Een gestandaardiseerde in vitro-procedure voor het evalueren van veranderingen in oppervlakte-microhardheid in nanohybride harscomposieten na blootstelling aan wei-eiwitdranken

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde in vitro methode om de effecten van wei-eiwitdranken op de microhardheid van harscomposieten te evalueren. De aanpak maakt gecontroleerde beoordeling van voedingsblootstelling mogelijk met behulp van cyclische onderdompeling en Vickers-testen, wat een reproduceerbaar model biedt voor het onderzoeken van de interactie tussen voedingsrijke dranken en herstellende biomaterialen.

Samenvatting

Het doel van deze in vitro studie was het evalueren van het effect van verschillende wei-eiwitdranken op de oppervlakte-microhardheid van drie nanohybride harscomposieten. In totaal werden 90 schijfvormige monsters bereid uit drie nanohybride harscomposieten (n = 30 per materiaal) en onderverdeeld in drie groepen (n = 10) volgens het immersiemedium: weiconcentraat, wei-isolaat en gedestilleerd water. De exemplaren werden twee keer per dag gedurende 30 dagen 10 minuten ondergedompeld. De oppervlaktemicrohardheid werd gemeten bij de basislijn en na de immersie met een Vickers microhardheidstester, en de hardheidsverandering werd berekend als ΔVHN. De gegevens werden geanalyseerd met tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA en post-hoc tests. De analyse toonde aan dat het samengestelde type, de immersieoplossing en hun interactie statistisch significante effecten hadden op ΔVHN-waarden (p < 0,0001). Het hoogste hardheidsverlies werd waargenomen in het injecteerbare composiet dat aan weiconcentraat was blootgesteld (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), terwijl de laagste verandering werd gemeten in het sterk gevulde composiet opgeslagen in gedestilleerd water (ΔVHN: 0,9 ± 0,4). Onderdompeling in weiconcentraat resulteerde in significant groter hardheidsverlies in alle composieten vergeleken met gedestilleerd water (p < 0,05). Wei-isolaat veroorzaakte ook significant groter hardheidsverlies in alle composieten behalve het sterk gevulde composiet, waarin geen statistisch significant verschil werd waargenomen (p = 0,076). Deze bevindingen geven aan dat wei-eiwitdranken de microhardheid van harscomposieten aan het oppervlak kunnen verminderen, waarbij de mate van degradatie afhangt van zowel materiaalsamenstelling als drankformulering.

Inleiding

Het langetermijnsucces van resincomposietrestauraties hangt af van hun weerstand tegen complexe orale omgevingsuitdagingen, waaronder mechanische belasting, voedingsblootstelling en chemische afbraak ^1,2. Nanohybride harscomposieten worden veel gebruikt vanwege hun gunstige esthetische en mechanische eigenschappen, met name oppervlakte-microhardheid, die dient als een belangrijke indicator van slijtagebestendigheid en structurele achteruitgang ^3,4.

Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat blootstelling aan zure dranken zoals vruchtensappen, koolzuurhoudende dranken en energiedranken een nadelige invloed kan hebben op composietrestauraties door microhardheid van het oppervlak te verminderen en de oppervlakteintegriteit^{te veranderen 5,6,7,8}. Deze afbrekende effecten worden beïnvloed door meerdere factoren, waaronder pH, belichtingstijd en samenstelling van de filler-matrix. De meeste bestaande experimentele modellen vertrouwen echter op sterk zure oplossingen, die mogelijk niet nauwkeurig de chemische uitdagingen weerspiegelen die bij hedendaagse voedingsgewoonten voorkomen.

Daarentegen zijn wei-eiwitdranken wijdverspreid geworden vanwege hun voedingswaarde en de toenemende consumptie onder fitnessgerichte mensen ^9,10. Ondanks hun bijna neutrale pH bevatten deze dranken lactose, eiwitten en andere organische componenten die kunnen interageren met de harsmatrix en de materiaalstabiliteit beïnvloeden. Daarom vereist het evalueren van hun effecten een protocol dat niet alleen rekening houdt met zuurgehalte, maar ook met organische samenstelling en herhaalde blootstellingspatronen.

