Real-time, niet-invasieve evaluatie van mitochondriale functie met behulp van resonantie Raman-spectroscopie

Samenvatting

We presenteren een niet-invasieve realtime methode voor het monitoren van mitochondriale gezondheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). We gebruikten RRS om mitochondriale redoxtoestanden te kwantificeren en ontwikkelden een metriek voor mitochondriale gezondheid, de Resonance Raman verlaagde mitochondriale ratio (3RMR), die een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening laat zien dan traditionele bloedgasanalyten.

Samenvatting

Hoewel mitochondriën centraal staan in de pathogenese en ziekteprogressie, blijft mechanistisch inzicht in de dynamiek van mitochondriale gezondheid kostbaar en ontoegankelijk. Om deze kloof te dichten, maakt deze studie gebruik van Resonance Raman Spectroscopie (RRS) om mitochondriale functie te beoordelen, met een draagbaar systeem dat realtime, niet-invasieve en kwantitatieve metingen levert van mitochondriale cytochroom-redoxtoestanden in rattenlevers. In dit protocol demonstreren we het gebruik van deze technologie, inclusief installatie, gegevensacquisitie en gegevensverwerking. Deze studie presenteert een proof-of-concept-experiment dat het vermogen van RRS benadrukt om realtime veranderingen in de mitochondriale redoxtoestand te meten – en daarmee de mitochondriale functie. Kort werd het RRS-apparaat verbonden met een laserpomp en een data-acquisitiecomputer en geplaatst op 1 cm afstand van de rattenlever.  Acquisitieparameters werden geselecteerd volgens het ratleverprotocol; Redoxtoestanden werden gemeten onder zuurstofhoudende en ischemische omstandigheden met behulp van een zuurstofstresstest. Veranderingen in mitochondriale redoxtoestanden werden gedurende de hele zuurstofstresstest gevolgd.

Inleiding

Mitochondriën spelen een cruciale rol in de cellulaire functie en homeostase. Mitochondriën zijn de belangrijkste drijfveren van cellulaire stofwisseling en reguleren ATP-aanmaak via oxidatieve fosforylering. Ze dienen ook als signaalorganellen die het cellot bepalen door apoptotische paden te reguleren, evenals ROS en Ca⁺² signalering¹. Mitochondriale disfunctie kan dus leiden tot diverse neurodegeneratieve, spier- en cardiovasculaire aandoeningen ^2,3. Ondanks de cruciale rol die mitochondriën spelen in de ziekteprogressie, kan het evalueren van mitochondriale functie invasief, kostbaar en beperkt zijn.

Belangrijke indicatoren van mitochondriale functie, zoals zuurstofverbruik, oxidatieve fosforylering en de activiteit van verschillende complexen binnen de elektronentransportketen (ETC), worden gemeten via respirometrie. De ETC bestaat uit vier complexen (I–IV) die zijn ingebed in het binnenste mitochondriale membraan (IMM). Deze complexen transporteren, met behulp van andere co-enzymen, elektronen van gereduceerde substraten, zoals NADH en FADH2, naar de eindelektronenacceptor,_O2, die vervolgens wordt gereduceerd tot water. De meeste hedendaagse respirometrie-assays, zoals de Seahorse en Orobros O2k, vereisen weefselverwerking, waardoor hun toepassing voor translationeel onderzoek^{beperkt wordt 4,5}. Het meten van mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) is een andere methode om mitochondriale disfunctie te evalueren, waarbij gebruikmaken van kationische lipofiele fluoroforen, zoals JC-1, samen met microscopische beeldvorming, waarbij gekoppelde (gezonde) en nietgekoppelde (beschadigde) mitochondriën fluoresceren met verschillende golflengten⁶. Deze assays kunnen echter een lage gevoeligheid^{hebben van 5}. De kleurstof zelf kan ook een hoge cytotoxiciteit hebben bij hoge concentraties⁵. Tot slot vereist deze techniek, net als bij respirometriemetingen, ook weefselverwerking. Spectroscopie-gebaseerde technieken zijn recentelijk gebruikt als niet-invasieve methoden om de gezondheid van mitochondria te evalueren. Zo is Fosformagnetische Resonantiespectroscopie (P-MRS), een methode die het cellulaire metabolisme evalueert door de concentraties van fosforhoudende metabolieten te meten, gebruikt om gemodificeerd adipogeen weefsel te karakteriseren dat differentiatie⁷ ondergaat. Deze techniek vereist echter ook gespecialiseerde apparatuur en training.

Onze groep demonstreerde onlangs een realtime, niet-invasieve en zeer specifieke techniek om de mitochondriale redoxtoestand te meten als marker voor orgaanlevensvatbaarheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). RRS gebruikt inelastische verstrooiing van fotonen voor de kwantificering van redoxtoestanden van mitochondriale cytochromen. Porfyrineringen in heemgroepen van moleculen zoals mitochondriale cytochromen, hemoglobine en myoglobine produceren een karakteristiek Raman-spectrum, afhankelijk van hun oxidatietoestand wanneer ze worden geëxciteerd met een 441 nm golflengte laser⁸. Hoewel het RRS-systeem een golflengte van 441 nm gebruikt, kunnen ook lasers met 420 nm en 405 nm golflengten worden gebruikt, die elk bij voorkeur een ander cytochroomcomplex versterken. Het spectrum verkregen uit een onbekend monster van belang wordt gekruist met vooraf opgenomen bibliotheken van volledig geoxideerde of gereduzeerde intacte mitochondriën, wat de verhouding van gereduceerde tot totale mitochondriën of de gemiddelde redoxtoestand van de in situ ETC-cytochromen oplevert. Deze verhouding wordt gedefinieerd als de Resonance Raman Reduced Mitochondriale Ratio (3RMR).

Er zijn 3 verschillende berekeningen/typen van 3RMR: mitochondriale 3RMR (mito-3RMR), complex III 3RMR (cIII-3RMR) en complex IV 3RMR (cIV-3RMR). Elk van deze indices wordt berekend door het deel van gereduceerd tot het totale aantal van een gegeven component. Bijvoorbeeld, de 3RMR van cIII zou de verhouding zijn van gereduceerde cIII tot het totale aantal cIII in het weefsel (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Hetzelfde patroon geldt voor cIV. Dus 3RMR-cIII zou verwijzen naar de verhouding van gereduceerde cIII tot de totale hoeveelheid cIII, en 3RMR-cIV zou verwijzen naar de verhouding van gereduceerde cIV tot de totale hoeveelheid cIV. Door regressieanalyse worden ofwel mitochondriale redoxtoestanden (mito-3RMR) berekend met behulp van spectrale bibliotheken van intacte mitochondriën, of individuele complexe redoxtoestanden (cIII-3RMR en cIV-3RMR) worden berekend met behulp van cIII- en cIV-spectrale bibliotheken. Een recente publicatie⁹ toonde aan dat mito-3RMR representatief is voor het gewogen gemiddelde van cIII- en cIV-redoxtoestanden (of cIII-3RMR en cIV-3RMR). Het is belangrijk op te merken dat cI en cII niet Raman-actief of resonant versterkt zijn over de 441 nm golflengte. Daarom worden ze niet berekend bij het berekenen van de mito-3RMR.

Door gebruik te maken van deze typen 3RMR, hebben we het optimale bereik van 3RMR gedefinieerd. In "gezonde" organen zijn mitochondriën intact en hebben ze voldoende zuurstoftoevoer. Daarentegen kunnen beschadigde organen onvoldoende zuurstofafgifte of -gebruik hebben, waardoor ETC-complexen elektronen ophopen. Elektronenaccumulatie veroorzaakt "reductieve spanning", waarbij de mitochondriën verschuiven van geoxideerd naar gereduceerd en de 3RMR-waarden toenemen. Verschillende studies 8,9,10,11,12, variërend van harten en levers in knaagdier- en varkensmodellen, zijn begonnen licht te werpen op het optimale "gezonde" bereik voor 3RMR, dat wordt voorgesteld tussen 10 en 30 te liggen. Zo onderwierpen Perry et al. zoogdierharten aan hypoxie, waarbij een 3RMR van 30% de optimale balans opleverde voor gevoeligheid en specificiteit om hypoxisch weefsel⁸ te detecteren. Deze trend werd verder bevestigd in aanvullende studies met hartweefsel^11,12 en levertransplantaten¹⁰. Daarnaast toonden Nyugen et ^al.9 aan dat 3RMR-waarden dalen tot zeer lage (geoxideerde) waarden voor weefsels waarin de stofwisseling is gestopt, met 3RMR-niveaus (7,667 ±± 4,926) van niet-transplanteerbare warm-ischemische levers na 3 uur normotherme machineperfusie, vergeleken met 3RMR-waarden boven 10 (~12–15) voor verse en transplanteerbare warm-ischemische levers⁹.

