtheid, met kernen goed gescheiden in driedimensionale ruimte, wat robuuste en ondubbelzinnige DAPI-spotdetectie mogelijk maakt. Daarentegen is deze workflow niet gemakkelijk overdraagbaar naar andere DA-clusters zoals PPL1 of PPM1/2. In die regio's liggen neurieten vaker naast of overlappen met DAPI-gekleurde kernen van niet-DA-cellen. Gezien het zeer lage basisaantal DA-neuronen in deze kleine clusters (vaak minder dan 10 cellen per cluster), kunnen zelfs een paar verkeerde classificaties leiden tot proportioneel grote fouten, waardoor de methode minder betrouwbaar is voor dergelijke toepassingen. Ten tweede labelt TH-immunokleuring ook neurieten en axonale projecties binnen de neuropil. Ondanks corrigerende aantekeningen tijdens de training produceren deze vezelbanen soms sterke TH-signalen en kunnen ze door de classifier verkeerd als voorgrond worden geclassificeerd. Deze gebieden in het PAM-cluster zijn echter vrijwel altijd vrij van DAPI-gekleurde kernen; dus droegen vals-positieve voxels in het neurietrijke gebied van het PAM-cluster minimaal bij aan het uiteindelijke aantal neuronen. Ten derde werkt de pixelclassificatie van Labkit op lokale textuurkenmerken binnen een eindige buurt (standaard filterkernels reageren op ongeveer 16 × 16 pixelvensters). Dit ontwerp zorgt voor rekenkundige efficiëntie en maakt realtime interactieve segmentatie mogelijk, maar betekent ook dat de classifier geen globale anatomische context kan benutten. Daarom kunnen zeldzame artefacten of onregelmatigheden in kleuring die aanzienlijk afwijken van de trainingsset een geval-tot-geval curatie vereisen. Ten slotte genereert de hier beschreven batchverwerkingspijplijn—waarbij Labkit-segmentatie wordt geïntegreerd met DAPI-spotdetectie en afstandstransformatie—meerdere uitvoerkanalen en filtercombinaties. Gebruikers moeten systematisch de optimale filterparameters valideren voor hun specifieke experimentele voorwaarden in plaats van kritiekloos de standaarddrempels uit dit protocol te hanteren.

Toekomstige toepassingen

Naast het hier getoonde PD-model kan deze semi-geautomatiseerde pijplijn direct worden toegepast op elk Drosophila-model waarbij PAM-cluster DA-neuronen worden gekwantificeerd, inclusief studies naar leren en geheugen, motivatie, slaapregulatie en leeftijdsgebonden neurodegeneratie. Specifiek kan de batchverwerkingscapaciteit van deze methode het geschikt maken voor: (1) Middel- tot hoge doorvoer-geneesmiddelscreenings: Het testen van meerdere neuroprotectieve verbindingen over verschillende doseringen wordt haalbaarder zonder een evenredige toename van de handmatige telinspanning. (2) Genetische modificatorscreenings: Kwantificatie van PAM-neuronen in honderden genetische kruisingen (bijv. RNAi-lijnen, overexpressielijnen) om versterkers of suppressoren van toxiciteit van α-synucleïne te identificeren. (3) Longitudinale verouderingsstudies: Het volgen van het verlies van PAM-neuronen over meerdere tijdspunten met verminderde handmatige telbelasting. Bovendien is de segmentatieworkflow op Labkit niet beperkt tot TH-kleuring; met passende hertraining kan het worden aangepast om andere neuronale populaties in de Drosophila-hersenen te kwantificeren, mits zij twee belangrijke kenmerken delen met de PAM-cluster: een relatief lage dichtheid van DAPI-gekleurde kernen en minimale interferentie door neurietkleuring. Naast Labkit en de hier gebruikte 3D-software kan de algemene logica van deze pijplijn—machine learning-gebaseerde pixelclassificatie gevolgd door spotdetectie en afstandstransformatie—worden geïmplementeerd in andere ondersteunde 3D-beeldanalyseplatforms, waardoor de toegankelijkheid en flexibiliteit voor de bredere onderzoeksgemeenschap toenemen.

Samenvattend presenteren we een semi-geautomatiseerde workflow voor het detecteren van groepsverschillen in het aantal TH⁺-neuronen van de PAM-cluster. Door Labkit-gebaseerde pixelclassificatie te combineren met spotdetectie en afstandstransformatie, maakt deze methode het mogelijk om het aantal TH⁺-neuronen tussen experimentele en controlegroepen binnen dezelfde batch te vergelijken, terwijl de last van handmatig tellen wordt verminderd naarmate de steekproefgrootte toeneemt. Schalen van tientallen naar honderden samples verhoogt de rekentijd proportioneel, maar de extra handmatige inspanning beperkt zich voornamelijk tot bestandsorganisatie en kwaliteitscontrole. Hoewel de PAM-cluster tot nu toe weinig aandacht heeft gekregen in PD-onderzoek, komt dit grotendeels door technische beperkingen en niet door biologische irrelevantie. Door een praktisch kwantificeringsinstrument te bieden, zal ons protocol in de toekomst het onderzoek vergemakkelijken naar de vraag of en hoe PAM-neuronen degenereren in PD-modellen en hun potentiële bijdrage aan niet-motorische symptomen, zoals reuktekorten en motivatieverval, onderzoeken. We verwachten dat dit protocol batch-niveau vergelijkende studies naar dopaminerge neurodegeneratie, synaptische plasticiteit en neuroprotectieve geneesmiddelscreening in het Drosophila-modelsysteem zal faciliteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3D image processing software - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	3D image analysis software gebruikt in dit onderzoek
4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Bloomington Drosophila Stock Center	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Bloomington Drosophila Stock Center	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Dumont pincet Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Electron Microscopy Sciences	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 confocal	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed secundair antilichaam, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Minutiennaalden, roestvrij staal, 0,15 mm diameter	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Normaal geitenserum, gelyofiliseerd vast	Sigma-Aldrich	566380
Numerieke computing software - Python	Python	3.8+
Numerieke computing software - Matlab	Mathwork	R2016a+	Numerieke computing software gebruikt in dit onderzoek
Octylfenol Ethoxylaat (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Paraformaldehyde-oplossing 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Polystyreen celcultuurschaal	Nest Scientific	706001
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
Konijn anti-Tyrosine Hydroxylase (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Natriumaziet	Sigma-Aldrich	S2002
Stereoscoop	Olympus	SZ51
Sterican Einmalkanülen 27 G grau 0,40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Spuit, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Transparante kleefband	3M Scotch 600, helder	600