Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Netwerkfarmacologie, machine learning en in vivo validatie van de Danzhi Jiangtang-capsule bij diabetische nefropathie

58 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71328

⸱

28 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Danzhi Jiangtang Capsule (DJC) kan diabetische nefropathie (DN) verminderen, zoals blijkt uit veranderingen in chemokinesignalering en pyroptosemarkers, ondersteund door bio-informatica en in vivo validatie.

Samenvatting

Hoewel Danzhi Jiangtang Capsule (DJC) een traditionele Chinese kruidenpreparaat is die klinisch wordt gebruikt voor diabetes, is niet volledig duidelijk hoe het de nier kan beschermen tijdens diabetische nefropathie (DN). Dit onderzoek was bedoeld om mogelijke mechanismen te onderzoeken waarmee DJC DN beïnvloedt, met een focus op de NLR-familie pyrine-domeinhoudende 3 (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD) pyroptose-gerelateerde signaalcascade.

Er werd een geïntegreerde strategie toegepast die netwerkfarmacologie en machine learning combineerde. De Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) en de Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM) werden gebruikt om bioactieve ingrediënten en hun bijbehorende eiwitdoelen van DJC te screenen. DN-geassocieerde genen werden opgehaald uit Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards en Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Belangrijke kandidaatdoelen werden gescreend en gerangschikt met behulp van meerdere machine learning-algoritmen. De bindingsaffiniteit tussen de actieve bestanddelen van DJC en kerndoelen werd beoordeeld via moleculaire koppeling. Ten slotte werden de therapeutische werkzaamheid en voorspelde mechanismen geëvalueerd bij db/db diabetische muizen.

Netwerkfarmacologieanalyse identificeerde 599 DJC-doelen en 68 overlappende genen die gedeeld werden met DN. Met behulp van machine learning-algoritmen werden C-C-motief chemokineligand 2 (CCL2) en CASP1 geïdentificeerd als geprioriteerde kandidaat-doelen. Moleculaire koppeling voorspelde mogelijke sterke bindingsaffiniteiten tussen de actieve bestanddelen van DJC en deze kerneiwitten. Functionele verrijkingsanalyses (GO/KEGG) suggereerden dat DJC-modulatie geassocieerd is met ontstekingsreacties en de MAPK-route. In vivo validatie toonde aan dat de behandeling van DJC de markers van nierschade en fibrose verzwakte. Deze bevindingen suggereren dat DJC DN deels kan verzwakken door veranderingen in de CCL2/C-motief chemokinereceptor 2 (CCR2)-gerelateerde pyroptose-signaalveranderingen.

Inleiding

De wereldwijde last van diabetes mellitus (DM) blijft toenemen en vormt een formidabele uitdaging voor de volksgezondheid. Naar schatting 5,2 miljoen sterfgevallen per jaar zijn het gevolg van DM en de bijbehorende complicaties1. DN wordt gezien als een ernstige microvasculaire complicatie en een belangrijke bijdrage aan de ontwikkeling van eindstadium nierziekte (ESRD), die ongeveer 30-40% van de diabetische bevolking treft 2,3. Meerdere verweven factoren dragen bij aan de pathologische progressie van DN, waaronder metabole disfunctie, hemodynamische remodellering en aanhoudende ontstekingsreacties. Pathologische aantastingen, waaronder hoge glucose en hyperlipidemie, activeren de door de GSDMD gemedieerde pyroptose-route van NLRP3/caspase-1/GSDMD, wat een inflammatoire geprogrammeerde dood veroorzaakt in renale mesangiale en tubulaire epitheelcellen, gevolgd door progressieve tubulointerstitiele laesies4. Pyroptose wordt gekenmerkt door een plasmamembraanruptuur, wat de afgifte van IL-1β en IL-185 aanjaagt. Dergelijke pro-inflammatoire factoren verhogen de transcriptie van het C-C-motief chemokine ligand 2 (CCL2), bevorderen macrofageninfiltratie en versterken de pyrototische activatie verder, waardoor nierschade6 geleidelijk wordt verergerd. In de klinische praktijk uit deze aandoening zich in progressieve albuminurie en geleidelijke vermindering van de glomerulaire filtratiesnelheid, wat kan leiden tot onomkeerbare nierschade en een duidelijke verslechtering van de kwaliteit van leven voor getroffen personen 7,8. Ondanks vooruitgang in de medische zorg slagen huidige therapeutische strategieën, die zich vooral richten op strikte glykemische en bloeddrukcontrole, er vaak niet in de ziekteprogressie volledig te stoppen. Hoewel opkomende farmacotherapieën, waaronder SGLT2-blokkerende middelen, GLP-1-agonisten en mineralocorticoïde receptorblokkers, evenals stamceltherapieën en dieetinterventies, veel aandacht hebben gekregen en steeds vaker voorkomen in praktijk9, blijft het restrisico op DN hoog. Daarom blijft het ontwikkelen van innovatieve therapeutische stoffen een dringende onderzoeksprioriteit, vooral die uit de traditionele geneeskunde die meerdere pathologische routes gelijktijdig kunnen aanpakken.

