Tunnelbehandeling en milieuverrijking voor herhaalde plethysmografie van het hele lichaam bij muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft tunnelbehandelingen en omgevingsverrijkingsprocedures voor herhaalde plethysmografie van het hele lichaam om stressgerelateerde ademhalingsvariabiliteit tijdens longitudinale studies bij muizen te verminderen.

Samenvatting

Herhaalde plenthysmografie van het hele lichaam (WBP) wordt veel gebruikt voor longitudinale beoordeling van de ademhalingsfunctie bij muizen. Echter, door het hanteren veroorzaakte stress kan fysiologische variabiliteit introduceren die de behandelingseffecten verstoort en de experimentele reproduceerbaarheid vermindert. Traditionele methoden voor het hanteren kunnen aanhoudende stressreacties en slechte habituatie veroorzaken tijdens herhaalde sessies, wat mogelijk de experimentele uitkomsten beïnvloedt. Dit protocol beschrijft verfijnde behandelings- en huisvestingsmethoden waarbij tunnelbehandeling en milieuverrijking worden geïntegreerd voor herhaalde WBP-sessies. Zes wilde type 129S1/SvImJ muizen (3 mannetjes, 3 vrouwtjes) kregen tunnelbehandeling en continue milieuverrijking gedurende een studie van 10 weken. Dieren ondergingen herhaalde WBP-sessies, en de acclimatieperiodes werden geanalyseerd op basis-, vroeg-, midden- en laattijdspunten. De ademhalingsfrequentie tijdens de eerste plaatsing van de kamer (fbegin, 0–2 min) en stabiele baseline (fbaseline, 8–10 min) werden gekwantificeerd om longitudinale acclimatiepatronen te beoordelen. Er werden progressieve veranderingen waargenomen gedurende de studietijdlijn onder de geïmplementeerde voorwaarden. De gemiddelde initiële ademhalingsfrequentie daalde van 345 ± 111 SD-ademhalingen/min bij de startlijn tot 267 ± 43 SD-ademhalingen/min tijdens late studiesessies, vergezeld van een verminderde variatiecoëfficiënt (32% tot 16%). De basislijnmetingen van de ademhaling daalden ook van 255 ± 67 naar 193 ± 43 ademhalingen/min (p = 0,033), wat overeenkomt met verbeterde meetstabiliteit tijdens latere sessies. Gedragswaarnemingen toonden kalme acclimatie met minimale ontlasting, urineren of onrust. Dit protocol biedt een praktische aanpak voor laboratoria die herhaaldelijk ademhalingsonderzoeken bij muizen uitvoeren. Tunnelbehandeling en milieuverrijking werden geassocieerd met progressieve acclimatie en verminderde ademhalingsvariabiliteit tijdens longitudinale WBP-studies.

Inleiding

Whole-body plethysmografie (WBP) maakt niet-invasieve beoordeling van de ademhalingsfunctie bij bewuste, ongeremde knaagdieren mogelijk en is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor longitudinale studies in de ademhalingsfysiologie, inademingstoxicologie en ziektemodellering ^1,2. De belangrijkste voordelen van de techniek, waaronder het niet-invasieve karakter en de geschiktheid voor herhaalde metingen, maken het bijzonder waardevol voor het volgen van ademhalingsveranderingen tijdens ziekteprogressie, therapeutische interventies of blootstellingsperiodes. Glaab en Braun² benadrukten dat niet-invasieve head-out body plethysmografie een betrouwbare methode is voor herhaalde longfunctiemetingen bij bewuste muizen, en essentiële hulpmiddelen biedt voor translationeel onderzoek naar luchtwegaandoeningen, waaronder opkomende luchtweginfecties. De kwaliteit en reproduceerbaarheid van WBP-metingen hangt echter kritisch af van het bereiken van lage ademhalingsfrequentietoestanden die consistent zijn met gedragsmatige rust, die mogelijk worden aangetast door door het hanteren veroorzaakte stress. Omgangsstress vormt een goed erkende maar vaak ondergeziene bron van experimentele variabiliteit die fysiologische metingen kan verstoren en de datakwaliteit kan aantasten. De standaardpraktijk in het laboratorium bestaat doorgaans uit staarthantering, waarbij muizen bij de staart worden vastgegrepen voor transport en manipulatie ^3,4.

