Methodenartikel

Geautomatiseerde operante intermitterende alcoholdrinken bij sociaal gehuisveste muizen via het Intellicage Testing System

156 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71345

⸱

5 juni 2026

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert methoden voor een high-throughput, geautomatiseerde beoordeling van alcoholgebruik bij sociaal gehuisveste muizen, uitgevoerd via het IntelliCage-testsysteem. Er wordt een gedetailleerde methodologie gegeven voor een operant, intermittent alcoholdrinkparadigma, samen met de experimentele bestanden en code om de resulterende data te analyseren.

Samenvatting

Ondanks bekende verwarringen van sociale isolatie bij knaagdiergedrag, vertrouwen veel onderzoekers op het alleen huisvesten van muizen om alcoholvoorkeur te beoordelen in preklinische modellen van alcoholgebruikstoornis (AUD). Dit protocol beschrijft een sociale alcoholdrinktaak die een hoogdoorvoer, geautomatiseerde beoordeling van alcoholgedrag bij muizen mogelijk maakt zonder de verstorende effecten van stress veroorzaakt door sociale isolatie. Het IntelliCage-testsysteem stelt onderzoekers in staat om gelijktijdig operant alcoholgebruik te beoordelen bij maximaal 16 muizen van hetzelfde geslacht, elk uniek geïdentificeerd met een subcutane geïmplanteerde radiofrequentie-identificatie (RFID)-transponder. De toegang tot sipperflessen wordt softwaregestuurd en kan individueel worden aangepast voor elke muis. In dit chronische, intermitterende alcoholdrinkparadigma doen muizen vrijwillig operante neusprikken om zes weken lang toegang te krijgen tot sipperflessen met 20% alcohol. Alcoholflessen zijn slechts om de dag beschikbaar voor 24 uur per keer en kunnen optioneel worden vervalst met kinine om strafongevoelig drinken te beoordelen. Bezoeken aan elke operante hoek, neuspoken en lickgegevens worden automatisch geregistreerd voor elke muis. Gedetailleerde experimentele methoden en de open-source code om de geregistreerde gegevens te analyseren, stellen onderzoekers in staat om alcoholgebruik dat relevant is voor AUD op een steeds efficiëntere en ethologisch relevante manier te beoordelen.

Inleiding

Studies in preklinische modellen zijn cruciaal voor het ontwikkelen van een dieper begrip van de neurobiologische mechanismen achter alcoholgebruikstoornis (AUD)-achtig gedrag. Toch vereisen veel traditionele metingen van alcoholgebruik bij knaagdieren, zoals de twee-fless keuze 1,2 en drink-in-het-donker 3,4,5-testen, een handmatige meting van vloeistofvolumes bij eenpersoonsgehuisde knaagdieren, een methode met lage doorvoer en foutgevoeligheid. De recente adoptie van open-source lickometersystemen die gebruikmaken van capacitieve 6,7,8,9,10- of foto-elektrische 11,12-technologie om lick-tellen te automatiseren, vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de doorvoer, nauwkeurigheid en technische gevoeligheid van alcoholdrinkmethoden. De meeste thuiskooi-lickometersystemen vereisen echter nog steeds dat knaagdieren afzonderlijk worden gehuisvest, wat isolatiespanning13,14 veroorzaakt. Hoewel de gerapporteerde bevindingen sterk variëren15,16, hebben knaagdieren over het algemeen een grotere voorkeur voor alcohol wanneer ze alleen worden gehuisvest 17,18,19,20. De effecten van sociale isolatie op alcoholgebruik variëren echter afhankelijk van de leeftijd, het geslacht, de woonomgeving en eerdere stressblootstelling 20,21,22. Sociale isolatie heeft het potentieel om significant te interageren met experimentele manipulaties om de validiteit van beoordeelde AUD-achtige gedragsuitkomsten te beperken.

Nieuwe, volledig geautomatiseerde huiskooimonitoringsystemen, zoals het IntelliCage-testsysteem (TSE Systems 23,24,25) of open-source alternatieven LIQ PARTI 20 en FARESHARE26, lossen dit probleem op door lickometry te combineren met radiofrequentie-identificatie (RFID) tracking van meerdere, in groepen gehuisveste dieren. Deze systemen voor het monitoren van thuiskooien maken efficiëntere en reproduceerbare kwantificering van alcoholdrinkgedrag mogelijk, zonder de verwarringen van stress veroorzaakt door sociale isolatie. Ze zijn daarom ideaal voor high-throughput, bevestigende studies van experimentele manipulaties die de kwetsbaarheid voor AUD-achtig gedrag beïnvloeden. Hiervan is het IntelliCage-testsysteem uniek doordat het programmeerbare, operante hoeken bevat om toegang tot sipperflesjes te beveiligen, waardoor onderzoekers zoekgedrag kunnen beoordelen bij afwezigheid van drugstoegang, operante verhoudingen voor individuele dieren kunnen moduleren en meer.

Hier presenteren de auteurs een operant paradigma van intermitterend alcoholgebruik, uitgevoerd via het IntelliCage-testsysteem onder sociaal gehuisveste muizen27,28. Dit paradigma maakt de langetermijn, geautomatiseerde beoordeling van alcoholgebruik mogelijk bij maximaal 16 muizen van hetzelfde geslacht, elk uniek geïdentificeerd door subcutane RFID-transponders. Zoals hieronder beschreven, worden muizen getraind om operant met de neus te prikken op een vaste ratio (FR)-3 om toegang te krijgen tot sipperflessen. Na een korte trainingsperiode worden de sipperflessen in twee van de vier open hoeken vervangen door 20% alcohol (95% ethanol [190 proof] in kraanwater, v/v). Muizen hebben continu toegang tot water, maar af en toe toegang tot alcohol om de dag gedurende 24 uur (12:30 tot 12:30 uur). Alcohollikken worden gekwantificeerd over een periode van zes weken, met halverwege het experiment een tweedaagse kinine-vervalsingstest (0,5 mM, 1,0 mM) om het alcoholgebruik zonder straf te beoordelen. Bezoek-, nosepoke- en lick-gegevens worden voor elke muis vastgelegd (Figuur 1), geëxtraheerd met TSE's eigen software en vervolgens geanalyseerd met de open-source pipeline29 om inzicht te krijgen in AUD-achtige gedragingen.