Danzhi Jiangtang Capsule (DJC), een exclusief in het ziekenhuis beschikbare formulering ontwikkeld in het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de Anhui Universiteit voor Chinese Geneeskunde (Anhui Provincial Medical Institution Preparation Approval No. Z20090006; Octrooi nr. ZL200310112845.1; Batch nr. 20220427), is een veelbelovende therapeutische kandidaat. Het moet worden afgesloten, opgeslagen in een droge, geventileerde omgeving en beschermd tegen licht. De formule bestaat uit zes traditionele Chinese kruiden: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex) en Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. In de klinische praktijk heeft DJC een significante hypoglykemische effectiviteit aangetoond en het vermogen om nierschademarkers bij diabetische patiënten te verlagen11. Eerder onderzoek suggereert dat DJC renoprotectieve effecten kan uitoefenen door het reguleren van de bloedsuikerspiegel en het lipidmetabolisme 12,13,14. Eerdere studies van DJC richtten zich voornamelijk op validatie van enkelvoudige paden met onsystematische doelselectie. Daarom integreerden we netwerkfarmacologie en machine learning om actieve componenten te screenen en kerngenen te identificeren, gevolgd door voorlopige in vivo validatie om de analyse te versterken.

Netwerkfarmacologie biedt een effectieve strategie voor het ontleden van ingewikkelde kruidenrecepten. Dit kader integreert bio-informatische en systematische biologische benaderingen, computationele chemie en farmacologie om de "multi-component, multi-target en multi-pathway" mechanismen van geneesmiddelactiviteit te ontcijferen 15,16,17. Deze holistische benadering faciliteert een gestructureerd onderzoek naar de ingewikkelde interacties tussen kruidenverbindingen en ziekte-specifieke netwerken, waarbij de synergetische effecten die inherent zijn aan TCM18 worden blootgelegd. Traditionele netwerkfarmacologie kan echter soms overmatige ruis in de data genereren. Om dit te overwinnen, maakt het integreren van machine learning-algoritmen nauwkeurige screening mogelijk van kernkarakteristieke genen uit grootschalige datasets. Bovendien biedt moleculaire koppeling een intuïtief, dynamisch perspectief om potentiële bindingsaffiniteiten tussen geneesmiddel en biomolecuul te voorspellen19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Screening van bioactieve verbindingen en potentiële doelwitten van DJC

Bioactieve verbindingen van de zes kruiden in DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) en Whitmania pigra (Hirudo) werden opgehaald uit de TCMSP-database. De screening werd uitgevoerd op basis van farmacokinetische parameters: orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18. Voor Whitmania pigra, dat geen gegevens heeft in TCMSP, zijn de actieve verbindingen en doelwitten verkregen uit de BATMAN-TCM, met een score ≥ 20 en een P-waarde < 0,05 als selectiecriteria. UniProt werd toegepast om alle verzamelde doelen te verenigen in een standaard genennomenclatuur.

Acquisitie van DN-gerelateerde genen

DN-gerelateerde genen werden verzameld uit drie bronnen. Eerst werden GeneCards en OMIM gezocht met "diabetische nefropathie" als zoekterm. Genen van GeneCards met een relevantiescore > 1 werden behouden. Ten tweede werden drie microarray-profielen (GSE30529, GSE104948, GSE96804) verkregen uit de GEO-repository. De monsters in GSE30529 waren afkomstig van nierbuisjes, terwijl die in GSE104948 en GSE96804 afkomstig waren van nierglomeruli. Alle databasezoekopdrachten zijn uitgevoerd op 15 december 2024. Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen DN-patiënten en gezonde controles in de GSE30529-dataset werden geïdentificeerd met het limma-pakket in R-software. De screeningscriteria werden ingesteld op een aangepaste p-waarde < 0,05 en |log2(Fold Change)| > 0,5. Vulkaangrafieken en heatmaps toonden verschillend expressieve genen.