Naast deze demonstraties van hoe 3RMR de levensvatbaarheid van weefsels kan meten, maken de gevoeligheid, specificiteit en gebruiksgemak van RRS het zeer toepasbaar voor veel andere soorten onderzoek waarbij het cellulaire metabolisme en mitochondriale functie worden beïnvloed. In eerdere studies is RRS gebruikt om maculadegeneratie en glaucoom bij muizen te detecteren door de metabole activiteit van niet-gemyeliniseerde axonen van retinale ganglioncellen bij de oogzenuwkop¹³ te evalueren. Daarnaast werd het gebruikt om coarctatie van de aorta (CoA) te detecteren in een rattenmodel van aangeboren hartziekten, een diagnose die vaak over het hoofd wordt gezien bij screenings voor pasgeborenen¹². Deze technologie werd ingezet om orgaanfunctie en levensvatbaarheid onder verschillende experimentele omstandigheden te begrijpen die relevant zijn op het gebied van orgaantransplantatie, waaronder studies die de levensvatbaarheid van orgaan beoordelen op ex vivo machine perfusie^10,11, reoxygenatie poststatische koude opslag^{evalueren of} reperfusieschade van warm-ischemische levers beperken⁹.

Dit artikel probeert RRS vast te stellen als een realtime, gevoelig instrument voor het beoordelen van mitochondriale gezondheid. Hele levers uit een rattenmodel werden blootgesteld aan verschillende niveaus van ischemie en zuurstofreperfusie als stresstest om de mitochondriale respons te beoordelen. In deze zuurstofstresstest worden verse levers onderworpen aan 5 minuten initiële perfusiestroom, 5 minuten ischemische en 5 minuten reperfusie. 3RMR-metingen en lactaat-, K+- en partiële zuurstofdruk (pO2) werden gedurende de hele stresstest uitgevoerd. Een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening werd waargenomen met 3RMR vergeleken met traditionele bloedgas-analyten. Met deze experimenten wordt het gebruik van RRS niet alleen benadrukt voor mechanistische studies, maar ook als diagnostische methode en therapeutisch testbed. Het gedeelde protocol kan dus nuttig zijn voor diverse onderzoekers die met mitochondriën werken. Al met al kan RRS, met zijn niet-invasieve realtime en zeer specifieke aard, een aanzienlijke impact hebben op het cellulaire metabolisme.

Protocol

Alle dieren voor de experimenten werden onderhouden volgens de richtlijnen van de National Research Council en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Massachusetts General Hospital (Boston, MA, VS).

1. Het opzetten en gebruiken van RRS

1. Beschrijving van het apparaat:
   OPMERKING: Het draagbare RRS-systeem (Pendar Technologies; het product is uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden) gebruikt een 441 nm laser vanwege een resonante versterking van het Raman-spectrum van mitochondriale cytochromen met deze golflengte. De laser werkt tussen de 4 mW en 8 mW.
   1. Verbind een laserexcitatiebron met een speciaal gebouwde probe via een glasvezelkabel. De probe schijnt een laserpunt van 2 mm diameter op het weefsel en verzamelt ook het uitgezonden spectrum. Het spectrum gaat vervolgens door een banddoorlaatfilter en wordt opgevangen door een charge-coupled device (CCD) array. Het spectrum wordt elke seconde verzameld over een tijdsbestek van 180 seconden en gemiddeld om een rauw, ruisgereduceerd spectrum voor analyse te creëren.
   2. De software vergelijkt dit verkregen spectrum met vooraf gemeten spectrale bibliotheken via een regressieanalyse.
2. Procedure voor pre-recording libraries
   OPMERKING: Voor de experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn gereduzeerde en geoxideerde vormen van mitochondriën, complex III, en complex IV, hemoglobine- en myoglobinebibliotheken gecreëerd en gebruikt. De RRS-signalen van alle bibliotheken werden opgenomen in een black box bij kamertemperatuur (21 °C). Deze bibliotheekbestanden worden apart meegeleverd met de analysesoftware. Afhankelijk van het weefsel van belang en de aanwezigheid van andere Raman-actieve moleculen, kunnen er echter ook andere bibliotheken worden gecreëerd door het volgende protocol passend aan te passen. Ruwe RRS-spectra van de hemoglobine-, myoglobine- en geoxideerde/gereduceerde complexe III/IV-bibliotheken worden geleverd in Aanvullende Figuur 1.
   1. Hemoglobinebibliotheken (Aanvullende Figuur 1C):
      1. Verzamel vers knaagdierbloed via dierlijke uitlating. Oxygeneer het verzamelde bloed met 100% zuurstof, of deoxygeneer het met 100% stikstof, in een glazen cuvet, waarbij natriumdithionaat wordt toegevoegd.
      2. Meet de RRS van elke staat 10 minuten door de glazen cuvetwand, met de RRS-probe 9 mm van de glazen cuvette geplaatst.
      3. Gebruik spectrale pieken bij 1356 ^cm-1 om de zuurstofgedroogde toestand te verifiëren, en gebruik pieken bij 1376 ^cm-1 om de zuurstofhoudende toestand te bevestigen.
   2. Gereduzeerde/geoxideerde mitochondriale bibliotheken (Figuur 1)
      1. Isoleer mitochondriën uit gehomogeniseerde en gezuiverde knaagdierenharten in een glazen cuvet. Plaats de Raman-sonde 9 mm van de glazen cuvet en meet de spectra van deze mitochondriën door de glazen wand.
      2. Creëer volledig geoxideerde omstandigheden door 100% zuurstoftoevoer naar de mitochondriën te leveren. Controleer de geoxideerde toestand door de afwezigheid van de gereduceerde RR-piek bij 1357 ^cm-1.
      3. Creëer volledig verminderde omstandigheden door de mitochondriën bloot te stellen aan 100% stikstof met kleine hoeveelheden waterstofsulfide. Controleer de gereduceerde omstandigheden door het ontbreken van een geoxideerde RR-markerpiek op 1371 ^cm-1.
   3. Geoxideerd/gereduceerd complex III/IV (Aanvullende Figuur 1A,B):
      1. Isoleer complex III en IV zoals elders beschreven 9,15,16,17. Kort gezegd, gebruik een standaardmonster van geïsoleerde mitochondriën (overeenkomend met 200 nanomol cytochroom a) als uitgangsmateriaal.
      2. Verdun de mitochondriën tot 10 nmol cytochroom A/mL in ijskoude buffer C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Voeg vervolgens 10% met n-β-D-dodecyl maltoside (DM) druppel voor druppel toe tot een uiteindelijke concentratie van 1%, terwijl je zachtjes op ijs mengt.
      3. Centrifugeer het extract op 40.000 × g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant aan op een 2,5 cm × 20 cm glazen kolom die eerder is gevuld met een uitwisselingshars die in evenwicht is gehouden met 5 kolomvolumes buffer C (met 0,02% w/v DM).
      4. Na wassen met 2 kolomvolumes buffer C elueer mitochondriale complexen door een lineaire 0–400 mM NaCl-gradiënt toe te passen in dezelfde buffer en verzamel je het eluum in 4 mL fracties.
      5. Groene fracties met Complex IV eluerden dicht bij het midden van de gradiënt (~180 mL NaCl), vóór de roodachtige fracties die Complex III bevatten. Concentreer de gepoolde fracties die elk complex bevatten tot 20–30 nmol cytochroom a/mL.
      6. Zodra de afzonderlijke complexen geïsoleerd zijn, worden ze blootgesteld aan oxiderende en reducerende omstandigheden. Verminder een monster van 11 mM van Complex III in Tris-buffer met 2 mL ascorbaat (1 M) om cytochroom c1 te reduceren en 2 mL HS (hydrosulfiet) om cytochromen b_L en b_H volledig te verminderen.
      7. Verminder een monster van 18,67 mM van Complex IV in de Tris-buffer in meerdere stappen, aangezien Complex IV een meerstaps katalytisch oxidatieproces ondergaat. Om Complex IV volledig te reduceren, voeg je twee 2 mL H₂O₂ toe (10 mM), gevolgd door 2 mL HS.
      8. Verzamel bibliotheekspectra na elke toevoeging om elke stap van de cyclus vast te leggen. Voeg volledig geoxideerde en gereduceerde spectra toe aan de uiteindelijke referentiebibliotheek om de stationaire toestanden van complex IV weer te geven.
      9. Bereid alle monsters voor in een glazen flesje van 1 mL en houd ze op een vaste positie op 9 mm afstand van de probelens en sluit ze in een zwarte doos om lichtbesmetting te voorkomen. Verzamel RRS-spectra voor 600 s voor elk complex en elke oxidatietoestand.
      10. Valideer de zuiverheid van geïsoleerde cIII en cIV zoals eerder beschreven¹⁷, en valideer de toereikendheid van geïsoleerde cIII- en cIV-spectrale bibliotheken bij het verklaren van de volledige mitochondriale spectra zoals beschreven in een recent artikel⁹.
   4. Myoglobinebibliotheken (Aanvullende Figuur 1D):
      1. Met vergelijkbare zuurstof- en stikstofstromen (met opgelost natriumdithioïet) varieer de oxymyoglobinesaturatie van het myocardmyoglobine-extract tussen 0% en 100%. Controleer het Raman-spectrum via markertoppen op 1355 ^cm-1 en 1376 ^cm-1.