Dit protocol vult andere gepubliceerde toepassingen van het IntelliCage-testsysteem aan om AUD-achtig gedrag te beoordelen 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, evenals ander gedragswijzen dat lijkt op middelengebruikstoornis.. In overeenstemming met rapporten die suggereren dat intermitterende toegangsschema's het vrijwillige alcoholgebruik bij knaagdieren verhogen 1,43,44,45,46,47, levert dit protocol bij de meeste muizen hoge niveaus van vrijwillige alcoholconsumptie op. Desalniettemin kunnen experimentele parameters, zoals de auteurs door het hele protocol aangeven, eenvoudig worden aangepast om experimentele vragen te beantwoorden. Al met al biedt deze methodologie een efficiënte en flexibele oplossing voor onderzoekers om de mechanismen achter AUD te bestuderen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Volledig geautomatiseerde tracking van muisbezoeken, neusprikken en likken via unieke RFID-identificatie. (A) Cartoondiagram van de implantatie van een muis RFID-transponder. RFID-transponders worden subcutaan geïmplanteerd in het dorsocervicale gebied om individuele tracking mogelijk te maken in een geautomatiseerd homecage monitoringsysteem. (B) Schema van de dataverzamelingsfasen tijdens het geautomatiseerde, operante intermitterende alcoholparadigma. De identiteit van het dier wordt gelezen en een hoekbezoek wordt geregistreerd via dubbele RFID-ringantenne en temperatuursensormetingen, die beide positief moeten zijn om een bezoek te registreren (links). Daarna worden muizen getraind om op een FR-3 schema te neusprikken om toegang te krijgen tot sipperflessen (in het midden). Succesvol neusprikken levert 5 seconden sipperfles toegang op, waarna muislikken worden geregistreerd via een op capaciteit gebaseerde lickometer (rechts). Cartoons gemaakt van aangepaste BioRender-sjablonen door Lucy Anderson, gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het NIH Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en voldeden aan het beleid van de Public Health Service inzake humane zorg en gebruik van proefdieren.

1. Het voorbereiden van het apparaat

OPMERKING: Elk IntelliCage-testsysteem bestaat uit een grote plastic huiskooi (39 cm x 58 cm x 21 cm) waarin tot 16 muizen van hetzelfde geslacht kunnen verblijven. De vorige cohorten varieerden in grootte van 8–16 muizen per kooi. Het apparaat is uitgerust met vier openbare hoeken, die allemaal zijn aangesloten op een centrale microprocessor op het bovenste deksel. Knaagdiervoer is toegankelijk via een grote metalen trechter in het midden van het deksel. Binnen de kooi lopen muizen vrij tussen openstaande hoeken en een centrale leefruimte, die is uitgerust met beddengoed en verrijkingsmaterialen. Elke operante hoek heeft een kleine ronde ingang die fysiek slechts één muis tegelijk toelaat. De identiteit van de muis wordt gelezen en geregistreerd op basis van dubbele RFID-ringantenne en temperatuursensormetingen, die beide positief moeten zijn om een bezoek te kunnen registreren. In elke opstaande hoek krijgen muizen twee neussteekpoorten, die elk de toegang tot een van de twee gemotoriseerde deuren regelen. Deze programmeerbare, gemotoriseerde deuren bieden toegang tot een van de twee sipperflessen. Onderzoekers programmeren handmatig de voorwaarden voor toegang tot de sipper bottle, evenals de gevoeligheid van de op capaciteit gebaseerde lickometers. Bezoek-, neuspoke- en lickgegevens worden individueel voor elke muis geregistreerd en via een centrale microprocessor naar een computer getransponeerd waarop het propriëtaire softwaresysteem van TSE wordt geladen. Hoewel dit in dit protocol niet besproken zal worden, bevat elke operante kamer ook een programmeerbare luchtpuffventiel voor gebruik bij aversieve conditionering.

  1. Rust een plastic woonkooi uit met vijf samengeperste katoenvezelpads (15,24 x 25,4 cm), twee kleine katoenen vierkantjes (5,08 x 5,08 cm) en vier plastic graafstructuren voor beddengoed en verrijking.
    OPMERKING: Het gebruik van samengeperste katoenvezelpads wordt om twee redenen aanbevolen: (1) om te voorkomen dat mogelijk stof of schilfers van veelgebruikt beddengoed de deurmechaniek verstoren, en (2) om gevechten tussen dieren gemakkelijker te kunnen identificeren.
  2. Plaats het bovenste deksel met openstaande hoeken in de plastic kooi van huis.
  3. Als deze is losgekoppeld, verbind je alle operante hoeken met de centrale microprocessor met de meegeleverde kabels en verbind je vervolgens de centrale microprocessor met een computer die vooraf is uitgerust met TSE-software via CAN-kabels.
    1. Als je meerdere apparaten gebruikt, sluit je alle kooien seriematig aan op dezelfde computer.
  4. Sluit de microprocessor aan op de stroombron en zorg ervoor dat de LED-lampjes in elke hoek aangaan en dat alle acht gemotoriseerde deuren bewegen.
  5. Vul acht sipperflessen met ~250 ml kraanwater (of andere vloeistof) elk, druk stevig op de doppen om een goede afsluiting te garanderen, en draai dan voorzichtig in de likkometeropeningen om een strakke verbinding met de likkometer te garanderen.
    OPMERKING: De gevoeligheid van visite-, nosepoke- en lick-sensoren kan optioneel worden geoptimaliseerd via een pilotexperiment. Om de gevoeligheid van elke hoek aan te passen, volg je de instructies van de fabrikant die in het "Help"-bestand van het "Controller"-programma staan. Alle studies hebben de volgende instellingen gebruikt: visit- 816 AAN/768 UIT; nosepoke- 21 AAN/26 UIT; lickometer- 69 AAN/80 UIT/15 time-out.
  6. Vul de voedselbak met knaagdieretjes.
  7. Zet de computer aan, open de applicatie "Controller" en laad het gewenste experimentbestand.

2. Dieren voorbereiden

OPMERKING: Dieren moeten minstens één week voor het begin van gedragstesten voorzien worden van RFID-transponders om voldoende hersteltijd te garanderen. Gebruik muizen die minstens ~50 dagen oud zijn, met een lichaamsgewicht van meer dan 15 g. Het implanteren van kleinere muizen vergroot het risico dat de muis tijdens de injectie verwondt. Afhankelijk van de muislijn kan agressiviteit een probleem worden in groepshuisomstandigheden, vooral bij mannetjes. Beperk dit risico door alle muizen samen te houden tijdens de adolescentie. De auteurs observeerden geen significante agressie in studies met volwassen (~PND 80–150) wildtype C57BL/6 muizen, maar dit garandeert niet de generaliseerbaarheid van dit protocol naar andere genotypen, leeftijden of huisvestingsindelingen.

