Bio-informatica en kwantitatieve real-time polymerase kettingreactieanalyse van SUCNR1 en GPR37L1 bij schizofrenie

Samenvatting

Deze studie evalueert SUCNR1 en GPR37L1 als kandidaat-schizofrenie-geassocieerde moleculaire markers via geïntegreerde bio-informatische analyse van de GSE54913 dataset, kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) validatie en correlatieanalyse met verbaal geheugen in een onafhankelijke cohort.

Samenvatting

Schizofrenie is een ernstige, complexe en multifactoriele psychische aandoening die talrijke genetische vatbaarheidselementen omvat, wat leidt tot aanzienlijke invaliditeit, morbiditeit en sterfte. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrijpen van de pathofysiologie en etiologie ervan, blijven specifieke diagnostische biomarkers voor schizofrenie ongrijpbaar. Deze studie had als doel kandidaat-moleculaire markers te identificeren die geassocieerd zijn met schizofrenie. Er werd een geïntegreerde bio-informatica-analyse uitgevoerd op de publieke microarray-dataset GSE54913. Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeanalyses toonden aan dat de meest significant verrijkte GO-termen gerelateerd waren aan kanaalactiviteit, waaronder passieve transmembrane transporteractiviteit, ionenkanaalactiviteit, activiteit van gated channel en substraatspecifieke kanaalactiviteit. De vijf belangrijkste verrijkte KEGG-routes waren insulinesecretie, cAMP-signaalroute, nucleotide-excisieherstel, TNF-signaalweg en glutathionmetabolisme. Validatie werd uitgevoerd met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) op een onafhankelijke steekproef van het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis. De qRT-PCR-resultaten waren grotendeels consistent met de microarray-analyse (Pearson r = 0,89, 95% BI: 0,66–0,97). Analyse van het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk identificeerde twee hubgenen, SUCNR1 en GPR37L1, die significant geassocieerd waren met de GO-term 'ionenkanaalactiviteit' en verrijkt waren in de KEGG-route 'insulinesecretie'. Bovendien vertoonde de SUCNR1-expressie een negatieve correlatie met verbale geheugenscores (r = -0,54, P = 0,015), terwijl GPR37L1 expressie een positieve correlatie vertoonde (r = 0,59, P = 0,0034). Deze bevindingen suggereren dat veranderde expressie van SUCNR1 en GPR37L1 mogelijk geassocieerd is met schizofrenie en mogelijk kandidaatmoleculaire markers zijn voor verder onderzoek.

Inleiding

Schizofrenie is een chronische en complexe psychische stoornis van onbekende oorzaak, gekenmerkt door ernstige hersenstoornissen, cognitieve stoornissen en psychosociale tekorten¹. Het vormt een grote wereldwijde gezondheidslast en treft wereldwijd meer dan 21 miljoen^mensen. Hoewel diagnostische en therapeutische benaderingen de afgelopen vijftig jaar aanzienlijk zijn geëvolueerd, blijft de kernpathogenese onduidelijk en zijn langetermijnuitkomsten die gepaard gaan met aanzienlijke invaliditeit, morbiditeit en sterfte niet significant verbeterd³. Daarom is het essentieel om potentiële cruciale genen en regulerende doelen te identificeren.

De pathofysiologie van schizofrenie, hoewel niet volledig toegelicht, wordt algemeen toegeschreven aan genetische polymorfismen en expressievariaties⁴. Bijvoorbeeld, genetische variatie in het oestrogeenalfa-gen kan de vatbaarheid voor schizofrenie beïnvloeden via alternatieve genregulatie en transcriptverwerking⁵. Evenzo is een functionele promotorvariant van NRG1 in verband gebracht met schizofrenie en gecorreleerd met verminderde expressie van de type III NRG1-isoform⁶. Postmortem studies hebben aangetoond dat de expressie van PDE4B-isoformen in schizofreene hersenen significant verminderd is, wat wijst op het voorspellende potentieel⁷. Andere kandidaten zijn de dopaminetransporter (DAT), vesiculaire monoaminetransporter (VMAT2) en monoamineoxidase (MAO), die synaptische dopamineniveaus reguleren en mogelijk als biomarkers⁸ dienen. Daarnaast kan TCP1 bijdragen aan cytoskelettekorten door onjuiste actinevouwing bij schizofrenie⁹. Het verduidelijken van genexpressieprofielen in de pathogenese van schizofrenie kan dus inzicht bieden in risicovoorspelling, mechanistisch begrip en therapeutische evaluatie.

