Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time, niet-invasieve evaluatie van mitochondriale functie met behulp van resonantie Raman-spectroscopie

96 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een niet-invasieve realtime methode voor het monitoren van mitochondriale gezondheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). We gebruikten RRS om mitochondriale redoxtoestanden te kwantificeren en ontwikkelden een metriek voor mitochondriale gezondheid, de Resonance Raman verlaagde mitochondriale ratio (3RMR), die een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening laat zien dan traditionele bloedgasanalyten.

Samenvatting

Hoewel mitochondriën centraal staan in de pathogenese en ziekteprogressie, blijft mechanistisch inzicht in de dynamiek van mitochondriale gezondheid kostbaar en ontoegankelijk. Om deze kloof te dichten, maakt deze studie gebruik van Resonance Raman Spectroscopie (RRS) om mitochondriale functie te beoordelen, met een draagbaar systeem dat realtime, niet-invasieve en kwantitatieve metingen levert van mitochondriale cytochroom-redoxtoestanden in rattenlevers. In dit protocol demonstreren we het gebruik van deze technologie, inclusief installatie, gegevensacquisitie en gegevensverwerking. Deze studie presenteert een proof-of-concept-experiment dat het vermogen van RRS benadrukt om realtime veranderingen in de mitochondriale redoxtoestand te meten – en daarmee de mitochondriale functie. Kort werd het RRS-apparaat verbonden met een laserpomp en een data-acquisitiecomputer en geplaatst op 1 cm afstand van de rattenlever.  Acquisitieparameters werden geselecteerd volgens het ratleverprotocol; Redoxtoestanden werden gemeten onder zuurstofhoudende en ischemische omstandigheden met behulp van een zuurstofstresstest. Veranderingen in mitochondriale redoxtoestanden werden gedurende de hele zuurstofstresstest gevolgd.

Inleiding

Mitochondriën spelen een cruciale rol in de cellulaire functie en homeostase. Mitochondriën zijn de belangrijkste drijfveren van cellulaire stofwisseling en reguleren ATP-aanmaak via oxidatieve fosforylering. Ze dienen ook als signaalorganellen die het cellot bepalen door apoptotische paden te reguleren, evenals ROS en Ca+2 signalering1. Mitochondriale disfunctie kan dus leiden tot diverse neurodegeneratieve, spier- en cardiovasculaire aandoeningen 2,3. Ondanks de cruciale rol die mitochondriën spelen in de ziekteprogressie, kan het evalueren van mitochondriale functie invasief, kostbaar en beperkt zijn.

Belangrijke indicatoren van mitochondriale functie, zoals zuurstofverbruik, oxidatieve fosforylering en de activiteit van verschillende complexen binnen de elektronentransportketen (ETC), worden gemeten via respirometrie. De ETC bestaat uit vier complexen (I–IV) die zijn ingebed in het binnenste mitochondriale membraan (IMM). Deze complexen transporteren, met behulp van andere co-enzymen, elektronen van gereduceerde substraten, zoals NADH en FADH2, naar de eindelektronenacceptor,O2, die vervolgens wordt gereduceerd tot water. De meeste hedendaagse respirometrie-assays, zoals de Seahorse en Orobros O2k, vereisen weefselverwerking, waardoor hun toepassing voor translationeel onderzoekbeperkt wordt 4,5. Het meten van mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) is een andere methode om mitochondriale disfunctie te evalueren, waarbij gebruikmaken van kationische lipofiele fluoroforen, zoals JC-1, samen met microscopische beeldvorming, waarbij gekoppelde (gezonde) en nietgekoppelde (beschadigde) mitochondriën fluoresceren met verschillende golflengten6. Deze assays kunnen echter een lage gevoeligheidhebben van 5. De kleurstof zelf kan ook een hoge cytotoxiciteit hebben bij hoge concentraties5. Tot slot vereist deze techniek, net als bij respirometriemetingen, ook weefselverwerking. Spectroscopie-gebaseerde technieken zijn recentelijk gebruikt als niet-invasieve methoden om de gezondheid van mitochondria te evalueren. Zo is Fosformagnetische Resonantiespectroscopie (P-MRS), een methode die het cellulaire metabolisme evalueert door de concentraties van fosforhoudende metabolieten te meten, gebruikt om gemodificeerd adipogeen weefsel te karakteriseren dat differentiatie7 ondergaat. Deze techniek vereist echter ook gespecialiseerde apparatuur en training.

Onze groep demonstreerde onlangs een realtime, niet-invasieve en zeer specifieke techniek om de mitochondriale redoxtoestand te meten als marker voor orgaanlevensvatbaarheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). RRS gebruikt inelastische verstrooiing van fotonen voor de kwantificering van redoxtoestanden van mitochondriale cytochromen. Porfyrineringen in heemgroepen van moleculen zoals mitochondriale cytochromen, hemoglobine en myoglobine produceren een karakteristiek Raman-spectrum, afhankelijk van hun oxidatietoestand wanneer ze worden geëxciteerd met een 441 nm golflengte laser8. Hoewel het RRS-systeem een golflengte van 441 nm gebruikt, kunnen ook lasers met 420 nm en 405 nm golflengten worden gebruikt, die elk bij voorkeur een ander cytochroomcomplex versterken. Het spectrum verkregen uit een onbekend monster van belang wordt gekruist met vooraf opgenomen bibliotheken van volledig geoxideerde of gereduzeerde intacte mitochondriën, wat de verhouding van gereduceerde tot totale mitochondriën of de gemiddelde redoxtoestand van de in situ ETC-cytochromen oplevert. Deze verhouding wordt gedefinieerd als de Resonance Raman Reduced Mitochondriale Ratio (3RMR).

