De Protoperithecia Assay kwantificeert fotoperiodieke responsen in Neurospora crassa door de vorming van protoperithecia te meten onder gedefinieerde licht-donker cycli. Deze plaatgebaseerde methode biedt een eenvoudige en schaalbare benadering om fotoperiode-afhankelijke ontwikkelingsresponsen te vergelijken over experimentele omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Plaatgebaseerde beeldvormingstest voor het kwantificeren van fotoperiodieke responsen in Neurospora crassa met behulp van de ontwikkeling van protoperithecia
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurospora crassa is een goed gevestigd modelorganisme voor het bestuderen van biologische timing en lichtgereguleerde ontwikkeling. De Protoperithecia Assay (PPA) is een plaatgebaseerde beeldvormingsmethode om fotoperiodieke responsen te kwantificeren door de vorming van protoperithecia te meten als ontwikkelingsoutput. Het doel van dit protocol is het bieden van een reproduceerbare en schaalbare workflow om te beoordelen hoe gedefinieerde licht-donker cycli de seksuele ontwikkeling van schimmels beïnvloeden. In deze assay worden schimmelculturen gekweekt op synthetisch kruisingsmedium onder gecontroleerde fotoperiodeomstandigheden, gevolgd door gestandaardiseerde verwijdering van oppervlakteconidien om de visualisatie te verbeteren. Protoperithecia worden gekwantificeerd door handmatig beeldgebaseerd tellen, en gemiddelde tellingen per plaat worden gebruikt voor statistische vergelijkingen over fotoperiodeomstandigheden. In tegenstelling tot eerdere benaderingen integreert de PPA gestandaardiseerde kweekomstandigheden, gecontroleerde fotoperiode-blootstelling en kwadrant-gebaseerde beeldvorming om reproduceerbare kwantitatieve vergelijkingen tussen stammen mogelijk te maken. Deze workflow gaat verder dan een basisprotocol door een consistent en schaalbaar kader te creëren voor het meten van fotoperiode-afhankelijke ontwikkelingsoutput onder gedefinieerde experimentele omstandigheden. De methode duurt ongeveer een week van inoculatie tot analyse en kan worden toegepast op meerdere stammen onder gedefinieerde omgevingsomstandigheden. De PPA biedt een eenvoudig en toegankelijk platform voor vergelijkende analyse van fotoperiode-afhankelijke ontwikkeling bij schimmels onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.
Inleiding
De protoperithecia-assay (PPA) kwantificeert fotoperiodieke responsen in de schimmel Neurospora crassa. Veel organismen meten de lengte van dag en nacht om biologische processen te coördineren in een fenomeen dat bekendstaat als fotoperiodisme 1,2,3,4,5,6,7,8. In deze test dient de ontwikkeling van de vrouwelijke geslachtsstructuur, het protoperithecium, als een meetbare, lichtafhankelijke proxy voor de fotoperiodieke respons. Hoewel fotoperiodisme goed is gekarakteriseerd bij planten via night-break experimenten3, bestaan er minder gestandaardiseerde benaderingen om fotoperiodieke responsen te kwantificeren bij niet-fotosynthetische eukaryoten zoals schimmels. N. crassa biedt hiervoor een hanteerbaar modelsysteem dankzij zijn goed gedefinieerde genetica en lichtgevoelige ontwikkelingspaden. Fotoperiode-afhankelijke regulatie van de voortplantingstiming is waargenomen bij organismen 1,2,3,4,5,6,7,8, wat de relevantie van lichtgestuurde fysiologische responsen ondersteunt; echter, mechanistische studies bij schimmels blijven beperkt door het ontbreken van reproduceerbare assays.