Recente computationele benaderingen hebben de identificatie van ziekte-geassocieerde genen bevorderd via geïntegreerde netwerkanalyse en machine learning-methoden 10,11,12. Ondanks talrijke genetische studies zijn er geen betrouwbare bloedgebaseerde diagnostische biomarkers vertaald in de klinische praktijk voor schizofrenie. Om deze kloof te dichten, gebruikte de huidige studie een geïntegreerde bio-informatica-benadering om de GSE54913 dataset opnieuw te analyseren, die bloedafgeleide transcriptomische gegevens bevat van goed gekarakteriseerde patiënten met schizofrenie en gezonde controles. De dataset werd geselecteerd omdat (1) perifere bloedmonsters minimaal invasief en klinisch praktisch zijn, (2) het een relatief grote steekproefgrootte bevat onder publiek beschikbare schizofrenie-microarray-datasets, en (3) ruwe gegevens beschikbaar waren voor heranalyse. De doelstellingen van deze studie waren: (1) het identificeren van verschillend tot expressie gebrachte genen bij schizofreniepatiënten vergeleken met gezonde controles met behulp van de GSE54913 dataset; (2) functionele verrijking en PPI-netwerkanalyses uitvoeren om hubgenen te identificeren; (3) validatie van de expressie van kandidaatgenen met qRT-PCR in een onafhankelijke cohort; en (4) de correlatie van hubgenexpressie met verbale geheugenprestaties onderzoeken. Voor zover de auteurs weten is dit de eerste studie die SUCNR1 en GPR37L1 identificeert als kandidaat bloedgebaseerde moleculaire markers voor schizofrenie.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis (projectidentificatiecode, YF-IRB202310215) en uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Alle deelnemers waren bewoners van de Chinese gemeenschap en gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming.

Proefpersonen en bloedmonsters
Tien volwassenen met de diagnose schizofrenie en tien gezonde controlevrijwilligers zonder familiegeschiedenis van psychische aandoeningen binnen drie generaties werden ingeschreven. Inclusiecriteria voor schizofreniepatiënten: (1) diagnose schizofrenie volgens DSM-5-criteria bevestigd door twee onafhankelijke senior psychiaters; (2) leeftijd 18–65 jaar; (3) geen verandering in antipsychotica gedurende minstens 4 weken voorafgaand aan bloedafname; (4) bereidheid om schriftelijke geïnformeerde toestemming te geven. Exclusiecriteria: (1) comorbide ernstige medische aandoeningen (bijv. diabetes, hart- en vaatziekten, kanker); (2) middelenmisbruik of afhankelijkheid in de afgelopen 6 maanden; (3) verstandelijke beperking; (4) zwangerschap of lactatie. Inclusiecriteria voor gezonde controles: (1) geen persoonlijke of familiegeschiedenis (binnen drie generaties) van een psychische aandoening; (2) geen huidig of voortijdig gebruik van antipsychotica; (3) leeftijds- en geslachtsgecorreleerd bij de schizofreniegroep; (4) geen ernstige medische aandoeningen. De gemiddelde ziekteduur voor schizofreniepatiënten was 12,5 ± 6,8 jaar; Alle patiënten kregen stabiele antipsychotica (6 op risperidon, 4 op olanzapine); de gemiddelde PANSS-totale score was 76,4 ± 12,3. Controles werden gematcht op leeftijd (±5 jaar) en geslacht (5 mannen, 5 vrouwen per groep). Het verbale geheugen werd beoordeeld met behulp van de totale geheugenscore op de Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Alle proefpersonen werden gerekruteerd uit het Wuhan Rongjun Youfu Ziekenhuis tussen 1 januari en 31 juli 2025. De basisdemografie wordt samengevat in Tabel 1.

De steekproefgrootte werd bepaald met behulp van steekproefgrootteberekeningssoftware voor een tweezijdige onafhankelijke t-test met een effectgrootte van 1,2, α = 0,05 en kracht (1-β) = 0,80, wat resulteerde in minimaal negen proefpersonen per groep.

