Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Summary

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Abstract

De kern is het karakteristieke organel van eukaryote organismen. In tegenstelling tot de klassieke leerboekvisie op statische kernen, is de vorm van de kern dynamisch in levende cellen. Veranderde of vervormde kernvorm is een kenmerk van kanker in dierlijke cellen en omgevingsstress bij planten. Nucleaire omhulningseiwitten interageren met chromatine om genexpressie te reguleren. Helaas is er weinig bekend over de impact van abiotische stress op de vorm, beweging van de kern en de chromatinedynamiek. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een pijplijn ontwikkeld met behulp van confocale microscopie en deeltjesvolgsoftware om de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels onder controle en abiotische stressconditie te kwantificeren. Deze confocale beeldvormingsmethode maakt gebruik van een dubbele fluorescentie-getagde markerlijn – nucleair enveloppe-eiwit en chromatine – om levende celbeeldvorming van de wortel uit te voeren in modelplant Arabidopsis thaliana onder gecontroleerde en zoutgestresste omstandigheden. Deze opgenomen films worden geanalyseerd om nucleaire en chromatinedynamiek te kwantificeren met behulp van de open-source beeldverwerkingssoftware Fiji/ImageJ met behulp van de TrackMate-plugin. Om deze methode te valideren, hebben we chromatinebeweging in controle- en zoutstresswortels gefotografeerd en gekwantificeerd, wat een afname van chromatinesnelheid onder zoutstressomstandigheden aantoonde. Deze methode maakt kwantitatieve levende celbeeldvorming van wortelkernvorm en chromatinedynamiek tijdens plantontwikkeling en omgevingsstress mogelijk, waardoor veranderingen in nucleaire en chromatinedynamiek veroorzaakt door abiotische stressoren worden geanalyseerd.

Introduction

De kernvorm varieert tussen verschillende celtypen en tijdens de ontwikkeling bij Arabidopsis thaliana-wortels ^1,2. Zo is de kernvorm bolvormig in de actief verdeelde meristematische gebieden. In tegenstelling tot het meristematische gebied zijn kernen in de wortelovergangs- en verlengingszone minder bolvormig. Bovendien passeren kernen in gedifferentieerde cellen, zoals wortelharen, door de strakke wortelhaarbasis en worden actief omgezet in langgerekte kernen ^3,4,5. De dynamische veranderingen in kernvorm en beweging zijn cruciaal voor het functioneren van cel ^6,7. Gebreken in de kernvorm leiden tot functionele beperkingen zoals verminderde kernbeweging ^1,3. In zoogdiercellen zijn veranderingen in de vorm van de cel en kern direct gecorreleerd met veranderingen in genexpressie en eiwitsynthese⁸.

Tijdens interfase wordt het DNA van een cel georganiseerd als chromatine. Het DNA in chromatine is gebundeld rond histonen, die het DNA kunnen aanspannen en losmaken om de expressie te veranderen. Evenzo zijn chromatinepositionering ten opzichte van de nucleaire envelop en nabijheid tot de nucleaire periferie ook belangrijk voor genexpressie⁹. Omgevingsstress, zoals osmotische stress, verandert de vorm van de kern en verandert daardoor de expressie van een set aanrakinggevoelige genen in A. thaliana-wortels ¹⁰. In deze context is het bestuderen van de kernvorm en chromatinedynamiek via live-cel timelapse-beeldvorming belangrijk. Een belangrijk aspect van de nucleaire dynamica is de snelheid waarmee kernen bewegen, aangezien kernpositionering binnen de cel genexpressie aanstuurt, en kernrepositionering kernbeweging^{vereist 11}. De snelheid van chromatinebeweging binnen de kern is eveneens belangrijk, aangezien de positionering van genen binnen de kern cruciaal is voor het bepalen van genexpressie¹².

