Plaatgebaseerde beeldvormingstest voor het kwantificeren van fotoperiodieke responsen in Neurospora crassa met behulp van de ontwikkeling van protoperithecia

Samenvatting

De Protoperithecia Assay kwantificeert fotoperiodieke responsen in Neurospora crassa door de vorming van protoperithecia te meten onder gedefinieerde licht-donker cycli. Deze plaatgebaseerde methode biedt een eenvoudige en schaalbare benadering om fotoperiode-afhankelijke ontwikkelingsresponsen te vergelijken over experimentele omstandigheden.

Samenvatting

Neurospora crassa is een goed gevestigd modelorganisme voor het bestuderen van biologische timing en lichtgereguleerde ontwikkeling. De Protoperithecia Assay (PPA) is een plaatgebaseerde beeldvormingsmethode om fotoperiodieke responsen te kwantificeren door de vorming van protoperithecia te meten als ontwikkelingsoutput. Het doel van dit protocol is het bieden van een reproduceerbare en schaalbare workflow om te beoordelen hoe gedefinieerde licht-donker cycli de seksuele ontwikkeling van schimmels beïnvloeden. In deze assay worden schimmelculturen gekweekt op synthetisch kruisingsmedium onder gecontroleerde fotoperiodeomstandigheden, gevolgd door gestandaardiseerde verwijdering van oppervlakteconidien om de visualisatie te verbeteren. Protoperithecia worden gekwantificeerd door handmatig beeldgebaseerd tellen, en gemiddelde tellingen per plaat worden gebruikt voor statistische vergelijkingen over fotoperiodeomstandigheden. In tegenstelling tot eerdere benaderingen integreert de PPA gestandaardiseerde kweekomstandigheden, gecontroleerde fotoperiode-blootstelling en kwadrant-gebaseerde beeldvorming om reproduceerbare kwantitatieve vergelijkingen tussen stammen mogelijk te maken. Deze workflow gaat verder dan een basisprotocol door een consistent en schaalbaar kader te creëren voor het meten van fotoperiode-afhankelijke ontwikkelingsoutput onder gedefinieerde experimentele omstandigheden. De methode duurt ongeveer een week van inoculatie tot analyse en kan worden toegepast op meerdere stammen onder gedefinieerde omgevingsomstandigheden. De PPA biedt een eenvoudig en toegankelijk platform voor vergelijkende analyse van fotoperiode-afhankelijke ontwikkeling bij schimmels onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.

Inleiding

De protoperithecia-assay (PPA) kwantificeert fotoperiodieke responsen in de schimmel Neurospora crassa. Veel organismen meten de lengte van dag en nacht om biologische processen te coördineren in een fenomeen dat bekendstaat als fotoperiodisme 1,2,3,4,5,6,7,8. In deze test dient de ontwikkeling van de vrouwelijke geslachtsstructuur, het protoperithecium, als een meetbare, lichtafhankelijke proxy voor de fotoperiodieke respons. Hoewel fotoperiodisme goed is gekarakteriseerd bij planten via night-break experimenten³, bestaan er minder gestandaardiseerde benaderingen om fotoperiodieke responsen te kwantificeren bij niet-fotosynthetische eukaryoten zoals schimmels. N. crassa biedt hiervoor een hanteerbaar modelsysteem dankzij zijn goed gedefinieerde genetica en lichtgevoelige ontwikkelingspaden. Fotoperiode-afhankelijke regulatie van de voortplantingstiming is waargenomen bij organismen 1,2,3,4,5,6,7,8, wat de relevantie van lichtgestuurde fysiologische responsen ondersteunt; echter, mechanistische studies bij schimmels blijven beperkt door het ontbreken van reproduceerbare assays.

Protoperithecia zijn voortijdige vrouwelijke geslachtsstructuren bij N. crassa. Ze ontstaan uit ascogonia, die opgerolde trichogynes ontwikkelen die versmelten met hyfen of conidia van het tegenovergestelde paringstype⁹. Na de fusie komen kernen van de "mannelijke" partner het protoperithecium binnen. Het aantal geproduceerde protoperithecia is seizoensgebonden en sterk door licht veroorzaakt¹⁰. Fotoperiodieke regulatie is centraal in de ecologie, chronobiologie en schimmelfysiologie omdat veel klokgestuurde processen afhankelijk zijn van licht. Licht beïnvloedt talrijke genetische routes, waaronder fotoreceptoren, kinasen en lichttransductiemechanismen die verband houden met seksuele ontwikkeling¹¹. Protoperithecia zijn goed geschikt voor het meten van fotoperiodieke output omdat ze gemakkelijk onder een microscoop zichtbaar zijn en gevoelig reageren op licht.