OPMERKING: De meeste hierboven beschreven spectrale componenten, zoals hemoglobine of geoxideerde/gereduceerde mitochondriën, zijn heembevattende moleculen en worden geëxciteerd door dezelfde golflengte. Dit RRS-systeem voorkomt signaaloverlap door voor elk molecuul een regressiebibliotheek te creëren op basis van zijn unieke spectrale signaal. De verkregen verstrooide spectra worden uitgevoerd door een regressie-algoritme tegen de geselecteerde bibliotheken. Het regressie-algoritme levert een factor op voor elk bibliotheekspectrum die de best passende schatting van de relatieve bijdrage in het geregistreerde spectrum weergeeft, en dus de relatieve concentratie in het weefsel. Omdat het algoritme de beste fit gebruikt over een reeks golfgetallen, maken kleine verschillen in de positie of intensiteit van spectrale pieken van de verschillende bibliotheekcomponenten het mogelijk dat de regressie zelfs nauw verwante chromoforen kan onderscheiden. Via het regressie-algoritme en spectrale bibliotheken kan het RRS-systeem het totale, verstrooide signaal opsplitsen in verschillende componenten, afhankelijk van hun unieke spectrale pieken, waardoor signaaloverlap met heemhoudende moleculen wordt voorkomen. Om de relatie tussen hemoglobine en mitochondriën te tonen, is aanvullende figuur 2 opgenomen, die beelden toont van spectra genomen van een leverperfusie, opgesplitst in het gemeten signaal, de lijn van best-fit en het onverklaarbare residu dat voortkomt uit verschillen in de individuele spectrale pieken. In paneel A worden gereduceerde en geoxideerde hemoglobinebibliotheken en gereduzeerde en geoxideerde mitochondriale regressiebibliotheken geselecteerd. De lijn van best-fit die via de bibliotheken en de regressieanalyse wordt samengesteld, overlapt netjes met het gemeten signaal, en er is weinig onverklaard residu. In paneel B worden alleen geoxideerde en gereduceerde mitochondriënbibliotheken geselecteerd. Omdat er een grote onverklaarde residuele structuur is, is de mitochondriale spectrale piek enkele golven verschoven ten opzichte van die van hemoglobine, die niet was opgenomen in de regressieanalyse. Bovendien leggen de auteurs in de aanvullende figuren van Nguyen et ^al.9 de relatie uit tussen mitochondriën en de individuele complexen (cIII en cIV), evenals de relatie tussen individuele complexen¹⁶, waarbij complex III scherpere, lagerfrequente pieken vertoont, terwijl complex IV bredere, omhoog verschoven banden vertoont. Verder tonen de auteurs aan dat de gereduzeerde Complex III- en Complex IV-bibliotheken het gemeten spectrum van verminderde hele mitochondriën volledig verklaren, wat resulteert in minimale onverklaarde residuen.

Figuur 1: Spectrale bibliotheken van volledig geoxideerde en gereduzeerde mitochondriën. RRS-bibliotheekspectra werden verkregen nadat geïsoleerde mitochondriën (A) 100% zuurstof of 100% stikstof (B) kregen om respectievelijk geoxideerde en gereduzeerde toestanden te bereiken. Deze toestanden werden bevestigd met de aanwezigheid van RR (C) zuurstofhoudende en verminderde (D) markerpieken. De verschuiving in deze pieken komt overeen met veranderingen in moleculaire vibratiemodi in aanwezigheid van zuurstof. De intensiteit van elke piek wordt genormaliseerd tot 1 willekeurige intensiteitseenheid (AU), omdat de versterking van de gereduceerde toestand groter is met deze 441 nm excitatiegolflengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Gegevensverzameling met behulp van RRS