  1. Subcutaan implanteren muizen met RFID-transponders in het dorsocervicale gebied voor unieke identificatie.
    1. Print een datatabel uit met alle proefdieren en een plek naast elke dier-ID om een barcodesticker te plaatsen met hun RFID-code.
    2. Verzamel alle dieren en benodigde benodigdheden: RFID-transponders, herlaadbare RFID-transponderinjector en isoflurane inductie-installatie.
    3. Plaats de eerste muis in de inductiekamer en doof met verdampte isofluraan (zuurstofflowmeter: 1,5 mL/min, isofluran: 1,5–3,5%) totdat de muis grote, hikkende ademhalingen neemt en niet reageert op een knijp in de teen.
      1. Terwijl je wacht tot de muis verdoofd is, laad je de RFID-transponder op de injector door de voorgeladen naald op de injectorbasis te schroeven en vervolgens langzaam de spuit uit te werpen totdat men de microchip ziet bewegen.
      2. Pas de barcode die de RFID-code identificeert toe op de geprinte datatabel naast de juiste dier-ID.
    4. Verwijder de muis uit de inductiekamer en implanteer de voorgeladen RFID-transponder subcutaan in het dorsocervicale gebied.
      1. Nadat je eerst hebt gecontroleerd of de muis niet reageert op een knellen in de teen, gebruik je de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand om het stoppelvel van de muis direct boven de schouderbladen te knijpen.
      2. Met de dominante hand steek je de injectornaald subcutaan in het achterste uiteinde van de nekvel van de muis, waarbij je ervoor zorgt dat de naald boven en parallel aan de wervelkolom wordt geheven om verwondingen te voorkomen.
      3. Met de spuittip in de stoppel van de muis en stevig gestabiliseerd tussen duim en wijsvinger, beweeg voorzichtig de dominante hand zodat iemand de injectorzuiger kan indrukken.
      4. Werp de RFID-transponder uit, waarbij je de vingers van de niet-dominante hand stevig om de stoppels klemt zodat je kunt voelen wanneer de microchip uit de spuittip is gekomen.
      5. Terwijl je de stoppels stevig vasthoudt, verwijder je langzaam de injector. Laat de stoppel pas los als de injector volledig is verwijderd om te voorkomen dat de transponder eruit valt.
        OPMERKING: Optioneel kan een enkele hechtknoop worden toegevoegd om de huid te sluiten terwijl de muis onder narcose is.
    5. Breng de muis terug naar zijn thuiskooi en monitor het herstel van de narcose totdat hij volledig loopbaar is.
    6. Houd de muis in de gaten op tekenen van lichamelijke beperking, waaronder gedeeltelijke verlamming, mank lopen of cirkelen, die kunnen wijzen op een off-target injectie. Als de beperkingen langer dan 24 uur aanhouden of het welzijn van dieren ernstig beïnvloeden, laat deze op humane wijze inslapen.
      1. Richt de RFID-transponderlezer boven het dorsocervicale gebied van de muis en scan om een succesvolle plaatsing te bevestigen.
    7. Eventueel neem je een weefselmonster voor genotypering.
      1. Herhaal dit met alle experimentele muizen.
  2. Eén dag na de eerste implantatie van de RFID-transponder gebruik je de RFID-transponderlezer om te controleren of geen muizen hun RFID-transponder zijn kwijtgeraakt. Als muizen hun transponder zijn kwijtgeraakt, herhaal dan de procedure met een nieuwe transponder en werk je de records dienovereenkomstig bij.
    OPMERKING: Meestal gebeurt dat binnen 24 uur na implantatie als een muis zijn RFID-transponder eruit valt. Dit kan gebeuren door onjuiste plaatsing van RFID-transponders en/of door het verzorgen of krabben van de muis op de injectieplaats. Vermijd opnieuw injecteren in eerdere injectiewonden en sluit muizen uit na drie mislukte RFID-transponderimplantaties.
  3. Controleer voordat u muizen in het IntelliCage-apparaat herplaatst of alle RFID-transponders succesvol kunnen worden gelezen. Weeg en registreer het lichaamsgewicht van alle muizen.

3. Het voorbereiden van experimentele bestanden

OPMERKING: Het IntelliCage-testsysteem wordt bestuurd en bediend via grafische gebruikersinterfaces die door TSE worden geleverd. Er zijn drie applicaties die worden gebruikt om IntelliCage-experimenten uit te voeren: "Designer", "Controller" en "Analyzer." Verschillende fasen van het experiment worden uitgevoerd via verschillende experimentbestanden, die zijn ontworpen in de "Designer"-applicatie en vervolgens worden uitgevoerd in de "Controller"-applicatie. Gedetailleerde informatie over hoe experimentbestanden te ontwerpen en aan te passen is eerder beschrevenin 48,49. Sjablonen van de vier experimentbestanden die in de studie zijn gebruikt (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment) zijn verstrekt om protocolreplicatie te ondersteunen. In deze bestanden vinden faseveranderingen plaats om 12:30 uur. De auteurs kozen deze timing omdat dieren werden gehuisvest op een lichtcyclus van 6:00 tot 18:00 uur. Dit maakte een ononderbroken donkere fase mogelijk om drinkgedrag te meten. Onderzoekers kunnen echter deze timing willen aanpassen om in overeenstemming te zijn met andere alcoholdrinkmethoden, zoals "drinking in the dark" procedures50.

  1. Stel experimentbestanden in in de applicatie "Designer".
    OPMERKING: Als je met de sjabloonbestanden werkt, verwijder dan de vier voorbeelddieren voordat je de huidige cohort invoert. Hernoem ook de groepsnamen naar het experimentele ontwerp en voeg groepen toe waar nodig. Zorg ervoor dat de nieuwe groepen allemaal beginnen met hetzelfde cluster als die in de template.
    1. Open het bestand Habituation.experiment in de "Designer"-applicatie en voer zorgvuldig de dier-ID, RFID-transpondercode en experimentele groep/genotype voor elke muis in. Sla het bestand op met een nieuwe naam om het sjabloonbestand te behouden.
      OPMERKING: Als RFID-transpondercodes verkeerd worden getypt, worden gegevens niet geregistreerd. Het toewijzen van dieren aan relevante experimentele groepen helpt bij het monitoren van hun gedrag en uiteindelijk het analyseren van de gegevens.
    2. Exporteer de dierinformatie als een dierenbestand.
    3. Voor elke fase van het experiment opent u het bijbehorende experimentbestand en laadt u het dierenbestand. Sla op en geef de juiste naam.
    4. Als je bestanden op een aparte computer ontwerpt, download dan experimentbestanden op een draagbare usb-stick voor transport naar de gedragsruimte.
  2. Download alle experimentbestanden op de computer die is aangesloten op de IntelliCage-apparatuur(s) en open het eerste bestand in de "Controller"-applicatie. Controleer of alle informatie correct geladen wordt.
  3. Maakt op papier of elektronisch een experimenteel logbestand aan waarin men de datum en tijd noteert waarop men verschillende fasen van het experiment kan starten/stoppen. Dit zal de analyse aanzienlijk vergemakkelijken, aangezien bepaalde drugsaandoeningen (zoals kinine-vervalste alcohol) niet worden vastgelegd in de IntelliCage-archiefdossiers.

figure-protocol-1
Figuur 2: Experimentele tijdlijn voor het paradigma van operant, intermitterend alcoholgebruik. (A) Schema van het IntelliCage-apparaat met alcoholhoudende sipperflessen in twee van de vier hoeken. (B) Experimentele tijdlijn die het schema van alle experimentele fasen weergeeft, zoals gebruikt in de vorige publicatie23. Cohort 1 voerde een kinine-vervalste alcoholtest uit nadat het stopzetten met intermitterend alcoholdrinken, terwijl cohorten 2 en 3 na vervalsing weer intermitterend alcoholgebruik gingen gebruiken. (C) Gedetailleerde experimentele kalender met softwarewijzigingen voor alle experimentele fasen: habituatie, watertraining, intermitterend alcoholdrinken, kinine-vervalste alcoholtest en "open bar"/free access alcoholdrinken. Kooiwisselingen worden minstens één keer per week gepland na het voltooien van een "Alcohol Access ON"-module. Cartoons gemaakt van aangepaste BioRender-sjablonen door Lucy Anderson, gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Het uitvoeren van het experiment

OPMERKING: Het paradigma van operant, intermittent alcoholdrinken bestaat uit vijf fasen: (1) habituatie, (2) watertraining, (3) intermitterend alcoholdrinken, (4) kinine-vervalste alcoholtest, en (5) "open bar"/free access alcoholdrinken. Elke fase van het experiment wordt uitgevoerd op verschillende experimentbestanden, behalve voor intermittent alcoholdrinken en de kinine-vervalste alcoholtest, die beide de parameters gebruiken die zijn gespecificeerd in het Intermittent Alcohol.experiment-bestand . Buiten kooiwisselingen moeten onderzoekers minstens drie keer per week bij muizen controleren om het welzijn van dieren te beoordelen en te controleren of de software goed werkt. Muizen die gewond of ziek zijn, moeten uit het experiment worden verwijderd. Voor een voorbeeld van een experimenteel schema, zie Figuur 2.