Er zijn 3 verschillende berekeningen/typen van 3RMR: mitochondriale 3RMR (mito-3RMR), complex III 3RMR (cIII-3RMR) en complex IV 3RMR (cIV-3RMR). Elk van deze indices wordt berekend door het deel van gereduceerd tot het totale aantal van een gegeven component. Bijvoorbeeld, de 3RMR van cIII zou de verhouding zijn van gereduceerde cIII tot het totale aantal cIII in het weefsel (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Hetzelfde patroon geldt voor cIV. Dus 3RMR-cIII zou verwijzen naar de verhouding van gereduceerde cIII tot de totale hoeveelheid cIII, en 3RMR-cIV zou verwijzen naar de verhouding van gereduceerde cIV tot de totale hoeveelheid cIV. Door regressieanalyse worden ofwel mitochondriale redoxtoestanden (mito-3RMR) berekend met behulp van spectrale bibliotheken van intacte mitochondriën, of individuele complexe redoxtoestanden (cIII-3RMR en cIV-3RMR) worden berekend met behulp van cIII- en cIV-spectrale bibliotheken. Een recente publicatie9 toonde aan dat mito-3RMR representatief is voor het gewogen gemiddelde van cIII- en cIV-redoxtoestanden (of cIII-3RMR en cIV-3RMR). Het is belangrijk op te merken dat cI en cII niet Raman-actief of resonant versterkt zijn over de 441 nm golflengte. Daarom worden ze niet berekend bij het berekenen van de mito-3RMR.

Door gebruik te maken van deze typen 3RMR, hebben we het optimale bereik van 3RMR gedefinieerd. In "gezonde" organen zijn mitochondriën intact en hebben ze voldoende zuurstoftoevoer. Daarentegen kunnen beschadigde organen onvoldoende zuurstofafgifte of -gebruik hebben, waardoor ETC-complexen elektronen ophopen. Elektronenaccumulatie veroorzaakt "reductieve spanning", waarbij de mitochondriën verschuiven van geoxideerd naar gereduceerd en de 3RMR-waarden toenemen. Verschillende studies 8,9,10,11,12, variërend van harten en levers in knaagdier- en varkensmodellen, zijn begonnen licht te werpen op het optimale "gezonde" bereik voor 3RMR, dat wordt voorgesteld tussen 10 en 30 te liggen. Zo onderwierpen Perry et al. zoogdierharten aan hypoxie, waarbij een 3RMR van 30% de optimale balans opleverde voor gevoeligheid en specificiteit om hypoxisch weefsel8 te detecteren. Deze trend werd verder bevestigd in aanvullende studies met hartweefsel11,12 en levertransplantaten10. Daarnaast toonden Nyugen et al.9 aan dat 3RMR-waarden dalen tot zeer lage (geoxideerde) waarden voor weefsels waarin de stofwisseling is gestopt, met 3RMR-niveaus (7,667 ±± 4,926) van niet-transplanteerbare warm-ischemische levers na 3 uur normotherme machineperfusie, vergeleken met 3RMR-waarden boven 10 (~12–15) voor verse en transplanteerbare warm-ischemische levers9.

Naast deze demonstraties van hoe 3RMR de levensvatbaarheid van weefsels kan meten, maken de gevoeligheid, specificiteit en gebruiksgemak van RRS het zeer toepasbaar voor veel andere soorten onderzoek waarbij het cellulaire metabolisme en mitochondriale functie worden beïnvloed. In eerdere studies is RRS gebruikt om maculadegeneratie en glaucoom bij muizen te detecteren door de metabole activiteit van niet-gemyeliniseerde axonen van retinale ganglioncellen bij de oogzenuwkop13 te evalueren. Daarnaast werd het gebruikt om coarctatie van de aorta (CoA) te detecteren in een rattenmodel van aangeboren hartziekten, een diagnose die vaak over het hoofd wordt gezien bij screenings voor pasgeborenen12. Deze technologie werd ingezet om orgaanfunctie en levensvatbaarheid onder verschillende experimentele omstandigheden te begrijpen die relevant zijn op het gebied van orgaantransplantatie, waaronder studies die de levensvatbaarheid van orgaan beoordelen op ex vivo machine perfusie10,11, reoxygenatie poststatische koude opslagevalueren of reperfusieschade van warm-ischemische levers beperken9.

Dit artikel probeert RRS vast te stellen als een realtime, gevoelig instrument voor het beoordelen van mitochondriale gezondheid. Hele levers uit een rattenmodel werden blootgesteld aan verschillende niveaus van ischemie en zuurstofreperfusie als stresstest om de mitochondriale respons te beoordelen. In deze zuurstofstresstest worden verse levers onderworpen aan 5 minuten initiële perfusiestroom, 5 minuten ischemische en 5 minuten reperfusie. 3RMR-metingen en lactaat-, K+- en partiële zuurstofdruk (pO2) werden gedurende de hele stresstest uitgevoerd. Een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening werd waargenomen met 3RMR vergeleken met traditionele bloedgas-analyten. Met deze experimenten wordt het gebruik van RRS niet alleen benadrukt voor mechanistische studies, maar ook als diagnostische methode en therapeutisch testbed. Het gedeelde protocol kan dus nuttig zijn voor diverse onderzoekers die met mitochondriën werken. Al met al kan RRS, met zijn niet-invasieve realtime en zeer specifieke aard, een aanzienlijke impact hebben op het cellulaire metabolisme.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren voor de experimenten werden onderhouden volgens de richtlijnen van de National Research Council en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Massachusetts General Hospital (Boston, MA, VS).

1. Het opzetten en gebruiken van RRS

  1. Beschrijving van het apparaat:
    OPMERKING: Het draagbare RRS-systeem (Pendar Technologies; het product is uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden) gebruikt een 441 nm laser vanwege een resonante versterking van het Raman-spectrum van mitochondriale cytochromen met deze golflengte. De laser werkt tussen de 4 mW en 8 mW.
    1. Verbind een laserexcitatiebron met een speciaal gebouwde probe via een glasvezelkabel. De probe schijnt een laserpunt van 2 mm diameter op het weefsel en verzamelt ook het uitgezonden spectrum. Het spectrum gaat vervolgens door een banddoorlaatfilter en wordt opgevangen door een charge-coupled device (CCD) array. Het spectrum wordt elke seconde verzameld over een tijdsbestek van 180 seconden en gemiddeld om een rauw, ruisgereduceerd spectrum voor analyse te creëren.
    2. De software vergelijkt dit verkregen spectrum met vooraf gemeten spectrale bibliotheken via een regressieanalyse.
  2. Procedure voor pre-recording libraries
    OPMERKING: Voor de experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn gereduzeerde en geoxideerde vormen van mitochondriën, complex III, en complex IV, hemoglobine- en myoglobinebibliotheken gecreëerd en gebruikt. De RRS-signalen van alle bibliotheken werden opgenomen in een black box bij kamertemperatuur (21 °C). Deze bibliotheekbestanden worden apart meegeleverd met de analysesoftware. Afhankelijk van het weefsel van belang en de aanwezigheid van andere Raman-actieve moleculen, kunnen er echter ook andere bibliotheken worden gecreëerd door het volgende protocol passend aan te passen. Ruwe RRS-spectra van de hemoglobine-, myoglobine- en geoxideerde/gereduceerde complexe III/IV-bibliotheken worden geleverd in Aanvullende Figuur 1.
    1. Hemoglobinebibliotheken (Aanvullende Figuur 1C):
      1. Verzamel vers knaagdierbloed via dierlijke uitlating. Oxygeneer het verzamelde bloed met 100% zuurstof, of deoxygeneer het met 100% stikstof, in een glazen cuvet, waarbij natriumdithionaat wordt toegevoegd.
      2. Meet de RRS van elke staat 10 minuten door de glazen cuvetwand, met de RRS-probe 9 mm van de glazen cuvette geplaatst.
      3. Gebruik spectrale pieken bij 1356 cm-1 om de zuurstofgedroogde toestand te verifiëren, en gebruik pieken bij 1376 cm-1 om de zuurstofhoudende toestand te bevestigen.
    2. Gereduzeerde/geoxideerde mitochondriale bibliotheken (Figuur 1)
      1. Isoleer mitochondriën uit gehomogeniseerde en gezuiverde knaagdierenharten in een glazen cuvet. Plaats de Raman-sonde 9 mm van de glazen cuvet en meet de spectra van deze mitochondriën door de glazen wand.
      2. Creëer volledig geoxideerde omstandigheden door 100% zuurstoftoevoer naar de mitochondriën te leveren. Controleer de geoxideerde toestand door de afwezigheid van de gereduceerde RR-piek bij 1357 cm-1.
      3. Creëer volledig verminderde omstandigheden door de mitochondriën bloot te stellen aan 100% stikstof met kleine hoeveelheden waterstofsulfide. Controleer de gereduceerde omstandigheden door het ontbreken van een geoxideerde RR-markerpiek op 1371 cm-1.
    3. Geoxideerd/gereduceerd complex III/IV (Aanvullende Figuur 1A,B):
      1. Isoleer complex III en IV zoals elders beschreven 9,15,16,17. Kort gezegd, gebruik een standaardmonster van geïsoleerde mitochondriën (overeenkomend met 200 nanomol cytochroom a) als uitgangsmateriaal.
      2. Verdun de mitochondriën tot 10 nmol cytochroom A/mL in ijskoude buffer C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8,45). Voeg vervolgens 10% met n-β-D-dodecyl maltoside (DM) druppel voor druppel toe tot een uiteindelijke concentratie van 1%, terwijl je zachtjes op ijs mengt.
      3. Centrifugeer het extract op 40.000 × g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant aan op een 2,5 cm × 20 cm glazen kolom die eerder is gevuld met een uitwisselingshars die in evenwicht is gehouden met 5 kolomvolumes buffer C (met 0,02% w/v DM).
      4. Na wassen met 2 kolomvolumes buffer C elueer mitochondriale complexen door een lineaire 0–400 mM NaCl-gradiënt toe te passen in dezelfde buffer en verzamel je het eluum in 4 mL fracties.
      5. Groene fracties met Complex IV eluerden dicht bij het midden van de gradiënt (~180 mL NaCl), vóór de roodachtige fracties die Complex III bevatten. Concentreer de gepoolde fracties die elk complex bevatten tot 20–30 nmol cytochroom a/mL.
      6. Zodra de afzonderlijke complexen geïsoleerd zijn, worden ze blootgesteld aan oxiderende en reducerende omstandigheden. Verminder een monster van 11 mM van Complex III in Tris-buffer met 2 mL ascorbaat (1 M) om cytochroom c1 te reduceren en 2 mL HS (hydrosulfiet) om cytochromen bL en bH volledig te verminderen.
      7. Verminder een monster van 18,67 mM van Complex IV in de Tris-buffer in meerdere stappen, aangezien Complex IV een meerstaps katalytisch oxidatieproces ondergaat. Om Complex IV volledig te reduceren, voeg je twee 2 mL H2O2 toe (10 mM), gevolgd door 2 mL HS.
      8. Verzamel bibliotheekspectra na elke toevoeging om elke stap van de cyclus vast te leggen. Voeg volledig geoxideerde en gereduceerde spectra toe aan de uiteindelijke referentiebibliotheek om de stationaire toestanden van complex IV weer te geven.
      9. Bereid alle monsters voor in een glazen flesje van 1 mL en houd ze op een vaste positie op 9 mm afstand van de probelens en sluit ze in een zwarte doos om lichtbesmetting te voorkomen. Verzamel RRS-spectra voor 600 s voor elk complex en elke oxidatietoestand.
      10. Valideer de zuiverheid van geïsoleerde cIII en cIV zoals eerder beschreven17, en valideer de toereikendheid van geïsoleerde cIII- en cIV-spectrale bibliotheken bij het verklaren van de volledige mitochondriale spectra zoals beschreven in een recent artikel9.
    4. Myoglobinebibliotheken (Aanvullende Figuur 1D):
      1. Met vergelijkbare zuurstof- en stikstofstromen (met opgelost natriumdithioïet) varieer de oxymyoglobinesaturatie van het myocardmyoglobine-extract tussen 0% en 100%. Controleer het Raman-spectrum via markertoppen op 1355 cm-1 en 1376 cm-1.

OPMERKING: De meeste hierboven beschreven spectrale componenten, zoals hemoglobine of geoxideerde/gereduceerde mitochondriën, zijn heembevattende moleculen en worden geëxciteerd door dezelfde golflengte. Dit RRS-systeem voorkomt signaaloverlap door voor elk molecuul een regressiebibliotheek te creëren op basis van zijn unieke spectrale signaal. De verkregen verstrooide spectra worden uitgevoerd door een regressie-algoritme tegen de geselecteerde bibliotheken. Het regressie-algoritme levert een factor op voor elk bibliotheekspectrum die de best passende schatting van de relatieve bijdrage in het geregistreerde spectrum weergeeft, en dus de relatieve concentratie in het weefsel. Omdat het algoritme de beste fit gebruikt over een reeks golfgetallen, maken kleine verschillen in de positie of intensiteit van spectrale pieken van de verschillende bibliotheekcomponenten het mogelijk dat de regressie zelfs nauw verwante chromoforen kan onderscheiden. Via het regressie-algoritme en spectrale bibliotheken kan het RRS-systeem het totale, verstrooide signaal opsplitsen in verschillende componenten, afhankelijk van hun unieke spectrale pieken, waardoor signaaloverlap met heemhoudende moleculen wordt voorkomen. Om de relatie tussen hemoglobine en mitochondriën te tonen, is aanvullende figuur 2 opgenomen, die beelden toont van spectra genomen van een leverperfusie, opgesplitst in het gemeten signaal, de lijn van best-fit en het onverklaarbare residu dat voortkomt uit verschillen in de individuele spectrale pieken. In paneel A worden gereduceerde en geoxideerde hemoglobinebibliotheken en gereduzeerde en geoxideerde mitochondriale regressiebibliotheken geselecteerd. De lijn van best-fit die via de bibliotheken en de regressieanalyse wordt samengesteld, overlapt netjes met het gemeten signaal, en er is weinig onverklaard residu. In paneel B worden alleen geoxideerde en gereduceerde mitochondriënbibliotheken geselecteerd. Omdat er een grote onverklaarde residuele structuur is, is de mitochondriale spectrale piek enkele golven verschoven ten opzichte van die van hemoglobine, die niet was opgenomen in de regressieanalyse. Bovendien leggen de auteurs in de aanvullende figuren van Nguyen et al.9 de relatie uit tussen mitochondriën en de individuele complexen (cIII en cIV), evenals de relatie tussen individuele complexen16, waarbij complex III scherpere, lagerfrequente pieken vertoont, terwijl complex IV bredere, omhoog verschoven banden vertoont. Verder tonen de auteurs aan dat de gereduzeerde Complex III- en Complex IV-bibliotheken het gemeten spectrum van verminderde hele mitochondriën volledig verklaren, wat resulteert in minimale onverklaarde residuen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Spectrale bibliotheken van volledig geoxideerde en gereduzeerde mitochondriën. RRS-bibliotheekspectra werden verkregen nadat geïsoleerde mitochondriën (A) 100% zuurstof of 100% stikstof (B) kregen om respectievelijk geoxideerde en gereduzeerde toestanden te bereiken. Deze toestanden werden bevestigd met de aanwezigheid van RR (C) zuurstofhoudende en verminderde (D) markerpieken. De verschuiving in deze pieken komt overeen met veranderingen in moleculaire vibratiemodi in aanwezigheid van zuurstof. De intensiteit van elke piek wordt genormaliseerd tot 1 willekeurige intensiteitseenheid (AU), omdat de versterking van de gereduceerde toestand groter is met deze 441 nm excitatiegolflengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Gegevensverzameling met behulp van RRS

  1. Apparaatopstelling:
    1. Verbind de spectrometerunit (ondergebracht in een compacte kast) op de gelijkstroom (DC) voeding en op de stroomadapter via de meegeleverde kabels. De spectrometerunit heeft één ronde plug met uitlijningsindrukken.
    2. Lijn de inkepingen van de ronde stekker uit met die van de kabel die op de stroomadapter wordt aangesloten. Er is geen schoonmaak nodig voordat de poorten worden aangesloten (Figuur 2).
    3. Sluit de computer die de analyse uitvoert aan op dezelfde stroomadapter die ook de spectrometer en voeding verbindt met de meegeleverde kabels.
    4. Plaats de laserprobe in de houder van de probe. Pas de positie van deze sonde aan aan aan het begin van het experiment aan.
    5. Open de spectrometerbesturingssoftware (Cellular Energetics Software).
  2. Software-setup:
    OPMERKING: Instellingenbestanden en regressiebibliotheken voor verschillende soorten weefsel worden bij het systeem geleverd. Deze bestanden bevatten informatie over welke bibliotheken het RRS-systeem in de regressie moet bevatten, hoeveel spectra er in het regressievenster zijn opgenomen, en andere parameters zoals laservermogen. Standaardinstellingen kunnen worden aangepast en er kan een nieuw instellingenbestand worden opgeslagen voor gebruik in toekomstige experimenten. Schermafbeeldingen van de hieronder beschreven software zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 3.
    1. Bij het openen van de spectrometerbesturingssoftware verschijnt een grafiek met percentage 3RMR, zuurstofsaturatie (StO2) en myoglobinesaturatie. Dit scherm is waar deze metrics worden weergegeven, indien geselecteerd, in realtime gedurende de metingen. Klik op het tabblad Instellingen linksonder op de pagina.
    2. Voer onder het tabblad Info sessie-informatie in onder Sessienaam, en eventuele benodigde details onder het tabblad Sessiebeschrijving .
    3. Er zijn twee manieren voor gegevensverzameling. Gebruik de Spot Check-modus om spectra te verzamelen totdat gespecificeerde kwaliteitsmetrics zijn behaald (bijv. target sigma of regressievenster/aantal spectra), en stop dan met opnemen. Gebruik Continue Modus om spectra op te nemen totdat de stopknop wordt ingedrukt. In beide modi worden alle gegevens, zowel 3RMR-resultaten als individuele spectra, automatisch opgeslagen. Dit experiment maakt gebruik van Continue Modus.
    4. Zodra alle sessiegegevens zijn ingevoerd, klik je op het tabblad Systeem .
    5. Selecteer onder Instellingen Bestand het protocol dat geschikt is voor het project (voor acellulaire rattenleverperfusies kies het Rat Liver Acellular protocol). Dit past automatisch het meettype, de gemiddelde lengte van de meting (regressievenster) en de doel-sigma aan.
      1. Om een nieuw instellingenbestand aan te maken, pas je een van de hierboven genoemde componenten aan en klik je vervolgens op de knop Opslaan . Dit zou deze parameters als een apart instellingenbestand moeten opslaan dat vervolgens in het systeem geïmporteerd kan worden.
      2. Om een nieuw instellingenbestand te importeren, klik je op het dropdownmenu naast Standaard (Mod) en selecteer je Importeren Nieuw Instellingenbestand. Klik op het nieuwe Instellingenbestand om te importeren.
    6. Selecteer en bevestig onder Regressiebibliotheken de combinatie van bibliotheken die gebruikt worden voor gegevensverzameling en analyses. De bibliotheken voor gereduceerde en geoxideerde mitochondriën [alleen Mito] werden voor dit experiment geselecteerd. Andere gebruikers kunnen ervoor kiezen bibliotheken te gebruiken die ook hemoglobine, myoglobine of andere complexen onder de Geavanceerde Bibliotheek bevatten.
    7. Selecteer en bevestig de voorkeursmodus voor vensterbreedte.
      1. Adaptieve breedtemodus: Gebruik de adaptieve breedtemodus om individuele spectra toe te voegen aan het gemiddelde spectrum totdat het maximale sigma-doel is bereikt. Als het sigma-doel niet wordt bereikt, stopt de opname wanneer het de bovengrens van het ingestelde regressievenster bereikt (d.w.z. het maximale aantal spectra dat het moest opnemen). De meetresultaten worden op het scherm weergegeven nadat het minimum sigma-doel is bereikt.
      2. Vaste breedtemodus: Gebruik de vaste breedtemodus om individuele spectra toe te voegen aan het gemiddelde spectrum totdat het doelaantal spectra is opgenomen (ingesteld onder gemiddelde lengte).
    8. Zodra de systeeminstellingen klaar zijn, klik je op het tabblad Plot .
    9. Selecteer onder Hoofdreeks de componenten die worden uitgezet en tijdens de metingen op het scherm worden weergegeven.
    10. Bevestig dat alle geselecteerde meetcomponenten in lijn zijn met het protocol van belang.
  3. Dataverwerving:
    OPMERKING: Raman-metingen moeten in een donkere ruimte worden genomen. Zorg ervoor dat de werkruimte zo goed mogelijk afgeschermd is van licht, voordat je begint met het verzamelen van gegevens. Als de kamer niet volledig tegen licht kan worden afgeschermd, wordt het RRS-systeem geleverd met een zwarte afdekking met een rechthoekige opening in het midden (afgebeeld in Figuur 2), waardoor de laserprobe kan worden geplaatst. De doos kan het monster/het deel van het orgaan bedekken waar RRS-metingen worden genomen. Vermijd directe of langdurige blootstelling aan de ogen bij het werken met de RRS-laser. Schiet geen laser direct in het oog of op reflecterende oppervlakken. Activeer de laser alleen wanneer deze direct op het weefsel van belang staat. De RRS-laser is een Klasse 3R-laser bij gebruik op 4 mW, en Klasse 3B bij gebruik op 10 mW. De laser is veilig voor weefselcontact.
    1. Selecteer de passende, vooraf opgeslagen instellingen, opnameparameters en bibliotheekbestanden.
    2. Plaats de laserprobe direct boven het weefsel/orgaan van interesse. Plaats de sonde zo loodrecht mogelijk en 1 cm van het weefsel af. Gebruik een liniaal om nauwkeurig 1 cm vanaf het oppervlak van het orgaan te meten. Stel de probe zo in dat hij dichter dan 1 cm is als het signaal niet duidelijk is. Zorg er echter voor dat de sonde het weefsel nooit raakt.
      OPMERKING: De sonde kan met de hand worden gebruikt, maar het wordt aanbevolen een sondehouder/standaard te gebruiken die verstelbaar is en stabiel blijft. Plaats de sonde zo loodrecht mogelijk en 1 cm van het weefsel af. Een liniaal kon worden gebruikt om nauwkeurig 1 cm vanaf het oppervlak van het orgel te meten. De probe kan worden aangepast zodat hij dichter dan 1 cm wordt geplaatst als het signaal niet duidelijk is. De sonde mag echter nooit het weefsel aanraken.
    3. Controleer of de laserplek zich op de linker laterale kwab bevindt, zo dicht mogelijk bij de portaalader.
    4. Controleer of alle geselecteerde bibliotheken, regressie-instellingen, target sigma, regressievenster en acquisitiemodi correct en naar wens zijn.
      1. Zorg dat de kamer zo donker mogelijk is. Controleer of de sonde geen besmetting, vooral geen bloed, op het raam heeft. In geval van besmetting gebruik je een pluisvrije, niet-schurende doek met 70% isopropylalcohol om het kwartsvenster schoon te maken, gevolgd door grondig te drogen met een droogdoek voordat je verder gaat.
      2. Bij zware besmetting veeg de sonde zo grondig mogelijk af, zoals hierboven beschreven. Kalibreer het apparaat vervolgens door de laser in een donkere behuizing te plaatsen die is bekleed met zwarte tape en op de Take Dark-knop te drukken. De kalibratie duurt ongeveer 5–10 minuten. Ongeacht de besmetting, kalibreer het apparaat eens per maand en het zal automatische herinneringsberichten sturen.
        OPMERKING: De uitleg van elke kwaliteitscontrolemaatstaf, voorbeelden van dergelijke kwaliteitscontrole-metrics en het ruwe spectrale signaal verkregen uit optimale en suboptimale opnames (Aanvullend Bestand 1, Figuur 3, Aanvullend Figuur 3). Deze kwaliteitscontrolecriteria zijn geoptimaliseerd voor hele levers uit het ratmodel. Elk nieuw ontwikkeld protocol dat een ander orgaan-/diermodel gebruikt, zou deze metrieken dienovereenkomstig moeten verfijnen en aanpassen.
    5. Klik op de Startknop op de Startpagina om data te verzamelen. Afhankelijk van de gekozen instellingen maakt de software opnames totdat de doelfoutwaarde (sigma) of 180 s is bereikt. Dataverzameling is nu voltooid.
      1. Leid de kwaliteit van het RRS-signaal af uit deze grafieken en waarden om aanpassing van de positie of de meetomstandigheden van de probe mogelijk te maken (Figuur 3). Als het verkregen RRS-signaal niet aan deze kwaliteitscontrolecriteria voldoet, stel de probe dan zo loodrecht mogelijk aan en ongeveer 9 mm van het oppervlak tot het probe-venster.
    6. Zodra het dataverzameling-/experimentele protocol is voltooid, gooi je de hele lever/het weefsel in een biohazard-bak. Maak elk systeem of oppervlak dat in contact was met het orgaan/weefsel schoon met 70% ethanol.
      1. Als je met een perfusiesysteem werkt, gebruik dan DI-water gemengd met enzymatische reiniger (7,8 mL verdund in 1 L gedeïoniseerd [DI] water), gevolgd door schoon DI-water.
        OPMERKING: Elke opname wordt opgeslagen als een apart analysebestand onder een nieuw sessiebestand. Resultaten voor 3RMR en mitochondriale signaalsterkte (r3RMR) worden in het hoofdvenster uitgezet. Het ruwe spectrum kan ook worden weergegeven. Andere kwaliteitscontrole-indicatoren, zoals restsignaalsterkte en totale signaalsterkte, worden weergegeven onder het tabblad Spectrum .
  4. Data-analyse:
    1. Als je klaar bent met gegevensverzameling, klik je op de Review-map onderaan het scherm om het experimentele bestand te openen en de resultaten te bekijken.
    2. Alternatief kun je een tekstbestand openen met de resultaten. Selecteer het sessiebestand van interesse. Er wordt een analysebestand geopend met alle verkregen metingen. Elke parameter en zijn sigma-waarde hebben een eigen kolom. Bijvoorbeeld, 3RMR-waarden die per seconde worden verkregen, worden vermeld onder de kolom "3RMR," en de sigma-waarde wordt vermeld onder "sigma_3RMR".
    3. De laatste rij van elke kolom bevat de eindwaarden voor elke parameter van dat sessiebestand. Gebruik deze waarde om te plotten.
    4. Herhaal stappen voor elk sessiebestand/elke opname. Plot kreeg waarden zoals gewenst.

figure-protocol-2
Figuur 2: RRS-apparaatopstelling. Een schema van de RRS-systeemopstelling. De probe is via een optische vezelkabel verbonden met het RRS-systeem, dat de laserexcitatiebron en de spectrometer bevat. Deze opstelling maakt vervolgens verbinding met elke laptop die de spectrometer-bedieningsapp bevat voor gegevensverzameling en analyse. Zowel de computer als de spectrometerunit zijn aangesloten op een stopcontact. RRS-metingen moeten in het donker worden genomen. Als de kamer niet volledig tegen licht kan worden afgeschermd, wordt het RRS-systeem geleverd met een zwarte afdekking met een rechthoekige opening in het midden, waar de laserprobe kan worden geplaatst. De doos bedekt het monster/het deel van het orgaan waaruit de RRS-metingen worden genomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Voorbeeldsporen en kwaliteitscontrolemetrics van suboptimale en optimale kwaliteitstraces. Het restsignaal (ruis) wordt gemarkeerd met een oranje beugel, en het mitochondriale signaal met een groene beugel. (A) Voorbeeldspoor van een suboptimaal Raman-signaal. Het restsignaal is te groot om te onderscheiden van het mitochondriale signaal. Spectrale pieken zijn niet te onderscheiden door het gemeten signaal. (B) Voorbeeldspoor van het optimale Raman-signaal. Het mitochondriale signaal is zichtbaar groter en verschilt van het restsignaal. Spectrale pieken uit de verkregen meting zijn te onderscheiden. (C) QC-metrieken verkregen van elk signaal. Over het geheel genomen is het totale signaal dat wordt verkregen bij de suboptimale meting kleiner dan de optimale meting. In de optimale opname wordt meer mitochondriaal signaal gemeten in vergelijking met de suboptimale opname, waarbij het mitochondriale signaal respectievelijk 17% en 14% van het totale signaal uitmaakt. Het signaal werd gemeten met 4,3% fout in de optimale meting, tegenover 18,5% fout in de suboptimale meting. Evenzo is het onverklaarbare restsignaal goed voor 11% van het totale signaal in de suboptimale opname, terwijl het 3,6% uitmaakt in de optimale opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Evaluatie van mitochondriale gezondheid met behulp van RRS

OPMERKING: Resonantie Raman Spectroscopie (RRS) technologie werd gebruikt om een mitochondriale levensvatbaarheidsmetriek (3RMR) te ontwikkelen die de levensvatbaarheid van transplantatieorganen aangeeft. Deze studie heeft als doel aan te tonen hoe veranderingen in zuurstofvoorziening – en daarmee cellulaire ademhaling – worden weerspiegeld in 3RMR-trends in vergelijking met traditionele schadebiomarkers, zoals lactaat en K+. Hier wordt een zuurstofstresstest gebruikt, waarbij na 5 minuten continue perfusie de zuurstofhoudende perfusiestroom voor 5 minuten wordt gepauzeerd en vervolgens 5 minuten wordt hervat. RRS-metingen, evenals in- en uitstroomperfusaatmonsters, worden gedurende de hele stresstest uitgevoerd.

  1. Leveraanschaf:
    1. Dieren kalmeren in een inductiekamer met 3%–5% isofluran. Filter overtollige damp met actieve kool.
    2. Voer een volledige hepatectomie uit bij mannelijke Lewis-ratten (150 g). Bind de takken van de poortader af. Injecteer 50 U natriumheparine via de IVC. Canuleer de portaalader tijdens de operatie met een katheter van 16 G en spoel de lever door met 50 ml zoutoplossing.
    3. Leg de verkregen levers op ijs in een petrischaal met 30 ml oplossing van de University of Wisconsin (UW).
  2. Subnormotherme machine perfusie (SNMP) opstelling en resonantie Raman-metingen:
    1. Stel het RRS-apparaat in zoals eerder beschreven. Stel het Acellular Rat Liver Protocol in op de spectrometercontrolesoftware, die automatisch de breedtemodus instelt op adaptieve breedte, gemiddelde lengte op 180 en doel-sigma op 1,5. Het selecteert ook 3RMR en Fluorescentie als meetparameters, evenals Mito alleen als regressiebibliotheek. Zet de acquisitiemodus op continue modus.
    2. Stel het SNMP-systeem op zoals elders beschreven18.
      1. Kort gezegd, zorg ervoor dat de perfusieopstelling bestond uit een perfusiekamer, een peristaltische pomp, een membraanoxygenator en een bubbelval.
      2. Zuurstof afleveren met een atmosferische mix (95% O2 en 5% CO2); Houd pO2 tussen 400–500 mmHg. Meet de intrahepatische druk met een druksensor en houd deze tussen 3–5 mmHg. Verzamel de monsters via bemonsteringspoorten.
    3. Zodra de software en het perfusiesysteem zijn ingesteld, verbind je de canule die de PV doorboort op de instroombuis van de perfusiemachine. Houd het orgaan, het perfusatiemiddel en de perfusie-installatie op kamertemperatuur (21 °C), zonder gebruik van een waterbad.
    4. Geef het perfusaat via de canule in de PV aan het orgaan met behulp van een peristaltische pomp.
      1. Om het perfusaat te bereiden, meng 500 mL fenol roodvrije Williams' Medium met 5 g Bovine Serum Albumine (BSA), 12 mg wateroplosbare dexamethason, 5 mL penicilline-streptomycine, 5 mL L-glutamine, 2,5 μL insuline en 1000 U heparine.
      2. Roer alle componenten ongeveer 20 minuten op een roerplaat, of totdat alle componenten zijn opgelost. Verhoog de perfusiestromen tot drukken van 3–5 mmHg.
    5. Plaats vervolgens de RRS-laserbron in de probehouder en plaats deze op 1 cm boven de grootste leverlob, zo dicht mogelijk bij de PV. Pauzeer de perfusiestroom na 5 minuten (T5) en hervat deze na 10 minuten (T10). Voer de stresstest uit na 15 minuten (T15).
    6. Neem RRS-metingen gedurende de hele stresstest; Neem elke 5 minuten in- en uitstroommetingen op, beginnend bij T0 (Figuur 4). Plot de 3RMR-waarden, evenals de uitvloei K+- niveaus en lactaatniveaus voor T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Figuur 5).
    7. Bereken de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) bij T0, T5, T10, T15 door de in- en uitstroompartiële zuurstofdruk (pO2) te vermenigvuldigen met de oplosbaarheidscoëfficiënt van zuurstof in plasma (0,00314). Plot de OCR voor T0, T5, T10, T15 (Figuur 5).
      OPMERKING: Voorbeeldige Resonantie Raman-spectrale sporen bij perfuseerde (T5), ischemische (T10) en reperfused (T15) toestanden van één lever worden getoond (Figuur 6)

figure-protocol-4
Figuur 4: Diagram dat experimentele stroming toont. Er werd een volledige hepatectomie uitgevoerd bij vrouwelijke Lewis-ratten. De verkregen lever werd op subnormotherme machineperfusie geplaatst en de eerste 5 minuten voorzien van zuurstofhoudende perfusaat. Perfusaat stroomt via de portaalader de lever binnen en circuleert via de peristaltische pomp (perfusiestroom weergegeven met blauwe pijlen). De zuurstofperfusie werd de volgende 5 minuten gepauzeerd bij T5 en opnieuw gestart voor nog eens 5 minuten bij T10. 3RMR-metingen die gedurende de stresstest worden uitgevoerd (afgebeeld als de laser). Perfusaatmonsters werden verkregen bij T0, T5, T10 en T15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verse levers werden onderworpen aan periodes van ischemie en reperfusie met behulp van een zuurstofstresstest. Vervolgens werden de realtime veranderingen in 3RMR gedurende de stresstest vergeleken met zuurstofverbruik, uitvloei van lactaat en kalium verkregen uit perfusatanalyse bij T0, T5, T10, T15. Onder gezonde omstandigheden worden 3RMR-waarden verwacht tussen 10% en 30% (Figuur 5A). Zoals verwacht vallen de 3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie benadrukt een niet-invasieve, realtime en zeer gevoelige methode om mitochondriale gezondheid te kwantificeren met behulp van een draagbaar Resonance Raman Spectroscopiesysteem dat bestaat uit een laser in een compacte probe, verbonden met een glasvezelkabel met een laserpomp. Deze methode gebruikte een 441 nm laser om mitochondriën te exciteren, die unieke spectrale signalen produceren afhankelijk van hun oxidatietoestand. Zo kan RRS elke toestand van mitochondriën kwantific...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren concurrerende belangen. S.N.T en P.R. hebben voorlopige octrooiaanvragen die relevant zijn voor deze studie. P.R. is medewerker en aandeelhouder van Pendar Technologies. S.N.T.'s worden beheerd door MGH en Partners HealthCare in overeenstemming met hun belangenconflictbeleid. De concurrerende belangen van J.N.K. worden beheerd door het belangenconflictbeleid van BCH. De volgende gepatenteerde technologieën zijn in deze studie gebruikt: US2020/0281474A1 In vivo monitoring van cellulaire energetica met Raman-spectroscopie (toepassing). Aanvullende octrooiaanvragen voor gebruik in de oogheelkunde, weefsellevensvatbaarheid en brandwondsbeoordeling met behulp van Resonance Raman Spectroscopie zijn ingediend, waarbij R.J. ook uitvinder is.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door genereuze financiering aan S.N.T. van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK134590). We erkennen ook dankbaar de financiering aan S.N.T van het US National Institute of Health (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), National Science Foundation (EEC 1941543), Polsky Family Foundation en Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115). Daarnaast erkennen wij financiering aan R.J. via Grant #LIFER23-263034 van de American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. De auteurs betuigen hun diepe dank voor de deskundige steun van de Pathology Core van de Harvard Medical School voor histologiestudies. Wij willen onze dank uitspreken aan Dr. Robert Balaban en Dr. Armel Femnou van het NIH National Heart, Lung, and Blood Institute voor hun expertise in mitochondriale energetica en hun belangrijke hulp bij het ontwikkelen van de RRS-bibliotheek van individuele mitochondriale complexen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Wordt gebruikt om de portale ader te canuleren
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Wordt gebruikt om overtollig vocht te filteren tijdens anesthesie
BSA Sigma-Aldrich A7906Perfusaat samenstelling
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Perfusaat samenstelling
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Perfusaat samenstelling
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen
Membrane Oxygenator Radnoti130144Wordt gebruikt om perfusato te oxygeneren. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Perfusaat samenstelling
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Voor bloedgasanalyse
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Neem contact op met Pendar Technologies voor vragen over dit product

Referenties

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GeneeskundeEditie 234Editie 234Lege waardeEditieMitochondri norgaanlevensvatbaarheidmitochondriale gezondheidLevertransplantatiemitochondriale redoxtoestanden

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.