Protoperithecia zijn voortijdige vrouwelijke geslachtsstructuren bij N. crassa. Ze ontstaan uit ascogonia, die opgerolde trichogynes ontwikkelen die versmelten met hyfen of conidia van het tegenovergestelde paringstype9. Na de fusie komen kernen van de "mannelijke" partner het protoperithecium binnen. Het aantal geproduceerde protoperithecia is seizoensgebonden en sterk door licht veroorzaakt10. Fotoperiodieke regulatie is centraal in de ecologie, chronobiologie en schimmelfysiologie omdat veel klokgestuurde processen afhankelijk zijn van licht. Licht beïnvloedt talrijke genetische routes, waaronder fotoreceptoren, kinasen en lichttransductiemechanismen die verband houden met seksuele ontwikkeling11. Protoperithecia zijn goed geschikt voor het meten van fotoperiodieke output omdat ze gemakkelijk onder een microscoop zichtbaar zijn en gevoelig reageren op licht.
Ondanks het belang van fotoperiodisme bij schimmels zijn er weinig gestandaardiseerde en reproduceerbare assays beschikbaar om de productie van protoperithecia onder gecontroleerde lichtcycli te kwantificeren. Een medium-through, plaatgebaseerde assay is waardevol omdat schimmels goedkope en gemakkelijk te onderhouden modelorganismen zijn, wat systematische analyse van door licht geïnduceerde seksuele ontwikkeling en genfunctie mogelijk maakt. Het meeste onderzoek naar fotoperiodisme heeft zich gericht op planten, terwijl equivalente kwantitatieve kaders voor schimmelsystemen beperkt blijven. Bij andere organismen, waaronder insecten, zijn lichtafhankelijke fenomenen zoals diapauzegoed gekarakteriseerd. 7, maar vergelijkbare benaderingen bij schimmels ontbreken. Deze kloof beperkt reproduceerbare vergelijking van fotoperiodieke responsen tussen stammen en experimentele omstandigheden.
De PPA bouwt voort op een studie uit 2004 die de productie van protoperithecia over toenemende daglengtes mat, van constante duisternis tot constant licht, in de band (bd) mutant (ras-1bd), die is gebruikt in circadiane studies 4,12. Fotoperiode-afhankelijke veranderingen in de productie van protoperithecia werden in deze achtergrond waargenomen. De huidige workflow past deze aanpak aan en breidd deze uit met behulp van de referentiestam FGSC 2489, die geassocieerd is met whole-genome sequencing en knockout-bronnen13,14. De assay kwantificeert het gemiddelde aantal protoperithecia geproduceerd onder gedefinieerde fotoperioden gedurende één week als proxy voor de fotoperiodieke respons. Deze benadering standaardiseert kweekomstandigheden, beeldvorming en kwantificering, waardoor reproduceerbare vergelijkingen tussen experimentele omstandigheden en stammen mogelijk zijn. Belangrijke methodologische vooruitgang zijn onder meer gestandaardiseerde plaatgebaseerde kweekomstandigheden, gedefinieerde fotoperiode-belichtingsparameters, kwadrantgebaseerde beeldvorming en een reproduceerbare kwantificatieworkflow.
Dit protocol kwantificeert fotoperiodieke responsen in N. crassa door de vorming van protoperithecia te meten na blootstelling aan gedefinieerde licht-donker cycli. Voor elke fotoperiodieke conditie worden vier biologische replicaten gebruikt, elk bestaande uit één onafhankelijk geïnënfecteerde synthetische kruisplaat (SC). Per plaat worden vier afbeeldingen verzameld en gemiddeld om één waarde per biologische replica te genereren voor statistische analyse. Platen worden zeven dagen geïncubeerd onder gekalibreerde fotoperioden (bijvoorbeeld 12 uur:12 uur of 8 uur tot 16 uur licht–donker cycli).
Een datalogger wordt in de groeikamer geplaatst om continu lichtintensiteit, temperatuur en vochtigheid vast te leggen, waardoor stabiele omgevingsomstandigheden worden geverifieerd. Lichtintensiteit blijft boven de 1.000 lux gehandhaafd, omdat lagere niveaus de productie van protoperithecia verminderen. Overmatige verlichting wordt vermeden om temperatuurstijgingen in de kamer en verstorende thermische effecten te voorkomen. Na de incubatie worden macroconidia voorzichtig verwijderd met een bevochtigd keukenpapier, doordrenkt met 70% ethanol. Vier gelijkmatig verdeelde kwadranten aan de rand van elke plaat worden met 40× vergroting afgebeeld met een stereomicroscoop onder helderveldverlichting. Protoperithecia worden handmatig geteld met een beeldverwerkingspakket, en gemiddelde tellingen per plaat worden gebruikt voor statistische vergelijkingen over fotoperioden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De gebruikte reagentia, software en apparatuur staan vermeld in de Materiaallijst.
