$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Overzicht van de analyseworkflow
Het algemene ontwerp van de transcriptomische en machine learning-gebaseerde analyse van deze studie wordt geïllustreerd in Figuur 1, met belangrijke stappen: verzameling van genen gerelateerd aan het Renin-Angiotensine-systeem (RASRG's); screening van RAS-gerelateerde differentieel tot expressie gebrachte genen (RASRDEGs) uit hypertensiedatasets; functionele verrijkingsanalyse (GO/KEGG/GSEA); immuuninfiltratieanalyse (CIBERSORT); de constructie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) en regulatienetwerken; machine learning gebaseerde sleutelgenselectie (logistische regressie, random forest [RF]); en evaluatie van het hypertensie diagnostisch model. Een volledige lijst van software, databases en online tools die in deze studie zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaloverzicht.
Datadownload
Hypertensiedatasets GSE753608 en GSE74144 (Homo sapiens) werden verkregen via het R-pakket GEOquery9 uit de GEO-database10. GSE75360 afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen (platform: GPL10558) omvatten 10 hypertensie- en 11 controlemonsters; GSE74144 afkomstig van witte bloedcellen (platform: GPL13497) omvatten 14 hypertensie- en 8 controlemonsters (Tabel 1). Eiwitcoderende RASRG's (1.264) werden aanvankelijk geïdentificeerd via GeneCards11 (trefwoord: "Renin-Angiotensin System") en PubMed (trefwoord: "Renin-Angiotensin System")12,13. De kruising van deze RASRG's met genen in GSE75360/GSE74144 leverde 1.159 uiteindelijke RASRG'sop, 14. De twee datasets werden afzonderlijk verwerkt omdat ze op verschillende microarrayplatforms waren gegenereerd. Probe-annotatie werd uitgevoerd volgens de bijbehorende GPL-platformannotatiebestanden, en genormaliseerde genexpressiematrices werden gebruikt voor downstream-analyses. Boxplots werden gebruikt om expressieverdelingen voor en na normalisatie te vergelijken.
Hypertensie-gerelateerde renine-angiotensine-gerelateerde differentieel tot expressie gebrachte genen
Monsters in de GSE75360 dataset werden gecategoriseerd in de hypertensiegroep en controlegroep. De limma-software werd gebruikt om differentiële genexpressie-analyse uit te voeren tussen de twee groepen14, waarbij differentieel tot expressie gedrukte genen (DEGs) werden geïdentificeerd door de drempel van |logFC| > 0,45 en p-waarde < 0,05. De resultaten van deze differentiële analyse werden weergegeven via vulkaangrafieken (gegenereerd met het R-pakket ggplot2).
Om RASRDEGs te verkrijgen, werden DEG's die aan bovenstaande drempel voldeden (|logFC| > 0,45, p-waarde < 0,05) gekruist met RAS-gerelateerde genen (RASRG's), en het doorsneeresultaat werd gepresenteerd via een Venn-diagram. Vervolgens werden de expressiepatronen van de geïdentificeerde RASRDEG's weergegeven als een heatmap met behulp van de R-pakket pheatmap, en werd de chromosomale lokalisatie van RASRDEGs weergegeven via chromosoomkaarten die werden gegenereerd met het R-pakket RCircos15.
Differentieel expressieve genvalidatie en ROC-curveanalyse
Er werd een intergroepgrafiek gemaakt om RASRDEG-expressieverschillen tussen hypertensie/controle in GSE7536016 te analyseren, waarbij R-pakket pROC werd gebruikt om ROC-curves te tekenen en AUC te berekenen (0,5–0,7: lage nauwkeurigheid; 0,7–0,9: gematigd; >0,9: hoog) voor de diagnostische effectiviteit van RASRDEG.
Correlatieanalyse
Spearmans correlatieanalyse werd uitgevoerd op RASRDEG-expressie in GSE75360; de resultaten werden gevisualiseerd via heatmap (R-pakket ggplot2) (|r| < 0,3: geen/zwakke correlatie; 0,3–0,5: zwak; 0,5–0,8: gematigd; >0,8: sterk).
Verrijkingsanalyse van GO en KEGG
GO (Gene Ontology, 2024 release, http://geneontology.org/) is een veelgebruikte bron voor grootschalige functionele verrijking, die drie domeinen bestrijkt: biologische processen (BP), cellulaire componenten (CC) en moleculaire functies (MF)17. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Release 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) slaat gegevens op over genomen, biopathways, ziekten en geneesmiddelen18.
RASRDEG's werden onderworpen aan GO-annotatie en KEGG-routeverrijkingsanalyse met behulp van het R-pakket clusterProfiler19. Verrijkingstestmethode: hypergeometrische test; Meervoudige testcorrectiemethode: Benjamini-Hochberg (BH) methode. Screeningscriterium: aangepaste p-waarde < 0,05.