Identificatie van veronderstelde therapeutische doelen van DJC voor DN

Venn-diagramanalyse identificeerde gedeelde loci tussen de DJC-doelpool en DN-geassocieerde genen van GeneCards, OMIM en GSE30529 DEGs. Deze gedeelde loci dienden als kandidaat-therapeutische genen voor alle downstream onderzoeksprocedures.

Vestiging en profilering van eiwitinteractie (PPI)-netwerken

Veronderstelde therapeutische loci werden geüpload naar STRING om een eiwit-eiwit interactienetwerk te construeren, met een interactie-cutoff boven een betrouwbaarheidswaarde van 0,4. Cytoscape verwerkte de netwerkdatasets voor visuele presentatie. Topologische indices zoals Degree werden berekend via de CytoNCA-plugin om kernknooppunten in het hele netwerk te identificeren.

Verrijkingsanalyse

Om de biologische rollen en signaalcascades gekoppeld aan kandidaatdoelen af te bakenen, werd functionele verrijking geanalyseerd in R met het clusterProfiler-pakket, met org. Hs.eg.db voor annotatie en ggplot2 voor visualisatie. Genontologie (GO) termen werden geëvalueerd binnen biologische processen (BP), cellulaire componenten (CC) en moleculaire functie (MF) categorieën. De Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routes werden behouden toen de verrijkingsp-waarde < 0,05 was.

Toepassing van het CytoHubba-algoritme

De CytoHubba-plugin in Cytoscape werd gebruikt om vier topologische centraliteitsindices voor elke netwerkknoop te berekenen. Degree, het aantal direct verbonden buren, weerspiegelt de breedte van de interacties tussen elk eiwit. Maximum neighborhood component (MNC), een maatstaf die de grootte van de grootste verbonden component in de buurt-subgraaf van de knoop kwantificeert, meet lokale reguleringsinvloed. De edge percolated component (EPC) beoordeelt het wereldwijde structurele belang via gesimuleerde willekeurige randverwijdering en kwantificatie van de gemiddelde verbonden componentgrootte. Genen die in de top 20 van elke index stonden, werden gekruist om de uiteindelijke hubgenen te vormen.

Machine learning-gebaseerde kerngenscreening

Drie machine learning-benaderingen werden toegepast op expressieprofielen uit de GSE30529-dataset om betrouwbare hubgenen onder kandidaatdoelen te identificeren.

(1) LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator): De regularisatieparameter λ werd afgestemd via vijfvoudige kruisvalidatie, waarbij de optimale waarde werd bepaald door de gemiddelde prestaties over folds. Inputgenexpressiekenmerken ondergingen automatische Z-score standaardisatie om effecten van expressiegrootte te elimineren. Met de strafparameter α vastgesteld op 1 voor pure LASSO-regularisatie, werd een vooraf gedefinieerd paneel van 100 λ-waarden gebruikt voor screening. De L1-straf verkleinde de coëfficiënten van laag-relevante features tot nul, waardoor gelijktijdige featureselectie en complexiteitscontrole mogelijk werden, terwijl de cross-validation-afgestelde regularisatiesterkte het risico op overfitting verminderde.

(2) SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination): Een tweelaags 5-voudig crossvalidatieframework werd gebruikt om robuuste feature-screening te garanderen. Vijf niet-overlappende subsets werden gegenereerd door stochastisch de gehele dataset te delen, waarvan vier werden gebruikt voor training en één voor testen over vijf iteraties; Fold-gewijze gemiddelde verminderde bias door splitsing van enkele steekproeven. Recursieve feature-eliminatie werd toegepast om de featuredimensionaliteit te verminderen en de complexiteit van het model te beperken, waardoor overfitting werd verminderd. Classificatiefoutpercentage en nauwkeurigheid dienden als prestatiemetrics om het optimale aantal kenmerken te bepalen.

(3) Willekeurig bos (RF): Er werd een initiële willekeurig bos met 500 bomen geconstrueerd, waarbij het optimale boomnummer werd bepaald door de minimale out-of-bag classificatiefout om het uiteindelijke model opnieuw te trainen. Alle overige hyperparameters, inclusief de willekeurige feature-subsetgrootte bij elke knoopsplitsing, werden op de standaard pakketinstellingen gehouden. Genen-belangrijkheidsscores uit het uiteindelijke model werden in aflopende volgorde gerangschikt om de ziektesignaturgenset te genereren. De uiteindelijke set kerngenen werd bepaald door de resultaten van deze drie algoritmen te kruisen.

