Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Deze studie combineert een rat oculaire hypertensiemodel met in vitro mechanische stammen, agonist/inhibitor en siRNA-experimenten in menselijke sclerale fibroblasten om aan te tonen dat de expressie van Piezo1 verhoogd is tijdens sclerale extracellulaire matrixremodellering en functioneel betrokken is bij myofibroblastdifferentiatie.
Differentiatie door mechanische spanning veroorzaakte myofibroblasten is een cruciaal mechanisme dat ten grondslag ligt aan de remodellering van de sclerale extracellulaire matrix (ECM) bij glaucoom. De omzetting van mechanische spanning in biochemische signalen binnen sclerale fibroblasten is echter onvoldoende opgehelderd. Deze studie had tot doel de rol van Piezo1 in cellulaire proliferatie en differentiatie te onderzoeken, in de context van door mechanische rek geïnduceerde myofibroblastdifferentiatie tijdens sclerale ECM-remodellering. Het onderzoeksontwerp combineert in vivo expressiewaarnemingen van een eenweekse rat oculaire hypertensiemodel met in vitro mechanistische assays met cyclische mechanische stretch (10% bij 0,5 Hz tot 24 uur) en farmacologische modulatie van Piezo1 (agonist Yoda1, remmer GsMTx4 en siRNA-knockdown) in primaire menselijke sclerale fibroblasten (HSF-cellen). Onze bevindingen tonen aan dat Piezo1 tot expressie komt in scleraweefsel en HSF-cellen. In de in vivo-arm werd na één week een significante toename van Piezo1-eiwitniveaus waargenomen in de sclera van oculaire hypertensieve ratten, wat samenviel met verhoogde expressie van type I collageen (COL1) en α-gladde musculus actine (α-SMA). In de in vitro experimenten verhoogde mechanische stretch (8–24 uur) de Piezo1-expressie in HSF-cellen. Bovendien faciliteerde activatie van Piezo1 met Yoda1 (24 uur) de proliferatie van HSF-cellen en verbeterde de expressie van α-SMA en COL1. Omgekeerd onderdrukte of remming van Piezo1 de expressie van COL1 en belemmerde het de differentiatie van myofibroblasten onder mechanische belasting. Daarnaast leidde de activatie van Piezo1 tot een upregulatie van de expressie van Yes-geassocieerde eiwitten (YAP), terwijl de door mechanische spanning geïnduceerde YAP-expressie afnam bij het neerzetten of remmen van Piezo1. Samenvattend suggereren onze bevindingen dat Piezo1 een rol speelt in door mechanische spanning veroorzaakte expressie van belangrijke ECM-componenten in de sclera in de context van glaucoom en mogelijk een potentieel therapeutisch doelwit is dat verdere in vivo validatie vereist.
Glaucoom is een belangrijke oorzaak van onomkeerbare blindheid, gekenmerkt door progressieve degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC's) en oogzenuwhoofd (ONH) axonen, en trof wereldwijd 76 miljoen mensen in 2020 1,2. Verhoogde intraoculaire druk (IOP) is de grootste risicofactor voor glaucoom3 en IOP-vermindering is momenteel de enige beschikbare optie om de ontwikkeling en progressie van glaucoom te vertragen4. De ONH, de structuur waar de RGC-axonen het oog verlaten, is de belangrijkste beschadigingsplaats bij glaucoom. IOP-verhoging induceert mechanische spanning en verplaatsing in de ONH, wat resulteert in degeneratie van de RGC-axonen binnen de laminaire cribrosa (LC), wat uiteindelijk leidt tot glaucomateuze optische neuropathie 5,6.
De peripapillaire sclera (PPS) is het belangrijkste dragende weefsel van de ONH, waarbij de mechanische eigenschappen van PPS de ONH-respons op door IOP geïnduceerde mechanische spanningbepalen 7,8. Finite elementenmodellering en ex vivo studies bevestigden dat de LC biomechanische spanning afhankelijk is van sclerale stijfheid, en dat verhoogde PPS-stijfheid bijdraagt aan verminderde spanning in de LC 9,10. Vervolgens kan de variatie in stijfheid11,12 en dikte13 van PPS de IOP-gerelateerde biomechanische eigenschappen van de ONH veranderen, waardoor de vatbaarheid voor schade aan de glaucomateuze oogzenuwverder verandert 14,15. In biomechanische studies was de oculaire stijfheid van de glaucomateuze sclera groter dan normaal in postmortale menselijke ogen 16,17, en peripapillaire sclera-verstijfing is consequent waargenomen in zowel menselijk glaucoom als experimentele diermodellen 18,19,20. Deze gegevens suggereren dat verharding van de sclera een beschermende reactie kan zijn door verminderde IOP-geïnduceerde ONH-vervorming tijdens glaucoom.