Analyse van genensetverrijking (GSEA)
Voor cohortniveau GSEA werden alle genen die werden getest in de differentiële expressieanalyse van GSE75360 gerangschikt in aflopende volgorde volgens logFC en gebruikt als inputgenlijst voor clusterProfiler19. Er werd geen DEG-voorfiltering toegepast vóór GSEA. De c2-genenverzameling van MSigDB20. Parameters: zaad = 2022, 10–500 genen per set; screeningscriteria: gecorrigeerd p < 0,05 (Benjamini-Hochberg, BH-methode), FDR < 0,2521.
Constructie van hypertensie diagnostisch model
Om belangrijke genen die met hypertensie geassocieerd zijn te identificeren, gebruikten we twee soorten machine learning-algoritmen: logistische regressie en random forests (RF). Logistische regressie (binaire afhankelijke variabele: hypertensie/controle) screende RASRDEGs met p < 0,05. Random Forest (RF, R-pakket randomForest): parameters set.seed(520), ntree = 1000; MeanDecreaseGini (variabele belangrijkheidsindicator) werd geëxtraheerd en de top 15 RASRDEG's werden geselecteerd. RASRDEG's werden gescreend met een p-waarde < 0,05 als standaard.
Het RF (Random Forest) algoritme, een ensemble-leermethode onder de categorie Bagging (waarbij meerdere beslissingsbomen worden geïntegreerd), werd toegepast via het R-pakket randomForest22 (parameters: set.seed(520), ntree = 1000). MeanDecreaseGini (die variabele belangrijkheid weerspiegelt door de gemiddelde zuiverheidsafname tijdens knoopsplitsing) van featuregenen werd geëxtraheerd en de top 15 RASRDEGs werden geselecteerd. Ten slotte werd een Venn-diagram van genen gescreend door logistische regressie en RF uitgezet om hypertensie-gerelateerde sleutelgenen te identificeren.
Validatie van het diagnostisch model voor hypertensie
Er werd een logistisch regressiemodel gebouwd op basis van belangrijke genen; Lineaire voorspelde waarde (η) werd berekend als:
Het R-pakket pROC16 werd gebruikt om ROC-curves te tekenen en de effectiviteit van het model bij het voorspellen van hypertensierisico te evalueren. Een nomogram werd geconstrueerd via het R-pakket rms23 om de bijdrage van elk sleutelgen aan het logistische regressiemodel te visualiseren (wat de associatie tussen sleutelgenen en hypertensierisico weerspiegelt). Kalibratiecurves werden gegenereerd om de consistentie tussen voorspelde en werkelijke hypertensiekansen te beoordelen; Beslissingscurveanalyse (DCA, R-pakket ggDCA24) werd uitgevoerd om het klinische nut (nettovoordeel) van het model in GSE75360 en GSE74144 te evalueren.
Enkel-gen GSEA
GSEA onderzoekt de rol van genen die geassocieerd zijn met een specifiek gen in biologische processen/routes/ziekten door de expressie ervan te analyseren, wat helpt bij het begrijpen van de functionele rol van het gen. Voor elk focaal gen in GSE75360 werden monsters op de mediaan verdeeld in groepen met hoge en lage expressie. Daarna werd differentiële expressieanalyse uitgevoerd over alle geteste genen, en genoombrede logFC-waarden werden vóór GSEA met clusterProfiler19 van hoog naar laag gerangschikt. Er werd geen DEG-voorfiltering toegepast vóór GSEA. Parameters: zaad = 2020, 10–500 genen per set (c2 genenverzameling van MSigDB21). Screeningscriteria: p < 0,05 (adj. p gecorrigeerd met BH-methode).
Immuuninfiltratieanalyse (CIBERSORT)
Het CIBERSORT-algoritme25 (gebaseerd op lineaire ondersteuningsvectorregressie) deconvoluteerde de transcriptoommatrix om de samenstelling van immuuncellen in gemengde monsters te schatten (gegevens met immuuncelverrijkingsscore > 0 werden geselecteerd). De uiteindelijke immuuncelinfiltratiematrix van GSE75360 werd weergegeven via een proportiestaafdiagram. Spearmans correlatie werd gebruikt om immuuncel-immuuncel- en sleutelgen-immuuncelassociaties te analyseren, met resultaten gepresenteerd als respectievelijk een correlatie-heatmap (R-pakket pheatmap) en correlatiebubbelplot (R-pakket ggplot2).
Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk
PPI-netwerken zijn systemen van onderling verbonden eiwitten die biologische processen reguleren via interacties. Met behulp van de STRING-database26 werd een PPI-netwerk voor sleutelgenen opgebouwd (minimale interactiescore: 0,150, laag vertrouwen). Renin-angiotensine-gerelateerde hubgenen werden geselecteerd door screening van interacterende genen. De GeneMANIA-database27, die functioneel vergelijkbare genen identificeert met behulp van genomische en proteomische datasets, werd gebruikt om functioneel vergelijkbare genen van belangrijke RAS-genen te voorspellen en om een eiwitinteractienetwerk op te bouwen.