Onafhankelijke dataset-gebaseerde verificatie van hubgenexpressie

Twee onafhankelijke externe datasets, GSE104948 en GSE96804, werden gebruikt om transcriptniveaus van de hubgenen te valideren. Genexpressiedatasets ondergingen normalisatie; expressieverschillen tussen DN-gevallen en gezonde proefpersonen werden uitgezet met behulp van de ggplot2- en ggsignif-toolkits van R.

Moleculaire koppeling

De 3D-conformaties van de hub-doeleiwitten (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00) verkregen uit de Protein Data Bank. Bioactieve 3D-conformaties werden via PubChem verkregen. Ursolinezuur, 3β-hydroxyuren-12-en-28-oïnezuur en quercetine werden geselecteerd voor koppeling omdat netwerkfarmacologie interacties voorspelde tussen deze actieve verbindingen en de kerndoelen CCL2 of CASP1. Eiwitstructuren werden voorbehandeld door native liganden en watermoleculen te strippen, polaire waterstoffen in te brengen, en vervolgens onderworpen aan moleculaire koppeling met AutoDock Vina. De bindingsaffiniteit, weergegeven door de dockingscore (in kcal/mol), diende om de sterkte van interacties te beoordelen. Een bindingsenergiedrempel van −5,0 kcal/mol werd vastgesteld om stabiele intermoleculaire interacties te definiëren. De gedockte conformaties werden gevisualiseerd met PyMOL.

Dieren en experimenteel ontwerp

De huidige studie gebruikte 30 mannelijke db/db-muizen van 8 weken oud van specifieke pathogen-free (SPF) graad, samen met 10 leeftijdsgematchte mannelijke SPF db/ m-muizen. Alle experimentele muizen werden grootgebracht in een SPF-faciliteit onder een licht-donker fotoperiode van 12 uur en onder stabiele omstandigheden gehouden: 22 ± 2 °C, 50–70% relatieve luchtvochtigheid en onbeperkte toegang tot regelmatig voedsel en drinkwater. Ethische goedkeuring voor alle in vivo experimentele protocollen werd verleend door de Animal Ethics Committee van de Anhui University of Chinese Medicine (Goedkeuringsnummer AHUCM-mouse-2023059).

Knaagdieren ondergingen een adaptatiefase van 7 dagen voordat ze willekeurig gegroepeerd werden (elk 6 dieren) en 8 weken dagelijkse interventie. Nuchtere bloedsuiker werd bij alle proefdieren gemeten; dieren werden toegewezen met behulp van een willekeurige getalletabel, en histologie, IHC en western blot-kwantificatie werden uitgevoerd onder blinde beoordeling.

Normale controlegroep (CTL): db/m muizen die zoutoplossing ontvangen via orale gavage.

Model (M) groep: db/db muizen die zoutoplossing krijgen via orale gavage.

DJC-Medium Dosis (DJC-M) groep: db/db muizen die DJC ontvangen met 0,78 g/kg (gelijk aan de klinische dagelijkse dosis voor volwassenen).

DJC-Hoge Dosis (DJC-H) groep: db/db muizen die DJC krijgen bij 1,56 g/kg (tweemaal de klinische dagelijkse dosis voor volwassenen).

Doseringsvoorbereiding

De dosisschaal van mens naar muis werd afgeleid met behulp van de normalisatiebenadering van lichaamsoppervlakte, zoals uiteengezet in Methodology of Pharmacological Experiments, met een conversiecoëfficiënt van 9,1. De klinische dagelijkse dosis van DJC was 6 g voor een volwassene van 70 kg (0,0857 g/kg), wat resulteerde in muisequivalente doses van 0,78 g/kg (1 keer klinische dosis) en 1,56 g/kg (2 keer klinische dosis). Alle muizen kregen intragastrische toediening met een constant volume van 10 mL/kg. DJC-poeder werd nauwkeurig gewogen en opgehangen in 0,5% CMC-Na-oplossing om uniforme suspenties te vormen bij 78 mg/mL (middelmatige dosis) en 156 mg/mL (hoge dosis).

Na 8 weken dagelijkse toediening werd bij alle experimentele muizen verdoving geïnduceerd met 1% natrium pentobarbital. Bloedmonsters werden verzameld via de abdominale aorta en gecentrifugeerd om de supernatanten te isoleren voor kit-gebaseerde biochemische assays. Metabole kooien werden gebruikt om urinemonsters van muis te verzamelen. Gedeeltelijk nierweefsel werd vastgesteld in 4% paraformaldehyde voor hematoxyline-eosine (HE) en Masson-kleuring. Met snap-frozen in vloeibare stikstof werden resterende nierweefsels bewaard bij −80 °C voor downstream analytische assays.

