De veelvoorkomende klasse van vasculitis-geassocieerde genetische varianten bij type I interferonopathieën binnen een pediatrische cohort

Samenvatting

Whole-exome sequencing van 1.204 pediatrische patiënten met vermoedelijke auto-inflammatoire ziekte identificeerde interferonopathie-geassocieerde varianten in 132 gevallen, waaronder 79 nieuwe mutaties. De meeste waren heterozygoot en gekoppeld aan vasculitische fenotypen. Deze bevindingen onderstrepen de diagnostische waarde van genetische tests en de centrale rol van gedisreguleerde type I interferonsignalering bij pediatrische vasculitis.

Samenvatting

Pediatrische vasculitis wordt traditioneel vastgesteld door histopathologische evaluatie; echter, in toenemende mate worden minder invasieve beeldvormingsgebaseerde benaderingen gebruikt in de klinische praktijk. Ondanks deze vooruitgang blijft het identificeren van een onderliggende monogene etiologie essentieel voor het begrijpen van ziektemechanismen, het voorspellen van prognoses en het sturen van gerichte therapeutische strategieën. Type I interferonopathieën vormen een heterogene groep immuungemedieerde aandoeningen die worden gekenmerkt door constitutieve interferonsignalering en frequente vasculitische of vasculopathische manifestaties. Aanhoudende activatie van nucleïnezuur-sensorroutes en verstoorde intracellulaire homeostase dragen bij aan endotheeldisfunctie en chronische vasculaire ontsteking.

Deze studie presenteert een uitgebreide genetische analyseworkflow voor het detecteren van vasculitis-geassocieerde varianten in interferonopathie-gerelateerde genen binnen een pediatrische autoinflammatoire cohort. Whole-exome sequencing werd uitgevoerd bij 1.204 patiënten met vermoedelijke auto-inflammatoire aandoeningen. Varianten die coderingsgebieden en laslocaties beïnvloeden, werden geanalyseerd met behulp van een bio-informatische pijplijn gebaseerd op richtlijnen van het American College of Medical Genetics and Genomics, waarbij statistische filter- en signaalverwerkingstechnieken werden geïntegreerd geïnspireerd door discrete Fouriertransformaties (DFT) en statistische verdelingen om de prioritisering en interpretatie van varianten te verbeteren.

Interferonopathie-geassocieerde varianten werden vastgesteld bij 132 pediatrische patiënten, geëvalueerd via een reumatologiekliniekdatabase. In totaal werden 92 unieke varianten gedetecteerd, waaronder 13 eerder gerapporteerde pathogene of waarschijnlijk pathogene varianten en 79 nieuwe varianten die in februari 2026 niet in openbare databases aanwezig waren. De klinische manifestaties bestonden voornamelijk uit terugkerende koorts, vasculitische manifestaties en complexe auto-inflammatoire presentaties.

Varianten betroffen genen die geassocieerd zijn met gestoorde interferonsignalering en aangeboren immuunactivatie, waaronder routes die gekoppeld zijn aan STING-activatie, nucleïnezuurmetabolisme en intracellulaire traffickingdisfunctie. Deze interdisciplinaire workflow toont het potentiële diagnostische nut van genomische analyse bij pediatrische vasculitis aan en benadrukt het belang van aanhoudende interferonsignalering bij vasculaire schade en de pathogenese van auto-inflammatoire ziekten.

Inleiding

Pediatrische vasculitis is traditioneel vastgesteld via histopathologische evaluatie, wat nog steeds de gouden standaard is. Recente diagnostische strategieën geven echter steeds meer de voorkeur aan minder invasieve benaderingen, met name beeldvormingsgebaseerde methodes. Ondanks deze vooruitgang is het identificeren van een onderliggende monogene etiologie van het grootste belang bij vasculitis bij kinderen, omdat het cruciale inzichten biedt in ziektemechanismen, prognose en mogelijkheden voor gerichte therapie ^1,2.

Vasculitis bij kinderen moet worden vermoed bij kinderen die zich presenteren met systemische ontsteking en betrokkenheid van meerdere orgaan. Grondige anamnese afnemen, uitgebreid lichamelijk onderzoek, laboratoriumonderzoeken, beeldvormende studies en in sommige gevallen weefselbiopten zijn vereist om de diagnose vast te stellen en mimics uit te sluiten. Vroege opsporing en behandeling zijn essentieel omdat onbehandelde ziekten kunnen leiden tot levensbedreigende complicaties of langdurige gevolgen¹.

Type I interferonopathieën omvatten een divers spectrum van monogene en complexe immuungemedieerde aandoeningen, gekenmerkt door aanhoudende activatie van type I interferonpaden en terugkerende vasculitische of vasculopathische kenmerken ^3,4. Ontregelde nucleïnezuurdetectie en verstoorde intracellulaire homeostase zijn centrale pathogene mechanismen die langdurige overproductie van interferonen koppelen aan vasculaire ontsteking en letsel. Gain-of-function-mutaties in TMEM173 (STING1) veroorzaken STING-geassocieerde vasculopathie met aanvang in de zuigelingentijd (SAVI), terwijl autosomaal dominante COPA-mutaties de endoplasmatisch reticulum-Golgi-transport verstoren, wat leidt tot abnormale STING-activatie en een vasculitisch fenotype ^3-5. Aanvullende interferonopathieën veroorzaakt door defecten in nucleïnezuurmetabolisme (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 en IFIH1) benadrukken verder de mechanistische link tussen interferondysregulatie en vasculaire pathologie³ (zie Figuur 1).

Figuur 1. Gedetailleerde pathogene architectuur van type I interferonopathieën die endotheeldisfunctie en microvasculaire schade veroorzaken bij pediatrische cohorten. (Links) Systemische context van pediatrische type I interferonopathie: defecte zelf-tegen-niet-zelfdiscriminatie en afwijkende host-nucleïnezuurdetectie triggeren systemische autoontsteking. Klinische fenotypen worden duidelijk gekenmerkt door vroege huidige vasculopathie en systemische betrokkenheid, vaak als chilblain-achtige huidlaesies. (Midden) Mechanistische cascade van genetisch defect naar systemische disregulatie: functieverliesmutaties in nucleïnezuurclearance-enzymen (bijv. DNASE1, TREX1) leiden tot de abnormale ophoping van endogeen DNA en RNA binnen het cytoplasma. Tegelijkertijd stimuleren gain-of-function-mutaties in sensoren zoals STING1 constitutieve activatie van het cGAS-STING-pad, onafhankelijk van virale triggers. Deze pathogene intracytoplasmatische detectie hyperactiveert interferonregulerende factoren, wat resulteert in de continue synthese van type I interferonen (IFN-α/β). Chronische cytokine-output zet een zelfvoorzienende systemische amplificatielus op via IFNAR1/2-receptoren, verergerd door verzwakte clearancemechanismen en positieve feedbackcontroles. (Rechts) Pathologische uitkomst: aanhoudende binding van circulerende IFN-α/β aan het endotheelcelreceptorcomplex induceert aanhoudende activatie van JAK-STAT. Deze constante homeostatische verstoring veroorzaakt aanhoudende endotheelstress en verstoort fysiologische vasorelaxatiemechanismen. Op capillair niveau veroorzaakt deze hyperinflammatoire toestand directe endotheelcelbeschadiging, aanzienlijke verdikking van de vatwanden en luminale microvasculaire trombose, wat culmineert in ernstige weefselischemie en necrotiserende microvasculopathie zonder autoantistof-gemedieerde auto-immuunroutes. Afkortingen: cGAS-STING = cyclische GMP-AMP syntase-stimulator van interferongenen; DNASE1 = deoxyribonuclease 1; GoF = gain-of-function; IFN = interferon; IFNAR = interferon alfa/bèta-receptor; IRF = interferonregulatiefactor; JAK-STAT = Janus kinase-signaaltransducer en activator van transcriptie; STING1 = stimulator van interferonrespons cGAMP interactor 1; TREX1 = drie prime reparatie exonuclease 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze benadering is ontwikkeld om interferonopathie-geassocieerde genvarianten te detecteren bij pediatrische auto-inflammatoire cohorten, aangezien conventionele methoden analytische uitdagingen kunnen ondervinden bij de vroege prioritering van zeldzame mutaties, en neutrofielheterogeniteit een cruciale rol speelt bij het voorspellen van terugvalrisico⁶. In de literatuur is de rol van interferonsignaaldysregulatie bij klein-vat vasculitis verlicht via single-cell analyses, wat het voordeel van whole-exome sequencing (WES) voor vroege diagnose in pediatrische cohorten⁶ benadrukt.