1. Voorbereiding van media en materialen
(Geschatte tijd: 1–1,5 uur actieve tijd; nachtelijke koeling optioneel)
- Bereid synthetisch kruisingsmateriaal (SC) voor
- Bereid SC medium: 0,2% sucrose, 5 μg/L biotine, 1,5% agar en Westergaards zouten (pH 6,5 met 1 N NaOH)15.
- Autoclave, het medium. Laat het afkoelen tot 50–55 °C totdat het een gietbare toestand bereikt.
VOORZICHTIG: Gebruik hittebestendige handschoenen bij het verwijderen van kolfs uit de autoclaaf.
- Gietborden
- Pipetteer 10 ml gesmolten medium in 60 mm petrischalen met een wegwerppipet.
- Laat platen 30–45 minuten bij kamertemperatuur stollen.
- Bewaar borden ondersteboven bij 4 °C tot wel 4 weken.
OPMERKING: Houd de hydratatie op het bord. Bewaar borden niet langer dan 4 weken op 4 °C.
- Bereid schimmelstammen voor
- Kweek elke stam in kleine glazen reageerbuisjes met een volledig of minimaal medium bereid volgens de laboratoriumhandleiding15.
- Tubes in constante duisternis (DD) bij 30 °C incuberen totdat er zichtbare myceliale dekking over het buisoppervlak ontstaat (meestal 2–3 dagen).
VOORZICHTIG: Behandel schimmelkweeken met standaard microbiologische praktijken en werk in een bioveiligheidskast om besmetting te minimaliseren.
2. Inoculatie van platen
(Geschatte tijd: 15–30 minuten per set platen)
- Schimmelconidia overdragen
- Inoculeer elke SC-plaat met een steriele techniek en een inoculatielus.
- Plaats conidien in het midden van de plaat om een gelijkmatige groei te garanderen (Figuur 1A). Conidia verschijnen als poederachtige, lichtgekleurde sporen die het kolonieoppervlak bedekken.
- Breng ongeveer 1–2 μL geconidiale suspensie (of een gelijkwaardige lus) aan om de inoculatie over platen te standaardiseren.
- Bereid platen voor voor incubatie
- Sluit platen stevig om besmetting te voorkomen en gasuitwisseling mogelijk te maken.
- Label elke plaat met de naam, datum en de toestand van de fotoperiode.
3. Opstelling van fotoperiodebehandelingen
(Geschatte tijd: 10 minuten opzetten + 7 dagen incubatie)
- Kalibreer de groeikamer
- Stel de kamertemperatuur in op 25 °C.
- Stel de luchtvochtigheid in op 50% (acceptabel bereik: 40%–60%) om te voorkomen dat het bord drooggaat.
- Programma-fotoperiodecycli: EQ (equinox): 12 uur licht / 12 uur donker en SDP (korte dag): 8 uur licht / 16 uur donker
- Stel de lichtintensiteit in op >1.000 lux op plaatniveau met behulp van een gekalibreerde lichtmeter. Vermijd intensiteiten die de kamertemperatuur boven de 25 °C verhogen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat kamerlampen het interieur niet oververhitten.
VOORZICHTIG: Gebruik geen Parafilm of plastic zakken om de luchtvochtigheid te behouden, omdat deze de gasuitwisseling beperken en schimmelgroei belemmeren. Als vochtigheidsregeling niet beschikbaar is, plaats dan een waterreservoir in de kamer.
- Plaatsborden in de kamer
- Leg de platen gelijkmatig op planken om een gelijkmatige lichtblootstelling te garanderen.
- Plaats een datalogger in de kamer om continu temperatuur en vochtigheid te monitoren en stabiele omgevingsomstandigheden te verifiëren.