  1. Kooiwisselingen
    OPMERKING: Voer minstens één keer per week kooiwisselingen uit. Tijdens alcoholgebruik kun je deze veranderingen pas na 12:30 uur uitvoeren tijdens "Water Access ONLY" om te voorkomen dat je het alcoholdrinken onderbreekt. Om dit te faciliteren, beginnen de Intermittent Alcohol.experiment - en Open Bar.experiment-bestanden altijd met "Water Access ONLY." Door de grootte van de kooien is het moeilijk om alleen bezette kooien te hanteren. De auteurs raden aan om ten minste één extra onderzoeker te laten helpen bij kooiwisselingen. Controleer de muizen 24 uur na elke kooiwissel om te controleren of de software correct draait en dat er geen agressie of gevechten is geweest als reactie op de stress van de kooiwissel.
    1. Bereid voordat je begint met het verwisselen van een kooi een nieuwe, schone plastic kooi met nieuw beddengoed en nestmateriaal. Vul elk van de acht sipperflessen/kooi met ~250 mL kraanwater of 20% alcohol (95% ethanol [190 proof] in kraanwater, v/v).
      OPMERKING: Onderzoekers kunnen optioneel een kleine hoeveelheid van het oude beddengoed toevoegen aan de nieuwe, schone kooi. Dit minimaliseert verstoring van gevestigde groepshiërarchieën en kan het risico op ruzie verlagen.
    2. Stop experiment in de applicatie "Controller". Nadat je hebt gecontroleerd of er geen muizen in de open hoeken zitten, verwijder je de metalen voedselhopper. Laat één persoon het metalen microprocessorapparaat hoog genoeg optillen zodat de tweede persoon de plastic kooi eronder vandaan kan schuiven. Controleer het juiste aantal muizen.
    3. Haal muizen één voor één uit de vieze kooi, scan de RFID-transponder en registreer het lichaamsgewicht. Onderzoek elke muis visueel op tekenen van letsel of ziekte.
      OPMERKING: De auteurs raden aan om het lichaamsgewicht op te nemen in een elektronisch spreadsheet (csv), zodat het gemakkelijk in de analysepijplijn kan worden gelezen.
    4. Plaats muizen tijdelijk in een schone opslagcontainer nadat je het lichaamsgewicht hebt geregistreerd.
    5. Maak het bovenste deel en de hoeken schoon met een natte handdoek die in desinfectiemiddel is gedrenkt. Let er goed op om het oppervlak en de onderrand van de hoekplaat schoon te maken, zonder dat er vloeistof op de elektronische onderdelen lekt.
    6. Til het metalen microprocessorapparaat hoog genoeg om de nieuwe, schone plastic kooi op zijn plaats te schuiven.
    7. Draai voorzichtig nieuwe sipperflessen in de lickometeropeningen, zodat je strakke verbinding met de lickometer hebt.
    8. Zet muizen over in een nieuw, schoon apparaat.
    9. Vervang de voedselhopper door een nieuwe, schone voedselhopper en verse knaagdierenvoedsel.
    10. Start hetzelfde experiment opnieuw in de "Controller"-applicatie of laad en start een nieuw experimentbestand.
    11. Zorg ervoor dat het programma goed draait en dat alle muizen bezoeken, neusprikken en likken correct worden geregistreerd.
      OPMERKING: Het programma "Controller" geeft automatisch waarschuwingen wanneer een dier binnen een periode van 12 uur geen geregistreerde likken heeft.
    12. Maak vuile apparatuur schoon. Plastic kooien, sipperflessen en plastic graafconstructies kunnen over het algemeen worden gewassen via typische kooiwassystemen.
  2. Dag 0: Habituatie
    OPMERKING: De habituatiefase wordt uitgevoerd met het bestand Habituation.experiment . Tijdens deze fase bevatten alle sipper flessen kraanwater. Muizen hebben gratis toegang tot alle flessen zonder operante neusprikken. Gemotoriseerde deuren gaan open wanneer muizen een open hoek binnenkomen, waardoor toegang tot de sipperfles-mondstukken onthuld worden.
    1. Na het verifiëren van de aanwezigheid van RFID-transponders en het registreren van het lichaamsgewicht van de muis, vul je alle acht sipperflessen met ~250 mL kraanwater en draai je voorzichtig in de lickometeropeningen.
    2. Plaats tot 16 muizen van hetzelfde geslacht in het voorbereide IntelliCage-apparaat.
    3. Laad het bestand Habituation.experiment in de "Controller"-applicatie en begin met opnemen.
    4. Controleer of alle gemotoriseerde deuren correct opengaan wanneer een muis de openstaande hoek binnenkomt en dat alle bezoeken, neusprikken en likken succesvol worden geregistreerd voor elke muis. Als er binnen een periode van 6 uur geen bezoeken, neusprikken of likken zijn geregistreerd bij een muis, controleer dan het .animal-bestand op fouten.
  3. Dag 1-3: Watertraining
    OPMERKING: De watertrainingsfase wordt uitgevoerd met het Water Training.experiment-bestand . Alle sipperflessen moeten alleen kraanwater bevatten. In deze fase trainen muizen om op een FR-1 te neuspoken en vervolgens op een FR-3-schema toegang te krijgen tot de sipper bottle nozzles. Na succesvol neusprikken gaan gemotoriseerde deuren open om 5 seconden toegang te geven tot de sipperfles. Zodra een individuele muis een succespercentage van 60% of hoger bereikt, wordt hij voor de rest van het programma overgeplaatst naar een FR-3 schema. Meestal schakelen muizen binnen 24–72 uur over op een FR-3 schema. Monitor de prestaties van de dieren in de "Controller." Als een dier niet binnen 72 uur een FR-3 schema haalt, sluit het dan uit van verdere experimenten.
    1. Als alle muizen er gehydrateerd en ongedeerd uitzien na 24 uur gewenning, stop dan met het draaien van het Habitatuation.experiment-bestand en begin met het Water Training.experiment-bestand .
    2. Controleer of bezoeken, neusprikken en likken succesvol worden geregistreerd door de software van elke muis en dat alle gemotoriseerde deuren correct openen.
  4. Dag 4+: Af en toe alcoholgebruik