Ondanks het belang van fotoperiodisme bij schimmels zijn er weinig gestandaardiseerde en reproduceerbare assays beschikbaar om de productie van protoperithecia onder gecontroleerde lichtcycli te kwantificeren. Een medium-through, plaatgebaseerde assay is waardevol omdat schimmels goedkope en gemakkelijk te onderhouden modelorganismen zijn, wat systematische analyse van door licht geïnduceerde seksuele ontwikkeling en genfunctie mogelijk maakt. Het meeste onderzoek naar fotoperiodisme heeft zich gericht op planten, terwijl equivalente kwantitatieve kaders voor schimmelsystemen beperkt blijven. Bij andere organismen, waaronder insecten, zijn lichtafhankelijke fenomenen zoals diapauze^goed gekarakteriseerd. 7, maar vergelijkbare benaderingen bij schimmels ontbreken. Deze kloof beperkt reproduceerbare vergelijking van fotoperiodieke responsen tussen stammen en experimentele omstandigheden.

De PPA bouwt voort op een studie uit 2004 die de productie van protoperithecia over toenemende daglengtes mat, van constante duisternis tot constant licht, in de band (bd) mutant (ras-1^bd), die is gebruikt in circadiane studies ^4,12. Fotoperiode-afhankelijke veranderingen in de productie van protoperithecia werden in deze achtergrond waargenomen. De huidige workflow past deze aanpak aan en breidd deze uit met behulp van de referentiestam FGSC 2489, die geassocieerd is met whole-genome sequencing en knockout-bronnen^13,14. De assay kwantificeert het gemiddelde aantal protoperithecia geproduceerd onder gedefinieerde fotoperioden gedurende één week als proxy voor de fotoperiodieke respons. Deze benadering standaardiseert kweekomstandigheden, beeldvorming en kwantificering, waardoor reproduceerbare vergelijkingen tussen experimentele omstandigheden en stammen mogelijk zijn. Belangrijke methodologische vooruitgang zijn onder meer gestandaardiseerde plaatgebaseerde kweekomstandigheden, gedefinieerde fotoperiode-belichtingsparameters, kwadrantgebaseerde beeldvorming en een reproduceerbare kwantificatieworkflow.

Dit protocol kwantificeert fotoperiodieke responsen in N. crassa door de vorming van protoperithecia te meten na blootstelling aan gedefinieerde licht-donker cycli. Voor elke fotoperiodieke conditie worden vier biologische replicaten gebruikt, elk bestaande uit één onafhankelijk geïnënfecteerde synthetische kruisplaat (SC). Per plaat worden vier afbeeldingen verzameld en gemiddeld om één waarde per biologische replica te genereren voor statistische analyse. Platen worden zeven dagen geïncubeerd onder gekalibreerde fotoperioden (bijvoorbeeld 12 uur:12 uur of 8 uur tot 16 uur licht–donker cycli).

Een datalogger wordt in de groeikamer geplaatst om continu lichtintensiteit, temperatuur en vochtigheid vast te leggen, waardoor stabiele omgevingsomstandigheden worden geverifieerd. Lichtintensiteit blijft boven de 1.000 lux gehandhaafd, omdat lagere niveaus de productie van protoperithecia verminderen. Overmatige verlichting wordt vermeden om temperatuurstijgingen in de kamer en verstorende thermische effecten te voorkomen. Na de incubatie worden macroconidia voorzichtig verwijderd met een bevochtigd keukenpapier, doordrenkt met 70% ethanol. Vier gelijkmatig verdeelde kwadranten aan de rand van elke plaat worden met 40× vergroting afgebeeld met een stereomicroscoop onder helderveldverlichting. Protoperithecia worden handmatig geteld met een beeldverwerkingspakket, en gemiddelde tellingen per plaat worden gebruikt voor statistische vergelijkingen over fotoperioden.

Protocol

De gebruikte reagentia, software en apparatuur staan vermeld in de Materiaallijst.