Veneus bloed werd afgenomen in EDTA-antistollingsbuizen en zonder vertraging verwerkt. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden vervolgens van de monsters gescheiden door dichtheidsgradiëntcentrifugatie met behulp van dichtheidsgradiëntmedium. Kort gezegd werd bloed 1:1 verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4), gelaagd op het dichtheidsgradiëntmedium en 30 minuten bij 20 °C gecentrifugeerd op 400 × g bij 20 °C met de rem uit. Na centrifugatie werd de PBMC-bevattende interface zorgvuldig overgebracht naar een nieuwe buis. De cellen werden twee keer gespoeld met PBS, waarbij elke wasbeurt gevolgd werd door centrifugatie op 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en de uiteindelijke pellet werd in PBS opgehangen. De levensvatbaarheid werd geëvalueerd met de trypanblauwe kleurstof-uitsluitingsmethode, en alleen preparaten met ≥95% levensvatbare cellen werden gebruikt. Geïsoleerde PBMC's werden gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C maximaal 3 maanden voordat RNA-extractie plaatsvond.

Microarraygegevens
De werkwijze van de studie is weergegeven in Figuur 1. De microarray-dataset GSE54913 werd gedownload van de GEO-database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Deze dataset is geselecteerd omdat (1) het transcriptomische gegevens bevat van perifere bloedmonsters, die minimaal invasief en klinisch praktisch zijn voor biomarkerontdekking; (2) het omvat een relatief grote steekproef uit publiek beschikbare schizofrenie-microarray-datasets (18 patiënten, 12 controles); (3) de ruwe gegevens beschikbaar waren voor heranalyse. Volgens het GEO-record werden de monsters afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), niet van plasma. De oorspronkelijke beschrijving 'plasmamonsters' in de vorige versie was een fout en is gecorrigeerd.

Datapreprocessing en differentieel expressief gen (DEG) screening
Ruwe data (. CEL-bestanden) werden voorbewerkt met behulp van microarray-voorverwerkingssoftware. Achtergrondcorrectie werd uitgevoerd met behulp van de Robust Multichip Average (RMA)-methode, gevolgd door quantielnormalisatie en log2-transformatie. Probesets zonder enige genannotatie werden eruit gefilterd. Sondes met >20% ontbrekende waarden over de steekproeven werden uitgesloten; Ontbrekende waarden voor de resterende probes werden geïimputeerd met behulp van het k-dichtstbijzijnde buren-algoritme (k = 10), geïmplementeerd in ontbrekende waarde imputatiesoftware. Batch-effecten waren niet aanwezig omdat alle monsters in één batch werden verwerkt volgens het GEO-record. Na preprocessing werden expressiewaarden voor 17.200 genen verkregen voor downstream analyse. DEG's tussen schizofreniepatiënten en gezonde controles werden geïdentificeerd met behulp van differentiële expressieanalysesoftware. Genen met een valse ontdekkingsrate (FDR) < 0,05, absolute vouwverandering (FC) > 1,2 en P < 0,05 werden als differentieel geexpresseerd beschouwd. Een relatief lage FC-drempel (absolute FC > 1,2) werd gekozen omdat schizofrenie een complexe psychiatrische aandoening is waarbij individuele genexpressieverschillen vaak subtiel zijn in plaats van dramatisch.

GO- en padverrijkingsanalyses
Functionele verrijkingsanalyses voor Gene Ontology (GO)-termen en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routes werden uitgevoerd met behulp van functionele verrijkingsanalysesoftware. De achtergrondgenen bestond uit alle genen die de preprocessing doorstonden (17.200 genen). Verrijkingstermen en -routes met ruwe P-waarden < 0,05 werden gerapporteerd. Omdat ruwe P-waarden werden gebruikt voor GO- en KEGG-verrijkingsuitgangen, moeten deze resultaten als verkennend worden geïnterpreteerd.

PPI-netwerkanalyse en hubgenidentificatie
Een eiwit-eiwit interactiedatabase werd gebruikt om een PPI-netwerk op te bouwen, met een gecombineerde interactiescore > 0,9 als drempel vastgesteld. Het netwerk werd gevisualiseerd met behulp van netwerkvisualisatiesoftware. Hubgenen werden geïdentificeerd met behulp van een hubgenidentificatie-plugin met het Degree-algoritme. De top 10 nodes met de hoogste graadscores werden geselecteerd als hubgenen. Het subnetwerk van belangrijke hubgenen werd geëxtraheerd met behulp van een subnetwerkextractie-plugin met standaardparameters (degree cutoff = 2, node score cutoff = 0,2, K-core = 2, maximale diepte = 100).

