Multimodale gedragsfenotypering van stress-geïnduceerde depressie-achtige toestanden bij Drosophila melanogaster

Samenvatting

Dit protocol biedt een kader voor het beoordelen van door stress veroorzaakte gedragsveranderingen in Drosophila melanogaster. Door complementaire assays te combineren kunnen we activiteit, verkenning en besluitvorming voor individuele vliegen kwantificeren. De aanpak is flexibel en kan worden aangepast aan een breed scala aan studies die stressbiologie, metabolisme en neurogedragsfunctie onderzoeken.

Samenvatting

Metabole, neurodegeneratieve en stressgerelateerde aandoeningen gaan vaak gepaard met veranderde voortbeweging, verminderde besluitvorming en verminderde gedragsflexibiliteit. Echter, toegankelijke multimodale gedragskaders om deze fenotypen bij Drosophila melanogaster te kwantificeren blijven beperkt. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat geforceerde zwemblootstelling, Y-doolhof-draaigedrag en handigheid, fototaxi's en activiteitsbeoordeling in het FlyVac-systeem, openveldverkenning en langdurige locomotorische monitoring met de Drosophila Activity Monitor integreert. Deze complementaire assays vangen meerdere gedragsdimensies vast, waaronder motorische output, motivatie, besluitvormingsstructuur en gedragsvariabiliteit, als functionele uitlezingen van neurale en metabole toestanden. De pijplijn is schaalbaar, reproduceerbaar en aanpasbaar voor farmacologische, genetische en omgevingsmanipulaties, en biedt een veelzijdig kader voor het detecteren van gedragsfenotypes gerelateerd aan stress, metabole en neurodegeneratie in Drosophila.

Inleiding

Gedragsveranderingen zoals veranderingen in voortbeweging, besluitvorming en verkennende activiteit worden veel gebruikt als indicatoren op organismeniveau van neurale en fysiologische toestand. Tussen taxa uit neurale disfunctie zich vaak in veranderde bewegingsstructuur, verminderde exploratiemotivatie, verminderd sensorisch geleid besluitvormingsgedrag en veranderingen in gedragsvoorspelbaarheid. Omdat deze organisme-niveau outputs neurale, metabole en fysiologische toestand integreren, leveren ze schaalbare uitdata om ziekte-relevante fenotypes te detecteren. Ondanks het uitgebreide gebruik van Drosophila melanogaster in moleculaire genetica en neurowetenschappen, blijven gestandaardiseerde multimodale gedragskaders die tegelijkertijd locomotorische prestaties, beslissingsstructuur en gedragsvariabiliteit vastleggen, beperkt.

Modelorganismen zijn essentieel voor het bestuderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan stressgerelateerde en neuropsychiatrische fenotypes, omdat gecontroleerde experimentele manipulatie bij mensen vaak onmogelijk is. Stressgerelateerde gedragssyndromen komen voor bij veel taxa, waaronder insecten, en betreffen geconserveerde neuromodulerende systemen, zoals serotonine en dopamine, evenals metabole signaalroutes. De fruitvlieg is daarom uitgegroeid tot een krachtig systeem om moleculaire disfunctie te koppelen aan gedragsuitkomsten op organismeniveau, dankzij zijn korte generatietijd, genetische tractabiliteit en behoud van ziekte-relevante routes ^1,2.

Tegelijkertijd worden veel gedragsonderzoeken bij Drosophila meestal geïsoleerd toegepast, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen algemene ziekte-effecten, motorische stoornissen, motivatieveranderingen en gedragsveranderingen op beslissingsniveau. Bovendien kunnen alleen gemiddelde gedragsmaten biologisch betekenisvolle fenotypes verhullen, aangezien neuromodulerende en ontwikkelingsstoornissen vaak de gedragsvariabiliteit veranderen in plaats van de gemiddelde gedragsoutput. Een multimodale gedragsbenadering die locomotorische, verkennende, sensorische en besluitvormingsassays combineert, is daarom noodzakelijk om robuuste fenotypische signaturen op organismeniveau^{te genereren 3}.

