Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nucleaire magnetische resonantiemetabolomische analyse van gebruikte menselijke embryocultuurmedia: methodevalidatie en technische overwegingen

98 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71285

⸱

31 juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen, voorbereiden en analyseren van gebruikt menselijk embryocultuurmedium met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, waardoor reproduceerbare detectie van laag-moleculair gewicht metabolieten uit microlitermonsters onder routinematige klinische kweekomstandigheden mogelijk is.

Samenvatting

Gebruikt menselijk embryokweekmedium bevat metabolieten met een laag moleculair gewicht dat een niet-invasieve weergave van de preimplantatie-embryofysiologie kan bieden. De metabolomische analyse van deze monsters op basis van kernmagnetische resonantie (NMR) is echter technisch uitdagend omdat routinematige embryokweekcondities microlitervolumes, eiwitsuppletie en paraffineolie-overlays omvatten die achtergrondsignalen genereren en de spectrale kwaliteit aantasten. Hier presenteren we een geoptimaliseerde NMR-metabolomics-workflow voor gebruikte embryocultuurmedia met gecontroleerde druppelverzameling om olieverontreiniging te minimaliseren, fluorgeholpen ethyleenpropyleen (FEP) buisvoeringen om het monster chemisch te isoleren van de externe referentie (TMSP) terwijl microlitervolumes worden opgenomen, en de opname met een Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulssequentie om macromoleculaire achtergrondsignalen te onderdrukken. Het protocol maakt consistente detectie en kwantificering van laag-moleculaire massa metabolieten uit individueel gekweekte menselijke embryo's mogelijk en ondersteunt reproduceerbare analyses onder routinematige laboratoriumomstandigheden. Vanwege talrijke technische uitdagingen moet de methode goed worden gevalideerd voordat deze voor onderzoeks- of klinische doeleinden kan worden gebruikt.

Inleiding

Tijdens de pre-implantatieontwikkeling in vitro consumeren en geven embryo's continu metabolieten met een laag moleculair gewicht op in het omliggende medium. De samenstelling van het gebruikte embryokweekmedium (SECM) weerspiegelt daarom de metabole activiteit van het embryo en biedt een niet-invasieve functionele uitlezing van de embryofysiologie en ontwikkelingscompetentie 1,2. Analyse van deze metabole voetafdruk kan conventionele beoordelingsmethoden aanvullen en embryoselectiestrategieën in geassisteerde voortplantingstechnologieverbeteren 3,4. In het bijzonder zijn veranderingen in de omzet van aminozuren en koolhydraten in verband gebracht met het ontwikkelingspotentieel en de levensvatbaarheid van embryo's 5,6,7.

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie wordt veel gebruikt voor niet-gerichte metabolietprofilering van diverse biologische monsters, waaronder gebruikte embryocultuurmedia 8,9,10. Toch blijft de analyse van deze monsters analytisch uitdagend11. In de routinematige klinische praktijk worden embryo's gekweekt in gedefinieerde microomgevingen die fysiologische omstandigheden nabootsen. Kweekmedia worden aangevuld met eiwitten, meestal albumine, om de osmotische druk te stabiliseren, giftige verbindingen te binden en dragermoleculen te leveren voor lipiden en groeifactoren die de normale ontwikkeling ondersteunen12. Om verdamping te voorkomen en constante concentraties opgeloste stoffen te behouden, worden kweekdruppels overheen gelegd met steriele paraffineolie13.

Lipiden afkomstig van overlay-olie- en eiwitcomponenten genereren brede achtergrondsignalen die smalle resonanties van laagmoleculaire metabolieten zoals glucose, pyruvaat en aminozuren verhullen. Bovendien vereist het analyseren van microlitermonstervolumes in standaard 5 mm NMR-buizen aanzienlijke verdunning om het actieve volume van de RF-spoel te bereiken. Deze vermindering van de analytenconcentratie vermindert de signaal-ruisverhouding (S/N) aanzienlijk, waardoor metabolieten met een lage abundantie worden gemaskeerd en reproduceerbare kwantificering wordt belemmerd. Hoewel talrijke studies NMR-gebaseerde metabolomics hebben toegepast op gebruikte menselijke embryokweekmedia, heeft het ontbreken van gestandaardiseerde en reproduceerbare verzamel- en voorbereidingsprotocollen de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid tussen studiesbeperkt 8,9,11.