1. Apparaatopstelling:
   1. Verbind de spectrometerunit (ondergebracht in een compacte kast) op de gelijkstroom (DC) voeding en op de stroomadapter via de meegeleverde kabels. De spectrometerunit heeft één ronde plug met uitlijningsindrukken.
   2. Lijn de inkepingen van de ronde stekker uit met die van de kabel die op de stroomadapter wordt aangesloten. Er is geen schoonmaak nodig voordat de poorten worden aangesloten (Figuur 2).
   3. Sluit de computer die de analyse uitvoert aan op dezelfde stroomadapter die ook de spectrometer en voeding verbindt met de meegeleverde kabels.
   4. Plaats de laserprobe in de houder van de probe. Pas de positie van deze sonde aan aan aan het begin van het experiment aan.
   5. Open de spectrometerbesturingssoftware (Cellular Energetics Software).
2. Software-setup:
   OPMERKING: Instellingenbestanden en regressiebibliotheken voor verschillende soorten weefsel worden bij het systeem geleverd. Deze bestanden bevatten informatie over welke bibliotheken het RRS-systeem in de regressie moet bevatten, hoeveel spectra er in het regressievenster zijn opgenomen, en andere parameters zoals laservermogen. Standaardinstellingen kunnen worden aangepast en er kan een nieuw instellingenbestand worden opgeslagen voor gebruik in toekomstige experimenten. Schermafbeeldingen van de hieronder beschreven software zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 3.
   1. Bij het openen van de spectrometerbesturingssoftware verschijnt een grafiek met percentage 3RMR, zuurstofsaturatie (StO₂) en myoglobinesaturatie. Dit scherm is waar deze metrics worden weergegeven, indien geselecteerd, in realtime gedurende de metingen. Klik op het tabblad Instellingen linksonder op de pagina.
   2. Voer onder het tabblad Info sessie-informatie in onder Sessienaam, en eventuele benodigde details onder het tabblad Sessiebeschrijving .
   3. Er zijn twee manieren voor gegevensverzameling. Gebruik de Spot Check-modus om spectra te verzamelen totdat gespecificeerde kwaliteitsmetrics zijn behaald (bijv. target sigma of regressievenster/aantal spectra), en stop dan met opnemen. Gebruik Continue Modus om spectra op te nemen totdat de stopknop wordt ingedrukt. In beide modi worden alle gegevens, zowel 3RMR-resultaten als individuele spectra, automatisch opgeslagen. Dit experiment maakt gebruik van Continue Modus.
   4. Zodra alle sessiegegevens zijn ingevoerd, klik je op het tabblad Systeem .
   5. Selecteer onder Instellingen Bestand het protocol dat geschikt is voor het project (voor acellulaire rattenleverperfusies kies het Rat Liver Acellular protocol). Dit past automatisch het meettype, de gemiddelde lengte van de meting (regressievenster) en de doel-sigma aan.
      1. Om een nieuw instellingenbestand aan te maken, pas je een van de hierboven genoemde componenten aan en klik je vervolgens op de knop Opslaan . Dit zou deze parameters als een apart instellingenbestand moeten opslaan dat vervolgens in het systeem geïmporteerd kan worden.
      2. Om een nieuw instellingenbestand te importeren, klik je op het dropdownmenu naast Standaard (Mod) en selecteer je Importeren Nieuw Instellingenbestand. Klik op het nieuwe Instellingenbestand om te importeren.
   6. Selecteer en bevestig onder Regressiebibliotheken de combinatie van bibliotheken die gebruikt worden voor gegevensverzameling en analyses. De bibliotheken voor gereduceerde en geoxideerde mitochondriën [alleen Mito] werden voor dit experiment geselecteerd. Andere gebruikers kunnen ervoor kiezen bibliotheken te gebruiken die ook hemoglobine, myoglobine of andere complexen onder de Geavanceerde Bibliotheek bevatten.
   7. Selecteer en bevestig de voorkeursmodus voor vensterbreedte.
      1. Adaptieve breedtemodus: Gebruik de adaptieve breedtemodus om individuele spectra toe te voegen aan het gemiddelde spectrum totdat het maximale sigma-doel is bereikt. Als het sigma-doel niet wordt bereikt, stopt de opname wanneer het de bovengrens van het ingestelde regressievenster bereikt (d.w.z. het maximale aantal spectra dat het moest opnemen). De meetresultaten worden op het scherm weergegeven nadat het minimum sigma-doel is bereikt.
      2. Vaste breedtemodus: Gebruik de vaste breedtemodus om individuele spectra toe te voegen aan het gemiddelde spectrum totdat het doelaantal spectra is opgenomen (ingesteld onder gemiddelde lengte).
   8. Zodra de systeeminstellingen klaar zijn, klik je op het tabblad Plot .
   9. Selecteer onder Hoofdreeks de componenten die worden uitgezet en tijdens de metingen op het scherm worden weergegeven.
   10. Bevestig dat alle geselecteerde meetcomponenten in lijn zijn met het protocol van belang.
3. Dataverwerving:
   OPMERKING: Raman-metingen moeten in een donkere ruimte worden genomen. Zorg ervoor dat de werkruimte zo goed mogelijk afgeschermd is van licht, voordat je begint met het verzamelen van gegevens. Als de kamer niet volledig tegen licht kan worden afgeschermd, wordt het RRS-systeem geleverd met een zwarte afdekking met een rechthoekige opening in het midden (afgebeeld in Figuur 2), waardoor de laserprobe kan worden geplaatst. De doos kan het monster/het deel van het orgaan bedekken waar RRS-metingen worden genomen. Vermijd directe of langdurige blootstelling aan de ogen bij het werken met de RRS-laser. Schiet geen laser direct in het oog of op reflecterende oppervlakken. Activeer de laser alleen wanneer deze direct op het weefsel van belang staat. De RRS-laser is een Klasse 3R-laser bij gebruik op 4 mW, en Klasse 3B bij gebruik op 10 mW. De laser is veilig voor weefselcontact.
   1. Selecteer de passende, vooraf opgeslagen instellingen, opnameparameters en bibliotheekbestanden.
   2. Plaats de laserprobe direct boven het weefsel/orgaan van interesse. Plaats de sonde zo loodrecht mogelijk en 1 cm van het weefsel af. Gebruik een liniaal om nauwkeurig 1 cm vanaf het oppervlak van het orgaan te meten. Stel de probe zo in dat hij dichter dan 1 cm is als het signaal niet duidelijk is. Zorg er echter voor dat de sonde het weefsel nooit raakt.
      OPMERKING: De sonde kan met de hand worden gebruikt, maar het wordt aanbevolen een sondehouder/standaard te gebruiken die verstelbaar is en stabiel blijft. Plaats de sonde zo loodrecht mogelijk en 1 cm van het weefsel af. Een liniaal kon worden gebruikt om nauwkeurig 1 cm vanaf het oppervlak van het orgel te meten. De probe kan worden aangepast zodat hij dichter dan 1 cm wordt geplaatst als het signaal niet duidelijk is. De sonde mag echter nooit het weefsel aanraken.
   3. Controleer of de laserplek zich op de linker laterale kwab bevindt, zo dicht mogelijk bij de portaalader.
   4. Controleer of alle geselecteerde bibliotheken, regressie-instellingen, target sigma, regressievenster en acquisitiemodi correct en naar wens zijn.
      1. Zorg dat de kamer zo donker mogelijk is. Controleer of de sonde geen besmetting, vooral geen bloed, op het raam heeft. In geval van besmetting gebruik je een pluisvrije, niet-schurende doek met 70% isopropylalcohol om het kwartsvenster schoon te maken, gevolgd door grondig te drogen met een droogdoek voordat je verder gaat.
      2. Bij zware besmetting veeg de sonde zo grondig mogelijk af, zoals hierboven beschreven. Kalibreer het apparaat vervolgens door de laser in een donkere behuizing te plaatsen die is bekleed met zwarte tape en op de Take Dark-knop te drukken. De kalibratie duurt ongeveer 5–10 minuten. Ongeacht de besmetting, kalibreer het apparaat eens per maand en het zal automatische herinneringsberichten sturen.
         OPMERKING: De uitleg van elke kwaliteitscontrolemaatstaf, voorbeelden van dergelijke kwaliteitscontrole-metrics en het ruwe spectrale signaal verkregen uit optimale en suboptimale opnames (Aanvullend Bestand 1, Figuur 3, Aanvullend Figuur 3). Deze kwaliteitscontrolecriteria zijn geoptimaliseerd voor hele levers uit het ratmodel. Elk nieuw ontwikkeld protocol dat een ander orgaan-/diermodel gebruikt, zou deze metrieken dienovereenkomstig moeten verfijnen en aanpassen.
   5. Klik op de Startknop op de Startpagina om data te verzamelen. Afhankelijk van de gekozen instellingen maakt de software opnames totdat de doelfoutwaarde (sigma) of 180 s is bereikt. Dataverzameling is nu voltooid.
      1. Leid de kwaliteit van het RRS-signaal af uit deze grafieken en waarden om aanpassing van de positie of de meetomstandigheden van de probe mogelijk te maken (Figuur 3). Als het verkregen RRS-signaal niet aan deze kwaliteitscontrolecriteria voldoet, stel de probe dan zo loodrecht mogelijk aan en ongeveer 9 mm van het oppervlak tot het probe-venster.
   6. Zodra het dataverzameling-/experimentele protocol is voltooid, gooi je de hele lever/het weefsel in een biohazard-bak. Maak elk systeem of oppervlak dat in contact was met het orgaan/weefsel schoon met 70% ethanol.
      1. Als je met een perfusiesysteem werkt, gebruik dan DI-water gemengd met enzymatische reiniger (7,8 mL verdund in 1 L gedeïoniseerd [DI] water), gevolgd door schoon DI-water.
         OPMERKING: Elke opname wordt opgeslagen als een apart analysebestand onder een nieuw sessiebestand. Resultaten voor 3RMR en mitochondriale signaalsterkte (r3RMR) worden in het hoofdvenster uitgezet. Het ruwe spectrum kan ook worden weergegeven. Andere kwaliteitscontrole-indicatoren, zoals restsignaalsterkte en totale signaalsterkte, worden weergegeven onder het tabblad Spectrum .
4. Data-analyse:
   1. Als je klaar bent met gegevensverzameling, klik je op de Review-map onderaan het scherm om het experimentele bestand te openen en de resultaten te bekijken.
   2. Alternatief kun je een tekstbestand openen met de resultaten. Selecteer het sessiebestand van interesse. Er wordt een analysebestand geopend met alle verkregen metingen. Elke parameter en zijn sigma-waarde hebben een eigen kolom. Bijvoorbeeld, 3RMR-waarden die per seconde worden verkregen, worden vermeld onder de kolom "3RMR," en de sigma-waarde wordt vermeld onder "sigma_3RMR".
   3. De laatste rij van elke kolom bevat de eindwaarden voor elke parameter van dat sessiebestand. Gebruik deze waarde om te plotten.
   4. Herhaal stappen voor elk sessiebestand/elke opname. Plot kreeg waarden zoals gewenst.