Histologische analyse

Na fixatie in 4% paraformaldehyde ondergingen nierweefsels gradueel ethanoldehydratie, clearing, paraffine-inbedding en 4-μm seriële sectie voor daaropvolgende HE en Masson's tricroomkleuring. HE kleuring werd uitgevoerd volgens standaardprocedures (deparaffinisatie, rehydratatie, hematoxyline nucleaire kleuring, differentiatie en blauwing van verzuurde ethanol, eosine-tegenkleuring, dehydratie, clearing en neutrale balsemmounting) om nierhistopathologische veranderingen te observeren. Secties werden 3 minuten ondergedompeld in hematoxyline-kleuring, gevolgd door eosine-tegenkleuring gedurende 15 seconden. Voor Massons tricroomkleuring ondergingen secties deparaffinisatie, rehydratatie, sequentiële kleuring, differentiatie en azijnzuurkleurscheiding, gevolgd door dehydratatie, opruiming en montage om de ophoping van niercollageen en fibrotische veranderingen te beoordelen. Brightfield-microscopie werd gebruikt om alle gekleurde weefseldoorsneden te inspecteren en te fotograferen met een vergroting van 200×. HE-gekleurde secties werden beoordeeld met behulp van de Glomerulaire Sclerose-index (GSI). Voor Massons trichrome kleuring werd de Masson Trichrome-preset toegepast om het blauwe collageenkanaal te isoleren, en werd de verhouding van collageenoppervlak tot rood gekleurd weefsel berekend.

Immunohistochemie (IHC)

Na 24-uur fixatie met 4% paraformaldehyde werden weefselmonsters gedehydrateerd via seriële ethanolgradiënten, vervolgens paraffine ingebed en in opeenvolgende secties van 5 μm gesneden. Na deparaffinisatie ondergingen secties antigeenextractie en endogene peroxidaseblokkering. Na het blokkeren werden weefselglaasjes geïncubeerd met verdunde primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts in een vochtige kamer. De preparaten kregen een secundaire antilichaamincubatie bij kamertemperatuur na PBS-washes, gevolgd door een DAB-chromogene reactie totdat de optimale kleuringsintensiteit was bereikt. De secties ondergingen vervolgens sequentiële hematoxyline-tegenkleuring, differentiatie, blauwing, uitdroging, clearing, coverslip-montage en bright-field microscopische beeldvorming. Antigeenwinning werd uitgevoerd via autoclaving gedurende 10 minuten, gevolgd door natuurlijke afkoeling tot kamertemperatuur. Na 60 minuten blokkering met 5% geitenserum bij kamertemperatuur, werden secties geïncubeerd met primair antilichaam (1:200 verdunning) en vervolgens HRP-geconjugeerde geitenantikonijn IgG secundair antilichaam (1:300 verdunning) elk 60 minuten bij kamertemperatuur. De DAB-chromogene reactie werd 3–5 minuten bij kamertemperatuur uitgevoerd, microscopisch gemonitord en afgesloten door spoelen met gedestilleerd water. Beelden werden gemaakt met een vergroting van ×200, en het percentage positieve kleuringsgebied werd gekwantificeerd met ImageJ.

ELISA-detectie

De teststappen voldeden aan de officiële protocollen die door kitleveranciers werden geleverd. Wasbuffer- en seriël verdunde standaarden werden vooraf voorbereid. Blanco-, standaard- en monsterputten werden geladen met reagentia en in het donker geïncubeerd. Platen werden na de incubatie grondig gewassen en vervolgens in het donker geïncubeerd met het enzym geconjugeerd. Na het wassen werd een chromogeen substraat toegevoegd voor een lichtbeschermde kleurreactie, die werd beëindigd met een stopbuffer zodra er duidelijke blauwe gradiënten in de standaardputten verschenen. De absorptie (OD) van elke put werd gemeten bij de doelgolflengte met behulp van een microplaatlezer. Serum IL-1β en IL-18 concentraties werden gekwantificeerd met kalibratiecurves die werden gegenereerd uit OD-waarden van standaardconcentraties (onverdunde serummonsters; absorptie gemeten bij 450 nm; acht technische replicatieputten per monster). Urinecreatinine en 24-uurs urine-eiwit werden gemeten in onverdunde urinemonsters die werden verzameld met 24-uurs metabole kooien (absorptie gelezen bij 546 nm; acht technische replicaties per monster).