Hier presenteren we een op NMR gebaseerde metabolomics-workflow (Figuur 1) die is ontworpen om technische uitdagingen te overwinnen die samenhangen met het bemonsteren en analyseren van menselijke embryocultuurmedia. De aanpak combineert gecontroleerde druppelverzameling om olieoverdracht te verminderen, microliter-volumeverwerving met fluorgekleurde ethyleenpropyleen (FEP) liners om verdunningsartefacten te voorkomen, en macromoleculaire signaalverzwakking met behulp van een Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulssequentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd tussen januari en april 2023 bij de afdeling Reproductieve Geneeskunde en Gynaecologische Endocrinologie, Universitair Medisch Centrum Maribor, Slovenië. NMR-analyse werd uitgevoerd bij het Nationaal Instituut voor Chemie in Ljubljana, Slovenië. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen. Het kreeg goedkeuring van zowel de Institutionele Ethische Commissie (nr. UKC-MB-KME-1/21) als de Nationale Commissie voor medische ethiek (nr: 0120-37/2021/15).

1. Studieontwerp

OPMERKING: De studie analyseerde kweekmedia van menselijke gebruikte embryo's met behulp van NMR-gebaseerde metabolomics.

  1. Verzamel monsters na uitgebreide embryokweek na intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Verzamel een gelijk aantal ongebruikte geïncubeerde controlemonsters.

2. Monsterverzameling

  1. Verzamel gebruikte embryokweekmedia (SECM) monsters na de embryo-incubatie, zoals geïllustreerd in Figuur 2.
  2. Na het verwijderen van het embryo uit de kweekdruppel aspireer je zorgvuldig overtollige olie van het oppervlak van de kweekschaal zonder het medium te verstoren (Figuur 2, stap 1).
  3. Met een steriele pipet aspireer je ongeveer 35 μL kweekmedium uit de oorspronkelijke druppel, waarbij je ongeveer 5 μL achterlaat om te voorkomen dat er residuele oppervlakteolie wordt ingelaten. Overbreng dit volume in een steriele petrischaal om een nieuwe druppel te vormen (Figuur 2, stap 2).
  4. Inspecteer de nieuw gevormde druppel visueel onder een stereomicroscoop. Aspirateer voorzichtig ongeveer 30 μL uit deze druppel, waarbij je opnieuw ongeveer 5 μL achterlaat om olieovervoer te minimaliseren. Breng dit volume over naar een tweede steriele locatie om een schonere druppel te vormen (Figuur 2, stap 3).
  5. Bekijk visueel de tweede druppel onder vergroting. Identificeer gebieden waar oliedruppels het minst uitgesproken zijn. Steek de pipettip in dit gebied en aspireer ongeveer 25 μL medium, waarbij je opnieuw ongeveer 5 μL achterlaat om olieovervoer te minimaliseren (Figuur 2, stap 4).
  6. Breng de verzamelde 25 μL onmiddellijk over in een steriele, RNase-vrije microcentrifugebuis. Vermijd het aanraken van de binnenwanden van de buis tijdens het doseren van het monster om besmetting en monsterverlies te voorkomen. Onmiddellijk alle verzamelde monsters in vloeibare stikstof bevriezen en bewaren bij -80 °C tot NMR-analyse (Figuur 2, stap 5).
  7. Verzamel bijeenkomende niet-verbruikte controledruppels (medium geïncubeerd zonder embryo's) die onder identieke kweekomstandigheden zijn bereid, geïncubeerd en verwerkt met dezelfde kweekschalen, overlay olie, incubatieduur, incubatoromgeving en hanteerprocedure zoals hierboven beschreven om omgevingsvariabiliteit en mogelijke systematische bias te minimaliseren.
    OPMERKING: Strikte naleving van sequentiële druppeloverdracht en visuele inspectie vermindert olieverontreiniging aanzienlijk. In dit stadium kan het experiment worden gepauzeerd en hervat voordat verdere monsterverwerking voor NMR-verwerving plaatsvindt.

