Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie evalueert SUCNR1 en GPR37L1 als kandidaat-schizofrenie-geassocieerde moleculaire markers via geïntegreerde bio-informatische analyse van de GSE54913 dataset, kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) validatie en correlatieanalyse met verbaal geheugen in een onafhankelijke cohort.
Schizofrenie is een ernstige, complexe en multifactoriele psychische aandoening die talrijke genetische vatbaarheidselementen omvat, wat leidt tot aanzienlijke invaliditeit, morbiditeit en sterfte. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrijpen van de pathofysiologie en etiologie ervan, blijven specifieke diagnostische biomarkers voor schizofrenie ongrijpbaar. Deze studie had als doel kandidaat-moleculaire markers te identificeren die geassocieerd zijn met schizofrenie. Er werd een geïntegreerde bio-informatica-analyse uitgevoerd op de publieke microarray-dataset GSE54913. Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeanalyses toonden aan dat de meest significant verrijkte GO-termen gerelateerd waren aan kanaalactiviteit, waaronder passieve transmembrane transporteractiviteit, ionenkanaalactiviteit, activiteit van gated channel en substraatspecifieke kanaalactiviteit. De vijf belangrijkste verrijkte KEGG-routes waren insulinesecretie, cAMP-signaalroute, nucleotide-excisieherstel, TNF-signaalweg en glutathionmetabolisme. Validatie werd uitgevoerd met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) op een onafhankelijke steekproef van het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis. De qRT-PCR-resultaten waren grotendeels consistent met de microarray-analyse (Pearson r = 0,89, 95% BI: 0,66–0,97). Analyse van het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk identificeerde twee hubgenen, SUCNR1 en GPR37L1, die significant geassocieerd waren met de GO-term 'ionenkanaalactiviteit' en verrijkt waren in de KEGG-route 'insulinesecretie'. Bovendien vertoonde de SUCNR1-expressie een negatieve correlatie met verbale geheugenscores (r = -0,54, P = 0,015), terwijl GPR37L1 expressie een positieve correlatie vertoonde (r = 0,59, P = 0,0034). Deze bevindingen suggereren dat veranderde expressie van SUCNR1 en GPR37L1 mogelijk geassocieerd is met schizofrenie en mogelijk kandidaatmoleculaire markers zijn voor verder onderzoek.
Schizofrenie is een chronische en complexe psychische stoornis van onbekende oorzaak, gekenmerkt door ernstige hersenstoornissen, cognitieve stoornissen en psychosociale tekorten1. Het vormt een grote wereldwijde gezondheidslast en treft wereldwijd meer dan 21 miljoenmensen. Hoewel diagnostische en therapeutische benaderingen de afgelopen vijftig jaar aanzienlijk zijn geëvolueerd, blijft de kernpathogenese onduidelijk en zijn langetermijnuitkomsten die gepaard gaan met aanzienlijke invaliditeit, morbiditeit en sterfte niet significant verbeterd3. Daarom is het essentieel om potentiële cruciale genen en regulerende doelen te identificeren.
De pathofysiologie van schizofrenie, hoewel niet volledig toegelicht, wordt algemeen toegeschreven aan genetische polymorfismen en expressievariaties4. Bijvoorbeeld, genetische variatie in het oestrogeenalfa-gen kan de vatbaarheid voor schizofrenie beïnvloeden via alternatieve genregulatie en transcriptverwerking5. Evenzo is een functionele promotorvariant van NRG1 in verband gebracht met schizofrenie en gecorreleerd met verminderde expressie van de type III NRG1-isoform6. Postmortem studies hebben aangetoond dat de expressie van PDE4B-isoformen in schizofreene hersenen significant verminderd is, wat wijst op het voorspellende potentieel7. Andere kandidaten zijn de dopaminetransporter (DAT), vesiculaire monoaminetransporter (VMAT2) en monoamineoxidase (MAO), die synaptische dopamineniveaus reguleren en mogelijk als biomarkers8 dienen. Daarnaast kan TCP1 bijdragen aan cytoskelettekorten door onjuiste actinevouwing bij schizofrenie9. Het verduidelijken van genexpressieprofielen in de pathogenese van schizofrenie kan dus inzicht bieden in risicovoorspelling, mechanistisch begrip en therapeutische evaluatie.