Figuur 2: RRS-apparaatopstelling. Een schema van de RRS-systeemopstelling. De probe is via een optische vezelkabel verbonden met het RRS-systeem, dat de laserexcitatiebron en de spectrometer bevat. Deze opstelling maakt vervolgens verbinding met elke laptop die de spectrometer-bedieningsapp bevat voor gegevensverzameling en analyse. Zowel de computer als de spectrometerunit zijn aangesloten op een stopcontact. RRS-metingen moeten in het donker worden genomen. Als de kamer niet volledig tegen licht kan worden afgeschermd, wordt het RRS-systeem geleverd met een zwarte afdekking met een rechthoekige opening in het midden, waar de laserprobe kan worden geplaatst. De doos bedekt het monster/het deel van het orgaan waaruit de RRS-metingen worden genomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeeldsporen en kwaliteitscontrolemetrics van suboptimale en optimale kwaliteitstraces. Het restsignaal (ruis) wordt gemarkeerd met een oranje beugel, en het mitochondriale signaal met een groene beugel. (A) Voorbeeldspoor van een suboptimaal Raman-signaal. Het restsignaal is te groot om te onderscheiden van het mitochondriale signaal. Spectrale pieken zijn niet te onderscheiden door het gemeten signaal. (B) Voorbeeldspoor van het optimale Raman-signaal. Het mitochondriale signaal is zichtbaar groter en verschilt van het restsignaal. Spectrale pieken uit de verkregen meting zijn te onderscheiden. (C) QC-metrieken verkregen van elk signaal. Over het geheel genomen is het totale signaal dat wordt verkregen bij de suboptimale meting kleiner dan de optimale meting. In de optimale opname wordt meer mitochondriaal signaal gemeten in vergelijking met de suboptimale opname, waarbij het mitochondriale signaal respectievelijk 17% en 14% van het totale signaal uitmaakt. Het signaal werd gemeten met 4,3% fout in de optimale meting, tegenover 18,5% fout in de suboptimale meting. Evenzo is het onverklaarbare restsignaal goed voor 11% van het totale signaal in de suboptimale opname, terwijl het 3,6% uitmaakt in de optimale opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Evaluatie van mitochondriale gezondheid met behulp van RRS

OPMERKING: Resonantie Raman Spectroscopie (RRS) technologie werd gebruikt om een mitochondriale levensvatbaarheidsmetriek (3RMR) te ontwikkelen die de levensvatbaarheid van transplantatieorganen aangeeft. Deze studie heeft als doel aan te tonen hoe veranderingen in zuurstofvoorziening – en daarmee cellulaire ademhaling – worden weerspiegeld in 3RMR-trends in vergelijking met traditionele schadebiomarkers, zoals lactaat en K⁺. Hier wordt een zuurstofstresstest gebruikt, waarbij na 5 minuten continue perfusie de zuurstofhoudende perfusiestroom voor 5 minuten wordt gepauzeerd en vervolgens 5 minuten wordt hervat. RRS-metingen, evenals in- en uitstroomperfusaatmonsters, worden gedurende de hele stresstest uitgevoerd.

1. Leveraanschaf:
   1. Dieren kalmeren in een inductiekamer met 3%–5% isofluran. Filter overtollige damp met actieve kool.
   2. Voer een volledige hepatectomie uit bij mannelijke Lewis-ratten (150 g). Bind de takken van de poortader af. Injecteer 50 U natriumheparine via de IVC. Canuleer de portaalader tijdens de operatie met een katheter van 16 G en spoel de lever door met 50 ml zoutoplossing.
   3. Leg de verkregen levers op ijs in een petrischaal met 30 ml oplossing van de University of Wisconsin (UW).
2. Subnormotherme machine perfusie (SNMP) opstelling en resonantie Raman-metingen:
   1. Stel het RRS-apparaat in zoals eerder beschreven. Stel het Acellular Rat Liver Protocol in op de spectrometercontrolesoftware, die automatisch de breedtemodus instelt op adaptieve breedte, gemiddelde lengte op 180 en doel-sigma op 1,5. Het selecteert ook 3RMR en Fluorescentie als meetparameters, evenals Mito alleen als regressiebibliotheek. Zet de acquisitiemodus op continue modus.
   2. Stel het SNMP-systeem op zoals elders beschreven¹⁸.
      1. Kort gezegd, zorg ervoor dat de perfusieopstelling bestond uit een perfusiekamer, een peristaltische pomp, een membraanoxygenator en een bubbelval.
      2. Zuurstof afleveren met een atmosferische mix (95_{% O2} en 5% CO₂); Houd pO₂ tussen 400–500 mmHg. Meet de intrahepatische druk met een druksensor en houd deze tussen 3–5 mmHg. Verzamel de monsters via bemonsteringspoorten.
   3. Zodra de software en het perfusiesysteem zijn ingesteld, verbind je de canule die de PV doorboort op de instroombuis van de perfusiemachine. Houd het orgaan, het perfusatiemiddel en de perfusie-installatie op kamertemperatuur (21 °C), zonder gebruik van een waterbad.
   4. Geef het perfusaat via de canule in de PV aan het orgaan met behulp van een peristaltische pomp.
      1. Om het perfusaat te bereiden, meng 500 mL fenol roodvrije Williams' Medium met 5 g Bovine Serum Albumine (BSA), 12 mg wateroplosbare dexamethason, 5 mL penicilline-streptomycine, 5 mL L-glutamine, 2,5 μL insuline en 1000 U heparine.
      2. Roer alle componenten ongeveer 20 minuten op een roerplaat, of totdat alle componenten zijn opgelost. Verhoog de perfusiestromen tot drukken van 3–5 mmHg.
   5. Plaats vervolgens de RRS-laserbron in de probehouder en plaats deze op 1 cm boven de grootste leverlob, zo dicht mogelijk bij de PV. Pauzeer de perfusiestroom na 5 minuten (T₅) en hervat deze na 10 minuten (T₁₀). Voer de stresstest uit na 15 minuten (T₁₅).
   6. Neem RRS-metingen gedurende de hele stresstest; Neem elke 5 minuten in- en uitstroommetingen op, beginnend bij T₀ (Figuur 4). Plot de 3RMR-waarden, evenals de uitvloei K^+- niveaus en lactaatniveaus voor T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Figuur 5).
   7. Bereken de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) bij T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ door de in- en uitstroompartiële zuurstofdruk (pO₂) te vermenigvuldigen met de oplosbaarheidscoëfficiënt van zuurstof in plasma (0,00314). Plot de OCR voor T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Figuur 5).
      OPMERKING: Voorbeeldige Resonantie Raman-spectrale sporen bij perfuseerde (T₅), ischemische (T₁₀) en reperfused (T₁₅) toestanden van één lever worden getoond (Figuur 6)

Figuur 4: Diagram dat experimentele stroming toont. Er werd een volledige hepatectomie uitgevoerd bij vrouwelijke Lewis-ratten. De verkregen lever werd op subnormotherme machineperfusie geplaatst en de eerste 5 minuten voorzien van zuurstofhoudende perfusaat. Perfusaat stroomt via de portaalader de lever binnen en circuleert via de peristaltische pomp (perfusiestroom weergegeven met blauwe pijlen). De zuurstofperfusie werd de volgende 5 minuten gepauzeerd bij T5 en opnieuw gestart voor nog eens 5 minuten bij T10. 3RMR-metingen die gedurende de stresstest worden uitgevoerd (afgebeeld als de laser). Perfusaatmonsters werden verkregen bij T0, T5, T10 en T15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Verse levers werden onderworpen aan periodes van ischemie en reperfusie met behulp van een zuurstofstresstest. Vervolgens werden de realtime veranderingen in 3RMR gedurende de stresstest vergeleken met zuurstofverbruik, uitvloei van lactaat en kalium verkregen uit perfusatanalyse bij T₀, T₅, T₁₀, T₁₅. Onder gezonde omstandigheden worden 3RMR-waarden verwacht tussen 10% en 30% (Figuur 5A). Zoals verwacht vallen de 3RMR-waarden bij T₀ en T₅ binnen dit bereik, aangezien de lever continu werd voorzien van zuurstofgehoudene perfusaat tussen deze tijdstippen (Figuur 5A). De 3RMR-waarde aan het einde van de ischemische periode (T₁₀) ligt echter buiten het optimale bereik (Figuur 5A). Deze toename wijst erop dat mitochondriën naar hun gereduceerde toestand verplaatsen, doordat de elektronen zich ophopen in de transportketen door zuurstofontholping. Bij T₁₀ wordt de zuurstofhoudende stroom hervat; De reperfusieperiode begint. Aan het einde van de reperfusieperiode (T₁₅) keren de 3RMR-waarden terug naar optimale niveaus (Figuur 5A) wanneer de activiteit van de ETC wordt hersteld met de herintroductie van zuurstof als laatste elektronenacceptor. Deze veranderingen in zuurstofstroom zijn ook zichtbaar in de ruwe spectra. Ruwe RRS-spectra bij T₀ en T₁₅ hebben spectrale kenmerken vergelijkbaar met die van geoxideerde mitochondriën (Figuur 6A,C), zoals een spectraal markerpiek bij 1371 ^cm-1 (Figuur 6D,F). Evenzo tonen de ruwe Raman-spectra op T₁₀ (Figuur 6B) verminderde RR-markers, zoals een spectrale markerpiek op 1357 ^cm-1 (Figuur 6E). Samenvattend identificeert RRS de verschuivingen in mitochondriale redoxtoestanden in realtime, wat zowel wordt aangetoond in het ruwe spectrale signaal als als een maatstaf voor mitochondriale gezondheid (3RMR).