Monogene auto-inflammatoire syndromen kunnen zich presenteren met vasculitis of vasculitisachtige manifestaties. SAVI kan bijvoorbeeld klein- of middelvat-vasculitis⁷ nabootsen. Evenzo vertegenwoordigt juveniele idiopathische artritis (JIA) een heterogene groep ontstekingsziekten bij het begin van de kindertijd die tot op volwassenheid kunnen aanhouden en geassocieerd zijn met interferonopathie-achtige ontregeling, wat de noodzaak van genetische analyse in pediatrische cohorten^{benadrukt 8}.

Type I interferonopathieën zijn Mendeliaanse aangeboren immuniteitsfouten die worden gekenmerkt door activatie van antivirale sensoren die worden geactiveerd door nucleïnezuren afkomstig van de gastheer, wat een falen in zelf- versus niet-zelfdiscriminatie^{vertegenwoordigt 3,4}. Deze aandoeningen worden gedefinieerd door upregulatie van type I interferonsignalering, en dermatologische manifestaties leveren vaak belangrijke diagnostische aanwijzingen. SAVI wordt geassocieerd met gain-of-function mutaties bij TMEM173 en presenteert zich bij vroeg-aanvangende cutane vasculopathie en pulmonale ontsteking⁹. De p.V155M-mutatie is de meest gerapporteerde variant¹⁰. SAVI is een zeldzame auto-inflammatoire ziekte die geassocieerd wordt met STING1-mutaties, gekenmerkt door vroege interstitiële longziekte (ILD) en cutane laesies, en kan klinisch imiteren door systemische lupus erythematosus (SLE)¹¹. Dysreguliere type I interferonsignalering is ook in verband gebracht met anti-neutrofiele cytoplasmatische antilichamen (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV). Bij AAV is een type I interferon-signatuur dominant bij microscopische polyangiitis/myeloperoxidase-ANCA-geassocieerde vasculitis (MPA/MPO-AAV) en wordt geassocieerd met de nierprognose, wat de bijdrage van zeldzame varianten aan interferondysregulatie¹² benadrukt.

Monogene auto-inflammatoire syndromen kunnen zich presenteren met vasculitis of vasculitisachtige manifestaties. SAVI kan bijvoorbeeld klein- of middelvat-vasculitis⁷ nabootsen. Eerder werd de grootste wereldwijde cohort van patiënten met activerende STING1-mutaties beschreven, wat een uitgebreide klinische en immunologische fenotypische karakterisering van SAVI¹³ bood. In de afgelopen twee decennia is er opmerkelijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van pathogeenherkenning door zowel hematopoëtische als niet-hematopoëtische cellen. Microbiële componenten worden gedetecteerd via door de kiemlijn gecodeerde receptoren, een belangrijke stap bij het starten van deze respons¹⁴. In 2006 werd aangetoond dat transfectie van DNA in verschillende celtypen upregulatie van type I interferonen induceert op een toll-like receptor (TLR)-onafhankelijke manier. In deze context werd STING, een transmembraaneiwit dat gelokaliseerd is in het endoplasmatisch reticulum, in 2008 geïdentificeerd als een belangrijke mediator van type I interferonresponsen op synthetisch en viraal DNA¹³. Gain-of-function mutaties in STING1 leiden tot een type I interferonopathie die bekendstaat als SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴. Deze ernstige ziekte wordt variatief gekenmerkt door vroeg beginnende systemische ontsteking, cutane vasculopathie en interstitiele longziekte (ILD)¹⁴. SAVI is zeldzaam, tot nu toe zijn er 52 patiënten uit 37 families gemeld, en de meeste gevallen ontstaan de novo, hoewel ook autosomaal dominante overerving is gedocumenteerd. Eerder werd de grootste wereldwijde cohort patiënten met activerende STING1-mutaties beschreven, wat een uitgebreide klinische en immunologische fenotypische karakterisering van SAVI ^9,10,11˒¹⁴ bood.

Dit protocol is ontwikkeld om vroege detectie mogelijk te maken van interferonopathie-geassocieerde genvarianten via WES-gebaseerde genetische analyse bij pediatrische patiënten met auto-inflammatoire kenmerken, omdat conventionele benaderingen vaak onvoldoende zijn om zeldzame mutaties te identificeren en mogelijk kansen voor vroege interventie missen. De literatuur toont aan dat de rol van interferonupregulatie in vasculitisachtige fenotypes is verduidelijkt door de studie van Mendeliaanse aandoeningen, wat het voordeel van WES voor zeldzame variantdetectie verder benadrukt ^4,7,12.

Het primaire doel van deze methode is het integreren van fysica-gebaseerde signaalverwerkingsprincipes met vereenvoudigde biofysische computationele modellering om variantdetectie in WES-gegevens voor type I-interferonopathieën te ondersteunen, terwijl de downstream effecten op interferonsignaalroutes, met name de Janus-kinase-signaaltransducer en activator van transcriptie (JAK-STAT) cascade, worden geïnterpreteerd. Deze verkennende benadering heeft als doel de analyse van genomische regio's aan te vullen die vaak worden beïnvloed door sequencing-ruis en niet-uniforme dekking van immuungemedieerde aandoeningen, waarbij gedisreguleerde interferonactivatie vasculitische fenotypes aanstuurt. Standaard bio-informatische workflows richten zich doorgaans op standaard kwaliteitsmetrics, wat ruimte kan laten voor extra ondersteunende filtering bij het identificeren van varianten in complexe regio's in genen zoals STING1 of TREX1. Door signaalverwerkingstechnieken toe te passen die geïnspireerd zijn op discrete Fouriertransformaties (DFT) en statistische verdelingen, extraheert deze methode onderliggende genomische kenmerken uit nucleotidesequenties en mappt basissen (A, T, C, G) naar binaire indicatoren voor mutatiepatroonanalyse¹⁵. Bovendien omvat biofysische modellering van interferonpaden drempelgedrag en cumulatieve signaalversterking om te beoordelen hoe genetische varianten endotheeldisfunctie kunnen ondersteunen, met een focus op de rol van de JAK-STAT-route bij het verzenden van type I interferon (IFN-α/β) signalen.

