Methodenartikel

Constructie van organoïden van menselijke borstkanker en komeetassay-gebaseerde kwantificering van door doxorubicine veroorzaakte DNA-schade

67 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

28 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol stelt een model voor organoïden (BCO's) voor menselijke borstkanker vast en evalueert kwantitatief DNA-schade door doxorubicine met behulp van de komeetassay. De haalbaarheid van het toepassen van de komeetassay op BCO's wordt aangetoond en er wordt een reproduceerbare, schaalbare en operationele workflow geboden voor het detecteren van door DOX veroorzaakte DNA-schade in BCO's.

Samenvatting

Borstkanker is de meest voorkomende maligniteit onder vrouwen wereldwijd en vertoont aanzienlijke heterogeniteit. Doxorubicine (DOX) wordt veel gebruikt bij de behandeling van borstkanker, en het primaire werkingsmechanisme is het induceren van DNA-dubbelstrengbreuken en het veroorzaken van celdood. In dit protocol werd een menselijk BCO-model ontwikkeld om DNA-schade door DOX kwantitatief te beoordelen. Primaire borstkankercellen werden geïsoleerd uit door patiënten afgeleide tumorweefsels via mechanische en enzymatische dissociatie en vervolgens gekweekt in een driedimensionale matrix om BCO's te genereren. Organoïden werden vervolgens behandeld met 8 μM DOX gedurende 2 uur. DNA-schade werd na 2 uur behandeling geëvalueerd. Na behandeling werden organoïden gedissocieerd in enkele cellen, ingebed in agarose met een laag smeltpunt, en onder alkalische omstandigheden elektroforeres. Na elektroforese werden DNA-migratiepatronen gevisualiseerd als komeetstructuren onder fluorescentiemicroscopie en kwantitatief geanalyseerd met OpenComet-software om het percentage staart-DNA (% staart-DNA) te bepalen. De komeettest heeft met succes DNA-schade in BCO's gedetecteerd. In vergelijking met de controlegroep vertoonden BCO's die 2 uur lang aan 8 μM DOX werden blootgesteld verlengde komeetstaarten na organoïde dissociatie en elektroforese. Kwantitatieve analyse toonde aan dat het percentage staart-DNA significant hoger was in de behandelde groep, wat wijst op de inductie van DNA-schade. Deze zeer gevoelige methode ondersteunt toxicologische en farmacodynamische studies van DOX en biedt een robuust technisch platform voor het beoordelen van DNA-schade in patiënt-afgeleide BCO-systemen.

Inleiding

Borstkanker is een kwaadaardige tumor die ontstaat uit het epitheelweefsel van de borst door genetische veranderingen, hormonale ontregeling en andere pathogene factoren. Het is de meest voorkomende maligniteit onder vrouwen wereldwijd en vertoont unieke epidemiologische patronen en aanzienlijke intratumorale heterogeniteit 1,2. DOX, een eerstelijns chemotherapeutisch middel, intercaleert in DNA, remt de activiteit van topoisomerase II en induceert DNA-strengbreuken, wat uiteindelijk apoptose in tumorcellen3 veroorzaakt. Traditionele tweedimensionale celkweeksystemen zijn beperkt in hun vermogen om de complexe cellulaire organisatie en heterogeniteit van borsttumoren te recapituleren. BCO's daarentegen zijn driedimensionale structuren die zijn afgeleid van tumorweefsels van patiënten en die de belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke tumor behouden, waaronder cellulaire samenstelling, weefselarchitectuur en moleculaire fenotypes. Opmerkelijk is dat BCO-modellen een hoge overeenstemming vertonen met klinische geneesmiddelresponsen; voor een gegeven therapeutisch middel bereikt de concordantie van negatieve respons 100%, en de concordantie van positieve respons 98% tussen BCO's en de overeenkomstige patiënt4.

BCO's dienen als een geavanceerd in vitro model dat belangrijke structurele en functionele kenmerken van primaire tumoren recapituleert en zijn breed toegepast om tumorgenese, ziekteprogressie en therapeutische resistentiete onderzoeken. Tumorinitiatie bij borstkanker berust doorgaans op de coöperatieve inactivatie van meerdere tumorsuppressorgenen, zoals TP53, PTEN, RB1 en NF1, omdat veranderingen in één enkel gen onvoldoende zijn om een kwaadaardige transformatie van het normale melkepitheel te veroorzaken. Dit proces gaat gepaard met verlies van celpolariteit, architectonische desorganisatie en ongecontroleerde proliferatie 6,7,8.