Totale RNA-isolatie en qRT-PCR
β-Actine werd gebruikt als het interne referentiegen (huishouding). De stabiliteit van β-actine-expressie tussen de monsters werd bevestigd door geen significant verschil in CT-waarden tussen de schizofrenie- en controlegroepen (P > 0,05). Relatieve kwantificatie werd uitgevoerd met de 2^{−ΔΔCt-methode} . Alle reacties werden in drievoud uitgevoerd, en de gemiddelde Ct-waarde werd gebruikt voor de berekening (zie primersequenties in Tabel 2). De top tien DEG's (vijf die het meest significant upreguleerd zijn en vijf die het meest significant worden gedownreguleerd door vouwverandering) werden geselecteerd voor initiële qRT-PCR-validatie om de algehele betrouwbaarheid van de microarraygegevens te bevestigen. Vervolgens werden SUCNR1 en GPR37L1 geselecteerd voor gerichte validatie op basis van drie criteria: (1) ze werden geïdentificeerd als hubgenen in de PPI-netwerkanalyse (graad ≥ 7); (2) ze waren significant geassocieerd met de top verrijkte GO-term 'ionenkanaalactiviteit' en de KEGG-route 'insulinesecretie'; (3) beide coderen GPCR's, die bekende doelwitten zijn bij schizofrenie.

Statistische analyse
De normaliteit werd geëvalueerd met de Shapiro–Wilk-test. Variabelen met een ongeveer normale verdeling (P > 0,05) werden geanalyseerd met parametrische methoden, waaronder de Student's t-test voor tweegroepsvergelijkingen en eenrichtings-ANOVA voor vergelijkingen met meer dan twee groepen. Wanneer aan de normaliteitsaanname niet werd voldaan, werden Mann–Whitney U of Kruskal–Wallis-tests gebruikt, waar van toepassing. Alle statistische tests waren tweezijdig. Voor meerdere vergelijkingen (bijvoorbeeld in ANOVA post-hoc tests) werd de Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) methode toegepast, met een FDR-drempel van 0,05. Voor correlatieanalyses werd geen meervoudige vergelijkingscorrectie toegepast, omdat slechts twee correlaties werden uitgevoerd; de ruwe P-waarden worden met voorzichtigheid gerapporteerd.

Resultaten

Identificatie van DEG's en hiërarchische clustering
Analyse van de GSE54913-dataset identificeerde 473 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs), waaronder 357 opgereguleerde en 116 neergereguleerde genen, tussen schizofreniepatiënten en controles (Figuur 2A,B). Hiërarchische clustering van deze DEG's onderscheidde schizofreniemonsters van controles (Figuur 2C).

Functionele verrijkingsanalyse van DEG's
GO-verrijkingsanalyse identificeerde termen gerelateerd aan kanaalactiviteit, waaronder passieve transmembraantransporteuractiviteit, ionenkanaalactiviteit, activiteit van gated channel en substraatspecifieke kanaalactiviteit (raw P < 0,05; Tabel 3). KEGG-routeanalyse identificeerde insulinesecretie, de cAMP-signaalroute, nucleotide-excisiereparatie, de TNF-signaalweg en glutathionmetabolisme als de best verrijkte routes (rauwe P < 0,05; Figuur 3C en Tabel 4).

Validatie van top DEG's door qRT-PCR
De top vijf gedownreguleerde genen (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 en BRIP1) en de top vijf upregulated genen (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS en C12orf68) werden gevalideerd door qRT-PCR. De gevalideerde genen en de bijbehorende microarray logFC-waarden staan vermeld in Tabel 5, qRT-PCR-validatie is weergegeven in Figuur 4, en ruwe CT-waarden worden weergegeven in Aanvullende Tabel S1. De qRT-PCR vouwveranderingen waren directioneel consistent met microarraygegevens voor alle tien genen (allemaal P < 0,05 volgens de Mann-Whitney U-test). Pearson-correlatie tussen microarray logFC en qRT-PCR logFC was r = 0,89 (95% BI: 0,66–0,97, P = 0,0004), wat wijst op sterke overeenkomst. Verschillen in expressie van SUCNR1 en GPR37L1 werden ook bevestigd (Figuur 5A,B).