Deze verkennende toepassing was ontworpen om uitlijningsprofielen in gebieden met lage dekking te bestuderen. Hoewel standaard computationele tools primaire variantfiltratie bieden, onderzoekt het ondersteunende model of SNR-gebaseerde beoordeling secundaire kwalitatieve gating kan bieden van coderende single-nucleotide varianten (SNV's) die worden beïnvloed door niet-uniforme leesverdeling. Deze fysica-gebaseerde benadering gebruikt SNR-optimalisatie om genotypekwaliteit en kleine leesverhoudingen te beoordelen. In de bredere literatuur heeft vergelijkbare stochastische modellering gegradueerde responsen in JAK-STAT-paden aangetoond in plaats van all-of-non-dynamiek, waardoor een betere voorspelling van interferonoverproductie^{mogelijk is 16}. De JAK-STAT-route, geactiveerd door type I interferonen (IFN's) die binden aan IFNAR1/IFNAR2-receptoren, omvat Janus-kinasen (JAK1, TYK2) die STAT1 en STAT2 fosforyleren, waardoor het ISGF3-complex wordt gevormd met IRF9 voor nucleaire translocatie en ISG-transcriptie¹⁷. Dit kan worden gemodelleerd met gewone differentiaalvergelijkingen (ODE's) voor IFN-β inductie:

waarbij de vermelde parameters de fosforyleringssnelheid, defosforylering en negatieve terugkoppeling via SOCS1 vertegenwoordigen, met de drempelafhankelijke amplificatie¹⁷ als nadruk. Aanvullende details zijn de vorming van STAT1-homodimeren voor IFN-γ signalering, maar bij type I interferonopathieën leidt aanhoudende activatie tot een overmatige ISG-expressie. Stochastische simulaties houden verder rekening met variabiliteit, waarbij Gillespie-algoritmen worden gebruikt om ruis in receptor-ligandbinding en nucleaire import te modelleren, waarbij cel-tot-cel heterogeniteit in IFN-responsen wordt onthuld¹⁶. Deze methode is bijzonder geschikt voor onderzoekers die auto-inflammatoire vasculitis onderzoeken, omdat het een kwantitatief kader biedt dat varianten koppelt aan pathway-dysregulatie, bijvoorbeeld via uitgebreide ODE's met paracriene effecten:

waarbij de vermelde parameters de productiesnelheid, degradatie en paracriene versterking¹⁸ weergeven. Gebruikers met toegang tot high-throughput sequencingdata en computationele bronnen kunnen deze aanpak toepassen om kandidaatvarianten te prioriteren en potentiële padeffecten te verkennen.

Deze studie was gepland met een multidisciplinaire reumatologie- en genetica-benadering om vasculitis-geassocieerde varianten in interferonopathie-gerelateerde genen te identificeren in een grote pediatrische cohort met auto-inflammatoire kenmerken, met behulp van een klinische exome sequencing (CES)/WES-gebaseerd genetisch analyseprotocol vanwege moeilijkheden bij de classificatie van vasculitis en beperkingen van traditionele benaderingen. Daarnaast was het onderzoek bedoeld om de diagnostische waarde van genetische evaluatie bij vasculitis bij kinderen te benadrukken.

De Chapel Hill Vasculitis-classificatie van 2012 omvat geen monogene auto-inflammatoire vasculitis¹⁹. Deze studie had als doel de frequentie van interferonopathie-gerelateerde varianten te bepalen die werden gedetecteerd bij een groep pediatrische patiënten met autoinflammatoire symptomen, bij te dragen aan de uitbreiding van de database over zeldzame ziekten en het belang van genetische evaluatie bij pediatrische vasculitis te benadrukken.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Geneeskunde van de Universiteit van Ege. Alle perifere bloedmonsters zijn genomen nadat schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van patiënten of hun wettelijke voogden, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Deze retrospectieve studie met één centrum was ontworpen om de frequentie van interferonopathie-geassocieerde varianten bij patiënten die genetische analyse ondergaan op vermoedelijke auto-inflammatoire ziekte te evalueren en om hun relatie met vasculitis te onderzoeken. Tussen 2022 en 2025 werden perifere bloedmonsters opgenomen die naar het Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde van de Universiteit van Ege werden gestuurd met een voorlopige diagnose van autoinflammatoire ziekte. In totaal ondergingen 1.204 monsters een genetische analyse. CES/WES werd gebruikt als een next-generation sequencing (NGS) benadering gericht op exonen en aangrenzende intronic-sequenties. Varianten werden geclassificeerd volgens ACMG-criteria en bio-informatische analyse. Goedaardige en mogelijk goedaardige varianten werden uitgesloten. Hiervan werden 132 pediatrische gevallen met geïdentificeerde interferonopathie-geassocieerde varianten die aan de inclusiecriteria voldeden, opgenomen in de laatste studiecohort.

Binnen deze pediatrische cohort werden klinische gegevens opgehaald uit een reumatologiekliniekdatabase. In totaal werden 92 unieke genetische varianten geïdentificeerd onder de 132 patiënten, waaronder 13 eerder gerapporteerde pathogene of waarschijnlijk pathogene varianten die zijn gedocumenteerd in openbare variantdatabases (bijv. ClinVar) en 79 nieuwe varianten die in februari 2026 ontbraken in openbare databases. De meeste varianten waren heterozygoot en werden geassocieerd met CAPS-achtige fenotypes of complexe auto-inflammatoire vasculitis-presentaties. WES gebruikte een NGS-benadering gericht op eiwitcoderende regio's (exonen) en aangrenzende intronic-sequenties om splitsite- en regulatievarianten te detecteren. Hoewel WES ongeveer 1%–2% van het menselijk genoom beslaat, vangt het bijna 85% van de bekende ziekteverwekkende mutaties, waardoor het een zeer efficiënt hulpmiddel is voor het opsporen van zeldzame varianten.

De laboratoriumworkflow omvatte genomische DNA-extractie uit perifere bloed, DNA-fragmentatie, adapter-ligated library preparation en exoomverrijking met behulp van hybridisatie-gebaseerde capture probes via biotine-streptavidine pulldown. High-throughput paired-end sequencing werd uitgevoerd op een DNA-nanoballsequencingplatform, waarbij een gemiddelde dekkingsdiepte van 100–200x werd bereikt om betrouwbare variantdetectie te garanderen. Bio-informatische analyse hield in dat het werd uitgelijnd op het referentiegenoom, variantroep werd gebruikt en werd annoteerd met behulp van gecureerde variantdatabases, waarbij variantclassificatie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van het American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Varianten werden gecategoriseerd als eerder gerapporteerd of nieuw. Geselecteerde varianten werden gevalideerd door Sanger-sequencing.

Naast standaard bio-informatische pijplijnen werden fysica-gebaseerde signaalverwerkingsprincipes en vereenvoudigde computationele modellering toegepast om sequencingdiepte, dekkingsuniformiteit en signaal-ruiskenmerken te beoordelen, waardoor een verkennende, aanvullende laag werd geboden voor het analyseren van ruwe sequencingdiepte en regionale dekking. Bovendien werden biofysische modelleringsconcepten gebruikt om de cumulatieve impact van vasculitis-geassocieerde genetische varianten te evalueren.

Dit interdisciplinaire kader dient als een voorlopig laboratoriummodel om variantfilteringskenmerken te bestuderen in een verkennende onderzoekscontext, met name om anti-interferon therapeutische strategieën te sturen. Beperkingen zijn onder meer een verminderde gevoeligheid voor laag-niveau mozaïekvarianten en de noodzaak van functionele validatie van nieuwe bevindingen. Potentiële toepassingen zijn onder meer vroege diagnose van pediatrische vasculitis, gepersonaliseerde therapeutische besluitvorming en uitbreiding van variantendatabases die relevant zijn voor immunologie, reumatologie en vasculaire geneeskunde.

DNA-fragmentatie

Twintig microliter verdund DNA werden overgebracht in nieuwe steriele PCR-buizen. Aan elke buis werden 2 μL fragmentatie-/adenylatiebuffer en 3 μL fragmentatie/adenylatie-enzymmengsel toegevoegd; het totale reactievolume was 25 μL. Het mengsel werd voorzichtig gemengd, kort gecentrifugeerd, en het fragmentatieprogramma werd uitgevoerd op de thermische cycler. Direct na voltooiing werden de buizen kort gecentrifugeerd en op ijs geplaatst. De verwachte uitkomst was een gemiddelde DNA-fragmentgrootte van 200–300 bp.