    OPMERKING: De fase van intermittent alcoholdrinken wordt uitgevoerd met behulp van het Intermittent Alcohol.experiment-bestand . In deze fase worden sipperflessen in twee van de vier openstaande hoeken vervangen door 20% alcohol. Water- versus alcoholhoeken zijn vooraf gespecificeerd via de functie "Clusters" in het experimentbestand. In het sjabloon wordt water geleverd in hoeken één en drie (aangeduid als "neutraal") terwijl alcohol in hoeken twee en vier (aangeduid als "onjuist") staat. Muizen hebben continu toegang tot water, maar af en toe toegang tot alcohol gedurende 24-uurs periodes (12:30 tot 12:30 uur) om de dag. 5 s sipper bottle access is beschikbaar op een FR-3 voor alle hoeken. Tijdens deze fase van het experiment voert u kooiwisselingen uit tijdens "Water Access ONLY"-periodes om alcoholgebruik te voorkomen. Onderzoekers moeten ervoor zorgen dat experimentele groepen ongeveer gelijke voorkeur tonen voor alle vier de hoeken tijdens watertraining voordat ze alcoholhoeken toewijzen voor intermitterend alcoholdrinken. In elk van de cohorten vertoonden experimentele groepen ongeveer gelijke bezoeken en likken over alle vier de hoeken tijdens de watertraining. Om deze reden hielden de auteurs hoekopdrachten vast over cohorten heen. Onderzoekers kunnen eenvoudig de verhouding licks en bezoeken over hoeken bekijken via het programma "Controller". Zorg ervoor dat je bezoek- en likgegevens regelmatig gedurende het experiment monitort om te voorkomen dat er problemen ontstaan (bijvoorbeeld apparatuurstoringen of muizen die bepaalde hoeken "bezetten").
    1. Nadat alle muizen met succes een FR-3-schema hebben behaald om toegang te krijgen tot sipperflessen, bereid je 20% alcohol voor (95% ethanol [190 proof] in kraanwater, v/v; ~250 mL/fles).
    2. Stop met het Water Training.experiment-bestand draaien.
    3. Verwijder sipperflessen in de operante hoek twee en vier (of de hoeken die je in het experimentbestand hebt gespecificeerd, als ze verschillen) en vervang elke door ~250 mL 20% alcohol.
    4. Draai voorzichtig nieuwe alcoholhoudende drinkflessen in de likkometeropeningen, zodat je strakke verbinding met de likkometer hebt.
    5. Laad het bestand Intermittent Alcohol.experiment en begin met opnemen.
    6. Controleer of bezoeken, neusprikken en likken succesvol worden geregistreerd door de software van elke muis en dat alle gemotoriseerde deuren correct openen.
    7. Controleer na 12:30 uur de volgende dag of het programma succesvol is overgeschakeld van de "Water Access ONLY" naar de "Alcohol Access ON" module en dat er likken zijn geregistreerd in de operante hoeken met alcohol.
  5. Dag 16+: Chinine vervalste alcoholtest
    OPMERKING: De test voor kinine-vervalsing van alcohol wordt uitgevoerd met behulp van het Intermittent Alcohol.experiment-bestand. In deze fase worden de sipperflessen in twee operante hoeken die voorheen 20% alcohol bevatten, vervangen door 0,5 mM, en vervolgens door 1 mM kinine, vervalst 20% alcohol om strafongevoelig drinken te beoordelen. Deze kinineconcentraties, die respectievelijk 0,016% en 0,032% kinine (w/v) overkomen, bleken eerder aversief te zijn in tests uitgevoerd door groep27,28 en andere31 Muizen hebben continue toegang tot water, maar af en toe toegang tot kininevervalste alcohol gedurende 24 uur om de dag (d.w.z. één dag 0,5 mM kinine, één dag alleen watertoegang), één dag van 1,0 mM kinine). Toegang wordt verzorgd volgens een FR-3 schema voor alle hoeken. In deze studie voerden muizen deze fase van de taak uit na 16 of 24 opeenvolgende dagen van onvervalst intermitterend alcoholgebruik. Kooiwisselingen werden niet op de dag tussen de vervalsingstests door op het water uitgevoerd om stressverstorende effecten te voorkomen. Na deze fase van het experiment kunnen muizen beginnen met "open bar"/gratis alcoholdrinken, of terugkeren naar intermitterend drinken om terugkerend drinken na vervalsing te beoordelen.
    1. Maak 0,5 mM en 1 mM kininevervuilde 20% alcohol (95% ethanol [190 proof] in kraanwater, v/v; ~250 mL/fles).
    2. Voer een kooiwissel uit en verwijder alle sipperflessen.
    3. Vul elke slurfles in alcoholhoeken met ~250 mL 0,5 mM kinine-vervuilde 20% alcoholoplossing.
    4. Draai voorzichtig nieuwe alcoholhoudende drinkflessen in de likkometeropeningen, zodat je strakke verbinding met de likkometer hebt.
    5. Laad het bestand Intermittent Alcohol.experiment en begin met opnemen.
    6. Controleer of bezoeken, neusprikken en likken succesvol worden geregistreerd door de software van elke muis en dat alle gemotoriseerde deuren correct openen.
    7. Controleer na 12:30 uur of het programma succesvol is overgeschakeld van de module "Water Access ONLY" naar de "Alcohol Access ON" en dat er likken zijn geregistreerd in de openstaande hoeken met alcohol.
    8. Vervang vóór 12:30 uur op de volgende alcoholdag elke fles in de alcoholhoek door ~250 mL 1 mM kinine-vervalste 20% alcoholoplossing. Er is geen noodzaak om het experiment voor de fleswissel te stoppen.
    9. Verwijder voor 12:30 uur op de volgende alcoholdag de sipperflessen met vervalste alcohol en vervang elke flessen met ~250 mL onvervalste 20% alcohol.
  6. Dag 20+: "Open bar"/gratis toegang tot alcoholgebruik
    OPMERKING: Men kan optioneel één dag "open bar"/gratis alcoholgebruik gebruiken als niet-operante controle. Deze fase wordt uitgevoerd met het bestand Open Bar.experiment . In deze fase bevatten sipperflessen in twee van de vier openstaande hoeken 20% alcohol, waar muizen gedurende één periode van 24 uur toegang toe hebben (12:30 tot 12:30 uur). Een bezoek aan de hoek opent de deuren zonder dat er neusprikken nodig zijn. In deze studie voerden muizen deze fase van de taak uit na de fase van intermitterend alcoholgebruik of kinine-vervalste alcoholtest.
    1. Bereid indien nodig 20% alcohol (95% ethanol [190 proof] in kraanwater, v/v; ~250 mL/fles).
    2. Stop voor 12:30 uur op de volgende alcoholische dag met het draaien van het huidige experimentbestand.
    3. Verwijder indien nodig sipperflessen in alcoholhoeken en vervang elke flessen door ~250 mL 20% alcohol.
    4. Draai voorzichtig nieuwe alcoholhoudende drinkflessen in de likkometeropeningen, zodat je strakke verbinding met de likkometer hebt.
    5. Laad het Open Bar.experiment-bestand en begin met opnemen.
    6. Controleer of bezoeken, neusprikken en likken succesvol worden geregistreerd door de software van elke muis en dat alle gemotoriseerde deuren vrij open zijn.
    7. Controleer na 12:30 uur of het programma succesvol is overgeschakeld van de module "Water Access ONLY" naar de "Alcohol Access ON" en dat er likken zijn geregistreerd in de openstaande hoeken met alcohol.