RRS kan ook 3RMR-waarden berekenen op basis van de redoxtoestanden van cIII en cIV. Een vergelijkbaar patroon werd waargenomen in de cIII- en cIV 3RMR-waarden (Figuur 5B). Bij T₀ werden volledig geoxideerde 3RMR-waarden voor cIV en 3RMR-waarden binnen het optimale bereik voor cIII waargenomen. Deze redoxbalans tussen de complexen is fysiologisch, omdat elektronen van cIII naar cIV stromen om snel geoxideerd te worden. Bij het begin van de ischemische werd een toename van de 3RMR-waarden per complex waargenomen. Tijdens de ischemische periode verhoogt een ophoping van elektronen via de ETC de reductieve spanning op cIII en cIV, wat op zijn beurt cIII-3RMR en cIV-3RMR verhoogt. Bij herintroductie van zuurstof dalen de 3RMR-waarden van beide complexen echter weer naar optimale niveaus: volledig geoxideerde cIV en fysiologisch verminderde cIII (Figuur 5B). De 3RMR-trends in beide complexen tonen aan dat het stoppen van zuurstof de gehele ETC beïnvloedt, en geen enkel individueel complex is bijzonder kwetsbaar voor no-flow ischemie.

Aan de andere kant werden de veranderingen in zuurstofingsdynamiek niet weerspiegeld in schadebiomarkers en bloedgasanalyten verkregen uit perfusatanalyse. Bij het begin van ischemische wordt verwacht dat lactaat en K⁺ stijgen, omdat de cel afhankelijk wordt van aerobe ademhaling en langzaam afbreekt om intercellulair K⁺ vrij te geven. We verwachten ook dat OCR zal afnemen, omdat de cellen niet genoeg energie produceren om de cellulaire ademhaling voort te zetten. Zelfs na een periode van niet-doorstromings-ischemie vertoonden de zuurstofverbruikspercentages geen tekenen van schade. De uitstroom van lactaat en K⁺ waarden blijven relatief consistent gedurende de inspanningstest, ondanks de veranderingen in zuurstofvoorziening (Figuur 5D–E).

Figuur 5: Veranderingen in 3RMR en schadebiomarkers gedurende de zuurstofstresstest. Het begin van ischemie en de reperfusieperiodes worden weergegeven via stippellijnen op respectievelijk minuut 5 en 10. Daarnaast worden perioden van zuurstofhoudende stroming weergegeven met blauwe lijnen, en periodes van ischemie met rode lijnen. (A) 3RMR-waarden gedurende de mitochondriale assay. De 3RMR-waarden stijgen wanneer de zuurstofhoudende stroom wordt gepauzeerd en dalen weer naar optimale niveaus wanneer de stroom wordt herstart. (B) 3RMR-waarden van complex III en complex IV. Het stoppen van de stroom leidt tot een vermindering van beide complexen. (C) Gemiddelde uitstroom K⁺ waarden gedurende de stresstest. K^+-waarden blijven gedurende de hele stresstest consistent, ondanks veranderingen in de zuurstofvoedingsdynamiek. (D) Gemiddelde uitvloei van lactaat gedurende de inspanningstest. De lactaatproductie blijft constant tijdens de stresstest. (E) Zuurstofverbruik op T₀, T₁₀, T₁₅. Aangezien pO2-waarden stroomgebaseerde metingen zijn, kon OUR niet worden berekend voor een periode zonder stromingsischemie. Er werden geen significante veranderingen waargenomen (p-waarde: 0,2500) (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeeldige ruwe spectrale sporen van een verse rattenlever tijdens de stresstest. Volledige spectrale profielen van een lever in (A) geoxideerde, (B) ischemische en (C) reperfiseerde toestanden. De verschuiving van de geoxygeneerde RR-marker naar de gereduceerde RR-marker is zichtbaar wanneer men inzoomt op de spectrale piek van de mitochondriën, gemarkeerd met een rood vakje in elk spectraal profiel. (D–F) Geoxideerde RR-markertoppen (1371 ^cm-1) zijn aanwezig in (D) geoxideerde en (F) reerfused toestanden en zijn gemarkeerd met een rode stippellijn. De piek van de verminderde RR-marker (1357 ^cm-1) is aanwezig in (E) ischemische toestand en wordt gemarkeerd met een blauw gestreepte lijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Spectrale sporen van gereduzeerd en geoxideerd complex III, complex IV, hemoglobine en myoglobine. (A) Complex III, (B) complex IV, (C) hemoglobine en (D) myoglobine. De regressieanalyse laat de verzamelde spectra vergelijken met deze spectrale bibliotheken (indien geselecteerd), en levert een factor op voor elk bibliotheekspectrum die de best passende schatting van de relatieve bijdrage in het geregistreerde spectrum en daarmee de relatieve concentratie in het weefsel vertegenwoordigt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Voorbeeld van het gebruik van regressiebibliotheken om overlappende heemhoudende moleculen (hemoglobine en geoxideerde/gereduceerde mitochondriën) af te breken. (A) Ruwe spectrale sporen van leverweefsel gedoordrenkt met cellulaire perfusaten, met alle noodzakelijke regressiebibliotheken, zoals hemoglobine, geoxideerd hemoglobine, gereduzeerde mitochondriën en geoxideerde mitochondriën, werden geselecteerd. Het is duidelijk dat de lijn van beste pasvorm, afgeleid van de bibliotheken en de regressieanalyse, netjes overlapt met het gemeten signaal, met weinig onverklaarde residuen. (B) Ruwe spectrale sporen uit hetzelfde weefsel, maar met alleen geoxideerde en gereduzeerde mitochondriën geselecteerd. Omdat er een grote onverklaarde residuele structuur is, is het duidelijk dat de mitochondriale spectrale piek enkele golven is verschoven ten opzichte van die van hemoglobine, die niet was opgenomen in de regressieanalyse. Deze figuur toont aan dat de hoge-resolutie spectrometer en regressieanalyse tegen het gehele spectrum in staat zijn nauw verwante spectra te onderscheiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Schermopnames van de software. (A) Hoofdvenster dat meetwaarden over de tijd toont. 3RMR, StO2 en andere geselecteerde series worden hier tijdens de meting weergegeven. Daarnaast wordt de signaalsterkte van elke serie weergegeven als een gestippelde lijn op de grafiek, en een waarde eronder aan de rechterkant van het scherm. Bijvoorbeeld, de hier vastgelegde doorgetrokken lijn vertegenwoordigt de 3RMR van een weefsel, en de stippellijn geeft r3RMR (signaalsterkte van 3RMR) aan. Als men de kwaliteit van de opgenomen spectra wilde zien, kon men klikken op het tabblad Spectrum Weergeven (omcirkeld in paars). (B) Scherm dat het ruwe spectrum van het weefsel weergeeft. Dit is het tabblad waar men de kwaliteit van het signaal kan beoordelen aan de hand van de sterkte van de gemeten spectra versus de resterende ruis. (C) Tab dat trends in series over het experiment toont. Als bijvoorbeeld meerdere 3RMR-metingen gedurende een experiment worden uitgevoerd, wordt elke meting in deze tab over de tijd weergegeven. Trends in andere series, indien geselecteerd, worden hier ook getoond. Dit tabblad was toegankelijk door op de knop Trends op het hoofdscherm te klikken (omcirkeld in groen op A). (D) Info-tabblad, waar men experimentele informatie kan invoeren, zoals sessienaam en beschrijving. (E) Systeemtab, waar men vooraf geladen protocollen kan uploaden. Als bijvoorbeeld het protocol LiverContAcell wordt geselecteerd, stelt dit protocol de regressiebibliotheek, het doelregressievenster en de sigma in volgens het acellulaire perfusieprotocol voor rattenlevers. Om een protocol te importeren, kan men klikken op Instellingen importeren vanuit Bestand en het protocol van interesse importeren. Als men een eigen protocol wil maken, kan men de benodigde bibliotheken selecteren uit het (F) Regressie Library keuzemenu, doel-sigma en regressievenster aanpassen, evenals alarmen, en linksonder op Save (weergegeven met een schijf) klikken. (F) Plottab, waar men kan kiezen welke serie in het hoofdvenster wordt weergegeven. Als men een spectrum opnieuw analyseert en meer series wil toevoegen aan zijn eerdere metingen, kan men de reeks van interesse onder het Recal-gedeelte selecteren. Tijdens herkalibratie (Recal) zal de software de gemeten ruwe spectra opnieuw analyseren en de resultaten van de nieuw geselecteerde reeks weergeven. Men kan ook de signaalsterkte van geselecteerde series vanuit dit tabblad tonen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 1: Uitleg van elke kwaliteitscontrolemaatstaf.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze studie benadrukt een niet-invasieve, realtime en zeer gevoelige methode om mitochondriale gezondheid te kwantificeren met behulp van een draagbaar Resonance Raman Spectroscopiesysteem dat bestaat uit een laser in een compacte probe, verbonden met een glasvezelkabel met een laserpomp. Deze methode gebruikte een 441 nm laser om mitochondriën te exciteren, die unieke spectrale signalen produceren afhankelijk van hun oxidatietoestand. Zo kan RRS elke toestand van mitochondriën kwantificeren via hun spectrale signaturen en de uitgezonden spectra vergelijken met vooraf gemeten spectrale bibliotheken met behulp van regressieanalyse. Vervolgens werd een mitochondriale gezondheidsmaatstaf ontwikkeld op basis van de verhouding van gereduceerde tot totale mitochondriën: de Reduced Resonance Raman Mitochondriale Ratio (3RMR).