- Begin met de assay
- Incubeer platen onder de geprogrammeerde fotoperiode gedurende 7 dagen zonder verstoring.
4. Monitoring en voorbereiding van platen voor beeldvorming
(Geschatte tijd: 15–20 minuten per bord)
- Verwijder platen uit de kamer
- Verwijder de platen na 7 dagen incubatie.
- Inspecteer platen op conidiale groei en vorming van protoperithecia.
- Maak platen schoon voor zichtbaarheid
- Verwijder oppervlakteconidien van het plaatdeksel en het agaroppervlak met gescheurde papieren handdoeken (Figuur 1B).
- Bevochtig een papieren handdoek met 1–2 ml 70% ethanol. Dep voorzichtig het plaatoppervlak 3–5 keer om de conidien te verwijderen. Laat platen 1–3 minuten aan de lucht drogen voordat je beeldvorming laat uitvoeren (Figuur 1C).
VOORZICHTIG: Ethanol is brandbaar; Blijf uit de buurt van warmtebronnen.
OPMERKING: Vermijd het uitoefenen van overmatige druk. Sleep de handdoek niet over het agaroppervlak, omdat dit het medium kan beschadigen of protoperithecia kan verstoren.
5. Beeldvorming van protoperithecia
(Geschatte tijd: 5 minuten per bord)
- Bereid je voor op beeldvorming
- Stel een microscoop op met een constante belichting en vergroting (meestal 40×).
- Zorg ervoor dat het oppervlak van de plaat droog en vrij van vuil is.
- Beelden vastleggen
- Beeld vier gelijkmatig verdeelde kwadranten aan de plaatrand voor met consistente vergroting.
- Label elke afbeelding met rek, fotoperiodeconditie, plaatnummer en kwadrantpositie.
- Sla afbeeldingen op in een consistent formaat (bijv. TIFF) voor analyse.
6. Kwantificering en data-analyse
(Geschatte tijd: 10–20 minuten per bord voor tellen; 15–25 minuten voor analyse)
- Graaf protoperithecia
- Open elke afbeelding in een beeldverwerkingspakket.
- Gebruik de Cell Counter-plugin om protoperithecia handmatig te tellen. Sluit bellen, randartefacten en dubbelzinnige structuren uit. De telling clusterde protoperithecia als individuele, onderscheidende eenheden.
- Recordtellingen per kwadrant en bereken het gemiddelde per plaat.
- Analyseer data
- Importeer gekwantificeerde gegevens in statistische analysesoftware.
- Voer statistische analyse uit met behulp van Welch's t-test voor vergelijkingen zoals weergegeven in Figuur 2.
- Genereer grafieken die fotoperiodebehandelingen, stammen of replicaten vergelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na de inoculatie met de wildtype-stam bedekten conidien het SC-oppervlak binnen 36–48 uur. Na 7 dagen fotoperiode ontstond een dichte conidiale laag die werd verwijderd met een bevochtigd papieren handdoekje dat doordrenkt was met 70% ethanol (Figuur 1). Deze stap legde onderliggende protoperithecieën bloot zonder hun structuur te verstoren. Onder microscopie verschenen protoperithecia als donkere, cirkelvormige structuren verspreid over het plaatoppervlak. Deze structuren vertoonden een bol...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van de PPA is om seksuele ontwikkeling in schimmels te gebruiken als proxy om te bepalen of een organisme een specifieke fotoperiode waarneemt. Door het gemiddelde aantal protoperithecia dat onder verschillende lichtcycli wordt geproduceerd te kwantificeren, kunnen fotoperiodieke responsen worden beoordeeld en vergeleken tussen verschillende omstandigheden. In overeenstemming met eerdere waarnemingen 4,16 vertoont N....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung en Morgan Bartleson voor hun steun, hulp en bijdragen aan dit project. De auteurs erkennen ook de afdeling Biologie van Rutgers University–Camden en het Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) voor het bieden van institutionele ondersteuning, onderzoeksfaciliteiten en middelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Alcoholbrandervlam | Wards | 470346-104 | Voor het steriliseren van inoculatieloop |
| Ammonium ijzersulfaat hexahydraat | Supelco | FX0245-1 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Ammoniumnitraat (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Voor minimaal medium |
| Autoclaaf | VWR International | 76683-456 | Voor het steriliseren van glaswerk en media |
| Biologische veiligheidskast | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Voor het verminderen van besmetting van de platen en het lab. |