Voorheen werden kernvorm en chromatinedynamica afzonderlijk afgebeeld en gekwantificeerd; daardoor bleef de relatie tussen kernvorm en chromatinedynamiek ononderzocht. Door kernen en chromatine gelijktijdig in beeld te brengen, kunnen hun posities ten opzichte van elkaar worden waargenomen, wat bewegingen kan onthullen zoals kernrotatie en intra-nucleaire chromatinebeweging die anders moeilijk of onmogelijk aan te tonen zijn. In deze methode presenteren we een live celbeeldvormingstechniek om de kernvorm te visualiseren en te kwantificeren via fluorescentie-gelabelde buitenste kernomhulde-eiwit WPP-domeininteracterende eiwit 1 (WIP1)¹³ en chromatine via centromere histon H3 (CENH3)^14-dynamiek gelijktijdig onder controle- en zoutstresscondities, met als doel de analyse mogelijk te maken van veranderingen in nucleaire en chromatinedynamiek veroorzaakt door abiotische stressoren. Om deze methode mogelijk te maken, hebben we een WIP1-GFP/CENH3-mRFP-lijn van A. thaliana gegenereerd. Daarnaast bestudeerden we de chromatinedynamiek op een kwantitatieve manier met behulp van de TrackMate-plugin van de open-source ImageJ/Fiji-software. We testten een dubbele fluorescerende lijn en chromatinedynamica-technieken die hier onder zoutspanningsomstandigheden werden gepresenteerd en ontdekten een verandering in centromerische foci-morfologie en -dynamiek door spanningsomstandigheden. Deze eenvoudige en reproduceerbare methode is ideaal voor het volgen van kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels met hoge doorvoer onder verschillende abiotische stresscondities.

Protocol

1. Teelt van A. thaliana-zaailingen

1. Voorbereiding van groeimedia
   1. Doe 800 ml puur water in een 1 L beker op een roerplaat. Voeg een roerreep toe aan het bekerglas.
   2. Zet de roerplaat aan op 600 toeren.
   3. Voeg 10 g sucrose toe aan de beker.
   4. Voeg 2,16 g Murashige en Skoog (MS) groeimedium toe aan de beker.
   5. Voeg 5 mg agar toe aan elk van de twee 1 L mediaflessen.
   6. Label één fles met "1/2 MS" en de andere met "100 mM NaCl".
   7. Label beide flesdeksels met autoclavetape.
   8. Voeg 5,84 g NaCl toe aan de fles met het label "100 mM NaCl".
   9. Vul de beker met 1 liter puur water.
   10. Zet de beker terug op de roerplaat en wacht tot de sucrose en MS zijn opgelost.
   11. Giet de inhoud van het bekerglas in een 1 L gegradueerde cilinder.
   12. Giet 500 ml van de gegradueerde cilinderinhoud in elke fles.
   13. Autoclavegroeimedium en 250 mL puur water met een vloeibare cyclus van 60 minuten bij 121 °C.
       OPMERKING: Zorg er bij het autoclaveren van media en water voor dat de deksels los zitten om mogelijke explosies te voorkomen.
   14. Schroef de deksels van het groeimedium opnieuw vast.
   15. Keer groeimediaflessen 7 keer om ervoor te zorgen dat agar volledig verspreid is.
   16. Bewaar kweekmedium in een koelkast van 4 °C tot het nodig is, en laat het in de magnetron vloeibaar maken.
2. Groeiplaten en zaden zetten
   1. Gebruik in een flowkap een pipetpistool om 50 mL groeimedium in elk van de tien platen te pipetteren (Figuur 1A).
   2. Terwijl het medium stijgt, maak je WIP1-GFP x CENH3-mRFP zaden schoon door ze 10 minuten in een microcentrifugebuis te vullen met 1 mL 70% ethanol (Figuur 1B).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er bij het hanteren van ethanol geen open vlammen in de buurt zijn.
   3. Na 10 minuten verwijder je in de flowhood de ethanol en spoel je de zaden twee keer af met 1 ml autoclavwater (Figuur 1C).
   4. Zodra het medium is uitgehard, gebruik je een 1000 μL pipet om schoongemaakte zaden op groeiplaten te plaatsen in twee rijen van 14 zaden per plaat (Figuur 1D).
   5. Label de platen met een permanente marker en sluit ze af met microporentape voordat je de flowkap verlaat (Figuur 1E).
3. Keimende zaailingen
   1. Wikkel groeiplaten in aluminiumfolie en stratificeer ze met een koude stratificatie in een koelkast van 4 °C gedurende minimaal 2 dagen (Figuur 1F).
   2. Na koude stratificatie haal je platen uit de koelkast en laat je ze verticaal onder groeilampen (~80 μmol/m²/s) staan voor minimaal 4 dagen (Figuur 1G).
   3. Breng de helft van de platen over naar 100 mM NaCl groeimedium in de flowkap, en sluit vervolgens de platen af en label ze (Figuur 1H).
   4. Kweekplaten onder groeilampen gedurende 2 dagen voor beeldvorming (Figuur 1I).