3. Monstervoorbereiding voor NMR-analyse

  1. Ontdooi monsters op kamertemperatuur gedurende ~10 minuten.
  2. Maak NMR-mengsel klaar:
    1. Breng 25 μL SECM over in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg 200 μL D₂O toe. Laat het 10 s vortexen en centrifugeer dan op 1000 × g gedurende 10 s bij kamertemperatuur.
  3. Load insert: Breng 225 μL van het mengsel over in een FEP-liner.
  4. Maak de externe referentiebuis klaar.
    1. Vul een 5 mm NMR-buis met 150 μL D₂O die 1 mM 3-(trimethylsilyl)propionium-2,2,3,3-d4 zuur natriumzout (TMSP-d4) bevat.
  5. Assembleer het monster: Steek het FEP-inzetstuk in de NMR-buis en sluit het af met parafilm.

4. NMR-verwerving en spectrale verwerking

  1. Verkrijg 1H-CPMG-verwerving met de Bruker cpmgpr1d pulssequentie met: 64 scans; 65.536 datapunten; Ontspanningsvertraging: 8 s; Spectrale breedte: 11,9 kHz; Echo-tijd: 400 μs × 80 lussen (effectief T₂-filter 32 ms); Totale verwervingstijd: ~15 min.
    OPMERKING: De effectieve duur van het CPMG T₂-filter van 64 ms is geselecteerd op basis van gevestigde metabolomicaprotocollen voor eiwithoudende biologische monsters, waarbij deze waarde efficiënte onderdrukking van macromoleculaire signalen biedt terwijl laag-moleculair gewicht metabolietresonantiesbehouden blijven.
  2. Voer spectrale verwerking uit:
    1. Verkrijg Fourier-transformatiespectra.
    2. Pas 0,3 Hz exponentiële lijnverbreding toe.
    3. Voer fase- en baselinecorrectie uit.
    4. Referentiespectra naar TMSP-d4 bij 0 ppm.
    5. Referentiechemische verschuivingen (δ) naar het externe TMSP-d4-signaal bij 0 ppm.
      OPMERKING: Omdat het monstermengsel in de FEP-liner (225 μL) en de externe TMSP-d4 referentieoplossing in de buitenste coaxiale spleet (150 μL) verschillende fysieke geometrieën en volumes beslaan binnen het detectievenster van de actieve NMR-spoel, schalen hun absolute signaalintensiteiten niet 1:1. Directe absolute kwantificatie met de externe referentie vereist een systeemspecifieke geometrische kalibratiecurve. Daarom werden, gezien de strikt constante monstervolumes en de zeer reproduceerbare pipetprecisie van dit protocol, ruwe emmerintegralen direct gebruikt om relatieve metabole variaties tussen monsters te volgen, waarbij externe referentie- of totalisatie-intensiteitsnormalisatie werd weggelaten.
  3. Voer spectrale binning uit:
    1. Sluit de waterresonantieregio uit (bijv. 4,65–5,00 ppm) en de TMSP-d4 referentieregio (bijv. -0,05–+0,05 ppm) vóór binning.
    2. Verdeel spectra in variabele breedte buckets om te voorkomen dat pieken worden gesplitst.
    3. Gebruik ruwe emmerintegralen voor statistische analyse in plaats van te normaliseren naar het externe TMSP-d4-signaal, aangezien de referentie fysiek geïsoleerd is in het buitenste buisvolume. Deze aanpak voorkomt kwantificatiefouten die voortkomen uit de verschillende actieve volumes van de insert versus de buitenste buis.
    4. Exporteer bucket-integralen als een numerieke datamatrix voor statistische analyse.
      OPMERKING: Elke "bucket" (of bin) vertegenwoordigt de opgetelde numerieke integraal van alle NMR-signalen binnen een gedefinieerd ppm-bereik. Hoewel deze integralen de relatieve concentratie van de chemische groepen in dat bereik weerspiegelen, kan een enkele emmer signalen bevatten van meerdere overlappende metabolieten of slechts een deel van het totale signaal van een specifiek metaboliet.