PPI-netwerkanalyse
Een PPI-netwerk werd opgebouwd uit alle DEG's (interactiescore > 0,9; Figuur 6A). De top tien hub-eiwitten op basis van mate van connectiviteit waren RTP5 (graad = 14), CXCL1 (graad = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (graad = 7) en ATM (graad = 5) (Figuur 6B en Tabel 6). Een subnetwerk van sleutelhubgenen werd geëxtraheerd met behulp van een subnetwerkextractie-plugin met standaardparameters. Het subnetwerkextractie-algoritme identificeerde een dicht verbonden cluster met RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 en SUCNR1, met een clusterscore van 6,2. ATM was niet opgenomen in het subnetwerk omdat het een lagere connectiviteit met de kerncluster had (Figuur 6C).

Associatie tussen verbaal geheugen en SUCNR1/GPR37L1
De expressie van SUCNR1 was significant verhoogd, terwijl GPR37L1 expressie verminderd was bij patiënten met schizofrenie vergeleken met gezonde controles (Figuur 5A,B). De expressie van SUCNR1 vertoonde een negatieve correlatie met verbale geheugenscores (r = -0,54, 95% BI: -0,79 tot -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Figuur 5C), terwijl GPR37L1 expressie een positieve correlatie vertoonde met verbale geheugenscores (r = 0,59, 95% BI: 0,20 tot 0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Figuur 5D). Correlatieanalyses werden uitgevoerd bij alle 20 proefpersonen, waaronder 10 schizofreniepatiënten en 10 gezonde controlepersonen. Met een steekproefgrootte van 20 had de studie 80% kracht om een correlatiecoëfficiënt van |r| te detecteren. > 0,6 bij α = 0,05. Gezien de bescheiden steekproefgrootte zijn deze correlationele bevindingen voorlopig en vereisen ze validatie in grotere onafhankelijke cohorten.

Data Beschikbaarheidsverklaring
De GSE54913 dataset die in deze studie wordt geanalyseerd, is openbaar beschikbaar via de Gene Expression Omnibus. Ruwe qRT-PCR CT-waarden worden weergegeven in Aanvullende Tabel S1. De analysescripts, DEG-uitvoerbestanden, verrijkingsresultaten, PPI-netwerkbestanden en bronbestanden zijn beschikbaar op https://sandbox.zenodo.org/records/514960 of 10.5072/zenodo.514960.