1. Voorbereiding van media en materialen

(Geschatte tijd: 1–1,5 uur actieve tijd; nachtelijke koeling optioneel)

1. Bereid synthetisch kruisingsmateriaal (SC) voor
   1. Bereid SC medium: 0,2% sucrose, 5 μg/L biotine, 1,5% agar en Westergaards zouten (pH 6,5 met 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoclave, het medium. Laat het afkoelen tot 50–55 °C totdat het een gietbare toestand bereikt.
      VOORZICHTIG: Gebruik hittebestendige handschoenen bij het verwijderen van kolfs uit de autoclaaf.
2. Gietborden
   1. Pipetteer 10 ml gesmolten medium in 60 mm petrischalen met een wegwerppipet.
   2. Laat platen 30–45 minuten bij kamertemperatuur stollen.
   3. Bewaar borden ondersteboven bij 4 °C tot wel 4 weken.
      OPMERKING: Houd de hydratatie op het bord. Bewaar borden niet langer dan 4 weken op 4 °C.
3. Bereid schimmelstammen voor
   1. Kweek elke stam in kleine glazen reageerbuisjes met een volledig of minimaal medium bereid volgens de laboratoriumhandleiding¹⁵.
   2. Tubes in constante duisternis (DD) bij 30 °C incuberen totdat er zichtbare myceliale dekking over het buisoppervlak ontstaat (meestal 2–3 dagen).
      VOORZICHTIG: Behandel schimmelkweeken met standaard microbiologische praktijken en werk in een bioveiligheidskast om besmetting te minimaliseren.

2. Inoculatie van platen

(Geschatte tijd: 15–30 minuten per set platen)

1. Schimmelconidia overdragen
   1. Inoculeer elke SC-plaat met een steriele techniek en een inoculatielus.
   2. Plaats conidien in het midden van de plaat om een gelijkmatige groei te garanderen (Figuur 1A). Conidia verschijnen als poederachtige, lichtgekleurde sporen die het kolonieoppervlak bedekken.
   3. Breng ongeveer 1–2 μL geconidiale suspensie (of een gelijkwaardige lus) aan om de inoculatie over platen te standaardiseren.
2. Bereid platen voor voor incubatie
   1. Sluit platen stevig om besmetting te voorkomen en gasuitwisseling mogelijk te maken.
   2. Label elke plaat met de naam, datum en de toestand van de fotoperiode.

3. Opstelling van fotoperiodebehandelingen

(Geschatte tijd: 10 minuten opzetten + 7 dagen incubatie)

1. Kalibreer de groeikamer
   1. Stel de kamertemperatuur in op 25 °C.
   2. Stel de luchtvochtigheid in op 50% (acceptabel bereik: 40%–60%) om te voorkomen dat het bord drooggaat.
   3. Programma-fotoperiodecycli: EQ (equinox): 12 uur licht / 12 uur donker en SDP (korte dag): 8 uur licht / 16 uur donker
   4. Stel de lichtintensiteit in op >1.000 lux op plaatniveau met behulp van een gekalibreerde lichtmeter. Vermijd intensiteiten die de kamertemperatuur boven de 25 °C verhogen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat kamerlampen het interieur niet oververhitten.
      VOORZICHTIG: Gebruik geen Parafilm of plastic zakken om de luchtvochtigheid te behouden, omdat deze de gasuitwisseling beperken en schimmelgroei belemmeren. Als vochtigheidsregeling niet beschikbaar is, plaats dan een waterreservoir in de kamer.
2. Plaatsborden in de kamer
   1. Leg de platen gelijkmatig op planken om een gelijkmatige lichtblootstelling te garanderen.
   2. Plaats een datalogger in de kamer om continu temperatuur en vochtigheid te monitoren en stabiele omgevingsomstandigheden te verifiëren.
3. Begin met de assay
   1. Incubeer platen onder de geprogrammeerde fotoperiode gedurende 7 dagen zonder verstoring.

4. Monitoring en voorbereiding van platen voor beeldvorming

(Geschatte tijd: 15–20 minuten per bord)

1. Verwijder platen uit de kamer
   1. Verwijder de platen na 7 dagen incubatie.
   2. Inspecteer platen op conidiale groei en vorming van protoperithecia.
2. Maak platen schoon voor zichtbaarheid
   1. Verwijder oppervlakteconidien van het plaatdeksel en het agaroppervlak met gescheurde papieren handdoeken (Figuur 1B).
   2. Bevochtig een papieren handdoek met 1–2 ml 70% ethanol. Dep voorzichtig het plaatoppervlak 3–5 keer om de conidien te verwijderen. Laat platen 1–3 minuten aan de lucht drogen voordat je beeldvorming laat uitvoeren (Figuur 1C).
      VOORZICHTIG: Ethanol is brandbaar; Blijf uit de buurt van warmtebronnen.
      OPMERKING: Vermijd het uitoefenen van overmatige druk. Sleep de handdoek niet over het agaroppervlak, omdat dit het medium kan beschadigen of protoperithecia kan verstoren.