5. Statistische analyse

  1. Importeer verwerkt 1H-CPMG spectra in Python (v3.12) met nmrglue15.
  2. Verwijder water en TMSP-d4 spectrale gebieden.
  3. Exporteer bucket-integralen voor analyse.
  4. Voer statistische tests uit met SciPy (v1.14.1):
    1. Beoordeel de normaliteit van elke spectrale emmer met behulp van de Shapiro–Wilk-test.
    2. Pas eenrichtings-ANOVA toe (voor normaal verdeelde data) of Kruskal-Wallis (voor niet-parametrische data) om emmers te identificeren met statistisch significante verschillen tussen ongebruikte geïncubeerde controle en verbruikte media.
    3. Voor emmers met significante verschillen voer je structurele toewijzing uit met een combinatie van 1D- en 2D-NMR-experimenten: 1 H-13C HSQC, 1 H-13C HMBC en 1 H-1H COSY.
    4. Vergelijk de waargenomen 2D-correlaties met standaarddatabases (bijv. HMDB) om de identiteit te verifiëren van de metabolieten die bijdragen aan de discriminerende categorieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De analytische workflow voor niet-gerichte NMR-metabolomische profilering van het gebruikte embryokweekmedium wordt samengevat in Figuur 1.

Verwijdering van olieverontreiniging tijdens bemonstering
Figuur 2 illustreert de sequentiële druppeloverdrachtsprocedure die wordt gebruikt om de overdracht van overlay-olie te verminderen. Monsters die zonder zorgvuldige pipettering werden verzameld, vertoonden brede kool...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie behandelden we belangrijke analytische uitdagingen die gepaard gaan met het identificeren en kwantificeren van laag-moleculair gewicht metabolieten in gebruikte embryocultuurmedia met behulp van niet-gerichte NMR-metabolomics. Onze resultaten tonen aan dat de geoptimaliseerde workflow het mogelijk maakt om hoogwaardige, informatierijke spectra te verwerven die geschikt zijn voor betrouwbare detectie van laagmoleculaire metabolieten.

Zorgvuldige ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Sloveense Onderzoeks- en Innovatieagentschap (ARIS) [projectnummer P3-0327].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 mm FEP tube linerSP Wilmad-LabGlass4682701Innere inleg voor coaxiale NMR
5 mm NMR tubeSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBBuitenbuis
6-wells kweekplaatOosafeOOPW-SW02Embryo kweekschaal
Cryogene vloeibare stikstofMesserContact fabrikantSnel invriezen van monsters
Deuterium oxide (D2O)EurisotopD214LNMR-oplosmiddel
Micropipet (10–100 µL)Eppendorf4924000053Pipetto met instelbaar volume
Microcentrifugebuizen, 1,5 mL, RNase-vrijEppendorfN216966NVerzameling en opslag van monsters
MineralolieVitrolifeVTL-10029Bedekking van kweekdruppel
NMR-spectrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlSpectra-acquisitie
Pasteur-pipetFalconFAL-357575Druppeloverdracht
Pipet, mechanisch met één kanaalSartorius728060Behandeling van monsters
Pipettips, sterielEppendorf22491148Compatibel met micropipet
Pipettips, steriel filterSartorius790201FAërosolbescherming
Secuentieel G-serie kweekmediaVitrolifeVTL-10143Embryo kweekmedium
TMSP-d4 (natrium 3-trimethylsilylproapinaat-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Chemische verschuivingsreferentie
Buizen, Safe-LockEppendorf0030121589Opslagbuizen