Figuur 1: Stroomdiagram: gegevensverzameling, voorverwerking, analyse en validatie. mRNA-microarray-analyses op PBMC's verkregen uit GSE54913. GO-functionele en padverrijkingsanalyses werden uitgevoerd op de DEG's. De top 10 genen gerangschikt op fold-verandering werden geselecteerd voor validatie van microarray-gegevens met qRT-PCR. PPI-netwerkanalyse identificeerde twee hubgenen. Ten slotte werd ex vivo analyse uitgevoerd van de twee hubgenen SUCNR1 en GPR37L1 . Afkortingen: DEGs = differentieel tot expressie gebrachte genen; mRNA = boodschapper-RNA; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen; qRT-PCR = kwantitatieve realtime polymerasekettingreactie; PPI = eiwit-eiwit interactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: DEG-selectie en hiërarchische clusteringanalyse. (A) Vulkaanplot van DEK's. De horizontale as staat voor log₂ (vouwverandering), en de verticale as voor –log₁₀(P-waarde). Groene en rode stippen vertegenwoordigen differentieel tot expressie gebrachte genen, en zwarte stippen tot niet-differentiële expressie van genen. (B) Aantal down- en upregulated DEGs. (C) Warmtekaart van differentieel tot expressie gebrachte genen. Rood duidt op upregulation en groen op downregulation. Afkorting: DEGs = differentieel tot expressie gebrachte genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: GO- en KEGG-verrijkingsanalyses van DEGs. (A,B) GO-verrijking en (C) KEGG-verrijking worden weergegeven op basis van rauwe P-waarden. Afkortingen: DEGs = differentieel tot expressie gebrachte genen; GO = Genontologie; KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen; BP = biologisch proces; CC = cellulaire component; MF = moleculaire functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Validatie van microarray-gegevens voor de top tien gedysreguleerde genen met behulp van qRT-PCR. (A) Verlaagde top vijf LEG's. (B) Gereguleerde top vijf TEG's. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. P-waarden worden weergegeven in de bijbehorende panelen. Afkortingen: DEGs = differentieel tot expressie gebrachte genen; qRT-PCR = kwantitatieve realtime polymerasekettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: SUCNR1 en GPR37L1 expressie bij schizofreniepatiënten en gezonde controlepersonen. (A) SUCNR1 en (B) GPR37L1 expressie bepaald door qRT-PCR. Correlatie tussen verbaal geheugen en (C) SUCNR1 en (D) GPR37L1 expressie. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde waar van toepassing. P-waarden voor correlaties worden weergegeven in de bijbehorende panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Analyse van eiwit-eiwitinteractienetwerk. (A) PPI-netwerk geanalyseerd met behulp van een eiwit-eiwitinteractiedatabase. (B) Eiwitten gerangschikt naar mate van associatie in het PPI-netwerk. (C) Subnetwerk gevisualiseerd met netwerkvisualisatiesoftware na subnetwerkextractie-analyse. Afkorting: PPI = eiwit-eiwitinteractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Variabele	Proefpersonen (n = 10)	Schizofreniepatiënten (n = 10)
Leeftijd (jaar)	36.5 ± 10.6	44,5 ± 9,5
Vrouwelijk geslacht, n (%)	5 (50)	5 (50)
Dagelijkse slaaptijd (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Body mass index (BMI; kg/m²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
Verbaal geheugenscore	61 ± 18	30.2 ± 10.8
De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie of getal (%).

Tabel 1: Basiskenmerken van schizofreniepatiënten en controlepersonen.

Gensymbool	Voorwaartse primerreeks (5'→3')	Omgekeerde primerreeks (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGCCTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGGGGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCTCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTATTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAAAGTCAG
β-Actin	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: kwantitatieve realtime polymerasekettingreactie.

Tabel 2: PCR-primers voor qRT-PCR.

GO ID	Term	Ruwe P-waarde	Graaf
GA:0015267	Kanaalactiviteit	0.000000056	13
GA:0022803	Passieve transmembraantransporteuractiviteit	5.78E-08	13
GA:0005216	Ionenkanaalactiviteit	0.000000127	12
GA:0022839	Activiteit van ionengestuurde kanalen	0.000000131	11
GA:0022836	Activiteit in het afgesloten kanaal	0.000000136	11
GA:0022838	substraat-specifieke kanaalactiviteit	0.00000017	12
GA:0005261	Kationkanaalactiviteit	0.00000668	9
GA:0015276	Activiteit van ligandgestuurde ionenkanalen	0.000315	5
GA:0022834	Activiteit met ligandafgesloten kanaal	0.000315	20
GA:0022890	Activiteit van anorganische kationtransmembrane transporters	0.000487	20
GA:0008324	Activiteit van kationtransmembrane transporter	0.0009	18
GA:0099094	activiteit van ligand-gestuurde kationenkanaal	0.00128	16
GA:0005244	Activiteit van spanningsgestuurde ionenkanalen	0.001382	16
GA:0022832	Activiteit van het spanningsgestuurde kanaal	0.001382	18
GA:0046873	Activiteit van metaaliontransmembraantransporters	0.001836	21
GA:0022824	Activiteit van zender-gestuurde ionenkanaal	0.002762	19
GA:0022835	Activiteit van zenderpoorten	0.002762	13
Opmerking: P-waarden zijn ruwe en niet aangepast; betekenis werd gedefinieerd als ruwe P < 0,05.

Tabel 3: Genontologie-analyse van differentieel tot expressie gebrachte genen (ruwe P < 0,05).