5. Gegevens analyseren

OPMERKING: De gegevens van elk experiment worden intern opgeslagen totdat het programma wordt gestopt. Op dat moment wordt een gezipt data-archief gemaakt en opgeslagen op de lokale harde schijf in C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. De bestandsnaam bestaat uit de datum en het moment waarop het programma is gestart en eindigt op .zip.  De data-archiefbestanden bevatten alle relevante informatie over het experiment, inclusief hoekbezoeken (starttijd, eindtijd, duur, bezoekvolgorde), nosepokes (starttijd, eindtijd, duur), licks (starttijd, eindtijd, duur), lichte en donkere tijden en temperatuurgegevens. Dit dataarchief kan worden gelezen en geanalyseerd met het programma "Analyzer". Hoewel er andere open-source pakketten bestaan voor het analyseren van IntelliCage-gegevensuitvoer (Ruffini et al., 2021; Gastaldi et al., 2025), creëerden de auteurs een data-analysepijplijn in R met behulp van publiek beschikbare pakketten uit het tidyverse om data uit het paradigma van intermitterend alcoholgebruik te analyseren. De pijplijn omvat meerdere kwaliteitscontrolestappen, waaronder analyse van hoekbezetting per muis; gemiddelde bezoek, neusprikken en likfrequentie over het circadiane ritme; FR-3 lick acquisitiesnelheid per muis; en dagelijkse liktellingen per muis. Daarnaast geven de auteurs basisanalyses van alcoholdrinkmaten in scripts. De basis is een R-notitieboeksjabloonbestand dat de Quarto-opmaaktaal gebruikt, de databestanden verwerkt en kan worden aangepast voor variaties die specifiek zijn voor diergroepen. De analyse wordt gedaan met de gratis versie van RStudio. Een projectsjabloonbestand voor R bevindt zich in de GitHub-repository29.

  1. Compileer alle gegevens, inclusief zip-bestanden die door de "Controller"-applicatie worden uitgevoerd en het CSV-bestand met gegevens over het gewicht van de muis.
    OPMERKING: De gewichten moeten de inname normaliseren op basis van lichaamsgewicht. In deze workflow was het logischer om de gewichtsgegevens in een apart bestand te verzamelen dan om deze aan elk experimentbestand toe te voegen. De eerste kolom moet overeenkomen met de Animal ID uit de archiefbestanden.
  2. Download de R-projecttemplate van de GitHub-repository.
    1. Hernoem het project zodat het overeenkomt met het experiment.
    2. De template wordt geleverd met voorbeeldgegevensbestanden om te illustreren hoe de analyse werkt, gelegen in de data/C1-submap. Vervang de archiefbestanden door gepersonaliseerde data-archieven.
  3. Start RStudio en open het project.
    1. In het bestandengedeelte van het venster rechtsonder in RStudio navigeert u naar de qmd-map en opent u het IC_template.qmd-bestand.
    2. Dupliceer het sjabloonbestand en hernoem het om bij het experiment te passen.
    3. Pas de metadata aan in het YAML-headergedeelte van het gedupliceerde bestand en het initiële codechunk.
    4. Pas de groepsnamen in het IC_Commons.R-bestand in de R-map aan om overeen te komen met de experimentele groepen. (Het sjabloon gebruikt twee groepen: Control en LBN.)
  4. Voer het notitieboekbestand uit.
    OPMERKING: Meer gedetailleerde instructies worden gegeven bij de README.md bestanden in de GitHub-repository.

figure-protocol-2
Figuur 3: Vergelijkbare toegang tot operante hoeken bij alle muizen tijdens trainings- en intermitterende alcoholdrinkfasen. Bij cohort één muizen23, een heatmap die de totale tijd toont die per dag per muis in elke hoek wordt doorgebracht tijdens (A) habituatie en watertraining versus (B) de eerste vier dagen intermitterend alcoholgebruik (n = 15 F, 16 M). Donkere rode kleuren geven meer tijd in de hoek per dag aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 4: Muizen doen bezoeken, neusprikken en likken die in overeenstemming zijn met het circadiane ritme en verkrijgen met succes toegang tot de sipperfles volgens een FR-3 schema. Bij cohort één muizen23 was de gemiddelde dichtheid van operante hoekbezoeken (A), (B) neusprikken en (C) likken gedurende de sessietijd gedurende de eerste acht testdagen. (D) Tijd totdat elke muis succesvol een FR-3-verhouding likt tijdens watertraining. (E) Bezoeksuccespercentage (= % van de bezoeken die resulteren in lik/totaal aantal bezoeken) onder muizen tijdens habituatie en watertraining (links) versus de eerste vier dagen van intermitterend alcoholgebruik (rechts). Cirkelsymbolen duiden vrouwelijke vrouwen aan (n = 15); Vierkante symbolen duiden mannen aan (n = 16). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 5: Muizen hebben vergelijkbare dagelijkse likpercentages tijdens trainings- en intermitterende alcoholdrinkfasen. Onder (A) vrouwelijke (n = 15) en (B) mannelijke (n = 16) cohort één muizen23, het totale aantal dagelijkse water- (blauw) en alcohollikken (rood) tijdens habituatie en watertraining (dag -4–0) versus intermitterend alcoholgebruik (dag 1–4). C staat voor controle-opvoeden; L staat voor LBN-opvoeding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Figuur 6: Muizen die in de vroege levensfase zijn blootgesteld, drinken meer alcohol dan controles in het operante, intermitterende alcoholdrinkparadigma. (A) Gemiddelde alcohollikken per dag, genormaliseerd door lichaamsgewicht (g; wekelijks gemeten) gedurende 8 dagen van intermitterende alcoholtoegang tussen controlemuizen (grijs; links) en LBN-grootgebrachte (roze; rechts) muizen. (B) Gemiddelde alcohollikken per dag genormaliseerd door het lichaamsgewicht vóór, tijdens en na kininevervalsing (0,5 mM, 1 mM). (C) Dichtheidsplot dat gemiddelde alcohollikken per dag toont, genormaliseerd door lichaamsgewicht tijdens één FR-0 "Open Bar" alcoholtoegangsdag. Cirkelsymbolen duiden vrouwelijke vrouwen aan (n = 15); Vierkante symbolen duiden mannen aan (n = 16). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De auteurs gebruikten geautomatiseerd homecage-testen via IntelliCages om te beoordelen hoe vroege levensproblemen (ELA) de kwetsbaarheid voor AUD-achtig gedrag veranderen27. Om tegenspoed te veroorzaken, gebruikten ze het paradigma van beperkte bedden en nesten (LBN), een model van middelenschaarste dat onvoorspelbare en gefragmenteerde moederzorginduceert 51,52,53,54,55,56. De studie was nieuw in het beoordelen van de effecten van ELA op alcoholgebruik bij sociaal gehuisveste muizen, zonder de verstorende effecten van stress veroorzaakt door sociale isolatie. Dit was belangrijk omdat sociale isolatie op volwassen leeftijd bekend staat om een verschillend effect te hebben op muizen die aan ELAblootgesteld zijn. Om maximale doorvoer te bereiken, maten de auteurs gelijktijdig alcoholgebruik in vier IntelliCage-apparaten, twee voor elk geslacht.