Realtime kwantitatieve PCR (RT-qPCR)

Totaal RNA werd geïsoleerd uit nierweefsel, en de zuiverheid en concentratie werden bepaald door spectrofotometrie. Gezuiverd RNA werd omgekeerd getranscribeerd om cDNA-templates te genereren. RT-qPCR werd uitgevoerd op een realtime PCR-instrument met het volgende thermische cyclusprogramma: 5 minuten pre-denaturatie (95 °C), gevolgd door 40 versterkingsrondes: 15 s bij 95 °C, 1 min bij 60 °C. RT-qPCR werd uitgevoerd in een reactie van 10 μL met 5 μL SYBR Green Master Mix, 0,2 μL forward primer, 0,2 μL reverse primer, 1 μL cDNA-sjabloon en 3,6 μL RNase-vrij water. Reverse transcriptie voor cDNA-synthese werd uitgevoerd in een totaal reactievolume van 20 μL. Smeltcurve-analyse werd uitgevoerd om de amplificatiespecificiteit te bevestigen, en elk monster werd geanalyseerd in drie technische replica's. De transcriptniveaus werden beoordeeld door 2⁻ΔΔCq-normalisatie naar β-actine, waarbij alle primersequenties in Tabel 1 zijn vermeld.

Western blot-analyse

Ongeveer 40 mg nierweefselmonsters werden uit elke muiscohort gehaald, op ijs gehakt en volledig gehomogeniseerd in een eiwitlysebuffer. Na een centrifugatie van 15 minuten bij 12.000 tpm bij 4 °C werd het totale eiwithoudende supernatant uit weefselhomogenaten verzameld, gealiquoteerd en gecryoppreserve bij −80 °C. De eiwitsupernatant werd gemengd met de laadbuffer en gedenatureerd door te koken in een waterbad. Ongeveer 10 μL genormaliseerd eiwitmonster werd per baan geladen en gescheiden op 10% SDS-polyacrylamide gels. Doeleiwitten werden via nat elektroblotting overgebracht naar nitrocellulosefilters. De overdracht vond plaats bij een vaste stroom van 400 mA in een ijsbad gedurende 30–45 minuten. Na de overdracht werden de vlekken 2 uur geïncubeerd in koude magere melk, waarna ze een nacht werden geïncubeerd bij 4 °C met 1:1.000 primaire antistoffen. Gewassen vlekken werden bedekt met bijpassende secundaire antilichamen (1:10.000) bij 4 °C gedurende 2 uur, en luminescentiebandsignalen werden opgenomen en gekwantificeerd uit blotfoto's met behulp van ImageJ-software. Voor GSDMD-N werd Tubulin gebruikt als belastingsregeling omdat het verwachte molecuulgewicht (~35 kDa) overlapt met dat van GAPDH (~36 kDa). Alle western blot-experimenten werden uitgevoerd met drie onafhankelijke biologische replicata.

Statistische analyse

Kwantitatieve gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd met een ongepaarde Student's t-test, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post hoc-test. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

DJC bioactieve component en doelidentificatie

In totaal werden 66 bioactieve verbindingen die voldeden aan de screeningscriteria (OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18) geïdentificeerd uit de zes kruiden waaruit DJC bestaat. Deze omvatten 26 verbindingen van Pseudostellaria heterophylla, 6 van Paeonia suffruticosa, 8 van Cuscuta chinensis, 6 van Alisma orientale, 10 van Rehmannia glutinosa en 10 van Whitmania p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

DN blijft een belangrijke oorzaak van ESRD, gekenmerkt door een complexe en multifactoriële pathogenese die nog niet volledig is begrepen20,21. Hoewel DJC veelbelovende klinische effectiviteit heeft aangetoond bij het verbeteren van DN, zijn de onderliggende moleculaire mechanismen grotendeelsongrijpbaar gebleven. In deze studie gebruikten we een multi-omics analysesysteem dat netwerkfarmacologie, machine ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Key Research Projects van de Provinciale Universiteiten van Anhui (subsidienummer 2024AH050968).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxyline Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
softwarenaamversie
AutoDock Vina1.2.3
Cytoscape software3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
R software4.2.0

Referenties

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BiologieEditie 233Editie 233Lege waardeEditiePyroptoseCCL2 CCR2 as
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.