Adapterligatie

Aan elk fragmentatieproduct werd 2,5 μL sequencingadapter toegevoegd, gevolgd door 10 μL ligatie-mastermix (zonder vortexen). Het mengsel werd voorzichtig gepipetteerd om homogeniteit te waarborgen, kort gecentrifugeerd en 15 minuten geïncubeerd bij 20 °C met het deksel van de thermische cycler open. Na de incubatie werden de buizen kort gecentrifugeerd en op ijs gelaten.

Zuivering op basis van kralen

Dertig microliter magnetische kralen werden aan elk monster toegevoegd en grondig gemengd door pipetten totdat een homogene suspensie was verkregen. Het mengsel werd 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd, waarna de buizen 3 minuten op een magnetische standaard werden geplaatst. Nadat het supernatant was verdwenen, werd het voorzichtig verwijderd. De pellet werd twee keer gewassen met 100 μL 80% ethanol, en de resterende ethanol werd na de laatste wasbeurt verwijderd. De kralen werden vervolgens tot 5 minuten aan de lucht gedroogd op de magnetische standaard. Negen microliter nucleasevrij water werden toegevoegd, de pellet werd opnieuw opgehangen door pipetten en 2 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na 3 minuten magnetische scheiding werd 7,5 μL supernatant overgebracht naar een nieuwe, gelabelde PCR-buis.

PCR-versterking

In vitro transcriptie (IVT) primers werden verdund (20 μL primervoorraad + 80 μL nucleasevrij water). Voor de PCR-reactie (totaal volume 17,5 μL) werden 2,5 μL IVT primer 1, 2,5 μL IVT primer 2 en 12,5 μL bibliotheekversterking mastermix toegevoegd. Het mengsel werd voorzichtig gepipetteerd en het PCR-3 programma werd uitgevoerd.

Zuivering na PCR

Vijfentwintig microliter magnetische kralen werden aan elk PCR-product toegevoegd. Na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur en magnetische scheiding werden de kralen twee keer gewassen met 100 μL 80% ethanol. Na tot 5 minuten aan de lucht drogen werd 11 μL nucleasevrij water toegevoegd. Tien microliter supernatant werden overgebracht naar een nieuwe buis. De concentratie van de bibliotheek werd gemeten; Doelwit: >25 ng/μL.

Pooling en hybridisatie (samples per pool)

Bibliotheken werden samengevoegd met acht patiëntenmonsters per pool (93,75 ng per monster, totaal 750 ng). Het volume werd aangepast naar 12,5 μL met nucleasevrij water indien nodig. De hybridisatiemix werd 15 minuten pre-incubated bij 65 °C. Blokkerende oplossing, universele blokkerende oligonucleottiden, exoomvangstprobe, nucleasevrij water en hybridisatie-enhancer werden sequentieel toegevoegd. Het 16 uur durende hybridisatieprogramma werd gestart (18:00–10:00).

Vangst van gehybridiseerde doelen op streptavidine-kralen

Streptavidinekralen werden drie keer gewassen met een bindende buffer. Na de 16 uur durende hybridisatie werd het mengsel aan de kralen toegevoegd en 30 minuten geïncubeerd bij 25 °C met zacht mengen elke 5 minuten. Het wassen werd uitgevoerd met capture wash buffer 1 bij kamertemperatuur, gevolgd door drie washes met voorverwarmde (48 °C) capture wash buffer 2, inclusief incubatie bij 48 °C. Na de laatste wasbeurt werd de pellet opnieuw opgehangen in 23 μL nucleasevrij water.

Enkelstrengs DNA (ssDNA) voorbereiding

Vierentwintig microliter TE-buffer werden toegevoegd en het mengsel werd 3 minuten bij 95 °C gedenatureerd, waarna het direct op ijs werd gelegd. Er werd een mastermix toegevoegd met splint ligatiebuffer en rapid DNA-ligase, en het SS-2-programma (37 °C, 30 min) werd uitgevoerd om het enkelstrengige DNA te circulariseren. Er werden een mengsel van verteringsbuffer en verteringsenzym toegevoegd, en het SS-3-programma (37 °C, 30 min) werd uitgevoerd. Vervolgens werd 3,75 μL verteringsstopbuffer toegevoegd. Vijfentachtig microliter magnetische kralen werden toegevoegd, gevolgd door standaard kralenzuivering. Vijftien microliter supernatant werden overgebracht in een nieuwe buis; de verwachte concentratie was 0,8–2 ng/μL.

DNA nanoball (DNB) voorbereiding

De ssDNA-producten werden gebruikt voor de vorming van DNB. DNB-vormingsbuffer, low-EDTA TE-buffer en DNB-enzymmengsels 1 en 2 werden toegevoegd. DNB-1 en DNB-2 programma's werden achtereenvolgens uitgevoerd. Na voltooiing werd 20 μL DNB reactiestopbuffer toegevoegd en voorzichtig gemengd (5–8x) met breed-boring pipettoppen; De verwachte concentratie was 8–40 ng. De voorbereide DNB's werden geladen op het DNA-nanoball-sequencingplatform voor high-throughput sequencing.

Sequencing dataverwerking en signaalanalyse

Ruwe sequencing-reads werden kwaliteitsgecontroleerd met FastQC (v0.11.9) en fastp (v0.23.1). De signaal-ruisverhouding (SNR) drempel van 20 dB werd geoptimaliseerd met behulp van een receiver operating characteristic (ROC) curve-analyse tegen een benchmarkdataset van bekende auto-inflammatoire varianten, waarbij een false discovery rate (FDR) van <1% werd gebalanceerd met een streefgevoeligheid van >95% voor laagfrequente varianten; reads die onder deze 20 dB-drempel vielen, werden verworpen. Uitlijning met het Genome Reference Consortium Human Build 38 (GRCh38) referentiegenoom en initiële variantaanroep werden uitgevoerd met BWA-MEM (v0.7.17) en de Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6).

Voor de fysica-gebaseerde signaalverwerkingsstappen werden nucleotidensequenties omgezet in binaire numerieke signalen (0 staat voor purinen; 1 voor pyrimidinen). Om de DFT te berekenen, werd het binaire signaal verwerkt met een schuifvenster van N = 512 basenparen en een overlap van 50% (256 bp stapgrootte) om gelokaliseerde genomische resolutie te behouden. De DFT werd gedefinieerd als:

Om hoogfrequente sequencing-artefacten te filteren zonder echte single-nucleotide varianten (SNV's), die zich manifesteren als scherpe, hoogfrequente gelokaliseerde overgangen, te verzachten, werd een low-pass digitaal filter programmatisch gekalibreerd. De optimale genormaliseerde cutofffrequentie (fc) werd iteratief bepaald door het bereik van 0,05–0,25 cycli/basis te scannen. Het optimalisatie-algoritme selecteerde fc = 0,15 cycli/basis, gedefinieerd als het kantelpunt waarbij het signaalvermogenspectrum ≥85% van de totale variantie van bekende true-positive controlevarianten behield, terwijl achtergrondruis werd geëlimineerd. DFT-gebaseerde filtering werd toegepast met behulp van aangepaste scripts geschreven in Python (v3.9), waarbij specifiek de NumPy (v1.23.0) en SciPy (v1.9.1) libraries werden gebruikt, om hoogfrequente ruis te verminderen terwijl mutatie-gerelateerde spectrale kenmerken behouden bleven. Filterparameters werden iteratief programmatisch gekalibreerd om overglading van zeldzame variantsignalen te voorkomen. De geïntegreerde workflow voor signaalverwerking en biofysisch modelleren wordt samengevat in Figuur 2.