De komeettest (ook wel single-cell gel elektroforese, SCGE genoemd) is een klassieke methode om DNA-schade op single-celniveau te beoordelen. De techniek werd voor het eerst geïntroduceerd door Rydberg en Johanson in 1978, en vervolgens verfijnd door Ostling en Johanson, die de neutrale komeettest opstelden voor het detecteren van DNA-dubbelstrengbreuken. In 1988 namen Singh en collega's alkalische elektroforesecondities toe, waardoor DNA-enkelstrengbreuken, abasische plaatsen en alkali-labiele laesies werden gedetecteerd, waardoor de toepasbaarheid van de assay aanzienlijk werd vergroot9. Het fundamentele principe van de komeettest is dat DNA-elektroforetische mobiliteit afhankelijk is van de DNA-integriteit. Na agarose-inbedding en -lysis om cellulaire membranen en eiwitten te verwijderen, migreren beschadigde DNA-fragmenten tijdens elektroforese naar de anode om een "komeetstaart" te vormen, terwijl intact DNA nabij de laadplaats blijft en de "komeetkop" vormt. Parameters zoals staartlengte, percentage staart-DNA (% staart-DNA) en olijfstaartmoment maken semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van DNA-schade mogelijk, en tijdsverloop van experimentele ontwerpen kunnen worden gebruikt om de DNA-reparatiecapaciteit te evalueren. Vanwege de hoge gevoeligheid, lage monsterinvoervereisten en relatieve procedurele eenvoud is de komeettest veel gebruikt in genetische toxicologie, kankerbiologie en geneesmiddelresponsstudies, met name voor het evalueren van DNA-schade veroorzaakt door chemotherapeutische middelen en radiotherapie, evenals voor tumorcelresistentiemechanismen. De assay is zeer gevoelig voor experimentele omstandigheden en procedurele variabiliteit, en reproduceerbaarheid en interlaboratoriumvergelijkbaarheid zijn afhankelijk van gestandaardiseerde workflows en geautomatiseerde beeldanalyse11. In de afgelopen jaren heeft de integratie van high-throughput beeldvormingssoftware, organoïdemodellen en genbewerkingssystemen de bruikbaarheid van de komeettest verder vergroot bij het onderzoeken van DNA-schade en reparatiemechanismen en bij het beoordelen van tumorbehandelingsreacties.

In vergelijking met traditionele DNA-schade-assays zoals γ-H2AX immunofluorescentiekleuring of flowcytometrie, biedt de komeettest een directe manier om fysieke DNA-strengbreuken op enkelcelniveau te kwantificeren. Omdat deze methodologie onafhankelijk werkt van specifieke eiwitexpressie of antilichaamspecificiteit, elimineert het effectief vals-negatieve resultaten die ontstaan door variaties in celcyclustoestanden of aberraties in DNA-schade-responsroutes. Bovendien recapituleert het driedimensionale organoïdemodel dat in deze studie wordt gebruikt, in tegenstelling tot conventionele tweedimensionale monolaagculturen, de complexe ruimtelijke architectuur, extracellulaire matrixinteracties en geneesmiddelpermeatiegradiënten van in vivo tumoren nauwkeuriger. Hoewel traditionele cellijnmodellen genotoxiciteit vaak overschatten door overmatige blootstelling aan kunstmatige geneesmiddelen, evalueert het organoïdeplatform DOX-geïnduceerde DNA-schade binnen een microomgeving die nauwkeurig lijkt op klinische fysiologische omstandigheden, waardoor de betrouwbaarheid en translationele waarde van dit screeningsparadigma13 aanzienlijk worden verhoogd.