Hier wordt een multimodale gedragspipeline gepresenteerd die gedwongen zwemblootstelling ^4,5, Y-doolhof-draaigedrag en handigheid ^6,7,8,9, fototaxis en activiteitsbeoordeling met het FlyVac-systeem^10,11, open-veld exploratie¹², en langdurige locomotormonitoring met de Drosophila Activity Monitor ^5,13 integreert (Figuur 1). Elke assay in dit kader vangt een unieke gedragsdimensie die relevant is voor stressgerelateerde fenotypes. De gedwongen zwemtest meet passief copinggedrag, waarbij een eerdere overgang naar immobiliteit een verminderde motivatie om ontsnappingsreacties vol te houden. De open-field en DAM-assays kwantificeren algemene locomotorische activiteit en circadiane structuur, en bieden basismetingen van motorische output en opwinding. De Y-doolhof-assay vangt de besluitvormingsstructuur vast via reeksen links-rechts keuzes, waardoor schatting mogelijk is van zowel draaibias (lateralisatie) als gedragsvariabiliteit als maatstaf voor voorspelbaarheid. Tot slot evalueert de FlyVac-assay sensorisch geleide besluitvorming en benaderings-vermijdingsgedrag door herhaalde fototactische keuzes. Samen bieden deze assays complementaire uitlezingen die veranderingen in activiteit, motivatie en gedrag op beslissingsniveau onderscheiden.

Dit protocol vangt complementaire aspecten van motorische output, motivatie, besluitvormingsstructuur en gedragsvariabiliteit en biedt een schaalbaar kader voor het detecteren van gedragsfenotypes gerelateerd aan stress, metabole en neurodegeneratie in D. melanogaster¹⁴. Het primaire doel van deze studie is het opzetten van een multimodaal gedragsfenotyperingskader dat complementaire assays integreert om meerdere dimensies van door stress veroorzaakte gedragsverandering vast te leggen. Het stressparadigma wordt hier gebruikt als een gestandaardiseerde verstoring om de gevoeligheid en toepasbaarheid van het kader aan te tonen.

Protocol

De geforceerde zwemtest werd uitgevoerd volgens de principes van de 3R's (Vervanging, Reductie en Verfijning). Vervanging werd bereikt door Drosophila melanogaster als ongewervelden model te gebruiken, waardoor geforceerde zwemparadigma's van gewervelden werden vermeden die om ethische redenen steeds meer worden beperkt. De reductie werd ondersteund door het hoge doorvoerkarakter van de assay, wat robuuste gedragsinferentie van relatief kleine groepen mogelijk maakt terwijl het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. De verfijning werd aangepakt door de zwemblootstelling te beperken tot 2 minuten, een duur die uitputting of verdrinking voorkomt en direct na testen volledig herstel van normaal bewegingsgedrag mogelijk maakt. Samen zorgen deze overwegingen ervoor dat de assay betekenisvolle gedragsgegevens levert, terwijl mogelijk stress wordt geminimaliseerd en ethische acceptatie wordt gemaximaliseerd, ook in onderwijsomgevingen.

1. Inductie van een depressie-achtige toestand bij Drosophila (vibratiestressprotocol)

1. Verzamel mannelijke D. melanogaster binnen 24 uur na eclosie onder lichte CO₂-anesthesie. Alle details worden vermeld in de Materiaaloverzicht.
2. Plaats vliegen in groepen van 10 in polypropyleen- of acrylbuisjes (95 mm lang × 25 mm binnendiameter) die met katoenen pluggen zijn afgesloten.
3. Vliegen worden blootgesteld aan mechanische trillingen (300 Hz) met behulp van een vibratieplatform.
4. Voer herhaalde cycli uit bestaande uit 45 minuten trilling gevolgd door 15 minuten herstel in flesjes met standaardvoedsel.
5. Blijf vibratiecycli voortzetten voor in totaal 6 uur per dag.
6. Herhaal het stressprotocol drie dagen achter elkaar.
7. Houd controlevliegen onder identieke huisomstandigheden zonder blootstelling aan trillingen.
   OPMERKING: In het huidige protocol werden alleen mannelijke vliegen gebruikt om de variabiliteit die samenhangt met geslachtsspecifieke fysiologische en gedragsverschillen, waaronder voortplantingstoestand en hormonale invloeden, te verminderen. Deze standaardisatie vergemakkelijkt het opsporen van door stress veroorzaakte gedragseffecten in een gecontroleerde omgeving. Het protocol is echter volledig toepasbaar op vrouwelijke vliegen, en geslachtsspecifieke reacties vormen een belangrijk gebied voor toekomstig onderzoek. Aangezien gevoeligheid voor stressgerelateerde en depressie-achtige fenotypes kan variëren met geslacht en leeftijd tussen taxa, waaronder Drosophila, kan het uitbreiden van dit kader naar verschillende demografische groepen extra biologische inzichten bieden. Dit paradigma is aangepast van gevestigde modellen voor oncontroleerbare vibratiestress die motivatie- en activiteitsveranderingen bij vliegen veroorzaken.

