Onderzoeksartikel

Vertegenwoordigende gerichte moleculaire en genomische karakterisering van virulentiegenen in Staphylococcus aureus na diabetische voetinfecties

DOI:

10.3791/71373

⸱

29 mei 2026

 ,  , 
1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie karakteriseerde de mechanismen van antimicrobiële resistentie, virulentiedeterminanten en genomische kenmerken van Staphylococcus aureus-isolaten die zijn hersteld na diabetische voetinfecties met behulp van antimicrobiële vatbaarheidstesten, PCR-gebaseerde virulentieprofilering en whole-genoomsequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetische voetinfecties (DFI's) vormen een groot probleem voor de volksgezondheid, en de methicillineresistente Staphylococcus aureus (MRSA) behoort tot de meest klinisch significante ziekteverwekkers. Deze studie onderzocht de prevalentie van virulentiegenen (can en hlg), antimicrobiële resistentieprofielen en representatieve genomische kenmerken van multidrugresistente S. aureus-isolaten die werden teruggevonden bij patiënten met DFI's. Tussen januari en december 2024 werd een dwarsdoorsnede-observationele studie uitgevoerd bij 125 patiënten met diabetische voetinfecties. Antimicrobiële gevoeligheidstesten werden uitgevoerd met de Kirby–Bauer schijfdiffusiemethode en cefoxitinescreening volgens de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), waarbij S. aureus ATCC 25923 werd gebruikt als kwaliteitscontrole-stam. Vancomycine gevoeligheid werd bevestigd door testen met minimale inhibitieconcentratie (MIC). Polymerasekettingreactie (PCR) werd gebruikt om de virulentiegenen (can en hlg) en blaOXA-groep I genen te detecteren. Whole-genome sequencing (WGS) werd uitgevoerd op twee representatieve isolaten, waaronder één multidrugresistent (MDR) isolaat en één extensief geneesmiddelresistent (XDR) isolaat, waarbij een de novo sequencingbenadering werd gebruikt om conceptgenoomassemblages te genereren. Onder 125 klinische monsters werd bacteriële groei waargenomen in 90 monsters (72%), waarvan 45 isolaten (50%) werden geïdentificeerd als S. aureus. Van deze isolaten werden 35/45 (77,78%) geclassificeerd als MRSA, en 36/45 (80%) multiresistent. Het hlg-gen werd in alle isolaten gedetecteerd, terwijl het can-gen werd geïdentificeerd in 13/45 (28,89%) isolaten. Er werden geen blaOXA-groep I genen gedetecteerd. Genomische analyse identificeerde meerdere resistentie-geassocieerde genen, waaronder blaZ, tet(38), norA en vanT, samen met CRISPR-Cas-elementen en plasmide-geassocieerde resistentiedeterminanten. Deze bevindingen benadrukken de hoge prevalentie van multidrugresistente S. aureus in DFI's en ondersteunen het belang van voortdurende genomische surveillance van klinisch relevante resistente stammen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Talrijke kolonisatie- en virulentiekenmerken maken de grampositieve bacterie Staphylococcus aureus (S. aureus) tot een veelvoorkomend opportunistisch pathogeen dat in staat is een breed scala aan infecties te veroorzaken, waaronder impetigo, wondinfecties, furunkels, huidabcessen, bacteremie en infectieuze endocarditis1. Sommige van deze infecties kunnen uitgroeien tot ernstige ziekte en vereisen ziekenhuisopname, vooral bij patiënten met diabetes mellitus, immunosuppressie, maligniteit, urinekatheterisatie of een infectie met het humaan immunodeficiëntievirus1.