De biomechanische eigenschappen van het weefsel van de sclera zijn het resultaat van de samenstelling van de extracellulaire matrix die door fibroblasten21 wordt gesynthetiseerd. Recent bewijs suggereert dat mechanische belasting die ontstaat door verhoogde IOP in staat is om sclerale fibroblasten in de sclera22 te activeren, myofibroblastdifferentiatie23 te bevorderen en te resulteren in ECM-remodellering24,25. De door mechanische spanning geïnduceerde myofibroblasttransformatie is een belangrijk proces tijdens sclerale ECM-remodellering bij glaucoom, maar het is onduidelijk hoe de mechanische spanning wordt omgezet in biochemische signalen en cellulaire reacties in sclerale fibroblasten.
Piezo1 is een lid van een nieuw, onderscheidend niet-selectief cationisch mechanosensitief kanaalfamilie die betrokken is bij fibrose van verschillende organen, waaronder hart- en longhuid26,27. Mechanische spanning kan de cellulaire Piezo1-kanalen activeren, wat leidt tot een verhoogde Ca2+-instroomvan 28, waardoor calciumafhankelijke signalering wordt gereguleerd om diverse cellulaire activiteiten te reguleren, waaronder de proliferatie, motiliteit en differentiatie van fibroblasten29,30. Recente studies toonden aan dat onder mechanische belasting Piezo1 de huidfibrotische processen bevordert door fibroblastproliferatie, motiliteit en differentiatiete stimuleren 31. Deze studie omvat twee complementaire componenten: een beschrijvende in vivo studie van Piezo1-expressie in een rat oculaire hypertensiemodel, en een mechanistische in vitro studie waarbij primaire menselijke sclerale fibroblasten onder cyclische mechanische belasting worden gebruikt. We stelden de hypothese op dat mechanische spanning Piezo1 activeert, wat de differentiatie van myofibroblasten en de expressie van ECM-componenten in sclerale fibroblasten bevordert, mogelijk via YAP-signalering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken oud) werden afkomstig van het Fudan University Children's Hospital Experimental Animal Center. Alle ratten werden ad libitum gehuisvest en onder SPF-omstandigheden gehuisvest bij 22±1 °C en een dag/nachtcyclus van 12 uur. Alle dierproeven volgden de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek en zijn goedgekeurd door de Institutionele Beoordelingscommissie en de Ethische Commissie van het Kinderziekenhuis van Fudan University (2022JS-EKYY-019). Menselijk scleraweefsel dat wordt gebruikt om primaire menselijke sclerale fibroblasten te produceren, is verkregen uit donorsclera volgens de institutionele richtlijnen, en alle gerelateerde procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Fudan University (2024-YS-187).
Experimenteel ontwerp
De huidige studie maakte gebruik van zowel in vivo als in vitro benaderingen, conceptueel verbonden door mechanische spanning, om de bijdrage van Piezo1 aan sclerale ECM-remodellering te onderzoeken. In vivo gebruikten we een rat oculaire hypertensiemodel om de expressie van Piezo1 te onderzoeken onder verhoogde IOP. In vitro hebben we primaire menselijke sclerale fibroblasten onderworpen aan cyclische mechanische stretch om de mechanische spanning te modelleren die de sclera bij glaucoom ondervindt, en manipuleerden we de activiteit van Piezo1 met behulp van farmacologische agonist (Yoda1), inhibitor (GsMTx4) en siRNA knockdown.
Experimenteel chronisch oculaire hypertensie (OHT) model
In totaal werden 18 mannelijke SD-ratten gebruikt. Bij elke rat kreeg het rechteroog een carbomerinjectie om oculaire hypertensie (OHT) op te wekken, waarbij het contralaterale linkeroog als controlegroep (NT) diende. Drie onafhankelijke biologische replicaties van het hele experiment werden uitgevoerd, wat resulteert in totaal 18 ogen per groep. De experimentele eenheid was het individuele oog. Onderzoekers die IOP-metingen uitvoerden en Western blot-analyse uitvoerden, werden blind voor groepstoewijzing.