Het algemene doel van dit protocol is het bieden van een gestandaardiseerde en reproduceerbare in vitro methode voor het beoordelen van de effecten van wei-eiwitdranken, specifiek concentreren en isoleren formuleringen, op de oppervlakte-microhardheid van nanohybride harscomposieten. Deze methode maakt gecontroleerde simulatie van dagelijkse voedingsblootstelling mogelijk via cyclische onderdompeling, waardoor de experimentele relevantie van in vitro testomstandigheden wordt verbeterd.

In vergelijking met conventionele modellen voor blootstelling aan zure dranken biedt dit protocol verschillende voordelen. Ten eerste maakt het onderzoek naar materiaaldegradatie mogelijk onder bijna neutrale pH-omstandigheden, waardoor materiaalreacties geëvalueerd kunnen worden buiten de door zuur veroorzaakte effecten. Ten tweede weerspiegelt het cyclische immersieontwerp beter de consumptiepatronen in het echte leven. Ten derde vergemakkelijkt de methode de vergelijkende evaluatie van verschillende samengestelde formuleringen op basis van structurele kenmerken zoals vulmateriaal en samenstelling van de harsmatrix.

Dit protocol is bijzonder geschikt voor onderzoekers die de chemische stabiliteit van restauratieve middelen onder voedingsrelevante omstandigheden willen evalueren, evenals voor studies die de interactie tussen voedingscomponenten en tandheelkundige biomaterialen onderzoeken. Het kan ook worden aangepast om alternatieve drankformuleringen, oppervlaktebehandelingen of nieuw ontwikkelde composietmaterialen te testen.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Monstervoorbereiding

1. Bereid in totaal 90 schijfvormige monsters voor uit drie nanohybride harscomposieten (n = 30 per materiaal).
2. Fabriceer monsters met cilindrische doorzichtige siliconenmallen (6 mm diameter × 2 mm dikte) om gestandaardiseerde afmetingen te garanderen.
3. Plaats het composietmateriaal in één stap (2 mm dikte) in de mallen en bedek het oppervlak met een doorzichtige microscoopglaasje om een vlak oppervlak te verkrijgen.
4. Polymeriseer het monster met een blauwe LED-lichtuithardingsunit (≈440–480 nm emissiespectrum) geplaatst op ongeveer 1 mm van het oppervlak met een uitgangsintensiteit van 1000 mW/^cm2 gedurende 20 seconden.
5. Controleer de uitharding van de lichtintensiteit met een radiometer vóór elke polymerisatiecyclus om consistente lichtblootstelling te garanderen.
6. Bewaar de voorbereide monsters 24 uur in gedestilleerd water bij 37 °C om postpolymerisatie mogelijk te maken en de initiële orale omstandigheden te simuleren.
   OPMERKING: Monsters kunnen tot 24 uur in gedestilleerd water bij 37 °C worden bewaard voordat verdere verwerking wordt gebruikt.

2. Afwerkings- en polijstprocedure

1. Werk de bovenoppervlakken van alle monsters af en polijst met aluminiumoxide-geïmpregneerde polijstschijven. Alle polijstprocedures moeten door één operator worden uitgevoerd om oppervlaktestandaardisatie te waarborgen.
2. Breng het polijsten sequentieel aan met medium, fijne en superfijne schijven gedurende elk 10 seconden onder waterkoeling bij ongeveer 10.000 tpm met lichte druk en een eenrichtingsrotatiebeweging.
3. Vervang polijstschijven na elke vijf exemplaren om een consistente schurende efficiëntie te behouden en oppervlaktestandaardisatie te waarborgen.
4. Na elke polijststap spoel je monsters 10 seconden met gedestilleerd water om vuil te verwijderen en laat je ze voorzichtig 5 seconden aan de lucht drogen voordat je doorgaat naar de volgende schijf.
5. Markeer het ongepolijste oppervlak van elk monster met een unieke identificatiecode om een consistente oriëntatie te garanderen tijdens het volgende onderzoek.
6. Bewaar monsters in gedestilleerd water bij 37 °C gedurende 24 uur voorafgaand aan de basislijn microhardheidstest.
   OPMERKING: Monsters kunnen tot 24 uur in gedestilleerd water bij 37 °C worden bewaard voordat ze de basislijn testen.