2. Gedwongen zwemtest in Drosophila melanogaster

VOORZICHTIG: Natriumdodecylsulfaat (SDS) is een irriterend middel. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen en oogbescherming) bij het voorbereiden en hanteren van SDS-oplossingen. Vermijd huid- en oogcontact. Verwijder afval met SDS volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.

1. Verzamel volwassen vliegen binnen 24 uur na eclosion en houd ze onder constant licht en gecontroleerde omgevingsomstandigheden.
2. Bereid multi-well chamber-slides voor en vul elke put met ~2 mL 0,08% SDS-oplossing bij kamertemperatuur.
3. Plaats direct voor het opnemen een enkele vlieg in elke put. Er is geen narcose nodig.
4. Noteer gedrag met een bovenaanzichtcamera gedurende 2 minuten om de latentie tot de eerste immobiliteit te kwantificeren.
5. Kwantificeer de latentie tot de eerste immobiliteit.
6. Verwijder vliegen na het registreren en leg ze op absorberend papier om het herstel van normale voortbeweging te bevestigen.
   OPMERKING: Immobiliteit wordt gedefinieerd als het stoppen van actieve ontsnappingsbewegingen terwijl de positie aan het oppervlak behouden blijft. Om extra parameters zoals de totale immobiliteduur en het aantal immobiliteitsperiodes vast te leggen, zijn langere opnametijden nodig (bijvoorbeeld 3 minuten). Deze test weerspiegelt passief copinggedrag; Verminderde latentie tot immobiliteit wordt geïnterpreteerd als verminderde motivatie om ontsnappingsreacties vol te houden. Variabiliteit in latentie tot immobiliteit / totale immobiliteit tussen vliegen. Deze test kan tijdelijke stress of vermoeidheid veroorzaken. Wanneer het wordt gebruikt in longitudinale ontwerpen, voer het uit vóór andere assays en zorg voor voldoende herstel (bijv. ≥24 uur) voor verdere tests.

3. Langdurige monitoring van locomotorische activiteit met behulp van de Drosophila Activity Monitor (DAM)

1. Verdoof fruitvliegjes kort (5 seconden) met CO₂ voor sortering.
2. Plaats individuele vliegen in glazen DAM-buizen met voedsel en katoenen plugs¹⁷.
3. Steek de buisjes in het Drosophila Activity Monitor-systeem.
4. Registreer de bewegingsactiviteit continu (48 uur) onder gecontroleerde temperatuur- en licht-donker omstandigheden.
5. Store beam-break telt met acquisitiesoftware.
6. Verwerk activiteitsgegevens in gedefinieerde tijdsintervallen (bijv. 1–10 minuten).
7. Sluit vliegen uit die sterven of geen activiteit vertonen na de acclimatie.
   OPMERKING: Continue locomotorische monitoring over een periode van 48 uur is voldoende om circadiane activiteitspatronen vast te leggen. DAM: variabiliteit in totale afstand, snelheid en gevechtsstructuur tussen individuen.

4. Lokomotor-assay in open veld

1. Kort (5 seconden) verdoven fruitvliegen met CO₂.
2. Breng individuele vliegen over naar rechthoekige arena's van 25 x 75 mm (één vlieg per arena).
3. Laat vliegen acclimatiseren (20 minuten) aan de arenaomgeving voordat ze worden opgenomen onder constant, laagintensief diffus wit licht.
4. Neem gedrag op onder constante verlichting met behulp van een geautomatiseerd videotrackingsysteem.
5. Analyseer trajecten met behulp van trackingsoftware om het volgende te extraheren:
   Totale afstand verplaatst
   Gemiddelde snelheid van de locomotor
   Versnellings- en bochtmetrieken
   OPMERKING: Deze test biedt een basis voor het interpreteren van gedragsveranderingen gerelateerd aan stress. De acclimatieperiode minimaliseert door de door het hanteren veroorzaakte stress en stelt vliegen in staat zich aan de arena te wennen, zodat geregistreerde locomotorische activiteit het basisgedrag weerspiegelt. Constante verlichting werd gebruikt om de variabiliteit van circadiane fluctuaties te verminderen en om consistente gedragscondities tussen de onderzoeken te waarborgen. Trajectorieën kunnen worden geëxtraheerd met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware zoals EthoVision XT (Noldus Information Technology), of met open-source alternatieven zoals Ctrax, idTracker en TrackMate (ImageJ/Fiji), afhankelijk van beschikbaarheid en voorkeur van de gebruiker. Open-field assay: variabiliteit in totale afstand, snelheid en gevechtsstructuur tussen individuen. Om order-effecten te verminderen, standaardiseer acclimatie en lichtomstandigheden tussen sessies. Wanneer meerdere assays op dezelfde individuen worden uitgevoerd, houd dan de blootstellingsduur van de arena consistent.