Een experimenteel chronisch OHT-model werd bij ratten gegenereerd, zoals eerder beschreven25. Kort daarna werden ratten verdoofd met 10% chloorhydraat, en na pupilverwijding met tropicamide werd een carbomeroplossing (0,3%, 20 μL) in de voorste oogkamer geïnjecteerd. Chlortetracyclinehydrochloride werd aangebracht om infectie te voorkomen. IOP-metingen werden uitgevoerd met een rebound-tonometer na 3 en 7 dagen. Weefsels uit de sclera werden een week nadat het model als vastgesteld werd beschouwd, verzameld.
De sclerale weefsels werden geïsoleerd zoals eerder beschreven in detail25. Na de narcose werden de ratten transcardiaal perfuseerd met 4% formaldehyde in PBS. Buitenstaand orbitaal weefsel werd van de bol gedissecteerd en de structuren van het voorste segment (hoornvlies, iris, lens) en het glasvocht werden zorgvuldig verwijderd. Het netvlies en de choroïde werden voorzichtig van de binnenste sclerawand geschraapt. Het achterste weefsel van de sclera werd verzameld en geïdentificeerd door pathologische H&E-kleuring.
Celkweek
Primaire humane sclerale fibroblasten (HSF-cellen) waren een eerder gevestigde cellijn uit de menselijke donorsclera32. Voor elk experiment werden drie onafhankelijke biologische replicaten (cellen van drie verschillende donoren) gebruikt. HSF-cellen werden in DMEM gehouden, aangevuld met 15% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2, bevochtigde atmosfeer). Kweeken werden elke vier dagen gesplitst en HSF-cellen tussen passages 5 en 9 werden voor alle experimenten gebruikt. HSF-cellen werden bevestigd door immunofluorescentie met behulp van collageen type I en α-gladde spier actinecelmarkers.
Toepassing van mechanische stimulatie
Het cyclisch-mechanische reksysteem werd gebruikt om mechanische cyclische rek te produceren. Een zaaddichtheid van 2×105 cellen/mL werd gebruikt voor HSF-cellen die waren geplateerd in zes-wellplaten met collageenbedekte flexibele bodems. Stretchgroepcellen werden blootgesteld aan cyclische rek met 10% amplitude en 0,5 Hz, zoals beschreven in onze vorige studie32. Cellen die in rekplaten werden gekweekt, maar statisch achterbleven, dienden als controle. Piezo1 siRNA knockdown-experiment: Cellen kregen een 48-uur transfectie van Piezo1 siRNA of negatieve controle siRNA voorafgaand aan de mechanische stretch. Na transfectie ondergingen de cellen een cyclisch mechanisch rekproces gedurende 24 uur. Vier groepen werden opgenomen: (A) controle-siRNA-getransfecteerde cellen zonder stretch; (B) het controleren van siRNA-getransfecteerde cellen met stretch; (C) Piezo1 siRNA-transfecteerde cellen zonder stretch; (D) Piezo1 siRNA-getransfecteerde cellen met stretch. Piëzo1-inhibitor (GsMTx4) experiment: Cellen werden behandeld met 5 μM GsMTx4 vóór en tijdens de mechanische stretch. Vier groepen werden opgenomen: (A) onbehandelde cellen zonder stretch; (B) onbehandelde cellen met stretch; (C) GsMTx4-behandelde cellen zonder stretch; (D) GsMTx4-behandelde cellen met stretch (met GsMTx4 aanwezig overal). Piezo1-agonist (Yoda1) experiment: Cellen werden gekweekt in aanwezigheid van 5 μM Yoda1 gedurende 24 uur. Twee groepen werden opgenomen: (A) onbehandelde (voertuig) controle; (B) Met Yoda1 behandelde cellen.