Constructie van regelgevend netwerk
mRNA-TF netwerk: Transcriptiefactoren (TF's) reguleren genexpressie via post-transcriptionele interactie met doelgenen. TF's die zich richten op hubgenen en hun regulatierelaties werden opgehaald uit de ChIPBase-database28, en het mRNA-TF-netwerk werd gevisualiseerd met behulp van Cytoscape29.
mRNA-miRNA netwerk: miRNA's moduleren meerdere doelgenen (enkele doelen kunnen worden gecoreguleerd door meerdere miRNA's). StarBase v3.030 werd gebruikt om miRNA's te identificeren die geassocieerd zijn met RASRDEG's, en het mRNA-miRNA-netwerk werd visualiseerd via Cytoscape.
mRNA-geneesmiddelnetwerk: Toxicogenomische databases31 werden gebruikt om directe/indirecte geneesmiddeldoelen van hubgenen te voorspellen. Het mRNA-geneesmiddelennetwerk (met gen-geneesmiddelinteracties) werd met Cytoscape gevisualiseerd om de netwerkconstructie te voltooien.
Ang II-geïnduceerd HUVEC-model
Menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs) werden op 37°C gehouden in een bevochtigde broedmachine met 5%CO2. Cellen werden in een volledig endotheliale celkweekmedium gehouden, aangevuld met foetaal rundserum en antibiotica volgens de instructies van de leverancier. Om een in vitro model voor endotheelletsel gerelateerd aan hypertensie op te zetten, werden HUVEC's 48 uur lang behandeld met angiotensine II (Ang II; 100 nM). Voertuigbehandelde cellen werden als controlegroep gebruikt.
Voor geninterventie-experimenten werden kleine interfererende RNA's gericht op CST3 of FURIN (si-CST3 en si-FURIN), overeenkomstige negatieve controle siRNA (si-NC), CST3- of FURIN-overexpressieplasmiden (oe-CST3 en oe-FURIN), en de bijbehorende lege-vector controle (oe-NC) getransfecteerd in HUVECs met behulp van een commercieel transfectie-reagens volgens het protocol van de fabrikant. Na transfectie werden cellen blootgesteld aan Ang II en vervolgens geoogst voor expressievalidatie en functionele tests. Knockdown- en overexpressie-efficiënties werden bevestigd door qRT-PCR en western blotting.
qRT-PCR
Totaal RNA werd geïsoleerd uit HUVEC's met een standaard RNA-extractiereagens, en complementair DNA werd gegenereerd met behulp van een reverse transcriptiekit. SYBR Green-chemie werd gebruikt voor qRT-PCR. Expressieniveaus van LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G, TBXAS1, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 en eNOS werden genormaliseerd tot GAPDH en berekend met de 2−ΔΔCt-methode .
Westelijke verplettering
Voor western blot-analyse werden eiwitten geëxtraheerd met een RIPA-lysisbuffer en gekwantificeerd met behulp van een BCA-assay. Gelijke eiwithoeveelheden werden opgelost door SDS-PAGE en overgedragen aan PVDF-membranen. Na blokkering werden membranen geïncubeerd met primaire antilichamen tegen CST3, FURIN, TBXAS1 of GAPDH en vervolgens met geschikte secundaire antistoffen. Banden werden gedetecteerd door chemiluminescentie en de densitometrie werd genormaliseerd tot GAPDH. Afgescheiden CST3 in kweeksupernatanten werd gekwantificeerd met een ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
Cellevensvatbaarheid
De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Kort gezegd werden getransfecteerde en met Ang II behandelde HUVEC's in 96-wellplaten gezaaid, en werd de absorptie bij 450 nm gemeten bij 0, 24, 48 en 72 uur na toevoeging van het CCK-8 reagens. Celmigratie werd geëvalueerd met behulp van Transwell-kamers. Na de aangegeven interventies werden cellen in de bovenste kamers geplant, en gemigrerde cellen op het onderste membraanoppervlak werden gefixeerd, gekleurd en geteld onder een microscoop in willekeurig geselecteerde velden.
Ontstekingstest
Om inflammatoire activatie, oxidatieve stress en endotheelfunctie te evalueren, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 en eNOS.mRNA-niveaus werden gedetecteerd met qRT-PCR. De stikstofoxideniveaus (NO) in de kweeksupernatant werden gemeten met een commerciële NO-assaykit, en de intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) werden gedetecteerd met DCF-fluorescentie volgens de instructies van de fabrikant.
Statistische analyse
Transcriptomische verwerking en modellering werden uitgevoerd in R. Continue variabelen werden beoordeeld op normaliteit met de Shapiro-Wilk test. Voor tweegroepsvergelijkingen werden onafhankelijke steekproeven t-tests gebruikt voor normaal verdeelde variabelen, terwijl Wilcoxon rangsomtesten werden gebruikt voor niet-normale variabelen. Voor drie of meer groepen werd eenrichtingsanalyse van variantie met passende post hoc testen gebruikt wanneer aan normaliteits- en homogeniteitsvariantie-aannames was voldaan; anders werd de Kruskal-Wallis-test toegepast. CCK-8 tijdverloopgegevens werden geanalyseerd met behulp van tweerichtingsanalyse van variantie. Spearman-correlatiecoëfficiënten werden berekend voor associatie-analyses. Tenzij anders vermeld, worden experimentele resultaten weergegeven als gemiddelde ± SD, en tweezijdige p < 0,05 werd als significant beschouwd.