ID	Beschrijving	Ruwe P-waarde	Graaf
HSA04911	Insulinesecretie	0.007066	6
HSA04024	cAMP signaalpad	0.010661	10
HSA03420	Nucleotide-excisieherstel	0.013724	4
HSA04668	TNF-signaalpad	0.023694	6
hsa00480	Glutathionmetabolisme	0.02466	4
HSA04740	Reuktransductie	0.032104	15
hsa05222	Kleincellige longkanker	0.03572	5
hsa00590	Metabolisme van arachidonzuur	0.035991	4
HSA04080	Interactie tussen neuroactieve liganden en receptoren	0.037546	12
HSA05031	Amfetamineverslaving	0.045653	4
hsa05203	Virale carcinogenese	0.046404	8
HSA04933	LEEFTIJD-WOEDE signaalweg bij diabetische complicaties	0.04831	5
Opmerking: P-waarden zijn ruwe en niet aangepast; betekenis werd gedefinieerd als ruwe P < 0,05.

Tabel 4: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes verrijkingsanalyse van genen (ruwe P < 0.05).

Gensymbool	Officiële volledige naam	logFC	Ruwe P-waarde
Verlaagd
HCN3	Hyperpolarisatie-geactiveerd cyclisch nucleotide-gestuurd kanaal 3	-1.489	0.0001
OLFML2A	Olfactomedine-achtig eiwit 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH oxidase 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Mas-gerelateerde G-eiwit gekoppelde receptorlid X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Fanconi-anemie groep J-eiwit	-1.699	0.0018
Opgereguleerd
CCL22	C-C motief chemokine 22	2.517	0.0041
PNMA2	Paraneoplastische Ma-antigenen	2.159	0.0062
TBX20	T-box transcriptiefactor TBX20	1.866	0.0001
ERAS	GTPase-tijdperken	1.846	0.0008
C12orf68	Coiled-coil domein met 184	1.839	0.0002
Opmerking: logFC en ruwe P-waarden zijn afkomstig uit de microarray differentiële expressieanalyse.

Tabel 5: Top tien DEG's gerangschikt op vouwverandering in upreguleerde en downgereguleerde genen.

Gensymbool	Beschrijving	Co-genen (n)	P-waarde
RTP5	Receptortransporterproteïne 5	14	0.000276
CXCL1	Groeigereguleerd alfa-eiwit 1	8	0.011423
CXCL10	C-X-C motief chemokine 10	7	0.046144
GPR37L1	Prosaposinereceptor GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Hydroxycarboxylzuurreceptor 1	7	0.046572
OPRL1	Nociceptinereceptor 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Somatostatinereceptor type 4	7	0.006742
SUCNR1	Succinaatreceptor 1	7	0.000105
Geldautomaat	Serine-proteïnekinase op dit moment	5	0.004961
PPI: eiwit-eiwit interactie; DET's: differentieel tot expressie gebrachte genen.

Tabel 6: Top 10 hubgenen geïdentificeerd in het PPI-netwerk voor DEGs.

Aanvullende tabel 1: Ruwe qRT-PCR CT-waarden, volledige bio-informatica analyseworkflow en verwerkte resultaten (DEG, GO/KEGG en PPI) voor de studie Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Schizofrenie is een ernstige, multifactoriele aandoening met talrijke genetische vatbaarheidsfactoren^13,14. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de pathofysiologie, ontbreken er nog steeds betrouwbare diagnostische biomarkers. In deze studie identificeerde een geïntegreerde bio-informatica-benadering 473 DEG's in bloedmonsters van patiënten met schizofrenie. GO- en KEGG-analyses benadrukten verrijking in kanaalactiviteitsgerelateerde termen en routes, waaronder insulinesecretie, cAMP-signalering, nucleotide-excisieherstel, TNF-signalering en glutathionmetabolisme. PPI-netwerkanalyse identificeerde verder SUCNR1 en GPR37L1 als hubgenen, en hun expressie was geassocieerd met verbale geheugenprestaties, wat suggereert dat ze mogelijk relevant zijn als schizofrenie-geassocieerde moleculaire markers.

De verrijking van "kanaalactiviteit" termen van GO sluit aan bij eerdere schizofrenieonderzoeken. Spanningsgestuurde calciumkanalen (bijv. CACNA1C, CACNB2) en kaliumkanalen (bijv. Kv3, Kv2.1) zijn betrokken bij vatbaarheid voor schizofrenie en neuronale excitabiliteit 15,16. Evenzo zijn de belangrijkste geïdentificeerde KEGG-routes consistent met bestaande literatuur. Hyperinsulinemie en insulinesecretieafwijkingen worden gerapporteerd bij vroege schizofrenie¹⁷. De cAMP-signaalroute wordt steeds meer gekoppeld aan ziektepathofysiologie¹⁸. Nucleotide-excisieherstelmechanismen, waaronder histonvariant H2AX-modificatie, kunnen ook een rol spelen 19,20,21,22. Bovendien zijn TNF-signalering en glutathionmetabolisme in verband gebracht met schizofreniepathogenese^23,24.