Biofysische en stochastische modellering van interferonsignalering

Om de functionele gevolgen van geïdentificeerde varianten te onderzoeken, werden de dynamica van JAK–STAT-paden gemodelleerd met gewone differentiaalvergelijkingen (ODE's) gedefinieerd als:

Deterministische ODE-simulaties werden uitgevoerd met COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) en bevestigd met aangepaste Python-scripts met behulp van de scipy.integrate.solve_ivp module. Biologisch realistische beginvoorwaarden werden vastgesteld en gevoeligheidsanalyses werden uitgevoerd op versterkingssnelheidsconstanten met behulp van de SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5). TYK2-gemedieerde IFN-α signaalkinetica werden geïntegreerd om versterking door versterking van functie te simuleren.

Stochastische effecten werden geïntroduceerd met behulp van een Langevin-formulering:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Daarnaast werden Gillespie-stochastische simulaties uitgevoerd met gebruik van de GillesPy2 (v1.7.0) Python-bibliotheek om transcriptionele bursting en heterogene IFN-β-geïnduceerde interferon-gestimuleerde genactivatie (ISG) te modelleren. Gedistribueerde vertragingsfuncties die worden weergegeven door gamma-kernelformuleringen werden in Python geïmplementeerd met numerieke integratie om vertraagde transcriptiefeedbackmechanismen te simuleren. Alle computationele pijplijnen, inclusief signaalfiltering en wiskundige modellering, werden uitgevoerd op een op Linux gebaseerde high-performance computing (HPC) omgeving.

Figuur 2. Geïntegreerd raamwerk voor signaalverwerking en biofysische modellering van JAK-STAT signalering. 1: Signaalverwerkingsfase: binaire mapping van nucleotidensequenties (purines = 0, pyrimidines = 1) gevolgd door DFT-gebaseerde filtering. Let op de kritische SNR-drempel van 20 dB voor nauwkeurige variantcalling. 2: Biofysische modellering: ODE-gebaseerde simulatie van versterkingssnelheden waarbij kleine verstoringen in begincondities leiden tot drempelverschuivingen in aanhoudende signalering. 3: Biologisch fenotype: modellering van TYK2-gain-of-function varianten in de IFN-α route, wat leidt tot versterkte STAT2-activatie en resulterende interferonopathiefenotypen. Afkortingen: DFT = discrete Fouriertransformatie; IFN-α = interferon alfa; JAK-STAT = Janus kinase-signaaltransducer en activator van transcriptie; ODE = gewone differentiaalvergelijking; SNR = signaal-ruisverhouding; STAT2 = signaaltransducer en activator van transcriptie 2; TYK2 = tyrosinekinase 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 vat de integratie samen van DFT-gebaseerde signaalverwerking met ODE- en stochastische modelleringscomponenten die worden gebruikt in de verkennende computationele workflow. Dit uitgebreide protocol integreert geavanceerde moleculaire genetica, high-throughput sequencingtechnologieën, signaalverwerkingsalgoritmen en biofysische modellering om de detectie en functionele interpretatie van interferonopathie-geassocieerde varianten bij pediatrische autoinflammatoriese vasculitis te ondersteunen.

Statistisch kader en signaalkaartverdeling van kansverdeling

Om de digitale mapping van genomische sequenties vóór signaalfiltering te formaliseren, werd een binair conversiekader opgesteld gebaseerd op nucleotidebiochemie. Voor elk gegeven structureel genomisch venster van lengte N worden purines {A, G} afgebeeld naar een digitale waarde van 0, en pyrimidinen {C, T} naar 1. Onder de nulhypothese (H0) van een onbevooroordeelde, uniforme achtergrondgenomische verdeling volgt deze binaire conversie een Bernoulli-proefkader. De kansmassafunctie (PMF) van het afgebeelde signaal X wordt als volgt gedefinieerd

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x voor x ∈ {0,1}

waarbij p = 0,5 de kans vertegenwoordigt om een pyrimidineresidu tegen te komen op een niet-geselecteerde achtergrondspoor. Bij het schalen van deze omzetting over sequentiële bases voor vermogensspectrale dichtheid (PSD) berekening via de DFT, gedraagt de cumulatieve achtergrondruisverdeling zich als een willekeurige wandeling, convergerend naar een Gaussische witte ruisverdeling door de centrale limietstelling. Bijgevolg volgt het genormaliseerde vermogensspectrum van deze nulverdeling een chi-kwadraat (χ²) verdeling met 2 vrijheidsgraden. Om een strikte statistische significantiedrempel (α = 0,05) te handhaven, werd de kritische vermogensintensiteitsdrempel voor het definiëren van een echte pathogene variant signaalpiek analytisch berekend met behulp van de volgende waarschijnlijkheidsdichtheidsintegratie:

Drempel = - In(a) x a²

waarbij σ² de operationele variantie van de lokale achtergrond-genomische ruisvloer vertegenwoordigt. Elke spectrale piek die deze drempel overschrijdt (p < 0,05, gelijk aan een SNR > 20 dB) werd geprioriteerd voor downstream in silico filtratiepoorten, waardoor variant calling data-gedreven is en minder wordt beïnvloed door stochastische sequencing-ruis.

Operationele efficiëntie en kostenanalyse (Figuur 3)

Vanuit een translationeel en klinisch implementatieperspectief werden de operationele efficiëntie, klinische doorlooptijd (TAT) en economische haalbaarheid van dit geïntegreerde protocol vergeleken met traditionele diagnostische routes, zoals sequentiële Sanger-sequencing of beperkte gerichte genpanelen. Hoewel conventionele diagnostische odyssees voor pediatrische vasculitis of vermoedelijke type I interferonopathieën vaak 8–12 weken beslaan vanwege iteratief enkelgentesten, bereikt de gestroomlijnde workflow—waaronder high-throughput WES, geoptimaliseerde 16-uur hybridisatie en geparallelliseerde DFT-signaalfiltering op een high-performance computing (HPC) cluster—een gerapporteerde totale klinische TAT van 10–14 dagen vanaf de ontvangst van het eerste monster tot het definitieve moleculaire rapport. Bovendien wordt door efficiënte samplemultiplexing (het samenvoegen van acht patiëntenmonsters per hybridisatieblok) de kosten van het kernreagens en sequencing geschat op ongeveer $250–$300 per patiënt, vergeleken met traditionele uitgebreide panels die vaak meer dan $1.200–$1.800 bedragen. Deze compressie van zowel diagnostische tijdlijn als kostenkaders suggereert dat de voorgestelde fysica-geïnspireerde bio-informaticaworkflow haalbaar en schaalbaar kan zijn voor routinematige klinische geneticalaboratoria.

Resultaten

In deze cohort van 132 patiënten met geïdentificeerde interferonopathie-geassocieerde varianten werd een breed spectrum aan genetische varianten vastgesteld (Tabel 1). Van de patiënten waren 53 (40,2%) vrouwelijk en 79 (59,8%) mannelijk. De gemiddelde leeftijd was 10,2 jaar (bereik: 0–18 jaar). Patiëntgegevens die overeenkomen met de uiteindelijke cohort worden verstrekt in Aanvullende Tabel S1.

Tabel 1: Verspreiding en classificatie van type I interferonopathie-geassocieerde genetische varianten geïdentificeerd binnen de pediatrische auto-inflammatoire cohort (n = 132). Klik hier om deze tabel te downloaden

De meest aangetaste genen waren ADAR (25 patiënten, 18,94%) en DNASE1 (24 patiënten, 18,18%). DNASE1-varianten waren exclusief klasse 3 (100% binnen het gen; 18,18% van de totale cohort). Evenzo waren de meeste ADAR-varianten klasse 3 (24 patiënten, 96,00%; 18,18% van de cohort), met slechts één klasse 2-variant (4,00% binnen het gen; 0,76% van de cohort) (Tabel 2).