2. Levende celbeeldvorming van A. thaliana wortelkernen en chromatine

1. Voorbereiding van de diabaan
   1. Pipette 60 μL puur water op een glazen glaasje (Figuur 2A).
   2. Leg 3 wortels van de 6 dagen oude A. thaliana-zaailing in het water (Figuur 2B).
   3. Plaats een 22 mm × 22 mm #1,5 schuifdeksel over de wortels zonder de bladeren te bedekken (Figuur 2C).
2. Confocale microscoopinstellingen
   1. Stel de belichtingstijd van de laser in op 1000 ms (1 s).
   2. In de lasercombiner stel je de 488 nm laser in op 50% voor groen fluorescerend eiwit (GFP) en 561 nm op 50% voor rood fluorescerend eiwit (RFP) (Figuur 2D). Beeld met 20× objectief zonder optische zoom. Als je langer dan 10 minuten opneemt, verlaag dan de intensiteit om fotobleaching te verminderen.
   3. Stel de Z-slice stapgrootte in op 0,3 μm.
   4. Stel het interval in op 1 minuut en de totale duur op 10 minuten.
3. Beeldvorming
   1. Zoek wortels en selecteer tot 20 z-slices en maak 16-bits afbeeldingen.
   2. Start timelapse.
   3. Sla timelapse op als een TIFF-bestand met lossless compressie.
   4. Verplaats data naar een computer voor analyse.

3. Tracking en analyse van gegevens

OPMERKING: Men heeft de Fiji-versie van de open-source software ImageJ nodig (aanbevolen versie 1.54), die wordt geleverd met TrackMate vooraf geïnstalleerd.