Ondanks de aanzienlijke voordelen van de organoïde-geïntegreerde komeetassay die in deze studie is vastgesteld voor het evalueren van DNA-schade, vereist de praktische implementatie zorgvuldige overweging van verschillende technische beperkingen en toepasbaarheidsparameters met betrekking tot monsterinvoer. Het protocol vereist een grondige maar zachte enzymatische dissociatie van de organoïden om een zeer levensvatbare single-cell suspension te verkrijgen. Een zaaddichtheid van 15.000–20.000 primaire borstkankercellen per 100 μL van de basale membraanmatrix (~200 cellen/1 μL) houdt de intercellulaire paracriene signalering in stand die nodig is voor robuuste bolvorming, terwijl centrale necrose door hyperdichtheid en snelle nutriëntendepletie wordt voorkomen. Wat betreft het therapeutische venster vereist deze test zorgvuldige kalibratie van de DOX-concentratie en blootstellingsduur om overmatige celdood te voorkomen (>20–30%). Blootstelling aan supralethale drugs genereert een overvloed aan "egel"-kometen, die bona fide DNA-schadesignalen verhullen en de interpretatie van data verwarren. Wat betreft de beperkingen van de assay, maakt de inherent lage doorvoer van de standaard alkalische komeettest deze onvoldoende voor high-throughput geneesmiddeltesten. Bovendien vereist deze techniek rigoureuze standaardisatie van experimentele procedures—waaronder gelhechtingsstabiliteit, alkalische ontwindingsduur en elektroforetische uniformiteit—aangezien zelfs kleine operationele afwijkingen aanzienlijke systemische fouten kunnen veroorzaken.

Samenvattend stelt dit protocol menselijke BCO's vast en toont het de haalbaarheid aan van het toepassen van de komeettest om DOX-geïnduceerde DNA-schade te kwantificeren. Na 8 μM DOX-behandeling van volledig gevestigde BCO's werd DNA-schade beoordeeld met behulp van de komeettest. Deze aanpak maakt een stabiele en directe evaluatie van door DOX veroorzaakte DNA-schade mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Suzhou Wuzhong Volksziekenhuis (Goedkeuringsnummer 20251w03) en werd uitgevoerd volgens medische ethische normen. Alle deelnemers in dit onderzoek gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Constructie van menselijke BCO's

  1. Transport en opslag van borstkankerweefsel
    1. Plaats onmiddellijk vers gereseceerd menselijk borstkankerweefsel in een voorgekoeld weefselconserveringsmiddel (4 °C).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel tijdens het transport volledig onder water blijft.
  2. Mechanische dissociatie van borstkankerweefsel
    1. Voer alle procedures uit in een bioveiligheidskast. Plaats het borstkankerweefsel in een kweekschaal van 6 cm en verwijder zichtbaar vetweefsel met steriele scalpels en pincetten.
    2. Voeg 3 ml PBS toe aan de 6 cm kweekschaal en was het tissue drie keer.
    3. Aspireer en gooi de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) weg.
    4. Herhaal stappen 1.2.2 en 1.2.3 nog twee keer extra.
    5. Breng het borstkankerweefsel over in een 1,5 mL microcentrifugebuis met behulp van een steriele chirurgische schaar en snijd het weefsel in kleine fragmenten van ongeveer 2 x 5 mm groot.
  3. Enzymatische vertering van borstkankerweefsel
    1. Voeg 1 mL organoïde dissociatieoplossing toe aan de 1,5 mL microcentrifugebuis en breng de suspensie over in een 15 mL centrifugebuis.
    2. Voeg een extra 8 ml organoïde dissociatieoplossing toe aan de 15 mL centrifugebuis.
    3. Incubeer de 15 mL centrifugebuis op 37 °C gedurende 40 minuten.
    4. Beweeg de tube elke 10 minuten op een shaker tijdens de spijsvertering.
    5. Voeg na 40 minuten 6 mL PBS toe aan de 15 mL centrifugebuis om de vertering te beëindigen.
      OPMERKING: Voeg PBS direct toe aan het verteringsmengsel om enzymatische activiteit te stoppen.
  4. Isolatie van primaire borsttumorcellen en inbedding van organoïden
    1. Plaats een 100 μm celfilter op een 50 mL centrifugebuis.
    2. Voeg 1 ml volledig celkweekmedium toe aan de celzeef.
      OPMERKING: Bereid het volledige celkweekmedium voor met 500 mL basaal medium, 50 mL fotaal rundserum en 5 mL penicilline-streptomycine.
    3. Aspireer 1 ml van de verteerde weefselsuspensie uit de 15 mL centrifugebuis en breng dit aan op de celzeef.
    4. Herhaal stap 1.4.3 totdat de hele ophanging door de zeef is gegaan.
    5. Spoel de celfilter af met nog eens 1 ml complete celkweekmedium.
    6. Centrifugeer de 50 mL centrifugebuis op 350 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    7. Aspireer en gooi het supernatant weg.
    8. Sussief de celpellet opnieuw in 1 mL compleet celkweekmedium en breng het over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    9. Centrifugeer de suspensie op 370 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    10. Aspireer en gooi het supernatant weg.
    11. Voeg 100 μL van de basalmembraanmatrix toe aan de 1,5 mL microcentrifugebuis en meng grondig.
      OPMERKING: Houd een zaaidichtheid van 15.000–20.000 primaire borstkankercellen per 100 μL van de basale membraanmatrix (200 cellen/1 μL). Dit ondersteunt intercellulaire paracriene signalering voor robuuste bolvorming en voorkomt centrale necrose.
    12. Doseer 25 μL van het basale membraanmatrix-celmengsel in elke put van een 24-put plaat.
    13. Inkeer de 24-wellplaat en incubeer deze bij 37 °C gedurende 10 minuten om de polymerisatie van de basementmembraanmatrix mogelijk te maken.
    14. Voeg 500 μL BCO-cultuurmedium toe aan elke put van de 24-put plaat.
      OPMERKING: Kweek-BCO's gebruiken een commercieel kant-en-gebruik medium met een gepatenteerde formulering.
    15. Incubeer de plaat in een bevochtigde broedmachine bij 37°C met 5% CO₂.
      OPMERKING: Na het zaaien in de extracellulaire matrix werden de BCO's 7–10 dagen gekweekt om een goede 3D-structurele ontwikkeling mogelijk te maken. De organoïden werden als volledig gevestigd en klaar voor medicamenteuze behandeling beschouwd toen ze dichte, bolvormige 3D-morfologieën vertoonden en een gemiddelde diameter van ongeveer 50–100 μm bereikten, zonder tekenen van centrale necrose. Zodra aan deze eindpunten was voldaan, werden de BCO's vervolgens behandeld met DOX.