Tabel 2: Varianten geïdentificeerd in het NGS-panel voor zeldzame ziekten. Klik hier om deze tabel te downloaden

Varianten bij STING1 (20 patiënten, 15,15%) en RNASEH2B (14 patiënten, 10,61%) kwamen ook vaak voor. Alle STING1-varianten waren klasse 3 (100%). Voor RNASEH2B hadden 10 patiënten (71,43%) klasse 3-varianten (7,58% van de cohort), terwijl 4 patiënten (28,57%) klasse 2-varianten hadden (3,03% van de cohort).

RNASEH2A mutaties werden vastgesteld bij 13 patiënten (9,85%), die allemaal klasse 3-varianten droegen (100%). TREX1-mutaties waren aanwezig bij 10 patiënten (7,58%), waaronder 8 klasse 3-varianten (80,00%; 6,06% van de cohort) en 2 klasse 2-varianten (20,00%; 1,52% van de cohort).

SAMHD1-varianten werden gedetecteerd bij 9 patiënten (6,82%), met 7 patiënten met klasse 3-varianten (77,78%; 5,30% van de cohort), 1 patiënt met een klasse 1-variant (11,11%; 0,76%) en 1 patiënt met een klasse 2-variant (11,11%; 0,76%).

RNASEH2C mutaties werden gevonden bij 8 patiënten (6,06%), die allemaal klasse 3 waren. DNASE1L3 mutaties werden vastgesteld bij 6 patiënten (4,55%), waaronder 5 klasse 3-varianten (83,33%; 3,79% van de cohort) en 1 klasse 2-variant (16,67%; 0,76%). PSMB8- en COPA-mutaties werden elk bij 5 patiënten (3,79%) gedetecteerd, waarbij alle varianten klasse 3 (100%) waren. DNASE2- en STAT4-mutaties waren elk aanwezig bij 3 patiënten (2,27%), waarbij alle varianten als klasse 3 werden geclassificeerd.

Over het geheel genomen vormden klasse 3-varianten de overheersende variantklasse over bijna alle genen in de cohort. De specifieke variantplaatsen, inclusief gedetailleerde nucleotidesubstituties en bijbehorende aminozuurveranderingen over de doelgenen, zijn gecatalogiseerd in Tabel 3.

Verkennende analyse van signaalverwerkingsprestaties

Om de robuustheid en gevoeligheid van de DFT-gebaseerde signaalverwerkingspijplijn te onderzoeken, werd een vergelijkende benchmark uitgevoerd met de standaard GATK-only variant-calling workflow, met specifieke focus op genomische regio's met lage dekking (diepte < 30x). In de voorlopige benchmarking liet de geïntegreerde DFT-filterindeling een potentiële trend zien naar verbeterde prioritering in geselecteerde laagdekkingsgebieden, wat een verkennende herstelschatting van tot 96,8% suggereert onder deze specifieke laboratoriumcontroleomstandigheden. Belangrijk is dat deze parameters en numerieke efficiëntiemetrics voorlopige, verkennende bevindingen vertegenwoordigen die zijn afgestemd binnen de context van de specifieke institutionele cohort, in plaats van een universeel gevalideerde klinische pijplijn. De pijpleiding haalde ook eerder afgedankte true-positive varianten terug in gebieden met hoge ruis. Bovendien werd de FDR verlaagd van 6,4% naar 1,2%, wat de potentiële robuustheid van het laagdoorlaatfilter benadrukt bij het elimineren van hoogfrequente sequencing-artefacten. Onder de nieuwe varianten die in de cohort werden geïdentificeerd, werden 14 varianten (wat 17,7% van de nieuwe bevindingen vertegenwoordigt), voornamelijk gelegen in gebieden met niet-uniforme dekking in STING1 en TREX1, aanvankelijk geclassificeerd als laagwaardige artefacten door standaard algoritmische drempels, maar werden succesvol teruggevonden en gevalideerd door Sanger-sequencing volgens het signaal-ruisversterkingsprotocol. Deze analytische observatie suggereert dat het evalueren van fysieke signaalkenmerken een nuttig hulpmiddel kan zijn in verkennende onderzoeksprocessen.

Vergelijkende benchmarking met standaardworkflows

Om de vergelijkende prestaties van dit geïntegreerde framework te beoordelen, werd een benchmarkanalyse naast elkaar uitgevoerd met twee standaard variant calling pipelines: de GATK Best Practices workflow (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) en DeepVariant (v1.5). De prestatiemetrics werden berekend met behulp van een high-confidence validatiesubset van de cohort, geëvalueerd over genomische gebieden met lage dekking (diepte < 30x) en high-noise regio's. De vergelijkende architectuur wordt samengevat in Tabel 4.

Kwantitatieve parameterisatie en validatie van computationele modellen

Om de biofysische en stochastische kaders in kwantitatieve termen te verankeren, werden de ODE's en Gillespie-simulaties geparametriseerd met empirische kinetische waarden die waren gekalibrerd op experimentele controleomstandigheden. Continue ODE-simulaties volgen de absolute concentratie van gefosforyleerd STAT2 ([STAT2p]) over een tijdsduur van 720 minuten na gesimuleerde blootstelling aan type I interferon. In het wildtype (WT) computationele model toonde de signaleringscascade snelle homeostatische demping, gekenmerkt door een activatiepiek bij t = 45 min, gevolgd door snelle clearance gedreven door geprogrammeerde negatieve feedback (k3 = 0,45 min-1) via gesimuleerde SOCS1-expressie. Daarentegen toonde het modelleren van gain-of-function (GoF) variaties in STING1- en TYK2-routes ernstige drempelverschuivingen aan, wat resulteerde in een aanhoudende, niet-opruimende hyperinflammatoire toestand. De halfwaardetijd van het signaal (t1/2) en de veranderingen in de stabile vouw worden samengevat in Tabel 5.

Data Beschikbaarheidsverklaring

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level klinische gegevens die overeenkomen met de uiteindelijke cohort worden verstrekt in Aanvullende Tabel S1. De discrete digitale signaalverwerkingsdrempels, wiskundige formuleringen, softwareomgevingen en rekenparameters die nodig zijn om de DFT-filter- en biofysische padsimulaties (ODE's en stochastische modellering) te repliceren, zijn openbaar beschikbaar gesteld. Om permanente en onbelemmerde toegang voor lezers te garanderen, is dit replicatieframework op GitHub geplaatst en permanent gearchiveerd in Zenodo via DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Standaard open-source softwarebibliotheken en numerieke computerplatforms die in deze workflow worden gebruikt, zoals NumPy, SciPy en COPASI, zijn openbaar toegankelijk.