Recente computationele benaderingen hebben de identificatie van ziekte-geassocieerde genen bevorderd via geïntegreerde netwerkanalyse en machine learning-methoden 10,11,12. Ondanks talrijke genetische studies zijn er geen betrouwbare bloedgebaseerde diagnostische biomarkers vertaald in de klinische praktijk voor schizofrenie. Om deze kloof te dichten, gebruikte de huidige studie een geïntegreerde bio-informatica-benadering om de GSE54913 dataset opnieuw te analyseren, die bloedafgeleide transcriptomische gegevens bevat van goed gekarakteriseerde patiënten met schizofrenie en gezonde controles. De dataset werd geselecteerd omdat (1) perifere bloedmonsters minimaal invasief en klinisch praktisch zijn, (2) het een relatief grote steekproefgrootte bevat onder publiek beschikbare schizofrenie-microarray-datasets, en (3) ruwe gegevens beschikbaar waren voor heranalyse. De doelstellingen van deze studie waren: (1) het identificeren van verschillend tot expressie gebrachte genen bij schizofreniepatiënten vergeleken met gezonde controles met behulp van de GSE54913 dataset; (2) functionele verrijking en PPI-netwerkanalyses uitvoeren om hubgenen te identificeren; (3) validatie van de expressie van kandidaatgenen met qRT-PCR in een onafhankelijke cohort; en (4) de correlatie van hubgenexpressie met verbale geheugenprestaties onderzoeken. Voor zover de auteurs weten is dit de eerste studie die SUCNR1 en GPR37L1 identificeert als kandidaat bloedgebaseerde moleculaire markers voor schizofrenie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis (projectidentificatiecode, YF-IRB202310215) en uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Alle deelnemers waren bewoners van de Chinese gemeenschap en gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming.
Proefpersonen en bloedmonsters
Tien volwassenen met de diagnose schizofrenie en tien gezonde controlevrijwilligers zonder familiegeschiedenis van psychische aandoeningen binnen drie generaties werden ingeschreven. Inclusiecriteria voor schizofreniepatiënten: (1) diagnose schizofrenie volgens DSM-5-criteria bevestigd door twee onafhankelijke senior psychiaters; (2) leeftijd 18–65 jaar; (3) geen verandering in antipsychotica gedurende minstens 4 weken voorafgaand aan bloedafname; (4) bereidheid om schriftelijke geïnformeerde toestemming te geven. Exclusiecriteria: (1) comorbide ernstige medische aandoeningen (bijv. diabetes, hart- en vaatziekten, kanker); (2) middelenmisbruik of afhankelijkheid in de afgelopen 6 maanden; (3) verstandelijke beperking; (4) zwangerschap of lactatie. Inclusiecriteria voor gezonde controles: (1) geen persoonlijke of familiegeschiedenis (binnen drie generaties) van een psychische aandoening; (2) geen huidig of voortijdig gebruik van antipsychotica; (3) leeftijds- en geslachtsgecorreleerd bij de schizofreniegroep; (4) geen ernstige medische aandoeningen. De gemiddelde ziekteduur voor schizofreniepatiënten was 12,5 ± 6,8 jaar; Alle patiënten kregen stabiele antipsychotica (6 op risperidon, 4 op olanzapine); de gemiddelde PANSS-totale score was 76,4 ± 12,3. Controles werden gematcht op leeftijd (±5 jaar) en geslacht (5 mannen, 5 vrouwen per groep). Het verbale geheugen werd beoordeeld met behulp van de totale geheugenscore op de Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Alle proefpersonen werden gerekruteerd uit het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis tussen 1 januari en 31 juli 2025. De basisdemografie wordt samengevat in Tabel 1.
De steekproefgrootte werd bepaald met behulp van steekproefgrootteberekeningssoftware voor een tweezijdige onafhankelijke t-test met een effectgrootte van 1,2, α = 0,05 en kracht (1-β) = 0,80, wat resulteerde in minimaal negen proefpersonen per groep.