De auteurs begonnen de analysepijplijn door grondige kwaliteitscontrole van de ruwe data uit te voeren. De hier opgenomen grafieken tonen representatieve gegevens van cohort één (n = 15 F, 16 M) van de gepubliceerde studie23. Scripts voor alle analyse en plotten zijn opgenomen in de GitHub-repository29. Experimentele dag 0 is uitgesloten vanwege een kooiwijziging, die de gegevensverzameling verstoorde. Onder de overwegingen voor data-exploratie en kwaliteitscontrole zorgden de auteurs ervoor dat alle muizen ongeveer gelijke toegang hadden tot alle operante hoeken tijdens zowel de training (Figuur 3A) als de periodieke alcoholdrinkfasen (Figuur 3B). Dit sluit significante effecten uit van muizen die de operante hoeken "bezitten", waardoor andere muizen geen toegang krijgen tot de sipper bottles. De auteurs bevestigden vervolgens dat muizen bezoeken, neusprikken en likken uitvoerden in een verwacht circadiaans ritme over experimentele dagen (Figuur 4A–C) en dat alle muizen binnen zes uur na de start van de module succesvol de eerste likkage uitvoerden op een FR-3-verhouding (Figuur 4D). Aan het einde van de watertrainingsfase behaalden alle muizen een relatief hoog lik-succespercentage (= % van de bezoeken die resulteerden in lik-/totaal aantal bezoeken), wat verder bevestigt dat de training aan het einde van de watertraining succesvol was (Figuur 4E).

Tijdens de habituatie, watertraining en het begin van intermitterend alcoholgebruik hielden muizen ongeveer een vergelijkbaar aantal dagelijkse likken aan (Figuur 5A–B). Hoewel sommige muizen aan het begin van operante watertraining op experimentele dag -3 (bijvoorbeeld P241260-1) een daling in het totale aantal likken vertoonden, ontwikkelden de meeste muizen snel genoeg een FR-1 en FR-3 neusstekerschema om de basisliksnelheden te behouden. Het is dus onwaarschijnlijk dat muizen tijdens watertraining overmatige uitdroging ervoeren. Alle muizen leerden het FR-3 schema in een redelijk tempo. Toen intermitterend alcoholgebruik op de experimentele dag 1 begon, kozen bijna alle muizen ervoor om alcohol te drinken, zij het in verschillende mate. Over het algemeen verhoogden muizen het totale aantal dagelijkse likken bij het drinken van alcohol niet significant. In plaats daarvan deden de muizen minder waterlikken om het verhoogde alcoholgebruik op te vangen.

Over alle dagen van intermitterend alcoholgebruik varieerden cohort één-muizen sterk in het dagelijkse alcohollikje ten opzichte van het lichaamsgewicht (Figuur 6A). De auteurs ontdekten dat muizen die het LBN-paradigma ondergingen significant een lager lichaamsgewicht hadden dan kruis-gefosterde controles23. Daarom kozen ze bij het onderzoeken van groepsverschillen in alcoholgebruik ervoor om dagelijkse alcohollikken te normaliseren op basis van lichaamsgewicht, wat de auteurs wekelijks beoordeelden tijdens kooiwisselingen. Met LBN gefokte muizen dronken over het algemeen meer alcohol per gram lichaamsgewicht dan controles tijdens zowel intermitterend drinken (Figuur 6A) als kininevervalsing (Figuur 6B). Deze trend bleef bestaan gedurende één dag van niet-operante open toegang (Figuur 6C). Deze bevindingen uit cohort één komen overeen met de gepubliceerde resultaten, waarin de auteurs rapporteren dat muizen die aan ELA blootgesteld waren, consequent meer alcohol per gram lichaamsgewicht dronken dan kruis-gestimuleerde controles tijdens intermitterende toegang, een effect dat vooral sterk was bijmannen van 23 jaar.

Mogelijk gemaakt door de efficiëntie van geautomatiseerde huiskooimonitoringssystemen, bevestigde de gepubliceerde studie verhoogd alcoholgebruik onder sociaal gehuisveste knaagdieren die aan ELA blootgesteld zijn, bij uiterst robuuste steekproefgroottes, inclusief beide geslachten (n = 54 controle, 43 LBN)23. Deze resultaten vormen een stap vooruit in het modelleren van AUD-achtige gedragingen die bij AUD-patiënten met een geschiedenis van adverse kinderervaringen 58,59,60,61,62 worden waargenomen, en openen de deur voor toekomstige mechanistische studies die de neurobiologie ten grondslag leggen aan toegenomen AUD-kwetsbaarheid na ELA.

Discussie

Zoals blijkt uit het gebruik van IntelliCages door de auteurs om AUD-achtig gedrag robuust te beoordelen bij muizen die aan ELA27 zijn blootgesteld, evenals het eerdere werk aan transgene lijnen28, bieden geautomatiseerde huiskooimonitoringsystemen een efficiënte en flexibele oplossing voor het bestuderen van preklinische modellen van AUD. De gelijktijdige beoordeling van maximaal 16 samen gehuisveste muizen verhoogt aanzienlijk de doorvoer van alcoholdrinkmethoden, terwijl de verstorende effecten van stress veroorzaakt door sociale isolatie worden vermeden. Het paradigma van operant, intermitterend alcoholgebruik stelt onderzoekers in staat om meerdere facetten van AUD-achtig gedrag te onderzoeken gedurende één periode van ~5–6 weken, waaronder binge-drinken, escalatie in de loop van de tijd en straf-ongevoelig drinken. Hoewel het paradigma één methode biedt om gedrag van AUD-achtig gedrag te beoordelen, kan het ontwerp eenvoudig worden aangepast om intermitterend drinken chronischer te meten, te testen op straf-ongevoelig drinken als reactie op een luchtpuff, of een variabele operantratio toe te voegen, naast andere mogelijkheden. Al met al verhogen geautomatiseerde monitoringsystemen in huiskooien aanzienlijk de doorvoer en specificiteit waarmee onderzoekers AUD-achtig gedrag kunnen beoordelen, wat de identificatie van nieuwe onderliggende circuits en behandelingen stimuleert.

Zoals bij alle technologie ervaren auteurs af en toe mechanische en technische storingen. Ondanks de verleiding om het systeem ongecontroleerd te laten draaien, is het van cruciaal belang dat onderzoekers het apparaat regelmatig blijven monitoren om een goede werking te waarborgen. Af en toe veroorzaakten mechanische storingen aan de magnetische deuren dat de slurperflessen voor muizen ontoegankelijk waren. Dit gebeurde zelden bij goede reiniging en onderhoud en was meestal minimaal storend voor de gegevensverzameling. Om fouten snel te identificeren, is het belangrijk om sipperflessen te monitoren op vergelijkbare verminderingen van het vloeistofgehalte en regelmatig de "Controller"-applicatie te controleren om te verifiëren dat er in alle hoeken likken worden geregistreerd voor alle dieren. Voor uitgebreider advies geven Masuda en collega's een uitstekende beschrijving van hoe je onderhoud opzet en uitvoert op IntelliCages48.