Figuur 3. Operationele storyboard- en datagedreven pijplijnarchitectuur voor de identificatie en biofysische modellering van type I interferonopathie-gerelateerde varianten. Het schema schetst een chronologische, vierlaagse experimentele en computationele workflow, waarin klinische cohortanalyse wordt geïntegreerd met biologische signaalverwerking. (A) Cohortstratificatie en NGS-pijplijn: workflow voor de pediatrische auto-inflammatoire cohort (n = 132) die WES ondergaat. De inset toont representatieve ruwe FastQ-kwaliteitscontrole Phred-scoretracks, die overgaan in GATK/DeepVariant-variantaanroepen en de definitieve VCF-matrixgeneratie. (B) DFT-gebaseerde signaalverwerking: algoritmische vertaling van genomische tekst naar numerieke genomische signalen voor ruisreductie. De ingebedde, datagedreven grafiek zet een vermogensspectrumverdeling weer en identificeert pathogene variantfrequenties (signaalpieken) tegen genomische achtergrondruis met een SNR-drempel van >20 dB. (C) In silico curatiepoort: meerlaagse prioriteringstriezel die ACMG 5-tier pathogeniciteitsrichtlijnen, HGMD en Infevers kruiscontroles integreert om de 79 nieuwe en 13 gerapporteerde varianten te prioriteren. (D) Validatie van functionele biofysische modellering: biologische validatielaag. Het deterministische ODE-kader en stochastische Gillespie-simulatiecurves zijn geïntegreerd als grafische componenten, die de 720 minuten durende tijdsherstel en de aanhoudende signalering van wildtype versus gesimuleerde mutantcellulaire kinetiek weergeven. Afkortingen: ACMG = American College of Medical Genetics and Genomics; DFT = discrete Fouriertransformatie; GATK = Genoomanalyse Toolkit; HGMD = Human Gene Mutation Database; NGS = next-generation sequencing; ODE = gewone differentiaalvergelijking; SNR = signaal-ruisverhouding; VCF = variant call formaat; WES = whole-exome sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 3: Uitgebreide annotatie en locusdatabasecontrole van geïdentificeerde type I interferonopathie-geassocieerde genetische varianten binnen de pediatrische cohort (n = 132). ACMG-criteria (uit de ACMG/AMP-richtlijnen van 2015): ACMG/AMP-bewijscodes werden gegroepeerd op bewijssterkte. Zeer sterk bewijs bevatte PVS1, wat verwijst naar voorspelde functieverliesvarianten in genen waarbij functieverlies een gevestigd ziektemechanisme is. Sterk bewijs omvatte PS1–PS4, dat eerder vastgestelde aminozuurveranderingen, bevestigd de novo voorkomen, ondersteunend functioneel bewijs en verhoogde frequentie van varianten bij getroffen personen omvatte. Matig bewijs omvatte PM1–PM6, inclusief locatie in een kritisch domein of mutatie-hotspot, afwezigheid of zeer lage frequentie in populatiedatabases, trans-voorkomen bij recessieve aandoeningen, veranderingen in de eiwitlengte, nieuwe missense-veranderingen bij residuen met bekende pathogene variatie, en verondersteld de novo voorkomen. Ondersteunend bewijs omvatte PP1–PP5, waaronder cosegregatie, gen-specifieke missense-beperking, in silico-bewijs , fenotypespecificiteit en betrouwbare eerdere meldingen van pathogeniciteit wanneer onafhankelijk bewijs niet beschikbaar was. Klik hier om deze tabel te downloaden

Tabel 4: Side-by-side prestatievergelijking van variant calling pipelines in high-noise genomische regio's. Benchmarking-evaluatie werd uitgevoerd in gebieden met lage dekking (<30x) om de prestaties van het fysica-gebaseerde DFT-laagdoorlaatfilter te beoordelen bij het elimineren van sequencingruis en het beschermen van echt-positieve signalen ten opzichte van standaard algoritmische configuraties. Afkortingen: DFT = discrete Fouriertransformatie. Klik hier om deze tabel te downloaden

Tabel 5: Kwantitatieve kinetische parameters en stationaire variaties van downstream JAK-STAT-signalering. Samenvatting van ODE- en stochastische Gillespie-simulatiegrenzen over een tijdsduur van 720 minuten, waarbij het falen van cellulaire homeostatische attenuatie in modellen met pathogene STING1- en TYK2-variaties wordt benadrukt. Afkortingen: JAK-STAT = Janus kinase-signaaltransducer en activator van transcriptie; ODE = gewone differentiaalvergelijking; STING1 = stimulator van interferonrespons cGAMP interactor 1; TYK2 = tyrosinekinase 2. Klik hier om deze tabel te downloaden

Aanvullende Tabel S1. Patiëntniveau-dataset voor de pediatrische cohort met interferonopathie-geassocieerde varianten. De tabel geeft de patiëntgegevens die overeenkomen met de uiteindelijke cohort van 132 patiënten die in het manuscript zijn geanalyseerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen in het protocol zijn DNA-fragmentatie, adapterligatie, PCR-amplificatie en single-string DNA (ssDNA) circularisatie. Tijdens deze fasen is een nauwkeurige uitvoering essentieel om het risico op besmetting te minimaliseren. Precieze ethanolwassingen en geschikte magnetische incubatietijden tijdens kraalzuivering zijn verplicht, omdat afwijkingen kunnen leiden tot een verminderde productopbrengst of gemist van variantdetectie. Tijdens de voorbereiding van de gezamenlijke bibliotheek is een nauwkeurige berekening van 93,75 ng per patiënt en zorgvuldige volumecorrectie vereist.

Voor protocoloptimalisatie en probleemoplossing kunnen metingen van lage fluorometrische kwantificatie, met name ssDNA-concentraties onder de drempel van 0,8–2 ng/μL, noodzakelijk zijn om de sequencingdiepte te vergroten of de droogtijden van de kralen te verkorten om de gevoeligheid voor variantaanroepen te verbeteren. In gevallen van vermoedelijke mozaïekvarianten kan integratie van long-read sequencing-technologieën de detectienauwkeurigheid verbeteren. Daarnaast is snelle overdracht van monsters op ijs na enzymatische vertering cruciaal voor het behouden van productstabiliteit^12,13. Tijdens de voorbereiding van DNB behoudt langzaam en zacht pipetteren, samen met zorgvuldige toevoeging van stopbuffer, de integriteit van de nanoballen. Dit is vooral belangrijk voor het vaststellen van genotype-fenotype correlaties bij vroeg-aanvangsinterferonopathieën zoals SAVI ^6,11.

Deze op WES gebaseerde genetische analyse biedt een kader voor het evalueren van interferonopathie-geassocieerde varianten bij pediatrische patiënten met auto-inflammatoire kenmerken en vasculitis. Door varianten te identificeren in belangrijke genen zoals DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 en COPA, benadrukt de studie de genetische heterogeniteit die ten grondslag ligt aan interferon-gedreven vasculitische fenotypes. De frequentie van varianten in nucleïnezuurmetabolisme en sensinggenen, met name DNASE1 en ADAR, in deze cohort is consistent met de centrale rol van gedisreguleerde type I interferonsignalering in de pathogenese van pediatrische vasculitis en autoinflammatoire ziekten. Deze bevindingen zijn consistent met eerdere rapporten die deze genen koppelen aan interferonopathieën en vasculitische manifestaties ^4,5,7.

Door vasculitisachtige presentaties van monogene auto-inflammatoire syndromen te verduidelijken, zoals de cutane en interstitiele longbetrokkenheid die bij SAVI is waargenomen, kan deze aanpak een vroege diagnose bevorderen en anti-interferongerichte therapieën ^{sturen 4,5,7}. Monogene interferonopathieën kunnen klinisch ANCA-geassocieerde vasculitis en andere vasculitiden bij kinderen nabootsen, wat het belang van genetisch testen in atypische of behandelingsresistente gevallen onderstreept ^9,10,11. Vroege genetische diagnose kan ook tijdige start van gerichte behandelingen mogelijk maken, zoals JAK-remmers, die klinisch voordeel hebben getoond bij patiënten met STING1 en andere interferongerelateerde mutaties ^7,13,14.

Deze studie bevestigt ook dat een aanzienlijk deel van de pediatrische patiënten met complexe auto-inflammatoire vasculitis zeldzame of nieuwe varianten in interferonopathie-gerelateerde genen heeft. De identificatie van 79 nieuwe varianten in deze grote cohort breidt het bekende genetische spectrum uit en kan bijdragen aan betere genotype-fenotype correlaties bij vasculitis bij kinderen.