Veneus bloed werd afgenomen in EDTA-antistollingsbuizen en zonder vertraging verwerkt. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden vervolgens van de monsters gescheiden door dichtheidsgradiëntcentrifugatie met behulp van dichtheidsgradiëntmedium. Kort gezegd werd bloed 1:1 verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4), gelaagd op het dichtheidsgradiëntmedium en 30 minuten bij 20 °C gecentrifugeerd op 400 × g bij 20 °C met de rem uit. Na centrifugatie werd de PBMC-bevattende interface zorgvuldig overgebracht naar een nieuwe buis. De cellen werden twee keer gespoeld met PBS, waarbij elke wasbeurt gevolgd werd door centrifugatie op 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en de uiteindelijke pellet werd in PBS opgehangen. De levensvatbaarheid werd geëvalueerd met de trypanblauwe kleurstof-uitsluitingsmethode, en alleen preparaten met ≥95% levensvatbare cellen werden gebruikt. Geïsoleerde PBMC's werden gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C maximaal 3 maanden voordat RNA-extractie plaatsvond.
Microarraygegevens
De werkwijze van de studie is weergegeven in Figuur 1. De microarray-dataset GSE54913 werd gedownload van de GEO-database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Deze dataset is geselecteerd omdat (1) het transcriptomische gegevens bevat van perifere bloedmonsters, die minimaal invasief en klinisch praktisch zijn voor biomarkerontdekking; (2) het omvat een relatief grote steekproef uit publiek beschikbare schizofrenie-microarray-datasets (18 patiënten, 12 controles); (3) de ruwe gegevens beschikbaar waren voor heranalyse. Volgens het GEO-record werden de monsters afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), niet van plasma. De oorspronkelijke beschrijving 'plasmamonsters' in de vorige versie was een fout en is gecorrigeerd.
Datapreprocessing en differentieel expressief gen (DEG) screening
Ruwe data (. CEL-bestanden) werden voorbewerkt met behulp van microarray-voorverwerkingssoftware. Achtergrondcorrectie werd uitgevoerd met behulp van de Robust Multichip Average (RMA)-methode, gevolgd door quantielnormalisatie en log2-transformatie. Probesets zonder enige genannotatie werden eruit gefilterd. Sondes met >20% ontbrekende waarden over de steekproeven werden uitgesloten; Ontbrekende waarden voor de resterende probes werden geïimputeerd met behulp van het k-dichtstbijzijnde buren-algoritme (k = 10), geïmplementeerd in ontbrekende waarde imputatiesoftware. Batch-effecten waren niet aanwezig omdat alle monsters in één batch werden verwerkt volgens het GEO-record. Na preprocessing werden expressiewaarden voor 17.200 genen verkregen voor downstream analyse. DEG's tussen schizofreniepatiënten en gezonde controles werden geïdentificeerd met behulp van differentiële expressieanalysesoftware. Genen met een valse ontdekkingsrate (FDR) < 0,05, absolute vouwverandering (FC) > 1,2 en P < 0,05 werden als differentieel geexpresseerd beschouwd. Een relatief lage FC-drempel (absolute FC > 1,2) werd gekozen omdat schizofrenie een complexe psychiatrische aandoening is waarbij individuele genexpressieverschillen vaak subtiel zijn in plaats van dramatisch.
GO- en padverrijkingsanalyses
Functionele verrijkingsanalyses voor Gene Ontology (GO)-termen en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routes werden uitgevoerd met behulp van functionele verrijkingsanalysesoftware. De achtergrondgenen bestond uit alle genen die de preprocessing doorstonden (17.200 genen). Verrijkingstermen en -routes met ruwe P-waarden < 0,05 werden gerapporteerd. Omdat ruwe P-waarden werden gebruikt voor GO- en KEGG-verrijkingsuitgangen, moeten deze resultaten als verkennend worden geïnterpreteerd.
PPI-netwerkanalyse en hubgenidentificatie
Een eiwit-eiwit interactiedatabase werd gebruikt om een PPI-netwerk op te bouwen, met een gecombineerde interactiescore > 0,9 als drempel vastgesteld. Het netwerk werd gevisualiseerd met behulp van netwerkvisualisatiesoftware. Hubgenen werden geïdentificeerd met behulp van een hubgenidentificatie-plugin met het Degree-algoritme. De top 10 nodes met de hoogste graadscores werden geselecteerd als hubgenen. Het subnetwerk van belangrijke hubgenen werd geëxtraheerd met behulp van een subnetwerkextractie-plugin met standaardparameters (degree cutoff = 2, node score cutoff = 0,2, K-core = 2, maximale diepte = 100).