2. Detectie van door DOX-geïnduceerde DNA-schade in BCO's met behulp van de komeettest

Het experimentele protocol werd aangepast op basis van vastgestelde richtlijnen en verder geoptimaliseerd om te voldoen aan specifieke laboratoriumomstandigheden14.

VOORZICHTIG: Voer alle DOX-afhandelingsprocedures uit—inclusief het wegen van droog poeder, het bereiden van voorraadoplossingen en seriële verdunning van werkende oplossingen—uitsluitend in een gecertificeerde Klasse II biologische veiligheidskast of een chemische dampafzuigkap. Vermijd strikt elke manipulatie op open laboratoriumbanken. Draag dubbele laagjes nitril handschoenen en bescherm het medicijn tegen licht tijdens alle procedures. Ten slotte worden alle met DOX besmette verbruiksmaterialen (bijv. pipettips en microcentrifugebuizen) strikt gescheiden als 'cytotoxisch afval' voor gespecialiseerde verwijdering; Meng deze items nooit met routinematig biohazardous afval.

  1. DOX-behandeling van BCO's
    1. Aspireer en gooi het verbruikte cultuurmedium weg.
    2. Voeg 500 μL verse BCO-cultuurmedium toe aan elke put
    3. Verwijder en gooi 4 μL van het medium uit elke put
    4. Voeg 4 μL van 1 mM DOX stockoplossing toe aan elke put.
      OPMERKING: Om een uiteindelijke werkconcentratie van 8 μM vast te stellen, bepaal je het vereiste voorraadvolume met behulp van de standaard verdunningsvergelijking: C1V1 = C2V2. Waarbij C1 de initiële DOX-voorraadconcentratie (1 mM) vertegenwoordigt, C2 de streefconcentratie (8 μM) en V2 het uiteindelijke putvolume (500 μL). Oplossen voor V1 levert 4 μL op. Daarom vereist het protocol dat 4 μL van de 1 mM DOX-voorraad wordt toegevoegd aan de resterende 496 μL kweekmedium per put, en vervolgens grondig wordt gemengd om een homogene verdeling te waarborgen.
    5. Incubeer de plaat in een incubator van 37°C met 5% CO₂ gedurende 2 uur.
  2. Dissociatie van BCO's
    1. Aspireer en verwijder het BCO-kweekmedium van de 24-well plaat.
    2. Voeg 500 μL organoïde dissociatieoplossing toe aan elke put.
    3. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om de basale membraanmatrix en organoïde structuren volledig te verstoren.
    4. Incubeer de plaat op 37 °C met 5% CO₂ gedurende 10 minuten.
    5. Breng 500 μL van de resulterende suspensie uit elke put over in een 15 mL centrifugebuis.
    6. Centrifugeer de suspensie op 350 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    7. Aspireer en gooi het supernatant weg.
    8. Voeg 1 mL compleet kweekmedium toe aan de 15 mL centrifugebuis om de celpellet opnieuw te suspenderen en vervolgens de resulterende suspensie over te brengen in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    9. Centrifugeer de suspensie op 350 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    10. Aspireer en gooi het supernatant weg.
      OPMERKING: Na centrifugatie blijft de organoïde pellet in de centrifugebuis.
  3. Celresuspendie en agarose-inbedding
    1. Verwarm het metalen verwarmingsblok voor tot 95 °C.
    2. Doe 1 ml agarose met een laag smeltpunt (LMP) in een metalen verwarmingsblok en incubeer 10 minuten om volledige smelting te garanderen.
    3. Pipet 100 μL gesmolten 0,5% agarose met een laag smeltpunt in een 1,5 mL microcentrifugebuis met BCO's.
    4. Breng de monsters onmiddellijk over in een 37 °C waterbad en laat ze 10 minuten in evenwicht komen.
    5. Meng grondig en onmiddellijk 50 μL van de cel–agarose-suspensie op een microscoopglaasje.