Verbaal geheugenverlies is een kern cognitief tekort bij schizofrenie, is aanwezig bij het begin van de ziekte en wordt geassocieerd met functionele uitkomsten. De Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) is een goed gevalideerde maat voor verbaal leren en geheugen. Het beoordelen van de correlatie tussen kandidaatmarkerexpressie en verbale geheugenprestaties helpt om klinische relevantie vast te stellen, aangezien cognitieve stoornissen een belangrijke bepalende factor zijn voor een beperking bij schizofrenie.

Hoewel de top tien DEG's die door qRT-PCR werden gevalideerd overeenkwamen met microarray-gegevens, kwamen ze niet overeen met de primaire GO/KEGG-bevindingen. Daarentegen waren SUCNR1 (upregulated) en GPR37L1 (downregulation) significant geassocieerd met "ionenkanaalactiviteit" en verrijkt met "insulinesecretie." Beide genen coderen voor G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's), die kritieke doelwitten van antipsychotica zijn en de activiteit van ionenkanaal²⁵ moduleren.

SUCNR1 (GPR91) koppelt metabole stress aan insulinesecretie en resistentie^26,27, en insulineresistentie is een bekende risicofactor voor schizofrenie²⁸. GPR37L1, een weesreceptor die sterk tot expressie komt in de hersenen, is betrokken bij de ontwikkeling van het cerebellaire lichaam en motorische functie²⁹, en is in verband gebracht met de ziekte van Parkinson³⁰ en niernatriumtransport³¹. De rol ervan bij schizofrenie kan het moduleren van de activiteit van ionenkanalen zijn.

Verbaal geheugenverlies is een kernkenmerk van schizofrenie, wat genetische aansprakelijkheid en ziekteernst^{weerspiegelt 32,33.} De inverse correlatie van SUCNR1-expressie en de positieve correlatie van GPR37L1-expressie met verbale geheugenscores ondersteunt hun potentiële relevantie bij schizofrenie verder.

Verschillende beperkingen moeten worden erkend. Ten eerste was de steekproefgrootte voor de validatiecohort (n = 10 per groep) klein, wat de statistische kracht en generaliseerbaarheid beperkt. Ten tweede kregen alle schizofreniepatiënten antipsychotica, dus de waargenomen veranderingen in expressie kunnen eerder medicatie-effecten dan ziektepathologie weerspiegelen. Toekomstige studies moeten ook patiënten met een eerste episode die niet zo naïef zijn, omvatten. Ten derde ontbrak het validatiecohort aan RNA-seq-bevestiging; transcriptome-brede sequencing in grotere onafhankelijke cohorten is gerechtvaardigd. Ten vierde sluit het dwarsdoorsnedeontwerp de beoordeling van oorzakelijke verbanden tussen biomarkerniveaus en ziekteprogressie uit. Ten vijfde waren de correlatieanalyses met verbaal geheugen verkennend en vereisen ze replicatie. Ten zesde werd de GSE54913 dataset gegenereerd op een microarrayplatform dat een lagere gevoeligheid heeft dan RNA-seq. Toekomstige richtingen omvatten longitudinale studies om SUCNR1- en GPR37L1-niveaus gedurende ziekte en behandeling te volgen, functionele studies om de mechanistische rollen van deze GPCR's in de pathofysiologie van schizofrenie te verduidelijken, en de ontwikkeling van een klinisch gevalideerde assay voor deze biomarkers.

Samenvattend suggereert deze geïntegreerde analyse dat veranderde expressie van SUCNR1 en GPR37L1 geassocieerd is met schizofrenie en verbale geheugenprestaties. Deze genen kunnen mogelijke moleculaire markers zijn die geassocieerd zijn met schizofrenie. Beperkingen zijn echter een relatief kleine steekproef en de gedeeltelijke beoordeling van de ernst van schizofrenie via verbaal geheugen. Verdere studies zijn nodig om deze bevindingen te bevestigen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction