We presenteren een niet-invasieve realtime methode voor het monitoren van mitochondriale gezondheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). We gebruikten RRS om mitochondriale redoxtoestanden te kwantificeren en ontwikkelden een metriek voor mitochondriale gezondheid, de Resonance Raman verlaagde mitochondriale ratio (3RMR), die een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening laat zien dan traditionele bloedgasanalyten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time, niet-invasieve evaluatie van mitochondriale functie met behulp van resonantie Raman-spectroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel mitochondriën centraal staan in de pathogenese en ziekteprogressie, blijft mechanistisch inzicht in de dynamiek van mitochondriale gezondheid kostbaar en ontoegankelijk. Om deze kloof te dichten, maakt deze studie gebruik van Resonance Raman Spectroscopie (RRS) om mitochondriale functie te beoordelen, met een draagbaar systeem dat realtime, niet-invasieve en kwantitatieve metingen levert van mitochondriale cytochroom-redoxtoestanden in rattenlevers. In dit protocol demonstreren we het gebruik van deze technologie, inclusief installatie, gegevensacquisitie en gegevensverwerking. Deze studie presenteert een proof-of-concept-experiment dat het vermogen van RRS benadrukt om realtime veranderingen in de mitochondriale redoxtoestand te meten – en daarmee de mitochondriale functie. Kort werd het RRS-apparaat verbonden met een laserpomp en een data-acquisitiecomputer en geplaatst op 1 cm afstand van de rattenlever. Acquisitieparameters werden geselecteerd volgens het ratleverprotocol; Redoxtoestanden werden gemeten onder zuurstofhoudende en ischemische omstandigheden met behulp van een zuurstofstresstest. Veranderingen in mitochondriale redoxtoestanden werden gedurende de hele zuurstofstresstest gevolgd.
Inleiding
Mitochondriën spelen een cruciale rol in de cellulaire functie en homeostase. Mitochondriën zijn de belangrijkste drijfveren van cellulaire stofwisseling en reguleren ATP-aanmaak via oxidatieve fosforylering. Ze dienen ook als signaalorganellen die het cellot bepalen door apoptotische paden te reguleren, evenals ROS en Ca+2 signalering1. Mitochondriale disfunctie kan dus leiden tot diverse neurodegeneratieve, spier- en cardiovasculaire aandoeningen 2,3. Ondanks de cruciale rol die mitochondriën spelen in de ziekteprogressie, kan het evalueren....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren voor de experimenten werden onderhouden volgens de richtlijnen van de National Research Council en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Massachusetts General Hospital (Boston, MA, VS).
1. Het opzetten en gebruiken van RRS
- Beschrijving van het apparaat:
OPMERKING: Het draagbare RRS-systeem (Pendar Technologies; het product is uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden) gebruikt een 441 nm laser vanwege een resonante versterking van het Raman-spectrum van mitochondriale cytochromen met deze golflengte. De laser werkt tussen de 4....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verse levers werden onderworpen aan periodes van ischemie en reperfusie met behulp van een zuurstofstresstest. Vervolgens werden de realtime veranderingen in 3RMR gedurende de stresstest vergeleken met zuurstofverbruik, uitvloei van lactaat en kalium verkregen uit perfusatanalyse bij T0, T5, T10, T15. Onder gezonde omstandigheden worden 3RMR-waarden verwacht tussen 10% en 30% (Figuur 5A). Zoals verwacht vallen de 3.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie benadrukt een niet-invasieve, realtime en zeer gevoelige methode om mitochondriale gezondheid te kwantificeren met behulp van een draagbaar Resonance Raman Spectroscopiesysteem dat bestaat uit een laser in een compacte probe, verbonden met een glasvezelkabel met een laserpomp. Deze methode gebruikte een 441 nm laser om mitochondriën te exciteren, die unieke spectrale signalen produceren afhankelijk van hun oxidatietoestand. Zo kan RRS elke toestand van mitochondriën kwantific.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren concurrerende belangen. S.N.T en P.R. hebben voorlopige octrooiaanvragen die relevant zijn voor deze studie. P.R. is medewerker en aandeelhouder van Pendar Technologies. S.N.T.'s worden beheerd door MGH en Partners HealthCare in overeenstemming met hun belangenconflictbeleid. De concurrerende belangen van J.N.K. worden beheerd door het belangenconflictbeleid van BCH. De volgende gepatenteerde technologieën zijn in deze studie gebruikt: US2020/0281474A1 In vivo monitoring van cellulaire energetica met Raman-spectroscopie (toepassing). Aanvullende octrooiaanvragen voor gebruik in de oogheelkunde, weefsellevensvatbaarheid en brandwondsbeoordeling met behulp van Resonance Raman Spectroscopie zijn ingediend, waarbij R.J. ook uitvinder is.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door genereuze financiering aan S.N.T. van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK134590). We erkennen ook dankbaar de financiering aan S.N.T van het US National Institute of Health (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), National Science Foundation (EEC 1941543), Polsky Family Foundation en Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115). Daarnaast erkennen wij financiering aan
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16 G Catheter | BD Insyte Authoguard | 381454 | Wordt gebruikt om de portale ader te canuleren |
| Activated Charcoral | Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal | 931401 | Wordt gebruikt om overtollig vocht te filteren tijdens anesthesie |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | Perfusaat samenstelling |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | Perfusaat samenstelling |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Perfusaat samenstelling |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G) | Fisher Scientific | 13-200-292 | Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen |
| Masterflex peristaltic pumps | Cole Parmer, Vernon Hill, IL | 7528-30 | Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen |
| Membrane Oxygenator | Radnoti | 130144 | Wordt gebruikt om perfusato te oxygeneren. |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Perfusaat samenstelling |
| RAPIDPoint 500 Blood Gas System | Siemens Healthineers | 41115805 | Voor bloedgasanalyse |
| Resonance Raman System | Pendar Technologies | A4D441 | Neem contact op met Pendar Technologies voor vragen over dit product |
Referenties
- San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
- Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
- Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
- Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
- Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
- Kowaltowski ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