5. Y-doolhof-draaiende gedrags- en gedragsvariabiliteitstest

1. Verdoven fruitvliegjes kort (5 seconden) met CO₂.
2. Plaats individuele vliegen in Y-doolhofkamers ^8,9. Doolhoven werden met een lasergraveur in 1,6 mm dik zwart acryl gesneden. We plaatsten vliegen in een reeks van 95 afzonderlijke doolhoven, elk bestaande uit drie symmetrische armen (12 mm lang en 3,3 mm breed).
3. Laat vliegen vrij verkennen gedurende langere opnameperiodes (20 min).
4. Record-draaibeslissingen (links of rechts) tijdens verkennende voortbeweging (1 uur).
5. Bereken individuele draaibias als het aandeel rechtsbochten. Bereken relevante metrieken zoals snelheid, versnelling, beweging zonder beweging, tijdsgebaseerde variaties in activiteit^12,15.
6. Kwantificeer gedragsvariabiliteit tussen vliegen met behulp van de mediane absolute deviatie (MAD) van draaibias.
   OPMERKING: Deze assay meet de bewegingshandigheid en gedragsvoorspelbaarheid, onafhankelijk van het algehele activiteitsniveau. Draaireeksen leggen de beslissingsstructuur vast; Turning bias weerspiegelt lateralisatie, terwijl variabiliteit tussen individuen gedragsvoorspelbaarheid weerspiegelt. bias = aandeel rechtsbochten (per vlieg); Variabiliteit = verspreiding (MADn) van bias tussen vliegen. Voor herhaald testen kun je overwegen de assayvolgorde tussen individuen of cohorten te compenseren om sequentie-effecten te controleren.

6. Fototactische keuzes: activiteitsmonitoring in het FlyVac-apparaat

1. Laad individuele vliegen in FlyVac-kamers ^6,11 zonder gebruik te maken van CO-2-anesthesie.
2. Laat acclimatisatie (10 minuten) toe voordat je met de proeven begint.
3. Geef herhaalde binaire licht-donker keuzes aan elke vlieg.
4. Registreer keuzes over 40 proeven met behulp van geautomatiseerde detectie.
5. Bereken de lichtkeuzekans per vlieg en de gemiddelde tijd tussen lichtkeuzes als maatstaf voor activiteit.
6. Kwantificeer gedragsvariabiliteit tussen individuen met behulp van MAD.
   OPMERKING: Het FlyVac-systeem maakt gelijktijdige beoordeling van gemiddelde beslissingsbias en interindividuele variabiliteit mogelijk. De gedragstests die in dit protocol worden beschreven, zijn modulair en kunnen in verschillende volgordes worden uitgevoerd, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Om de mogelijke overdrachtseffecten te minimaliseren, wordt echter aanbevolen om de verplichte zwemtest uit te voeren vóór andere assays. Om order-effecten te verminderen, standaardiseer acclimatie en lichtomstandigheden tussen sessies.

7. Data-analyse

OPMERKING: Gedragsanalyses werden uitgevoerd met individuele vliegen als inferentie-eenheid, tenzij anders vermeld.