De standaardpraktijk in het laboratorium bestaat doorgaans uit het vasthouden van de staart, waarbij muizen bij de staart worden vastgegrepen voor transport en manipulatie. Gouveia en Hurst³ toonden aan dat staartbediening angst veroorzaakt bij muizen, waarbij dieren die in handen zijn verhoogd angstachtig gedrag vertonen in het verhoogde plus doolhof vergeleken met tunnelhandwerken. Deze angstreactie wordt geassocieerd met veranderde fysiologische parameters. Rasid et ^al.4 gebruikten WBP om de ademhalingseffecten van routinematige laboratoriumprocedures te kwantificeren, waarbij vaststelden dat vasthouden en hanteren het kleine volume aanzienlijk veranderden op een geslachtsafhankelijke manier, met effecten die tot 24 uur na de procedure aanhielden. De omvang en duur van deze door het hanteren veroorzaakte effecten onderstrepen dat ademhalingsmetingen die kort na het vasthouden van de staart worden genomen, de acute stressfysiologie kunnen weerspiegelen in plaats van een stabiele basisfunctie.

De bredere literatuur over vasthouden en het omgaan met stress onthult effecten die verder reiken dan directe gedragsreacties. Buynitsky en Mostofsky⁵ bespraken de uitgebreide effecten van stress door beperking op fysiologische, immunologische, endocriene en ontwikkelingsprocessen, waarbij ze benadrukten dat stressgerelateerde confounds vaak onvoldoende worden gedocumenteerd in onderzoeksartikelen. Specifiek voor ademhalingsstudies wordt het probleem verergerd door de noodzaak van herhaalde metingen. Elke afhandelingsgebeurtenis kan de stressrespons resetten, waardoor progressieve habituatie wordt beperkt en inconsistente basislijnmetingen ontstaat over longitudinale tijdstippen. DeLorme en Moss¹ vergeleken vastgehouden versus ongebonden plethysmografie bij muizen met bekende fysiologische verschillen tussen de inspanningen, en concludeerden dat hoewel ongebonden eenkamersystemen verbeterde analyse van luchtwegreactiviteit boden, de uitdaging om reproduceerbare basislijnmetingen te verkrijgen bleef.

Tunnelhantering, waarbij muizen vrijwillig een tunnel betreden voor vervoer, is uitgegroeid tot een op bewijs gebaseerde optie die de door het hanteren veroorzaakte angst aanzienlijk vermindert. De effectiviteit van de methode is aangetoond in meerdere stammen en experimentele contexten. Gouveia en^{Hurst 3} toonden aan dat muizen met een tunnelhandvat een grotere bereidheid vertoonden om met begeleiders te interageren en minder angstachtig gedrag vertoonden bij verhoogde plus doolhoftesten in vergelijking met muizen met staarthandvat, met voordelen die zelfs werden waargenomen wanneer tunnels onbekend waren. Belangrijk is dat deze voordelen verder reiken dan de directe periode na de behandeling. Sensini et ^al.6 onderzochten de effecten van hanteringstechniek en frequentie van omgaan tussen geslachten, en ontdekten dat frequent tail-handling welzijnsgerelateerd gedrag zoals graven verminderde en bij mannetjes meer wanhoopachtig gedrag toenam, terwijl tunnelbehandeling door beide geslachten werd verkozen en geassocieerd werd met positievere benaderingsgedrag en minder defensieve reacties. Bovendien toonden Davies et ^al.7 aan dat de voordelen van niet-staartbehandeling blijven bestaan tijdens complexe procedures. Muizen die tijdens hun laboratoriumervaring, ook tijdens vastzettingsprocedures, aan staartaanraking werden blootgesteld, vertoonden een betere respons op omgevingsprikkels en minder gemak van hanteren dan muizen die uitsluitend met cupping of tunnelmethoden werden behandeld.

Naast het kiezen van de behandelmethode kan systematische habituatie aan experimentele procedures de door stress veroorzaakte variabiliteit verder verminderen. Sorli et ^al.8 onderzochten het trainen van muizen voor head-out plethysmografie, een op fixatie gebaseerd systeem, en ontdekten dat vijf opeenvolgende dagen training de tolerantie verbeterde, waarbij muizen op de tweede dag een verbeterde gedragsstabiliteit vertoonden, hoewel de ademhalingsparameters binnen 5 minuten tijdens alle sessies stabiliseerden. Evenzo toonden Ueno et ^al.9 aan dat herhaald zacht hanteren van mannelijke C57BL/6-muizen vóór gedragstesten angstachtig gedrag bij verhoogde plus doolhoftesten verminderde en de ruimtelijke cognitie verbeterde, wat aangeeft dat herhaald contact met begeleiders meetbare habituatie-effecten kan veroorzaken. Deze bevindingen suggereren dat het combineren van niet-aversieve omgangsmethoden met systematische habituatieprotocollen cumulatieve voordelen kan bieden voor het verminderen van fysiologische variabiliteit tijdens herhaalde metingen.

Milieuverrijking vormt een extra factor die de stressrespons en de basisfysiologie kan beïnvloeden, hoewel de effecten complex en contextafhankelijk zijn. Hoewel verrijking over het algemeen een positief welzijn bevordert, kan overmatige of onvoorspelbare verrijking paradoxaal genoeg de fysiologische variabiliteit en stressgerelateerde gedragingen in sommige experimentele contexten verhogen^10,11. Een evenwichtige aanpak die stabiele kernelementen, zoals nestelmateriaal, behoudt, terwijl beheersbare nieuwigheid wordt geboden door periodieke rotatie van verrijkingsitems, kan het welzijn optimaliseren zonder confounding variatie¹² te introduceren. De interactie tussen verrijking, behandelingsmethode en habituatieprotocollen blijft onderbelicht in de context van herhaalde ademhalingsmetingen, wat de noodzaak benadrukt van geïntegreerde protocollen die alle drie de factoren gelijktijdig behandelen.

Ondanks de groeiende erkenning van de effecten van het hanteren op fysiologische metingen, blijven gestandaardiseerde protocollen die specifiek zijn ontworpen om de stress van het hanteren tijdens herhaalde WBP-sessies te minimaliseren, beperkt. Bestaande WBP-protocollen vertrouwen doorgaans op uitgebreide acclimatieperiodes (10–30 minuten per sessie) om stress-geïnduceerde tachypneu te laten afnemen, maar behandelen zelden de onderliggende behandelmethode of evalueren systematisch of progressieve habituatie tussen sessies plaatsvindt. Bovendien beoordelen de meeste studies niet of dieren fysiologische toestanden bereiken die consistent zijn met gedragsmatige rust, zoals ademhalingsfrequenties die in de literatuur worden gerapporteerd als geassocieerd met rust- of slaapgerelateerde toestanden, of in plaats daarvan overgaan van acute stress naar chronische laag-niveau opwinding. Hier presenteren we een protocol dat tunnelbehandeling, evenwichtige milieuverrijking en herhaalde WBP-sessies integreert gedurende een 10-wekenlange longitudinale studie. We beschrijven een benadering die geassocieerd is met progressieve veranderingen in ademhalingsfrequentie die consistent is met habituatie, waaronder het afnemen van de initiële ademhalingsfrequenties over sessies en basislijnmetingen die in de literatuur worden gerapporteerd als geassocieerd met rust- of slaapgerelateerde toestanden. Belangrijk is dat dit protocol niet alleen wordt gepresenteerd als een verfijning van dierenwelzijn, maar ook als een experimenteel ontwerp dat kan helpen variabiliteit te verminderen en de consistentie tijdens longitudinale ademhalingsmetingen te verbeteren.

Protocol

Voer alle procedures uit in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol #23-103) aan de University of Miami. Huismuizen in een door AAALAC geaccrediteerde vivariumfaciliteit met milieuomstandigheden die volgens institutionele normen worden gehandhaafd.

1. Dierselectie en huisvestingsomstandigheden

1. Selecteer en bereid dieren voor op de studie
   1. Selecteer dieren uit een gevestigde fokkolonie of haal ze bij een commerciële leverancier. Voor deze studie gebruik je zes wilde type 129S1/SvImJ muizen (3 mannetjes, 3 vrouwtjes).
   2. Houd dieren onder SPF (specifiek pathogen-vrij) condities in een door AAALAC geaccrediteerde faciliteit met routinematige gezondheidsmonitoring uitgevoerd volgens institutionele normen.
   3. Bevestig dat dieren ongeveer 6 maanden oud zijn (jongvolwassenen) bij de start van het onderzoek.
      OPMERKING: Muizen in deze studie hadden eerder blootstelling aan tunnelbehandeling als onderdeel van routinematig verzorgen. Voor naïeve muizen voer je een conditioneringsperiode in voordat je met WBP-sessies begint (zie Stap 3.2).
2. Begin met experimentele procedures wanneer muizen de geschikte leeftijd bereiken voor de onderzoeksdoelstellingen. In deze studie waren muizen ongeveer 6 maanden oud (jongvolwassenen) aan het begin van de WBP-sessies. Voor reproduceerbaarheid gebruik muizen binnen een bepaalde leeftijdscategorie (bijv. ±1 maand) en geef de specifieke gebruikte leeftijden op, aangezien leeftijd de basisrespiratorische parameters en habituatiekinetiek kan beïnvloeden.

2. Protocol voor milieuverrijking

1. Constant nestmateriaal bieden
   1. Plaats bij elke kooiwisseling één samengeperst katoenen vierkantje (ongeveer 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) in elke kooi.
   2. Breng het grootste deel van de bestaande neststructuur intact over naar de nieuwe kooi tijdens het wisselen van kooi met beide handen.
   3. Als het opgehoopte nestmateriaal ongeveer 10 g overschrijdt (ongeveer twee keer de oorspronkelijke massa), verwijder dan de oudste en meest verdichte delen van de bodem terwijl de externe koepelstructuur behouden blijft.
   4. Voeg één verse katoenen vierkant (5 cm × 5 cm) toe aan de schone kooi om het bouw- en onderhoud van het nest te ondersteunen.
   5. Vervang het nestmateriaal alleen als het zichtbaar nat is (urinebesmetting bedekt >25% van het oppervlak) of als het nest is vernietigd en niet binnen 48 uur is herbouwd (Figuur 1A en 1C).
      OPMERKING: Behoud de neststructuur om stress geassocieerd met kooiwisselingen te minimaliseren en behoud consistente reuk- en tactiele signalen gedurende het hele onderzoek. Nesten kwaliteit dient als indicator voor dierenwelzijn en gezondheidstoestand¹³.
2. Beoordeel wekelijks nestbouw met de volgende gestandaardiseerde procedure
   1. Bij elke kooiwissel zet je het intacte nest voorzichtig over op een schoon oppervlak met beide handen zonder de structuur te verstoren.
   2. Neem een foto van het nest direct van bovenaf met de camera 30–40 cm loodrecht op het oppervlak om de algehele structuur en kratervorming te visualiseren.
   3. Neem een foto van het nest vanaf de zijkant op nesthoogte om de wandintegriteit en koepelkenmerken te documenteren.
   4. Beoordeel het nest met behulp van de gestandaardiseerde 5-punts Deacon-schaal¹³, waarbij 1 = nestmateriaal grotendeels onaangeroerd en 5 = koepelvormig nest met een duidelijke krater. Zie Figuur 1A–1C voor voorbeelden van nesten met score 5.
   5. Zet het nest voorzichtig terug in de schone kooi.
      OPMERKING: Wekelijkse nestfoto's bieden objectieve documentatie van de kwaliteit van het nest gedurende het hele onderzoek. Achteruitgang bij het bouwen van het nest kan wijzen op ziekte, stress of andere welzijnszorgen die veterinaire aandacht vereisen.
3. Bied wekelijks gewisselde verrijking
   1. Kies één verrijkingsitem en plaats het in de kooi. Gebruik versnipperd papier (gewoon wit papier, een handvol portie), keukenpapier (2–3 vellen, ongeparfumeerd, wit, gevouwen of verkreukeld), of papieren schuilplaatsen (kartonnen buisjes of kleine doosjes).
   2. Roteer wekelijks verrijkingsitems volgens een vooraf bepaald schema (bijv. Week 1: versnipperd papier; Week 2: keukenpapier; Week 3: kartonnen buis; Week 4: herhalen) om een beheersbare nieuwigheid te behouden.
      OPMERKING: Wekelijkse rotatie zorgt voor nieuwigheid zonder muizen te overweldigen. Vermijd plastic verrijkingsvoorwerpen, zoals plastic hutten, ballen of stijve structuren, die de fysiologische variabiliteit kunnen vergroten¹¹. Vervang alle verrijkingsitems bij elke kooiwisseling.