Westelijke verplettering
De eiwitniveaus werden beoordeeld met Western blotting na routinematige procedures. Kort gezegd hebben we sclerale of gekweekte fibroblastmonsters gelyseerd in de RIPA-buffer. Eiwit (20 μg) werd opgelost door SDS-PAGE en vervolgens gedeponeerd op nitrocellulosemembranen. De membranen werden vervolgens geblokkeerd met 5% BSA gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur, gevolgd door een nachtelijke incubatie bij 4 °C met de juiste primaire antistoffen. De gebruikte antilichamen omvatten Piezo1, collageen type I, α-gladde spieractine, YAP en GAPDH. Het Piezo1-antilichaam is door de fabrikant gevalideerd voor Western blot en immunofluorescentie in ratten- en mensweefsels, met knockout-/knockdowngegevens beschikbaar op het productblad. Na drie wasbeurten met TBST hebben we de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met geschikte HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (anti-konijn of antimuis). Bandintensiteiten werden vervolgens gemeten met beeldanalysesoftware, en het signaal van elke doelband werd genormaliseerd naar het GAPDH-signaal van dezelfde baan. De resulterende gegevens worden gepresenteerd als fold-change ten opzichte van de controleconditie.
Celproliferatie
Celproliferatie werd beoordeeld met een colorimetrische levensvatbaarheidstest volgens het verstrekte protocol. We voegden een tetrazoliumverbinding (10 μL/mL) toe aan elke put en incubeerden de platen gedurende 2 uur onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2). De absorptie werd toen gemeten op 450 nm.
Kleine interfererende RNA-transfectie
De piezo1 siRNA-transfectie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven31. De sequenties waren als volgt: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (zintuig) en 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (antisense), negatieve controle (NC) siRNA, 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (zintuig) en 5'-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3' (antisense).
Immunofluorescentie
Voor immunofluorescentie werden gekweekte cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde (20 min, kamertemperatuur), permeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 (40 min), en vervolgens geblokkeerd met 10% BSA. Weefselsecties ondergingen een nachtelijke fixatie in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, gevolgd door permeabilisatie en blokkering. Exemplaren werden geïncubeerd met primaire antilichamen tegen Piezo1 en α-SMA. Vervolgens pasten we fluorescerend kleurstofgeconjugeerde secundaire antilichamen aan: groen-gelabelde anti-muis (voor α-SMA) en rood-gelabelde anti-konijn (voor Piezo1), elk met verdunning van 1:500. Kernen werden tegengekleurd met DAPI en beelden werden gemaakt met een fluorescentiemicroscoop.
Agonist- en remmerbehandeling
HSF-cellen werden behandeld met 5 μM GsMTx4 en 5 μM van de Piezo1-agonist Yoda1, gebaseerd op eerdere studies33.
Statistische analyse
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voor vergelijkingen tussen twee groepen gebruikten we een tweezijdige Student's t-test. Meerdere groepsvergelijkingen werden uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoc test. De normaliteit van de gegevens werd gecontroleerd met de Shapiro-Wilk test, en de homogeniteit van varianties werd geëvalueerd met behulp van de Levene-test. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met speciale statistische software.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Piezo1 wordt tot expressie gebracht in rattenscleraweefsels en HSF-cellen
Eerst onderzochten we Piezo1-expressie in zowel ratten-scleraweefsels (in vivo) als gekweekte menselijke sclerale fibroblasten (in vitro). Om weefselspecifieke expressie van Piezo1 te onderzoeken, werd de BioGPS-genannotatiedatabase34 gebruikt. BioGPS-analyse toonde aan dat Piezo1 sterk tot expressie komt in verschillende oogweefsels, waaronder re...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Verhoogde intraoculaire druk (IOP) veroorzaakt mechanische spanning in de oogzenuwkop en laminaire cribrosa, wat bijdraagt aan retinale ganglionceldegeneratie38,39. De peripapillaire sclera (PPS) is een belangrijk belastend weefsel dat invloed heeft op de biomechanica van ONH40. Eerdere studies hebben aangetoond dat mechanische spanning differentiëring van sclerale fibroblast naar myofibroblast en remodell...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82401257).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer) | Solarbio, Shanghai, China | — | 20 μL |
| 10% chloral hydrate | Macklin, Shanghai, China | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I) | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| Chlortetracycline hydrochloride | Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China | — | |
| COL1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, Australia | — | |
| GAPDH primary antibody | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism version 8.4 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 microscope | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| Nitrocellulose membranes | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| Rebound tonometer (TonoLab) | Icare, Espoo, Finland | — | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China | — | |
| The Flexcell FX-5000 Tension System | Flexcell International Corporation | — | Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells. |
| Tropicamide | Bausch Lomb Freda, Shandong, China | — | |
| YAP primary antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA primary antibody | Abcam, Cambridge, UK | — |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.