1. Verplichte zwemtest: Analyseer de video-opnames handmatig of met behulp van gedragsscoresoftware.
   OPMERKING: Immobiliteit werd gedefinieerd als het ontbreken van actieve ontsnappingsbewegingen terwijl de vlieg boven water bleef. De volgende parameters werden per vlieg geëxtraheerd: latentie tot eerste immobiliteit(en). Groepsvergelijkingen werden uitgevoerd met niet-parametrische statistische tests vanwege de niet-normale verdeling van gedragsmaten.
2. Langdurige locomotorische activiteit (DAM): Recordaantal bundelbreuken door de Drosophila Activity Monitor. Exporteer en bak in intervallen van 10 minuten.
   OPMERKING: Voor elke vlieg werden totale activiteitstellingen en circadiane activiteitspatronen berekend. Deze patronen kunnen worden berekend in R, Python of Excel—afhankelijk van wat beschikbaar is. Vliegen die inactiviteit vertoonden door sterfte of technische artefacten werden uitgesloten vóór de analyse. De test duurde 48 uur.
3. Open-veld locomotorassay: Verwerk de videotrackinggegevens met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware. Importeer de videobestanden in EthoVision XT. Voer tracking uit met behulp van geautomatiseerde detectie met contrastgebaseerde drempelwaarde.
   OPMERKING: Trajectorieën zijn gladgestreken met het standaard filteralgoritme. Per-fly locomotorparameters (afstand, snelheid, versnelling) werden geëxporteerd als CSV-bestanden voor downstream analyse. Parameters per vlieg omvatten: totale afstand (mm), acceleraties (mm/^s). Samenvattende statistieken werden op individueel niveau berekend voorafgaand aan de groepsvergelijking. De duur van deze test was 1 uur per groep.
4. Y-doolhof draaigedrag: Haal de draaibeslissingen uit geregistreerde trajecten, classificeer als links of rechts, en exporteer als binaire sequenties (links/rechts) voor elk individu.
   OPMERKING: Voor elke vlieg werd de draaibias berekend als het aandeel rechtse bochten over alle geregistreerde beslissingen. De gedragsvariabiliteit tussen vliegen werd gekwantificeerd met behulp van de geschaalde mediane absolute deviatie (MAD_n = 1,4826 × MAD) van draaibias. De duur van deze test was 1 uur per groep.
5. FlyVac fototactische keuzes: Noteer automatisch binaire licht–donker keuzes. Voor elke vlieg bereken je de lichtkeuzekans (LCP) als het aandeel proeven waarin de lichte arm werd gekozen. Druk de fototactische bias uit als het gemiddelde van binaire trialuitkomsten (licht = +1, donker = −1).
   OPMERKING: De variabiliteit tussen vliegen werd gekwantificeerd met MAD_n van individuele fototaxis-indices.
6. Statistische analyse: Beoordeel de groepsverschillen in gedragsmaten met permutatietests en 10.000 labelrandomisaties.
   OPMERKING: Om variabiliteit te vergelijken werden permutatietests uitgevoerd op de absolute verschillen in MAD_n tussen groepen. Betrouwbaarheidsintervallen voor MAD_n schattingen werden verkregen met bootstrap resampling. Een twee-staart, niet-gekoppelde t-test werd gebruikt om de afstand die door vliegen werd afgelegd (mm) en maximale versnelling (mm/s²) te vergelijken. Voor datavisualisatie werden viooldiagrammen (voornamelijk om dichtheid, concentratie en scheefheid weer te geven), boxdiagrammen en kolomdiagrammen gebruikt. De statistische significantie werd geëvalueerd op α = 0,05.

Resultaten

De toepassing van het vibratiestressprotocol leverde meetbare gedragsveranderingen op over meerdere assays (Figuur 1) die zijn ontworpen om activiteit, copinggedrag en besluitvorming bij D. melanogaster vast te leggen.

Depressie-achtige inductie

Vliegen die werden blootgesteld aan herhaalde mechanische trillingen (Figuur 1A) vertoonden verminderde exploratieve activiteit en verande...

Discussie

Het huidige protocol demonstreert een multimodale benadering om depressie-achtige gedragstoestanden bij D. melanogaster op te wekken en te kwantificeren. Met behulp van een vibratie-gebaseerd stressparadigma gecombineerd met complementaire gedragstests toont deze studie aan dat depressie-achtige inductie kan worden waargenomen over maatstaven van copinggedrag, locomotorische activiteit, exploratieve dynamiek, besluitvorming en gedragsvariabiliteit¹⁶. Het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	Met alle platforms
Cotton closures for narrow vials	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Catalognummer: 51-101
Drosophila Activity Monitor (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: niet beschikbaar	32 buizen
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	Catalogusnaam: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Versie 11.0.1
Logitech C920 HD Pro Webcam, HD 1080p lensCatalognaam: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Zwitserland	RRID: niet beschikbaar	De overheadopnamecamera gebruikt voor FST
Narrow Fly Vial, Polypropylene	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Catalogusnummer: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, Nederland	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Sodium dodecyl sulfate (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Duitsland	Catalogusnaam: Sodium dodecyl sulfate (ACS reagent, ≥99% zuiverheid); RRID: niet beschikbaar
ZEISS Stemi 508 Stereomicroscope	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Duitsland	15634448