  4. Cellyse en DNA-ontbinding
    1. Dompel de glaasjes onder in een koude lysisoplossing en incubeer ze 12 uur in het donker bij 4 °C.
    2. Haal de glaasjes uit de lysisoplossing en dompel ze onmiddellijk onder in alkalische ontwindingsoplossing.
      OPMERKING: Om de alkalische ontwikkelingsoplossing te bereiden, los 0,6 g NaOH op in 4,975 mL ultrazuiver water, voeg vervolgens 250 μL 200 mM EDTA toe. Om de alkalische elektroforesebuffer te bereiden, los je 12 g NaOH op in 995 mL ultrazuiver water, voeg je vervolgens 5 mL 200 mM EDTA toe.
      VOORZICHTIG: NaOH in de komeettestbuffer is een zeer corrosieve sterke basis die ernstige cutane en oculaire brandwonden kan veroorzaken. Voeg tijdens de oplossingsvoorbereiding de vaste NaOH-pellets langzaam, stapsgewijs en onder continu magnetisch roeren aan het water toe. Giet nooit direct water op de droge pellets, omdat de gewelddadige exotherme reactie ervoor kan zorgen dat de bijtende vloeistof kookt en spat. Voer bovendien al het droge poeder uitsluitend in een chemische dampkap om het inademen van bijtend stof te voorkomen.
    3. Dompel de glaasjes onder in een lysisoplossing en incubeer ze 1 uur in het donker bij 4 °C.
  5. Elektroforese
    1. Breng de slides van de alkalische ontwikkelingsoplossing over naar de elektroforesekamer.
    2. Voeg 1 L alkalische elektroforesebuffer toe aan de elektroforesetank om volledige onderdompeling van de glaasjes te garanderen.
    3. Voer elektroforese uit bij 25 V en 300 mA gedurende 30 minuten.
  6. Slide washing en fixatie
    1. Dompel de glaapjes onder in 5 mL 70% ethanol en incubeer ze 5 minuten op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Ethanol vormt een ernstig brandgevaarlijk risico. Bij het uitvoeren van grote hoeveelheden preparaten of weefseluitdroging, houd robuuste ventilatie in de experimentele omgeving. Isoleer het operationele gebied strikt van alle ontstekingsbronnen, inclusief open vlammen (zoals alcoholbranders) en elektrostatische vonken. Na gebruik sluit u onmiddellijk de reagentiacontainers af en bewaart u ze in een speciaal explosiebestendige brandbare opslagkast.
    2. Plaats de glaasjes in een broedmachine van 37 °C en laat ze 15 minuten drogen.
  7. DNA-kleuring en beeldvorming
    1. Voeg 1 μL fluorescerende kleuring van nucleïnezuur toe aan 10 ml ultrazuiver water.
      VOORZICHTIG: Behandel deze nucleïnezuur-intercalerende middelen als potentiële mutagenissen en behandel ze met strikte voorzorgsmaatregelen. Om kruisbesmetting in routinewerkplekken te voorkomen, richt u een speciale 'nucleïnezuurkleuringszone' in met speciale pipetten. Als je gesmolten agarose aanvult met kleurstoffen, laat de gel dan afkoelen tot ongeveer 60 °C voordat je het toevoegt, om inhalatie van gevaarlijke, kleurstofrijke dampen te voorkomen. Tot slot gooi je alle gebruikte kleuringsoplossingen en afvalgels strikt weg in aangewezen nucleïnezuur-gevarenbakken.
    2. Dompel de glaasjes onder in de kleuroplossing die in stap 2.7.1 is bereid en incubeer ze 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    3. Voer een enkele wasbeurt van 5 minuten uit met 5 ml ultrazuiver water.
    4. Laat de dia's 15 minuten aan de lucht drogen in een broedmachine van 37 °C.
    5. Visualiseer komeetstructuren met een fluorescentiemicroscoop met een groen excitatiefilter en detecteer rode fluorescentie.