Figuur 1. Protocolimplementatie en welzijnsindicatoren tijdens longitudinale plenthysmografie (WBP) studies. (A) Representatief nest van hoge kwaliteit (Deacon-score 5) uit een vrouwelijke kooi met een goed gevormde koepelstructuur en een afgebakende krater. (B) Doorschijnende polycarbonaattunnel (ongeveer 10 cm lang × 5 cm interne diameter) geïntegreerd met het nestmateriaal in de thuiskooi. Tunnels bleven permanent in kooien als verrijkings- en behandelingsmiddelen gedurende de hele studie. (C) Representatieve nestelkwaliteit van de late studie (week 10) die een aanhoudende score 5 nestbouw toont in zowel mannetjes- als vrouwtjeskooien. (D) Nest-kwaliteitsscores gedurende de 10-wekenstudieperiode. Elk datapunt vertegenwoordigt de wekelijkse nestscore voor een kooi met behulp van de gestandaardiseerde 5-punts Deacon-schaal¹³, waarbij 1 = onaangeroerd nestmateriaal en 5 = volledig koepelvormig nest met een krater. Beide kooien behielden gedurende alle studiefasen een consistente score van 5 nestkwaliteit. Het gearceerde groene gebied duidt scores aan die samenhangen met optimale welzijnsomstandigheden (scores 4–5). Studiefasen worden aangegeven door gekleurde achtergrondregio's die overeenkomen met Baseline (Week 0), Vroege studie (weken 2–3), Middenstudie (weken 5–7) en Late studie (weken 8–10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Tunnelafhandeling Implementatie

1. Bereid de afhandelingstunnels voor
   1. Gebruik doorzichtige polycarbonaattunnels (100 mm of 130 mm lang × 50 mm interne diameter) met gladde, afgeronde randen (Figuur 1B).
   2. Plaats permanent één tunnel in elke huiskooi als onderdeel van de kooiverrijking.
   3. Verwijder geen tunnels tussen afhandelingsgebeurtenissen.
      OPMERKING: Door de tunnel in de kooi te houden, krijgt hij vertrouwde kooigeuren en wordt hij geassocieerd met de thuisomgeving in plaats van met procedures te hanteren. Muizen gebruiken vaak tunnels als toevluchtsoord of nestelplaatsen.
   4. Bij elke kooiwissel veeg je de tunnel met een kleine hoeveelheid gebruikte bodembedekking uit de vorige kooi voordat je het in de schone kooi plaatst.
   5. Autoclave-tunnels of was ze met hetzelfde desinfectiemiddel dat wordt gebruikt voor kooi-sanitatie als desinfectie nodig is tussen het gebruik. Spoel grondig af en laat de tunnels aan de lucht drogen voordat je ze terugbrengt naar de kooi.
      OPMERKING: Het behouden van olfactorische continuïteit helpt de stress die gepaard gaat met onbekende geuren te minimaliseren. Tunnels zijn autoclavabel en herbruikbaar.
2. Conditione muizen aan tunnel hantering
   1. Voor naïeve volwassen muizen voer je een conditioneringsperiode van minimaal 1–2 weken in voordat je begint met WBP-sessies^14,15.
   2. Plaats doorzichtige polycarbonaattunnels (zie Stap 3.1) permanent in de huiskooi en laat 3–7 dagen passieve vertrouwdheid toe.
   3. Na passieve blootstelling voer je dagelijks zachte behandelingssessies uit. Moedig muizen aan om vrijwillig de tunnel binnen te gaan, tilt de tunnel vervolgens horizontaal op voor 30–60 seconden voordat je de muis terugbrengt naar de kooi.
   4. Evalueer succesvolle habituatie met de volgende criteria: vrijwillige tunnelbetreden binnen 10–30 seconden, kalm gedrag binnen de tunnel zonder ontsnappingspogingen of vocalisatie, en spontaan tunnelgebruik voor rust of verkenning tijdens routine kooiobservaties^14,15.
   5. Begin met WBP-sessies zodra aan alle habituatiecriteria is voldaan.
      OPMERKING: Muizen in deze studie hadden eerder blootstelling aan tunnelbehandeling als onderdeel van routinematige verzorging voordat WBP-sessies begonnen.
3. Voer niet-aversieve behandeling uit
   1. Draag poedervrije nitrilhandschoenen voor alle behandelingen.
   2. Gebruik tunnelbehandeling als primaire afhandelingsmethode. Als de muis zich in de tunnel bevindt, til je de tunnel horizontaal op met één hand om de basis te ondersteunen.
   3. Als de muis buiten de tunnel is, plaats dan de tunnelopening binnen 5–10 cm van de muis en laat 10–30 minuten vrijwillig binnen zonder achtervolging of forcering.
   4. Als de muis niet binnen 30 seconden binnenkomt, moedig dan beweging naar de tunnel aan met een gevouwen hand achter de muis zonder contact te maken.
   5. Als de muis na twee pogingen niet binnenkomt (maximaal 60 seconden), gebruik dan de cupping-methode. Plaats een platgedrukte hand bij de muis, laat vrijwillige nadering 10–20 seconden toe, en schep de muis dan voorzichtig met beide handen op terwijl je het vasthouden van de staart vermijdt.
   6. Gebruik de omgaansmethode die resulteert in kalm gedrag, gedefinieerd als afwezigheid van vocalisatie, ontsnappingspogingen of stressgerelateerde ontlasting.
4. Muizen overbrengen naar de plethysmografiekamer
   1. Breng de muis van de tunnel naar de handen die in de hand zitten voordat je hem in de kamer plaatst.
   2. Houd de tunnel horizontaal en kantel de achterkant (staartzijde) ongeveer 10–20° omhoog.
   3. Laat de muis achteruit de tunnel gaan, met de achterpoten eerst, op de handen die in de hand zitten.
   4. Laat beide handen in de kamer zakken en laat de muis vrijwillig binnen 5–10 seconden op de vloer van de kamer stappen.
      OPMERKING: Deze tunnel-naar-hand-naar-kamer overdrachtsmethode biedt verbeterde controle tijdens het plaatsen van de kamer.
   5. Alternatief kun je de muis direct van de tunnel naar de kamer brengen door de tunnel over de kameropening te kantelen.
      OPMERKING: Directe tunnel-naar-kamer-overdracht biedt minder controle tijdens plaatsing en werd minder vaak gebruikt in deze studie.
   6. Draai de tunnel nooit verticaal om of schud hem ervan.
   7. Sluit het kamerdeksel direct na het plaatsen van de muis af en breng de tunnel terug naar de thuiskooi.
      KRITIEKE STAP: Grijp muizen nooit bij de staart tijdens het onderzoek. Als een muis binnen 30 seconden de tunnel niet binnenkomt of een hand niet nadert, moedig dan beweging zachtjes aan met zacht beddengoed zonder achter aan te jagen of te forceren interactie. Laat de muis kiezen tussen tunnel of handbenadering op basis van individuele voorkeur. Geduld tijdens de eerste sessies helpt positieve associaties te creëren met niet-aversieve omgang ^3,7.