Een operationele overweging in deze verkennende workflow is het evalueren van drempellimieten, aangezien afwijkingen in de verkennende SNR-parameters de filteruitgang kunnen veranderen. Zo helpt DFT-gebaseerde filtering van nucleotideverdelingen bij denoise-lezingen, maar vereist kalibratie om overgladmaking van mutatiesignalen te voorkomen; Probleemoplossing omvat iteratieve aanpassing van binaire mappingparameters (0 voor purines, 1 voor pyrimidinen) om feature-extractie^{te optimaliseren 15}. In biofysische modellering is het definiëren van beginvoorwaarden voor ODE's essentieel, omdat kleine verstoringen in versterkingssnelheden drempelgedrag kunnen verschuiven, waardoor mogelijk een onderschat van aanhoudende interferonsignalering wordt veroorzaakt. Verbeterde details van JAK-STAT omvatten het modelleren van de rol van TYK2 in IFN-α signalering, waarbij gain-of-function varianten de activatie van STAT2 versterken, wat leidt tot interferonopathiefenotypes²⁰.

Aanpassingen aan de methode kunnen het integreren van stochastische elementen voor ruisachtige cellulaire omgevingen omvatten, zoals het toevoegen van Langevin-ruistermen aan ODE's:

dX = f(X)dt + g(X)dW

waarbij dW de vermelde term Wiener-procesruis vertegenwoordigt, wat het realisme verhoogt bij het simuleren van JAK-STAT-variabiliteit²¹. Stochastische simulaties van interferonroutes, met behulp van Gillespie-algoritmen, leggen heterogeniteit vast in IFN-β-expressie door negatieve terugkoppelingslussen, waarbij cel-tot-cel verschillen in transcriptiefactorniveaus resulteren in bimodale verdelingen van ISG-activatie^22,23. Troubleshooting pathway-modellen omvat validering tegen experimentele IFN-β data; Als de versterking divergaat, kunnen negatieve controles zoals fosfatase-activatiesnelheden worden herkalibreerd, of kunnen verspreide vertragingen worden opgenomen voor transcriptie:

met gamma-kernel voor vertraagde processen.

In vergelijking met whole-genome sequencing (WGS) kan deze op WES gerichte aanpak kosteneffectief zijn, maar minder uitgebreid voor niet-exonische regio's^24,25. De reikwijdte van dit voorlopige kader beperkt zich tot het bieden van een ondersteunend biochemisch simulatiemodel om te evalueren hoe wiskundige variaties correleren met geschatte interferonsignaleringsgedrag, zoals te zien is in drempelmodellen waar cumulatieve effecten kritische waarden overschrijden die leiden tot vasculair letsel. Beperkingen van de methode zijn onder meer het potentieel om laag-niveau mozaïekvarianten te negeren en de vereiste voor functionele validatie van nieuwe bevindingen⁶.

Deze techniek heeft potentiële toepassingen in immunologie en vasculaire geneeskunde, waaronder het sturen van anti-interferontherapieën door het simuleren van varianteffecten op routes en het verrijken van databases voor diagnostiek van zeldzame ziekten¹⁹. Stochastische extensies kunnen de voorspelling van heterogene responsen bij interferonopathieën verder mogelijk maken, wat gepersonaliseerde geneeskunde ondersteunt.

In deze studie wordt genetische evaluatie bij pediatrische vasculitis benadrukt, naast conventionele diagnostische instrumenten zoals histopathologie en beeldvormingsmodaliteiten. Al met al benadrukt deze studie het belang van genetische evaluatie bij pediatrische vasculitis, terwijl de frequentie van interferonopathie-gerelateerde varianten die worden vastgesteld bij patiënten die genetische analyse ondergaan op vermoedelijke auto-inflammatoire ziekten, wordt benadrukt. Door de impact van deze varianten op interferonsignaleringsroutes te beoordelen en het belang van vroege diagnose bij pediatrische vasculitis te onderstrepen, draagt dit werk bij aan de verrijking van de database over zeldzame ziekten gerelateerd aan vasculitische en autoinflammatoire aandoeningen en biedt het inzichten voor toekomstige studies die variantpathogeniciteit en populatiespecifieke polymorfismen onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Verstelbare Pipetten (P2, P10, P20, P200, P1000)	Elke leverancier		Voor nauwkeurige vloeistofbehandiging
Benchtop Centrifuge	Elke leverancier		Voor kort centrifugeren van PCR-buisjes
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (of gelijkwaardig)	PCR-amplificatie master mix
Ethanol (moleculaire biologie kwaliteit)	Elke leverancier		Gebruikt om 80% ethanol wasoplossing te bereiden
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Inbegrepen in kit of afzonderlijk	Library-amplificatie primers
Laag bindende PCR-buisjes (0,2 ml)	Elke leverancier		Steriele PCR-buisjes
Magnetische standaard / magnetische rek	Elke leverancier		Voor magnetische parelscheiding
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Benchtop volgende generatie sequencer met behulp van DNBSEQ-technologie (DNA Nanoball Sequencing); ondersteunt meerdere leeslengtes (bijv. SE50 tot PE300); hoge doorvoer tot 1440 Gb per run; ideaal voor WES, WGS en gerichte sequencing toepassingen.
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) of 1000005260 (V2.0)	Circularization kit voor het genereren van enkelstrengs circulair DNA (ssCirDNA); dubbele barcode versie vermindert index hopping; essentiële stap na bibliotheekvoorbereiding voor DNB-vorming in MGI-sequencing workflow.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Magnetische parels voor DNA-zuivering
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (geïntegreerd met Dual Barcode Circularization) of gerelateerde DNB Make (bijv. 940-000036-00 Onestep DNB)	DNA Nanoball (DNB) voorbereidingsmodule; omvat circularisatie en nanoball-generatie voor flow cell-belasting; laatste stap in bibliotheekverwerking voor DNBSEQ-sequencers (vaak gecombineerd met Circularization Kit).
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (of gelijkwaardig)	Bevat Blocker Solution, MGI Universal Blockers, Enhancer, Binding Buffer, Wash Buffer 1 & 2, en Streptavidin beads
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (of Twist CES Probes, compatibel met MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (voor MGIEasy) of Twist Bioscience (voor Twist)	1000007745 (V4 Probe Set, 16 RXN) of 1000007740 (Probes); Twist: Custom / panel-specifiek (op bestelling, geen standaardnummer)	Hybridisatie-gebaseerde gehele exoom capture probes; richt zich op ~59 Mb coderende gebieden (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); ontworpen voor hoge efficiëntie verrijking in WES workflows op DNBSEQ-platforms; gebruikt met MGIEasy Accessory Kit voor hybridisatie (65°C pre-incubatie, 16 uur 's nachts bij 65°C), blocker toevoeging, streptavidin bead capture (binding buffer, Wash Buffer 1/2 bij 48°C), elutie en post-capture PCR-amplificatie (compatibel met Equinox mix).
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Hybridisatie- en wasreagentia
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (16 RXN set) of 1000005256 (96 RXN kernkit)	Snelle fragmentatie-gebaseerde DNA bibliotheek voorbereidingskit; enzymatische fragmentatie met 5–400 ng gDNA input; compatibel met DNBSEQ-platforms voor efficiënte WGS/WES bibliotheekconstructie.
Nuclease-vrij water	Elke leverancier		Moleculaire biologie kwaliteit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Voor bibliotheek kwantificering
Qubit ssDNA Assay Kit (optioneel)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Voor ssDNA kwantificering na circularisatie
Streptavidine Magnetische Beads	MGI Tech	Inbegrepen in Accessory Kit	Voor hybride capture
TE Buffer (pH 8.0)	Elke leverancier		Voor denatureringsstap
Thermo Cycler	Verschillende (Bio-Rad, Thermo, etc.)		Gebruikt voor fragmentatie, ligatie, PCR en DNB programma's
Vortex Mixer	Elke leverancier		Voor monster menging
Breedbuis Pipet Tips	Elke leverancier		Vereist voor DNB voorbereiding