Dit artikel richt zich op het aantonen van realtime veranderingen in 3RMR als functie van zuurstofvoorziening met native tissue zonder de noodzaak van monsterverwerking. Dit werd bereikt via een zuurstofstresstest: na 5 minuten continue zuurstofhoudende perfusie wordt de perfusiestroom 5 minuten gepauzeerd en opnieuw gestart voor nog eens 5 minuten. 3RMR-metingen worden gedurende de hele stresstest uitgevoerd. Een stresstestmodel, waarbij we schakelen tussen ischemische en zuurstofhoudende perioden, stelt ons in staat continue veranderingen in mitochondriale redoxtoestanden te volgen – en daarmee ook de mitochondriale functie. Met andere woorden, de zuurstofstresstest stelt ons in staat de trends in 3RMR te volgen als functie van zuurstofgehalte. Onze groep heeft het verhogen van 3RMR-waarden toegeschreven aan ischemische toestanden, die de perfusiestroom verstoren, waardoor elektronen die door de ETC passeren zich ophopen, aangezien_O2 niet beschikbaar is als de uiteindelijke elektronenacceptor. Deze ophoping van elektronen veroorzaakt een verminderde toestand, wat vertaalt in een toename van 3RMR-waarden. Echter, bij herintroductie van_O2 wordt verwacht dat gezonde mitochondriën de ETC-activiteit hervatten en herstellen tot fysiologische redoxtoestanden, aangezien hun structurele en functionele elementen intact zijn.

Zoals verwacht werd in het huidige artikel een realtime, continue toename van 3RMR waargenomen gedurende de ischemische periode (Figuur 5A). Evenzo keert 3RMR geleidelijk terug naar optimale niveaus gedurende de reperfusieperiode (Figuur 5A). Deze real-time verandering in mitochondriale redoxtoestanden is ook zichtbaar in de spectrale grafiek, aangezien de mitochondriale piek gedurende de ischemische periode verschuift van geoxideerd (1371 ^cm-1) naar gereduceerde (1357 ^cm-1) toestanden, en aan het einde van de reperfusie weer oxideert (Figuur 6). Andere pieken van verminderde RR-markers verschijnen ook tijdens de ischemische periode. In tegenstelling tot traditionele mitochondriale gezondheidsassays is Resonance Raman gevoelig genoeg om de redoxtoestanden van complex III en complex IV te kwantificeren, wat mechanistisch inzicht kan geven in de specifieke impact van ischemie-reperfusieletsels op de ETC. In gezonde mitochondriën worden elektronen door verschillende complexen in de ETC geleid, beginnend bij complex I, totdat ze O₂ bereiken als de uiteindelijke elektronenacceptor. Een pauze in de zuurstofstroom kan elk complex naar een gereduceerde toestand verplaatsen, omdat elektronen zich terugtrekken langs de ETC. Zoals verwacht werd een realtime toename waargenomen in 3RMR-waarden van cIII en cIV bij het begin van ischemie. Dit geeft aan dat het ontbreken van_O2 invloed heeft op het geheel van de ETC, en niet op een specifiek complex (Figuur 5B). Zoals we hieronder zullen bespreken, vergemakkelijkt de gevoeligheid van RRS gedetailleerde mechanistische studies en ondersteunt het de ontwikkeling van gerichte therapieën voor IRI.

Traditioneel verwachten we ook verhoogde lactaatniveaus in ischemische organen, omdat zij afhankelijk zijn van anaerobe stofwisseling bij afwezigheid van zuurstof om ATP te produceren. Evenzo werd een toename van K^+-niveaus verwacht in beschadigde organen, aangezien de membraanintegriteit van cellen wordt verstoord, waardoor een uitvloeiing van intercellulair K⁺ mogelijk is. Tot slot kunnen ernstig beschadigde cellen een lagere stofwisseling hebben, omdat hun metabole routes worden beïnvloed door ischemie-geïnduceerd metabolisch afval en ROS, wat leidt tot een verminderd zuurstofverbruik. Er worden echter geen veranderingen waargenomen in lactaat, K⁺ of zuurstofverbruik tijdens of na de ischemische periode. In feite geven de waarden geen einde aan de zuurstoftoevoer, aangezien ze gedurende de inspanningstest relatief consistent blijven (Figuur 5B–D). In wezen toont deze studie met behulp van een zuurstofstresstest aan dat 3RMR-waarden verschuivingen in mitochondriale redoxtoestanden tijdens ischemie-reperfusie sneller, in realtime en gevoeliger weerspiegelen dan traditionele schade-biomarkers (Figuur 5). We erkennen dat deze studie de 3RMR-dynamiek vergeleken met indirecte indicatoren van mitochondriale gezondheid, zoals lactaat en OCR, in plaats van met meer directe downstream-vergelijkers zoals NAD+/NADH en ATP. Hoewel deze studie veranderingen in 3RMR niet expliciet correert met ATP/NADH-concentraties, heeft eerder onderzoek ^9,14 aangetoond dat 3RMR voorspellend is voor veranderingen in deze downstream biomarkers. Zo toonden Nguyen et ^al.9 aan dat 3 uur warm-ischemische (WI) levers met lage 3RMR-waarden (<10%) significant lagere ATP-concentraties en NAD/NADH-verhoudingen hebben dan 1 uur WI-levers (3RMR-waarden van ~15%). Daarnaast zagen Jain et ^al.14 geen significante verschillen in de NAD+/NADH-verhouding of EC in groepen zonder significante verschillen in hun 3RMR. Ze observeerden ook dat de NAD+/NADH-verhoudingen en EC significant verschilden in 24-uur koud-ischemische (CI) levers bij acellulaire perfusie in vergelijking met cellulaire perfusie, wat ook statistisch significante 3RMR-waarden liet zien. Gezamenlijk tonen deze resultaten 3RMR-waarden aan die veranderingen weerspiegelen in directere metingen van mitochondriale en ETC-functie.