4. WBP Sessieprotocol

1. Bereid het plethysmografiesysteem voor
   1. Kalibreer de plethysmograaf voor het hele lichaam eenmaal per dag vóór gegevensverzameling.
   2. Met lege en afgesloten kamers start je de geautomatiseerde kalibratiesequentie via FinePointe ademhalingsanalysesoftware (doelwit: 18–22 cm H₂O). Bevestig succesvolle kalibratie wanneer het effectieve bereik van de box flow ±40 mL/s per site overschrijdt.
   3. Stel de biasstroom in op 1,0 L/min per kamer.
   4. Controleer de kamertemperatuur (22°C–24°C) en luchtvochtigheid continu met behulp van digitale sensoren.
   5. Plaats kamers op een rustige plek met constante verlichting en minimale trillingen.
      OPMERKING: Houd de constante kameromstandigheden gedurende alle sessies. Temperatuurschommelingen veranderen ademhalingspatronen en verstoren longitudinale vergelijkingen¹.
2. Voer WBP-sessies uit tijdens een consistente circadiane fase
   1. Voer alle metingen uit binnen hetzelfde tijdsvenster van de lichtcyclus.
   2. Voer sessies uit tussen 08:00–10:00 (licht aan om 06:00) en vermijd de eerste 2 uur na het aangaan van het licht wanneer de circadiane ritmes overgaan.
3. Transportmuizen naar de experimentele ruimte
   1. Breng huiskooien ongeveer 15 minuten voor de sessie begint naar de experimentele ruimte met een kar.
   2. Laat muizen wennen aan de experimentele omgeving terwijl ze in hun vertrouwde thuiskooi blijven.
   3. Plaats huiskooien bij de plethysmografiekamers.
   4. Gebruik tunnelbehandeling (zie Stappen 3.3–3.4) om elke muis van de thuiskooi naar de gevouwen handen en vervolgens naar de kamer te brengen.
   5. Ga rustig om met muizen en minimaliseer abrupte bewegingen tijdens de overdracht.
      OPMERKING: Individuele muisoverdracht duurt slechts enkele seconden.
4. Plaats de muis in de kamer
   1. Breng de muis voorzichtig van de gevouwen handen naar de kamer (zie Stap 3.4).
   2. Sluit het kamerdeksel binnen 5 seconden na het plaatsen van de muis.
5. Begin met acclimatie en opname
   1. Begin met het registreren van ademhalingssignalen met behulp van de ademhalingsanalysesoftware.
   2. Geef 10 minuten ruimte voor acclimatisatie zonder verstoring of interventie.
6. Monitor gedragsstabiliteit tijdens de acclimatie
   1. Observeer de muis continu gedurende de acclimacatieperiode.
   2. Noteer overmatige beweging, aanhoudende immobiliteit met tekenen van stress (bijv. stijve houding), of herhaalde ontsnappingspogingen zonder periodes van kalm gedrag in het sessielogboek.
   3. Besef dat dergelijke sessies nog steeds geldige f initiëlegegevens kunnen opleveren; echter, f-baselinemetingenkunnen onbetrouwbaar zijn.
   4. Waarschuw sessies zonder waarneembare kalme periodes tijdens het acclimatievenster voor mogelijke uitsluiting van basislijnanalyses volgens studiespecifieke criteria.
   5. Behoud alle sessies in deze studie, want geen enkele voldeed aan de exclusiecriteria op basis van acclimatisatiegedrag.
      KRITIEKE STAP: De 10-minuten acclimatisatieperiode is essentieel om de habituatie te beoordelen. Hoewel sommige protocollen acclimatatieperiodes van 20–30 minuten hanteren, bereikten goed gehabitueerde muizen in deze studie binnen 8–10 minuten stabiele ademhalingspatronen, waardoor langdurige acclimatie onnodig en mogelijk contraproductief werd door toegenomen beweging.