Totale RNA-isolatie en qRT-PCR
β-Actine werd gebruikt als het interne referentiegen (huishouding). De stabiliteit van β-actine-expressie tussen de monsters werd bevestigd door geen significant verschil in CT-waarden tussen de schizofrenie- en controlegroepen (P > 0,05). Relatieve kwantificatie werd uitgevoerd met de 2−ΔΔCt-methode . Alle reacties werden in drievoud uitgevoerd, en de gemiddelde Ct-waarde werd gebruikt voor de berekening (zie primersequenties in Tabel 2). De top tien DEG's (vijf die het meest significant upreguleerd zijn en vijf die het meest significant worden gedownreguleerd door vouwverandering) werden geselecteerd voor initiële qRT-PCR-validatie om de algehele betrouwbaarheid van de microarraygegevens te bevestigen. Vervolgens werden SUCNR1 en GPR37L1 geselecteerd voor gerichte validatie op basis van drie criteria: (1) ze werden geïdentificeerd als hubgenen in de PPI-netwerkanalyse (graad ≥ 7); (2) ze waren significant geassocieerd met de top verrijkte GO-term 'ionenkanaalactiviteit' en de KEGG-route 'insulinesecretie'; (3) beide coderen GPCR's, die bekende doelwitten zijn bij schizofrenie.
Statistische analyse
De normaliteit werd geëvalueerd met de Shapiro–Wilk-test. Variabelen met een ongeveer normale verdeling (P > 0,05) werden geanalyseerd met parametrische methoden, waaronder de Student's t-test voor tweegroepsvergelijkingen en eenrichtings-ANOVA voor vergelijkingen met meer dan twee groepen. Wanneer aan de normaliteitsaanname niet werd voldaan, werden Mann–Whitney U of Kruskal–Wallis-tests gebruikt, waar van toepassing. Alle statistische tests waren tweezijdig. Voor meerdere vergelijkingen (bijvoorbeeld in ANOVA post-hoc tests) werd de Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) methode toegepast, met een FDR-drempel van 0,05. Voor correlatieanalyses werd geen meervoudige vergelijkingscorrectie toegepast, omdat slechts twee correlaties werden uitgevoerd; de ruwe P-waarden worden met voorzichtigheid gerapporteerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Identificatie van DEG's en hiërarchische clustering
Analyse van de GSE54913-dataset identificeerde 473 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs), waaronder 357 opgereguleerde en 116 neergereguleerde genen, tussen schizofreniepatiënten en controles (Figuur 2A,B). Hiërarchische clustering van deze DEG's onderscheidde schizofreniemonsters van controles (Figuur 2C).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Schizofrenie is een ernstige, multifactoriele aandoening met talrijke genetische vatbaarheidsfactoren13,14. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de pathofysiologie, ontbreken er nog steeds betrouwbare diagnostische biomarkers. In deze studie identificeerde een geïntegreerde bio-informatica-benadering 473 DEG's in bloedmonsters van patiënten met schizofrenie. GO- en KEGG-analyses benadrukten verrijking in kanaalac...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Deze studie werd ondersteund door het Noncommunicable Chronic Diseases-National Science and Technology Major Project of China (2025ZD0549004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| affy | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/affy/ | microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis |
| CytoHubba | National Institute of Bioinformatics | https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba | hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis |
| G*Power | Heinrich Heine University Düsseldorf | https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower | sample size calculation software. Description: Sample size calculation software |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation |
| impute | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/impute/ | missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation |
| Limma | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/limma/ | differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis |
| MCODE | Cytoscape app | https://apps.cytoscape.org/apps/mcode | subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction |
| R/Bioconductor | R Foundation | https://www.r-project.org/ | statistical computing environment. Description: Statistical computing environment |
| STRING | EMBL | https://string-db.org/ | protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database |
| SYBR Green | Takara | RR820A | fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR |
| TRIzol | Takara | 9109 | RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.