Hoewel dit artikel RRS gebruikt gedurende een perfusie van 15 minuten om de prestaties van het systeem aan te tonen, hebben andere gepubliceerde studies het nut van RRS in longitudinale studies aangetoond. Meer specifiek hebben we in een eerder onderzoek aangetoond dat RRS traditionele biomarkers aanvult tijdens langere orgaanperfusies, omdat het inzicht geeft in de gezondheid en functie van mitochondria die aanzienlijk verschillen van traditionele methoden. Zo gebruikte de studie RRS om de levensvatbaarheid te beoordelen van transplanteerbare (24 uur SCS) en niet-transplanteerbare (72 uur SCS) koud-ischemische rattenlevers gedurende subnormotherme perfusie¹⁰. Hoewel de initiële reactie op zuurstofvoorziening in beide groepen vergelijkbaar was, nam de 3RMR van niet-transplanteerbare levers toe met perfusie, terwijl de 3RMR van transplanteerbare lever consistent bleef via SNMP. Evenzo waren kaliumwaarden en totale gewichtstoename voor 72-uur BI-levers hoger gedurende SNMP vergeleken met 24-uurs BI-levers. De studie toonde het nut van RRS aan bij het aanvullen van traditionele biomarkers gedurende lange perfusies. In een andere studie gebruikten we RRS om de reoxygenatiedynamiek en het metabole herstel van koud-ischemische (CI) rattenlevers¹⁴ te begrijpen. We perfuseerden minimaal ischemische (15 minuten koud-ischemie) en 24-uur koud-ischemische levers met een acellulaire of een RBC-verpakte perfusaat (pRBC). Wanneer 24-uur CI-levers werden geperfuseerd met acellulair perfusat, observeerden we een latente afname van 3RMR vergeleken met perfusatie met pRBC's. De studie schreef deze vertraagde toename van 3RMR toe aan de ophoping van elektronen bij de mitochondriale cytochromen tijdens koude ischemie, die snel kunnen worden overgedragen aan de overvloedige zuurstofmoleculen in het geval van het pRBC-gebaseerde perfusaat. In combinatie met andere letselmarkers zien we echter grotere leverschade in 24-uur CI-levers die worden geperfuseerd met pRBC's. De studie concludeerde dat het meten van mitochondriale zuurstofvorming in realtime via RRS inzicht kan geven in het herstel van mitochondrien, wat gunstig kan zijn voor het optimaliseren van strategieën voor lange perfusie. In wezen geven de bevindingen aan dat het integreren van traditionele biomarkers (bijv. lactaat, OCR, ATP) met door RRS gedreven inzichten in mitochondriale redoxtoestanden en zuurstofdynamiek een meer uitgebreide beoordeling van het mitochondriale herstel biedt.

Andere studies hebben RRS gebruikt als testplatform voor therapieën die ischemie-reperfusieschade aan de ETC⁹ kunnen verminderen. Tijdens langdurige perioden van ischemische hopen elektronen zich op binnen de ETC, met de mogelijkheid voor elektronen om via de verschillende complexen te ontsnappen, vooral tijdens reperfusie. Het begrijpen van de redoxtoestand van individuele complexen als functie van ischemie-reperfusie kan een dieper inzicht bieden in de locatie van de blessure, met mogelijkheden voor meer gerichte interventies. Zo heeft onze groep RRS gebruikt om therapeutische interventies te ontwikkelen voor complex-III disfunctie in warm-ischemische varkenslevers. In een studie uitgevoerd door Nguyen et al. (2026)⁹ werden levers van 1 uur en 3 uur WI-levers op SNMP geplaatst voor 3 uur. Zoals eerder vermeld, is het bekend dat drie-uur WI-levers schade aan de ETC oplopen, wat leidt tot overoxidatie en verminderde stofwisseling. Hoewel 3RMR-waarden voor verse en 1 uur WI-levers binnen het optimale bereik lagen gedurende de perfusie, zagen we dat 3RMR-waarden van 3 uur WI-levers continu daalden, tot onder het optimale bereik (10%) na 3 uur. Daarnaast observeerden we geen verschillen in de 3RMR-waarden van cIV tussen beide groepen, waarbij cIV volledig geoxideerd was in elke groep. De hyperoxidatie van cIII, gecombineerd met een gezonde redoxtoestand waargenomen in cIV, wijst op door reperfusie veroorzaakte overoxidatie bij complex III. Gewapend met deze kennis konden Nyugen et al. (2026)⁹een therapeutisch middel selecteren dat de disfunctie van cIII kon overwinnen: methyleenblauw (MB), dat fungeert als een elektronenshuttle tussen cI en cytochroom c, cIII omzeilt en elektronen direct naar cIV overdraagt. De 3RMR-resultaten weerspiegelden het therapeutische effect van MB op de mitochondriën, aangezien 3RMR-waarden tijdens SNMP van 3h WI-levers stegen om elektronen die direct naar cIV werden getransporteerd en het hepatische metabolisme weer te starten. Het verzachtende effect van MB werd ook bevestigd door het verminderen van de uitstroom van lactaat en het verbeteren van het zuurstofverbruik. In wezen maakte de specificiteit van RRS de ontwikkeling mogelijk van een therapeutisch pad dat was afgestemd op mitochondriale behoeften na warme ischemie.

Gedurende dit artikel presenteren we Resonance Raman Spectroscopie als een niet-invasieve, realtime en zeer specifieke methode om mitochondriale gezondheid te meten. De studie toont aan hoe RRS subtiele verschuivingen in redoxtoestanden kan meten zonder het weefsel te verstoren voordat dergelijke fysiologische veranderingen gevolgloze effecten hebben. Het is echter belangrijk om de verschillende beperkingen van het Resonance Raman-systeem te benadrukken. Ten eerste vereist RRS dat alle moleculen die resonant versterkt zijn in een weefsel worden geïdentificeerd en meegenomen in de regressie, waarbij elk molecuul verschillende versterkingsfactoren heeft om rekening te houden met relatieve signaalsterktes. Hoewel we spectrale bibliotheken hebben gemaakt voor al deze componenten bij een bepaalde golflengte en weefsel, kan het zijn dat de gebruiker nieuwe bibliotheken moet creëren en valideren voor elk weefsel en golflengte van belang. Bovendien kunnen sommige weefsels complexe spectrale elementen bevatten, wat het lastig kan maken om mitochondriale cytochromen te meten die in lagere concentraties voorkomen. Zo bevatten varkens- of menselijke levers bètacaroteen, en bloed hemoglobine, die beide sterke spectrale signalen hebben die bijdragen aan het aantal spectrale signaturen waarmee RRS rekening moet houden in de regressie. Ten slotte heeft de 441 nm laser die voor deze metingen wordt gebruikt een bundeldiameter van 2 mm en een penetratiediepte van minder dan 1 mm. Dergelijke gelokaliseerde oppervlaktemetingen kunnen bemonsteringsfouten bevorderen, omdat verschillen in redoxtoestand in andere delen van het orgaan over het hoofd kunnen worden gezien. Om dergelijke uitdagingen te overwinnen, kunnen metingen worden genomen uit biopten uit de kern van het orgaan, of een multi-laser opstelling kan metingen over een groter oppervlak mogelijk maken om een completer begrip van de gezondheid van het hele orgaan te krijgen.

Concluderend laten we zien dat Resonance Raman Spectroscopie gevoelig is voor subtiele veranderingen in mitochondriale dynamiek in vergelijking met bloedgasanalyten. Een gedetailleerde uitleg over het opzetten en bedienen van het systeem wordt hier gegeven. We benadrukken het niet-invasieve karakter van RRS en leggen uit hoe het als diagnostische en mechanistische benadering kan worden gebruikt. We benadrukken ook het gebruik ervan bij het ontwikkelen van specifieke therapeutische routes voor mitochondriale disfunctie. Toekomstige studies kunnen zich richten op het aanpassen van het RRS-systeem om de gezondheid van mitochondria te evalueren uit biopten, precisiegesneden weefselsneestukken of andere weefselafgeleide producten, waaronder menselijk weefsel voor translationeel onderzoek. De adoptie van RRS biedt een krachtige benadering in metabolisch onderzoek, waardoor ons begrip van cellulaire bio-energetische processen gemakkelijker wordt verbeterd dan traditionele methoden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Wordt gebruikt om de portale ader te canuleren
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Wordt gebruikt om overtollig vocht te filteren tijdens anesthesie
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Perfusaat samenstelling
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusaat samenstelling
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Perfusaat samenstelling
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Wordt gebruikt om perfusato door de lever te laten stromen
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Wordt gebruikt om perfusato te oxygeneren.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Perfusaat samenstelling
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Voor bloedgasanalyse
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Neem contact op met Pendar Technologies voor vragen over dit product