1. Initialisatie
   1. Open AfbeeldingJ/Fiji.
   2. Klik en sleep een .vsi-bestand naar het hoofdvenster van ImageJ/Fiji (Figuur 3A).
   3. Een prompt getiteld Bio-Formats Import Options verschijnt; klik rechtsonder op Oké (Figuur 3B).
   4. Er verschijnt een prompt getiteld Bio-Formats Series Options . Zorg dat Serie 1 is geselecteerd en klik linksonder op Oké (Figuur 3C).
      OPMERKING: Het bestand kan een minuut duren om te laden, vooral als het veel Z-lagen of tijdspunten heeft.
   5. Zodra het beeld is geopend (Figuur 3D), splits je de signalen door via het hoofdvenster ImageJ te navigeren naar Afbeelding > kleur > splits kanalen (Figuur 3E). Dit creëert twee aparte vensters, één voor GFP-gelabelde kernen en één voor RFP-gelabelde chromatine (Figuur 3F).
2. Preprocessingchromatine
   1. Bepaal welk van de twee vensters overeenkomt met chromatine.
   2. Klik op het chromatinevenster (Figuur 3F) en pas de Z-project-operatie toe door te navigeren in het hoofdvenster ImageJ om > stacks > Z-project te beelden (Figuur 4A).
   3. Verander het projectietype naar Maximale Intensiteit en zorg dat Alle Tijdframes actief is, klik dan op Ok (Figuur 4B).
   4. Open het contrastmenu door op Ctrl+Shift+C te drukken of door te navigeren in het hoofdvenster ImageJ om een afbeelding te maken > > Helderheid/Contrast aan te passen (Figuur 4C).
   5. Schuif de tweede balk (gelabeld Maximum) naar links totdat de chromatine goed zichtbaar is (Figuur 4D).
3. Trackingchromatine
   1. Navigeer naar plugins (Figuur 5A).
   2. Klik op de pijltje naar beneden in het plugins-menu om naar de trackingoptie te scrollen (Figuur 5A).
   3. Klik op tracking, daarna op TrackMate.
   4. De begininstellingen verschijnen. Controleer of de kalibratie-instellingen kloppen, klik dan op Volgende (Figuur 5B).
   5. Selecteer Thresholding Detector en klik op Volgende (Figuur 5C).
   6. Ga in het afbeeldingsvenster naar het laatste frame van de timelapse (Figuur 5D).
   7. Klik naast de intensiteitsdrempel op Auto, en vervolgens op Preview.
   8. Pas de intensiteitsdrempel aan en klik op Voorbeeldweergave. Pas de drempel herhaaldelijk aan en bekijk deze totdat de preview alle chromatine bevat en minimale ruis bevat, en klik dan op Volgende (Figuur 5D).
   9. De initiële drempeldetectie zal plaatsvinden; klik op Volgend (Figuur 5E).
   10. Handmatig drempel totdat alleen chromatine zichtbaar is, klik dan op Volgend (Figuur 5F).
   11. Op deze pagina kun je spots filteren. Negeer dit en klik op Volgend (Figuur 6A).
   12. Selecteer Eenvoudige LAP-tracker en klik op Volgende (Figuur 6B). De LAP-tracker is toepasbaar wanneer getrackte objecten niet samensmelten of splitsen.
   13. Stel de linking max afstand in op 5 micron, gap-sluitende maximale afstand op 15 micron, en gap-sluitende maximale frame-gap op 1. Klik op Volgende (Figuur 6C).
   14. Tracking zal plaatsvinden. Sporen verschijnen in het originele afbeeldingsvenster. Klik op Volgende (Figuur 6D).
   15. Deze pagina maakt track-filtering mogelijk. Druk op de groene + knop linksonder om een filter te maken, kies dan het aantal plekken in track-modus en druk op Auto (Figuur 6E).
   16. Zorg ervoor dat de modus op Boven staat. Dit zal plekken verwijderen die snel verschijnen en verdwijnen.
   17. Klik op Volgende (Figuur 6E).
   18. De pagina met weergaveopties maakt het mogelijk om gegevens als een csv-bestand te exporteren. Klik onderaan de pagina op de knop Tracks , en vervolgens op Exporteren naar CSV (Figuur 7A).
   19. Deze pagina maakt ingebouwde plotten mogelijk; Negeer het en klik op Volgende.
   20. Sla op de laatste pagina de video op met de Capture-overlay en druk op uitvoeren. Klik erop en navigeer vervolgens naar het bestand > sla op als > GIF (Figuur 7B).
4. Basis snelheidsanalyse
   1. Open de CSV-gegevens van de tracks in een spreadsheetsoftware.
   2. Verwijder alle kolommen behalve TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME en RADIUS.
   3. De plekken in elk spoor zijn niet in volgorde. Om ze te ordenen, bevries eerst de bovenste vier rijen en maak vervolgens een nieuwe kolom aan met de titel TRACK_FRAME en kopieer en plak je deze formule in de kolom: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Selecteer de TRACK_FRAME kolom, klik er met de rechtermuisknop op en klik dan op Sorteerblad A–Z. De plekken binnen elk spoor zouden nu op volgorde moeten zijn.
   5. Om te bevestigen dat er geen vlekken ontbreken in het midden van een spoor, maak je een nieuwe kolom aan en gebruik je deze formule: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Zorg ervoor dat de eerste plek van elk nummer "NA" teruggeeft en de rest 1.
   6. Maak een kolom aan voor Snelheid (micron/frame) en plak de volgende formule erin: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Dit zal de stelling van Pythagoras gebruiken om de afstand tussen twee punten te berekenen.
   7. Om dit te vertalen naar Snelheid (micron/seconde), maak je een nieuwe kolom aan en plak je de volgende formule erin: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Dit zal de seconden/frame vinden en micron/frame dienovereenkomstig vertalen.

Results

Live cel beeldvorming van kernomhulsel en chromatinedynamica
We genereerden een dubbele fluorescentiemarkerlijn, die het buitenste nucleaire omhullingseiwit WIP1-GFP en centromere chromatine CENH3-mRFP omvat (Figuur 8). Zaailingen van 4 dagen oud werden voor 2 dagen overgebracht naar de controleplaat of platen met 100 mM NaCl. Na 2 dagen incubatie is er een duidelijke wortelgroeiremming waargenomen bij zoutbehandeling, zoals eerder gerapp...

Discussion

De hier gepresenteerde methode is ideaal om chromatinedynamiek te volgen. In vergelijking met eerdere live-celbeeldvormingsmethoden met aparte beeldvorming, maakt gelijktijdige beeldvorming van kernen en chromatine het mogelijk de relatie tussen nucleaire en chromatinedynamiek te onderzoeken. Dit kan bewegingen zoals kernrotatie en intra-nucleaire chromatinebeweging onthullen die anders moeilijk aan te tonen zijn.

Als live-cel beeldvormingsmethode is het het b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987