5. Beeldvorming van protoperithecia

(Geschatte tijd: 5 minuten per bord)

1. Bereid je voor op beeldvorming
   1. Stel een microscoop op met een constante belichting en vergroting (meestal 40×).
   2. Zorg ervoor dat het oppervlak van de plaat droog en vrij van vuil is.
2. Beelden vastleggen
   1. Beeld vier gelijkmatig verdeelde kwadranten aan de plaatrand voor met consistente vergroting.
   2. Label elke afbeelding met rek, fotoperiodeconditie, plaatnummer en kwadrantpositie.
   3. Sla afbeeldingen op in een consistent formaat (bijv. TIFF) voor analyse.

6. Kwantificering en data-analyse

(Geschatte tijd: 10–20 minuten per bord voor tellen; 15–25 minuten voor analyse)

1. Graaf protoperithecia
   1. Open elke afbeelding in een beeldverwerkingspakket.
   2. Gebruik de Cell Counter-plugin om protoperithecia handmatig te tellen. Sluit bellen, randartefacten en dubbelzinnige structuren uit. De telling clusterde protoperithecia als individuele, onderscheidende eenheden.
   3. Recordtellingen per kwadrant en bereken het gemiddelde per plaat.
2. Analyseer data
   1. Importeer gekwantificeerde gegevens in statistische analysesoftware.
   2. Voer statistische analyse uit met behulp van Welch's t-test voor vergelijkingen zoals weergegeven in Figuur 2.
   3. Genereer grafieken die fotoperiodebehandelingen, stammen of replicaten vergelijken.

Resultaten

Na de inoculatie met de wildtype-stam bedekten conidien het SC-oppervlak binnen 36–48 uur. Na 7 dagen fotoperiode ontstond een dichte conidiale laag die werd verwijderd met een bevochtigd papieren handdoekje dat doordrenkt was met 70% ethanol (Figuur 1). Deze stap legde onderliggende protoperithecieën bloot zonder hun structuur te verstoren. Onder microscopie verschenen protoperithecia als donkere, cirkelvormige structuren verspreid over het plaatoppervlak. Deze structuren vertoonden een bol...

Discussie

Het doel van de PPA is om seksuele ontwikkeling in schimmels te gebruiken als proxy om te bepalen of een organisme een specifieke fotoperiode waarneemt. Door het gemiddelde aantal protoperithecia dat onder verschillende lichtcycli wordt geproduceerd te kwantificeren, kunnen fotoperiodieke responsen worden beoordeeld en vergeleken tussen verschillende omstandigheden. In overeenstemming met eerdere waarnemingen ^4,16 vertoont N....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	BD	90000-786	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Alcoholbrandervlam	Wards	470346-104	Voor het steriliseren van inoculatieloop
Ammonium ijzersulfaat hexahydraat	Supelco	FX0245-1	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Ammoniumnitraat (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Voor minimaal medium
Autoclaaf	VWR International	76683-456	Voor het steriliseren van glaswerk en media
Biologische veiligheidskast	ThermoFischer Scientific	1323TS	Voor het verminderen van besmetting van de platen en het lab.
Biotine	VWR	97061-444	Voor synthetisch kruisingsmedium
Boorzuur (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Calciumchloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Voor synthetisch kruisingsmedium
Calciumchloride dihydraat (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Voor minimaal medium
Citroenzuurmonohydraat (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Kopersulfaat pentahydraat (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Gebruikt om conidia van het oppervlak van de plaat te verwijderen en inoculatieloop te steriliseren
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Voor het analyseren van beelden/telling
Handschoenen	SW Safety Solutions	76382-944	Voor veiligheid
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Voor het uitvoeren van statistische tests en het maken van figuren
Groeikamerraam	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Programmeerbaar voor fotoperiodecycli
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Voor het loggen van lichtintensiteit en temperatuur
Inoculatieloop	VWR International	10806-354	Voor het overbrengen van schimmelmateriaal naar petrischalen
Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Mangansulfaat monohydraat (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Microscoop (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Voor beeldvorming
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Schimmelstam
Papierhanddoeken	Kimberly-Clark Professional, Scott en Kleenex	6666114	Voor het gieten van media
Permanente stift	Sharpie	30072	Voor het labelen van platen
Petrischalen	VWR International	25384-164	Voor het plateren van synthetisch kruisingsmedium
Pipetten	VWR International	75816-090	Voor het gieten van media
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Kaliumnitraat (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Voor synthetisch kruisingsmedium
Kleine wegwerpbare glazen testbuisjes	VWR International	470211-698	Voor initiële schimmelstamgroei
Natriumchloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Voor synthetisch kruisingsmedium
Natriumcitraat dihydraat (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Voor minimaal medium
Natriumhydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Voor synthetisch kruisingsmedium
Natriummolybdaat dihydraat (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium
Zinksulfaat heptahydraat (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Voor synthetisch kruisingsmedium/minimaal medium