3. Basislijn microhardheidsmeting

1. Voer de basislijn Vickers microhardheidstest (VHN) uit volgens eerder gepubliceerde protocollen met een Vickers microhardheidstester¹¹.
2. Breng een lading van 200 g toe voor een verblijfstijd van 15 seconden.
3. Maak drie inkepingen per exemplaar met een afstand van minstens 1 mm. Voer inkepingen uit op het centrale oppervlak van elk monster om randeffecten te voorkomen.
4. Bereken gemiddelde basislijn VHN.
5. Voer metingen uit door één gekalibreerde operator om variabiliteit te minimaliseren.
   OPMERKING: Exemplaren kunnen tot 24 uur worden bewaard in gedestilleerd water bij 37 °C vóór onderdompeling.

4. Voorbereiding van onderdompelingsmedia

1. Bereid twee wei-eiwitformuleringen voor: wei-eiwitconcentraat (WC) en wei-eiwitisolaat (WI) met commercieel verkrijgbare poeders.
2. Los 25 g wei-eiwitpoeder op in 200 ml gedestilleerd water (0,125 g/mL) om de dompeloplossingen te bereiden.
3. Meng de oplossingen met een laboratoriumshaker gedurende 60 seconden totdat volledige oplossing is bereikt.
4. Laat de oplossingen 5 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen om schuimvorming te minimaliseren en homogeniteit te waarborgen.
5. Meet en registreer de pH van elke oplossing met een gekalibreerde digitale pH-meter vóór de onderdompeling.
6. Bereid verse wei-oplossingen voor elke dompelcyclus om een consistente chemische samenstelling te waarborgen en eiwitafbraak te voorkomen.
7. Gebruik 10 ml onderdompelingsoplossing per monster om volledige onderdompeling tijdens elke cyclus te garanderen.

5. Onderdompelingsprocedure

1. Verdeel elke samengestelde groep in drie deelgroepen (n = 10).
2. Dompel monsters in de toegewezen oplossingen gedurende 10 minuten, twee keer per dag. Selecteer de onderdompelingsduur en frequentie op basis van eerder gevestigde in vitro blootstellingsmodellen voor dranken die zijn ontworpen om herhaalde dagelijkse consumptiepatronen te simuleren⁷.
3. Na elke onderdompelingscyclus spoel je de monsters af met gedestilleerd water en plaats je ze 10 minuten in kunstmatig speeksel om kortdurende blootstelling aan speeksel te simuleren.
4. Bewaar de monsters tussen de dompelcycli door in gedestilleerd water op 37 °C tot de volgende belichtingscyclus.
5. Pas deze procedure alleen toe op de wei-blootgestelde groepen. Houd de controlegroep continu in gedestilleerd water (DW) op 37 °C gedurende de hele experimentele periode.
   OPMERKING: Het immersieprotocol kan tussen cycli worden gepauzeerd en de volgende dag worden hervat zonder de experimentele consistentie te beïnvloeden.
6. Zet het immersieprotocol 30 dagen door.

6. Microhardheidsmeting na de onderdompeling

1. Spoel de monsters af met gedestilleerd water en droog ze voorzichtig.
2. Voer Vickers microhardheidstests uit met dezelfde parameters (200 g, 15 s).
3. Noteer drie inkepingen en bereken het gemiddelde VHN na de immersie.
4. Bepaal de ΔVHN voor elk monster.