| Biotine | VWR | 97061-444 | Voor synthetisch kruisingsmedium |
| Boorzuur (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Calciumchloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Voor synthetisch kruisingsmedium |
| Calciumchloride dihydraat (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Voor minimaal medium |
| Citroenzuurmonohydraat (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Kopersulfaat pentahydraat (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Gebruikt om conidia van het oppervlak van de plaat te verwijderen en inoculatieloop te steriliseren |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Voor het analyseren van beelden/telling |
| Handschoenen | SW Safety Solutions | 76382-944 | Voor veiligheid |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | Voor het uitvoeren van statistische tests en het maken van figuren |
| Groeikamerraam | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Programmeerbaar voor fotoperiodecycli |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Voor het loggen van lichtintensiteit en temperatuur |
| Inoculatieloop | VWR International | 10806-354 | Voor het overbrengen van schimmelmateriaal naar petrischalen |
| Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Mangansulfaat monohydraat (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Microscoop (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Voor beeldvorming |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Schimmelstam |
| Papierhanddoeken | Kimberly-Clark Professional, Scott en Kleenex | 6666114 | Voor het gieten van media |
| Permanente stift | Sharpie | 30072 | Voor het labelen van platen |
| Petrischalen | VWR International | 25384-164 | Voor het plateren van synthetisch kruisingsmedium |
| Pipetten | VWR International | 75816-090 | Voor het gieten van media |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Kaliumnitraat (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Voor synthetisch kruisingsmedium |
| Kleine wegwerpbare glazen testbuisjes | VWR International | 470211-698 | Voor initiële schimmelstamgroei |
| Natriumchloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Voor synthetisch kruisingsmedium |
| Natriumcitraat dihydraat (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Voor minimaal medium |
| Natriumhydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Voor synthetisch kruisingsmedium |
| Natriummolybdaat dihydraat (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
| Zinksulfaat heptahydraat (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium |
Referenties
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol. 1997;35:427-37.
- Jabbur ML et al. Bacteria can anticipate the seasons: photoperiodism in cyanobacteria. Science. 2024;385:1105-11.
- Ikeno T et al. Photoperiodic diapause under the control of circadian clock genes in an insect. BMC Biol. 2010;8:116.
- Arendt J. Melatonin and the pineal gland: influence on mammalian seasonal and circadian physiology. Rev Reprod. 1998;3:13-22.
- Kronstad JW, Staben C. Mating type in filamentous fungi. Annu Rev Genet. 1997;31:245-76.
- Innocenti FD, Pohl U, Russo VE. Photoinduction of protoperithecia in Neurospora crassa by blue light. Photochem Photobiol. 1983;37:49-51.
- Carrillo AJ et al. Functional profiling of transcription factor genes in Neurospora crassa. G3 (Bethesda). 2017;7:2945-56.
- Belden WJ et al. The band mutation in Neurospora crassa is a dominant allele of ras-1 implicating RAS signaling in circadian output. Genes Dev. 2007;21:1494-05.
- Colot HV et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:10352-7.
- Galagan JE et al. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa. Nature. 2003;422:859-68.
- Perkins DD. How to choose and prepare media. Available from: https://www.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20choose%20and%20prepare%20media.pdf. Accessed April 10, 2026.
- Corrochano LM. Fungal photobiology: a synopsis. IMA Fungus. 2011;2:25-8.
- Corrochano LM. Light in the fungal world: from photoreception to gene transcription and beyond. Annu Rev Genet. 2019;53:149-70.
- Roenneberg T, Merrow M. Seasonality and photoperiodism in fungi. J Biol Rhythms. 2001;16:403-14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