Referenties

  1. Seli E, Botros L, Sakkas D, Burns DH. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2008;90(6):2183-2189.
  2. Vergouw CG et al. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod. 2008;23(7):1499-1504.
  3. Eldarov C et al. LC-MS analysis revealed significantly different metabolic profiles in spent culture media of human embryos with distinct morphology, karyotype and implantation outcomes. Int J Mol Sci. 2022;23(5):2706.
  4. Simopoulou M et al. Editorial: The role of metabolomics in ART: from diagnosis to treatment. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1558561.
  5. Gardner DK et al. Human and mouse embryonic development, metabolism and gene expression are altered by an ammonium gradient in vitro. Reproduction. 2013;146:49-61.
  6. Sturmey RG, Hawkhead JA, Barker EA, Leese HJ. DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo. Hum Reprod. 2009;24:81-91.
  7. Sturmey RG, Brison DR, Leese HJ. Assessing embryo viability by measurement of amino acid turnover. Reprod Biomed Online. 2008;17:27-33.
  8. Nadal-Desbarats L et al. Is NMR metabolic profiling of spent embryo culture media useful to assist in vitro human embryo selection? Magn Reson Mater Phy. 2013;26:193-202.
  9. Wallace M et al. 1H NMR-based metabolic profiling of Day 2 spent embryo media correlates with implantation potential. J Assist Reprod Genet. 2014;31:58-63.
  10. Salmerón AM et al. Solution NMR in human embryo culture media as an option for assessment of embryo implantation potential. NMR Biomed. 2021;34:e4536.
  11. Kirkegaard K et al. NMR metabolomic profiling of Day 3 and 5 embryo culture medium does not predict pregnancy outcome in good prognosis patients. Hum Reprod. 2014;29(11):2413-2420.
  12. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril. 2009;91(5):1745-1749.
  13. Martinez CA et al. The overlaying oil type influences in vitro embryo production: differences in composition and compound transfer into incubation medium between oils. Sci Rep. 2017;7:10505.
  14. Beckonert O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2007;2:2692-2703.
  15. Helmus JJ, Jaroniec CP. Nmrglue: an open-source Python package for the analysis of multidimensional NMR data. J Biomol NMR. 2013;55:355-367.
  16. Siristatidis C et al. Why has metabolomics so far not managed to efficiently contribute to the improvement of assisted reproduction outcomes? Diagnostics (Basel). 2021;11(9):1602.
  17. Miao SB et al. Glutamine as a potential non-invasive biomarker for human embryo selection. Reprod Sci. 2022;29(6):1721-1729.
  18. Ferrick L, Lee YSL, Gardner DK. Metabolic activity of human blastocysts correlates with their morphokinetics, morphological grade, KIDScore and artificial intelligence ranking. Hum Reprod. 2020;35(9):2004-2016.
  19. Boyama BA et al. Homocysteine in embryo culture media as a predictor of pregnancy outcome in assisted reproductive technology. Gynecol Endocrinol. 2016;32(3):193-195.
  20. Yazdani A, Halvaei I, Boniface C, Esfandiari N. Effect of cytoplasmic fragmentation on embryo development, quality, and pregnancy outcome: a systematic review of the literature. Reprod Biol Endocrinol. 2024;22:1-40.
  21. Scott R et al. Non-invasive metabolomic profiling of human embryo culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic reproductive potential: a prospective blinded pilot study. Fertil Steril. 2008;90:77-83.
  22. Vergouw CG et al. Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod. 2012;27(8):2304-2311.
  23. Figoli CB et al. A robust metabolomics approach for the evaluation of human embryos from in vitro fertilization. Sci Rep. 2024;14(1):17447.
  24. Olcay IO et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo aneuploidy. Gynecol Endocrinol. 2022;38(8):461-466.
  25. Tesarik J. Non-invasive biomarkers of human embryo developmental potential. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4928.
  26. Alizadeh Moghadam Masouleh A et al. Embryo metabolism as a novel non-invasive preimplantation test: nutrients turn over and metabolomic analysis of human spent embryo culture media (SECM). Hum Reprod Update. 2025;31(5):405-444.
  27. Hajnajafi K, Iqbal MA. Mass-spectrometry based metabolomics: an overview of workflows, strategies, data analysis and applications. Proteome Sci. 2025;23:5.
  28. Emwas AH et al. NMR spectroscopy for metabolomics research. Metabolites. 2019;9(7):123.
  29. Giera M, Yanes O, Siuzdak G. Metabolite discovery: biochemistry's scientific driver. Cell Metab. 2022;34(1):21-34.
  30. Lippi G et al. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med. 2006;44:311-316.
  31. An Z, Shi C, Li P, Liu L. Stability of amino acids and related amines in human serum under different preprocessing and pre-storage conditions based on iTRAQ®-LC-MS/MS. Biol Open. 2021;10(2):bio055020.
  32. Fomenko MV, Yanshole LV, Tsentalovich YP. Stability of metabolomic content during sample preparation: blood and brain tissues. Metabolites. 2022;12(9):811.
  33. Wishart DS et al. HMDB 5.0: The Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D622-D631.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GeneeskundeEditie 233Editie 233Lege waardeEditieNMR-spectroscopieMetabolomicsOlieverontreinigingCPMG
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.