7. Statistische analyse

1. Analyseer de microhardheidswaarden van Vickers met behulp van een ANOVA model van herhaalde metingen, met tijdstip (basislijn en post-immersie) als de factor binnen het onderwerp en het samengestelde type en de immersieoplossing als factoren tussen de onderwerpen.
2. Bereken indien passend ΔVHN-waarden als beschrijvende uitkomstmaten om de grootte van de microhardheidsverandering voor elk monster aan te geven.
3. Voer post-hoc paarwijze vergelijkingen uit met behulp van Tukey's honestly significant difference (HSD) test.
4. Bereken 95% betrouwbaarheidsintervallen voor alle groepsgemiddelden.
5. Rapporteer effectgroottes met gedeeltelijke eta-kwadraat (η²p) voor ANOVA-resultaten.
6. Vergelijk pH-waarden tussen wei-eiwitoplossingen met behulp van Welch's t-test.
7. Stel het statistische significantieniveau in op p < 0,05.
8. Naast absolute ΔVHN-waarden wordt ook een procentuele microhardheidsverandering berekend met de volgende formule: [(baseline VHN − post-immersie VHN) / baseline VHN] × 100.

Resultaten

Beschrijvende statistieken

De gemiddelde ΔVHN (±SD) waarden van de samengestelde oplossingscombinaties worden weergegeven in Tabel 1.

...

Harscomposiet	Oplossing	ΔVHN (Gemiddelde ± SD)	95% BI	n

Discussie

Het huidige protocol biedt een gestandaardiseerde benadering om de chemische impact van wei-eiwitdranken op de microhardheid van harscomposieten te evalueren. Kritieke stappen zijn onder meer uniforme monsterfabricage, gecontroleerde lichtuithardingscondities en gestandaardiseerde Vickers-testparameters. Het handhaven van consistente afmetingen van het monster en de uithardingsintensiteit is essentieel, aangezien variaties de mate van omzetting en mechanische stabiliteit kunnen beïnvloed...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aluminiumoxide polijstschijven	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turkije	5714	Medium, fijn, superfijn, gebruikt voor afwerking en polijsten
Analytische weegschaal			Gebruikt voor het wegen van materialen
Kunstmatige speekseloplossing	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turkije		Gebruikt voor opslag tussen onderdompelingscycli
Digitaal pH-meter	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	Meting van de pH van dranken
Gedestilleerd water	Niet gespecificeerd	Niet van toepassing	Gebruikt als controleoplossing en voor opslag van monsters
Glasmicroscoopglas	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China	7102	Gebruikt om een platte monstersoppervlak te verkrijgen tijdens composietplaatsing
Graderende cilinder	Niet gespecificeerd	Niet van toepassing	Gebruikt voor het meten van vloeistofmengsels
Hoog gevulde nano hybride harscomposiet (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokyo, Japan)	10942	Gebruikt als herstelmateriaal; verschilt in vulstofgehalte en harsmatrixsamenstelling
Incubator	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Duitsland	UN55	Gebruikt voor opslag bij 37 °C
Injecteerbare nano hybride harscomposiet (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Tokyo, Japan)	12365	Gebruikt als herstelmateriaal; verschilt in vulstofgehalte en harsmatrixsamenstelling
Laboratoriumbeker	Niet gespecificeerd	Niet van toepassing	Gebruikt voor de bereiding van weipoederoplossingen
Laboratoriumschudler	Niet gespecificeerd	Niet van toepassing	Gebruikt voor het mengen en homogeniseren van oplossingen
LED-lichthardende unit en radiometer	Woodpecker LED-hardingseenheid (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China)	FD-300	Polymerisatie en  verificatie van lichtintensiteit
Micromotor handpiece	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan	C1056002	Gebruikt in polijstprocedure
Matig gevulde nano hybride harscomposiet (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)	6570A2	Gebruikt als herstelmateriaal; verschilt in vulstofgehalte en harsmatrixsamenstelling
Siliconemolden	Niet gespecificeerd	Niet van toepassing	Schijfvormig, 6 mm diameter × 2 mm dikte, gebruikt voor monsterfabricage
Vickers microhardheidsmeter	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan	HMV-G31	Vickers hardheidsgetal (VHN) testen
Weipoederconcentraat	Weipoeder Aardbeien Smaak, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkije		Lactosegehalte: ~1–2%, eiwitgehalte: ~85–90%
Weipoederisolaat	Isoleer Wei Chocolade Smaak, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkije		Lactosegehalte: ~4–6%, eiwitgehalte: ~70–80%