3. Gegevensverwerking

  1. Voer geautomatiseerde kwantitatieve analyse uit van komeetassaybeelden met behulp van de OpenComet-plugin in Fiji (officiële distributie) om DNA-gerelateerde parameters te verkrijgen.
    OPMERKING: Wat betreft de statistische analyse, omvatte dit werk strikt alleen hoogresolutie, duidelijk afgebeelde kometen die intacte morfologie vertonen en geen overlapping vertonen. Omgekeerd sloot het screeningsprotocol 'egel'- of 'spook'-kometen uit (die een verminderde kop en een uitgebreide staart vertonen, wat wijst op ernstige apoptose of necrose), evenals beelden met wazige randen, celclustering of achtergrondartefacten.
    1. Open de Fiji-software (Aanvullende Figuur 1A).
    2. Klik op Plugins in de menubalk (Aanvullende Figuur 1A).
    3. Selecteer OpenComet (aanvullende figuur 1B).
    4. Klik op Bladeren onder Invoerbestanden en selecteer de komeet-assaybeelden voor analyse (Aanvullende Figuur 1C).
    5. Klik op Bladeren onder de Outputmap en definieer de bestemmingsmap voor uitvoerbestanden (Aanvullende Figuur 1C).
    6. Klik op Run om de geautomatiseerde analyse te starten (Aanvullende Figuur 1C). Deze stap sluit de workflow voor gegevensverwerking en analyse af.
      OPMERKING: Voor elke experimentele groep kwantificeerde deze studie het percentage staart-DNA (%Staart-DNA) uit een gerandomiseerde selectie van minstens 50 cellen. Latere statistische analyse gebruikte een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) om groepsgemiddelden te vergelijken, waarbij p < 0,05 als statistisch significant werd beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Oprichting van BCO's

Deze studie heeft met succes borstkankerorganoïden vastgesteld uit primaire tumorweefselmonsters. In de beginfase van de kweek werden duidelijk een groot aantal enkele cellen of kleine celclusters waargenomen, met cellen die relatief verspreid waren en geen duidelijke driedimensionale bolvormige organisatie hadden. Sommige cellen vertoonden ronde of bijna ronde morfologieën, wat erop wijst dat tumorafgeleide cellen overlee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De komeettest vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in methoden voor het beoordelen van genotoxiciteit. Dankzij de enkelcelresolutie en de directe visualisatie van DNA-schadepatronen op basis van elektroforetische migratie, biedt deze techniek duidelijke voordelen ten opzichte van conventionele genotoxiciteitsassays15.

Verschillende cruciale stappen tijdens de experimentele procedure beïnvloeden de reproduceerbaarheid en de inter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het Project van het Engineering Research Centre van de provincie Jiangsu voor Moleculaire Doeltherapie en Companion Diagnostics in de Oncologie (SGK2202319), het innovatieve onderzoeksteam voor wetenschap en technologie van de Jiangsu instelling voor hoger onderwijs (2021), het programma van het Jiangsu beroepscollege voor engineering technology research centre (2023), de Natural Science Key Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (subsidie nr. 24KJA310008), de Sleutelprogramma's van het Suzhou Beroepsgezondheidscollege (szwzy202406), het Project van het Staatssleutellaboratorium voor Stralingsgeneeskunde en Bescherming, Soochow Universiteit (nr. GZK1202506), het Dongwu Health Talent Program (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

Referenties

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

KankeronderzoekEditie 233Editie 233Lege waardeEditie

Gerelateerde artikelen