7. Observeer het gedrag van de muis tijdens de acclimatie
   1. Observeer muizen continu gedurende de 10 minuten durende acclimatieperiode door visuele monitoring van de kamers.
   2. Let op duidelijke stressindicatoren, waaronder ontlasting, plassen, langdurige ontsnappingspogingen of langdurige immobiliteit.
   3. Noteer na elke sessie de aanwezigheid en de geschatte hoeveelheid fecale pellets en urine in de kamer.
      OPMERKING: Deze observaties geven een kwalitatieve beoordeling van stressniveaus en de voortgang van de gewoonte, maar werden in deze studie niet formeel gescoord met behulp van een gestandaardiseerde ethogram.
8. Analyseer aspiratorische metrieken in de acclimatatiefase
   1. Gebruik de ademhalingsanalysesoftware om automatisch de ademhalingsfrequentie te berekenen op basis van druksignalen met behulp van het standaard ademdetectiealgoritme en de standaard drempelinstellingen in deze software.
   2. Ademhalingssignalen verkrijgen onder stabiele luchtstroomcondities (zie Stap 4.1) met behulp van standaard acquisitieparameters.
   3. Bereken de gemiddelde ademhalingsfrequentie voor twee periodes: finitial (0–2 min), die de initiële stressrespons en de fysiologie direct na het hanteren vertegenwoordigt, en fbaseline (8–10 min), wat de gestabiliseerde basisademhalingsfrequentie vertegenwoordigt.
   4. Sluit perioden met zichtbare bewegingsartefacten uit, gedefinieerd als niet-ademhalingsdrukafbuigingen of onregelmatige golfvormen die verband houden met dierlijke bewegingen of kamerverstoringen.
      OPMERKING: Inspecteer visueel een subset van de opnames (ongeveer 10%) om nauwkeurige ademdetectie door het geautomatiseerde algoritme te bevestigen. Handmatige validatie bevestigde overeenstemming tussen geautomatiseerde detectie en waargenomen ademhalingspatronen.
9. Ga door met het experimentele protocol indien van toepassing.
   1. Ga door met experimentele interventies na de acclimatisatieperiode van 10 minuten volgens het onderzoeksontwerp (bijv. aerosoliseerde medicijntoediening, hypoxische uitdaging, inspanningstesten).
      OPMERKING: Tijdens habituatiebeoordelingssessies in deze studie werden geen experimentele interventies uitgevoerd. De gerapporteerde ademhalingsmetingen (finitial en fbaseline) werden verkregen tijdens acclimatiesessies zonder aanvullende procedures.
10. Zet de muis terug in de kooi thuis
    1. Gebruik tunnel handling of gevouwen handen om de muis van de kamer terug naar de thuiskooi te brengen.
    2. Observeer de muis 5 minuten na de sessie om normaal gedrag te bevestigen, waaronder spontane beweging, verzorging, interactie met kooigenoten en onderzoek van voedsel en water.
    3. Verleng de observatie en raadpleeg veterinair personeel als abnormaal gedrag langer dan 15 minuten aanhoudt, waaronder langdurige immobiliteitheid (>5 min), zware ademhaling, gebogen houding of het niet omgaan met kooigenoten.
       OPMERKING: Er werden in deze studie geen abnormaal gedrag na de sessie waargenomen.
11. Houd een consistente sessiefrequentie aan
    1. Houd regelmatig WBP-sessies gedurende de longitudinale studieperiode (10 weken in dit protocol).
    2. Voer wekelijkse sessies uit om de voortgang van habituatie te volgen.
    3. Plan sessies op consistente tijden van de dag (zie Stap 4.2) om circadiane en procedurele consistentie te behouden.