Het is ook essentieel om het gedrag van dieren regelmatig te observeren om te letten op vechten of ander verwarrend gedrag. Hoewel de auteurs geen grote problemen hadden met vechten bij het uitvoeren van dit paradigma met C57/BL6-muizen, heeft het co-huisvesten van mannetjes met agressievere genotypen tot aanzienlijke problemen geleid. Houd regelmatig in de gaten op opgedroogd bloed, mank lopende dieren of andere tekenen van gevecht, vooral na het wisselen van de kooi. Als men deze tekenen opmerkt, verwijder dan onmiddellijk het betreffende dier(s) en sluit het uit van verdere experimenten. Gebruik het gedeelte "Individuele muisprestatie" van de meegeleverde code om te beoordelen of, en hoe lang, agressie het drinkgedrag van individuele muizen heeft beïnvloed. Sluit alle getroffen dagen uit van de analyse. Zoals eerder vermeld, kunnen de auteurs de generaliseerbaarheid van het protocol naar verschillende genotypen of huisvestingsindelingen niet garanderen.

In verband daarmee hadden de auteurs soms problemen met muizen die operante hoeken "opzegden", door urenlang in dezelfde hoek te slapen of anderszins in dezelfde hoek te blijven. Dit gedrag blokkeert andere muizen om toegang te krijgen tot de sipperflessen in die hoek. Deze situaties kunnen de drinkresultaten verstoren als ze niet goed worden meegenomen in de analyse. Gebruik de secties "Corner Occupancy (Visit Durations)" en "Individual mouse performance" van de verstrekte code om te bepalen of "hogging" het gedrag van de muis significant genoeg beïnvloedde om bepaalde experimentele dagen uit te sluiten. In het algemeen is het onvermogen om sociaal gedrag tijdens experimenten vast te leggen of te kwantificeren een grote beperking van dit geautomatiseerde monitoringsysteem.

Ten slotte, zoals steeds vaker het geval is bij geavanceerde neurowetenschappelijke methoden, produceren geautomatiseerde homecage monitoringsystemen grote hoeveelheden data. Via open-source code zoals hiergepresenteerd op 29 en ontwikkeld door anderen63,64, beschikken onderzoekers over meerdere hulpmiddelen om outputdata te organiseren en te analyseren. Echter, aanpassingen aan het hier gepresenteerde protocol vereisen aanpassing van de code. Verder kunnen talrijke aanvullende analyses worden uitgevoerd op de schat aan outputgegevens die hier niet worden gepresenteerd.

Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het kwantificeren van alcoholconsumptie (g alcohol per kg muisgewicht per dag). De auteurs bespreken dit kort en leveren enkele voorlopige code om deze analyse uit te voeren in de GitHub-repository29. Daar gebruiken de auteurs een lik-naar-volume conversiefactor van 1,94 μL/lik, in overeenstemming met berekeningen gemaakt door Kasia Radwanska en collega's30,37. Hoewel deze lick-conversiefactor door anderen in het veld is gebruikt om alcoholconsumptie te schatten(30,37,38,39), werd hij berekend door het meten van het waterverbruik. Het is dus mogelijk geen nauwkeurige maatstaf voor 20% alcoholconsumptie vanwege verschillen in oppervlaktespanning tussen water en alcohol. Anderen in het veld hebben een lick-conversiefactor van 3 μL/lick 31,34,36,38 gebruikt, wat de noodzaak benadrukt om deze meting op te lossen. Men kan niet uitsluiten dat muizen likken van verschillende groottes uitvoeren, wat deze berekening verder bemoeilijkt. Als onderzoekers geïnteresseerd zijn in een nauwkeurige meting van alcoholconsumptie (g/kg/dag), raden de auteurs aan een lik-naar-volume conversiefactor te berekenen die consistent is met het experimentele ontwerp.

Samenvattend bieden de vooruitgang en toegenomen toegankelijkheid van geautomatiseerde systemen voor het monitoren van thuiskooien onderzoekers nieuwe en verbeterde hulpmiddelen om alcoholgebruik preklinisch te beoordelen. Operante paradigma's voor intermitterend alcoholgebruik zoals deze stellen onderzoekers in staat om meerdere aspecten van AUD-achtig gedrag gelijktijdig te beoordelen met een veel hogere doorvoer en met meer ethologische relevantie dan de traditionele methodologie. Via IntelliCage-testsystemen en open-source alternatieven20,26 kunnen onderzoekers alcoholgebruik dat overeenkomt met AUD efficiënter en flexibeler onderzoeken, waardoor effectieve interventies worden geïdentificeerd.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van het NIH Intramural Research Program van de National Institutes of Health aan V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). We willen Miriam Bocarsly, Anoo Maskeri en Erin Murray bedanken voor hun hulp bij het ontwikkelen van dit protocol.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ethanol, 190 ProofDecon Laboratories2801G
IntelliCage Testing SystemTSE Systemshttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Bevat 1x 2000P Static Cage (Tecniplast, 2000P001),  4x Muizenhuizen (Tecniplast, ACRE011), en 8x Drinkflessen (Techniplast, ACBT0252) en Doppen (Techniplast, ACCP3521)
IntelliCage Software ("Designer", "Controller", "Analyzer")TSE Systemshttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Versie 3.6.9.0
Iso Pads, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Geperste kussentjes van katoenvezel (15,24 x 25,4 cm)
IsofluraanBaxter10019-360-40
Isofluraan VXP™ Well-fill VerdamperMedVet91305535
Laboratorium Knaagdier DieetLabDiet5001
Medium Sure-Seal Muis/Raad Inductiekamer World Precision InstrumentsEZ-178
NestletsAncareNES 3600Kleine katoenen vierkantjes (5,08 x 5,08 cm)
OHAUS Compass™ CX Schaal - 2.200 gram x 1 gramUlineH-8110Voor muis lichaamsgewicht metingen
PC + DisplaySupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Verkocht als onderdeel van IntelliCage testsysteem
RFID Transponder (1,25 x 7 mm)TSE Systems290000-IC-60400
RFID Transponder InjectorAVIDAVID2028
RFID Transponder ReaderTSE Systems290000-IC-50800
RStudioPosithttps://posit.co/download/rstudio-desktopVersie 2026.01.1+403; met Tidyverse (2.0.0) en Quarto (1.9.37)
Tri Pour Wegwerp BekerConsolidated Plastics45317Voor muis lichaamsgewicht metingen

Referenties

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

Herprints en machtigingen

Tags

Operant gedragIntelliCage-systeemalcoholgebruikstoornisgeautomatiseerde beoordelingintermitterende toegang tot alcoholRFID-transpondervrijwillig drinkgedraghigh-throughput testen

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.