Resultaten

De toepassing van dit tunnelbehandelings- en omgevingsverrijkingsprotocol op zes wilde type 129S1/SvImJ-muizen (3 mannetjes, 3 vrouwtjes) gedurende een 10 weken durende longitudinale WBP-studie leverde bewijs op van progressieve habituatie en verbeterde fysiologische stabiliteit. Metingen van de ademhalingsfrequentie werden verkregen tijdens herhaalde WBP-sessies die op regelmatige longitudinale intervallen werden uitgevoerd, met gegevens geanalyseerd uit vier studiefasen: Baseline (week...

Discussie

Dit protocol beschrijft een geïntegreerde benadering die tunnelbehandeling, milieuverrijking en herhaalde blootstelling combineert in de context van longitudinale WBP. Onder deze omstandigheden toonden metingen van de ademhalingsfrequentie progressieve stabilisatie over herhaalde sessies, wat consistent is met verminderde opwinding en progressieve habituatie. Verschillende implementatiefactoren lijken belangrijk voor succesvolle protocoluitvoering. Ten eerste moet tunnelbehandeling worde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	Aspen houtsnippers bedden. Autoclaved voor gebruik; geplaatst op een diepte van ongeveer 1 cm op de kooibodem.
Autoclaved Water	Facility-provided	Niet van toepassing	Autoclaved gemeentelijk water wordt ad libitum aangeboden via standaard waterflessen.
Cardboard Tube	Facility-generated	Niet van toepassing	Vlakke kartonnen toiletpapierrol. Gebruikt als geroteerde verrijking en schuilplaats.
Crink-I-Nest (Bestraald)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	Verrijkingsmateriaal van versnipperd papier. Gamma-bestraald. Wordt aangeboden als geroteerde verrijking op een afwisselende weekbasis.
FinePointe Software	Data Sciences International	Geen catalogusnummer	Software voor respiratoire gegevensverzameling en -analyse, versie 3.0. Gebruikt voor WBP-gegevensverzameling en parameterberekening.
Rack voor Individueel Geventileerde Kooi (IVC)	Allentown	EP5000E	Uitlaatpak IVC-rack, capaciteit van 140 kooi. Dubbelzijdig systeem met hoge dichtheid en automatische ventilatieaansluitingen.
Bestraald knaagdierdeegruim	Envigo	T.2918.15	Standaard bestraald knaagdierdeegruim. Wordt ad libitum aangeboden via een draadroostertrichter.
Muisoverdrachttunnel	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Duidelijke polycarbonaat tunnel, 100 mm lengte × 50 mm interne diameter. Autoclaveerbaar en herbruikbaar. Gebruikt voor dieroverdrachtprocedures met weinig stress.
Nestlets (Bestraald)	Lab Supply	IRR	Geperste katoenen nestvierkantjes (∼5 cm × 5 cm, ∼2,5 g elk). Gamma-bestraald. Wordt aangeboden als constante verrijking; een per kooi.
Nitrilbotten, Poedervrij	Kimberly-Clark	KC500	Paarse nitril poedervrije onderzoekshandschoenen. Gedragen tijdens alle procedures met contact met dieren.
Niet-geweven gaasje	Pivetal	21295040	Niet-steriele, niet-geweven gaasje, 4-laags, 4 inch × 4 inch (10,16 cm × 10,16 cm). Gebruikt als verrijkingsmateriaal.
Papierhanddoek	Tork (Essity)	MB 540A	Witte meervoudige handdoek. Gebruikt als geroteerd verrijkingsmateriaal.
Smartphone-camera	Apple	Geen catalogusnummer	iPhone-smartphonecamera. Gebruikt voor wekelijkse documentatie van nestscores.
Whole-Body Plethysmography-systeem	Data Sciences International	10222C (2-site); 770621 (4-site)	FinePointe FP Series onbeperkt whole-body plethysmografiesysteem voor muizen. Beschikbaar in 2-site en 4-site configuraties.