Methicillineresistente S. aureus (MRSA) stammen worden geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit vanwege hun vermogen om snel antimicrobiële resistentie-determinanten te verwerven en te blijven bestaan in zorgomgevingen1. Patiënten met diabetes mellitus ontwikkelen vaak diabetische voetzweren door neuropathie, vasculaire insufficiëntie en verzwakte immuunresponsen2. Diabetische voetinfecties (DFI's) hebben een complexe pathofysiologie, en klinische uitkomsten worden beïnvloed door zowel microbiële als gastheer-geassocieerde factoren, waaronder bacteriële virulentie3. Hoewel diabetische voetzweren polymicrobiële gemeenschappen kunnen bevatten die bestaan uit aerobe en anaerobe bacteriën en schimmels, blijft S. aureus een van de belangrijkste pathogenen die uit deze infecties worden geïsoleerd4. Het organisme bezit verschillende virulentie-determinanten die immuunontwijking, weefselinvasie, chronische kolonisatie en aanhoudende infecties mogelijk maken. Bovendien heeft de verwerving van mecA/SCCmec-gemedieerde methicillineresistentie en andere antimicrobiële resistentiedeterminanten de therapeutische opties voor DFI-geassocieerde infecties aanzienlijk beperkt 4,5. Eerdere studies rapporteerden een hoge prevalentie van multidrugresistente (MDR) S. aureus-isolaten bij diabetische voetinfecties, waarbij resistentie vaak geassocieerd is met β-lactamase-genen, waaronder blaTEM, blaOXA en blaCTX-M variant6.

Verschillende virulentie-geassocieerde genen dragen bij aan de pathogeniciteit en persistentie van S. aureus bij chronische wondinfecties. Hiervan codeert het hlg-gen γ-hemolysine, een cytotoxische factor die geassocieerd is met weefselvernietiging, ontsteking, immuunomzeiling en persistentie van in de gemeenschap verkregen MRSA-stammen 7,8. Het can-gen codeert voor een collageenbindende adhesin die de bacteriële hechting aan collageenrijke weefsels faciliteert en bijdraagt aan chronische kolonisatie en persistentie van infecties8. Eerdere onderzoeken identificeerden een hoge prevalentie van hlg onder MRSA-isolaten die hersteld zijn van diabetische voetinfecties, met nadruk op het gelijktijdig voorkomen van virulentie- en antimicrobiële resistentie-determinanten in deze infecties9. Onjuiste blootstelling aan antibiotica, langdurige ziekenhuisopname, verminderde weefselpenetratie van antimicrobiële middelen en chronische wondprogressie dragen verder bij aan het ontstaan en de verspreiding van MDR-organismen bij patiënten met DFIs10. Volgens internationale definities vertonen multidrugresistente (MDR) bacteriën resistentie tegen ten minste één antimicrobieel middel in drie of meer antimicrobiële klassen, blijven extensief resistente (XDR) bacteriën vatbaar voor slechts één of twee antimicrobiële klassen, en pandrug-resistente (PDR) bacteriën zijn resistent tegen alle geteste antimicrobiële klassen10. Ondanks het erkende klinische belang van S. aureus bij diabetische voetinfecties, blijft er beperkte geïntegreerde moleculaire en genomische informatie die virulentiedeterminanten koppelt aan antimicrobiële resistentieprofielen in klinische isolaten uit deze regio.

Daarom was deze studie gericht op het karakteriseren van patronen van antimicrobiële resistentie, het bepalen van de prevalentie van geselecteerde virulentiegenen (hlg en can), het voorkomen van blaOXA-groep I genen te onderzoeken en representatieve whole-genome sequencing-analyses uit te voeren van geselecteerde multidrugresistente S. aureus-isolaten die zijn teruggevonden bij patiënten met diabetische voetinfecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bestudeer patiënten

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Goedkeuringscommissie van de Universiteit van Anbar, Ministerie van Hoger Onderwijs en Wetenschappelijk Onderzoek, Irak (Goedkeuringsnummer 145), Ramadi City, gouvernement Anbar, Irak, op 24 december 2023. Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen van de Universiteit van Anbar. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan inschrijving.

Van januari tot december 2024 werd een dwarsdoorsnede-observationele studie uitgevoerd in Ramadi Teaching Hospitals en aanverwante privéklinieken in het gouvernement Anbar, Irak. In totaal werden tijdens de studieperiode 125 opeenvolgende in aanmerking komende patiënten met diabetische voetinfecties (DFI's) ingeschreven. De steekproefgrootte werd bepaald op basis van het aantal beschikbare beschikbare patiënten tijdens de studieperiode, in plaats van door statistische berekeningen. Klinisch werd DFI gedefinieerd als de aanwezigheid van een voetzweer van welke graad dan ook bij patiënten met type 1 diabetes mellitus (T1DM) of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Mannelijke en vrouwelijke patiënten met verschillende zwerenernst werden opgenomen.

Patiënten kwamen in aanmerking als zij een klinisch gediagnosticeerde diabetische voetzweer hadden, de deelnemende zorginstellingen bezochten en geïnformeerde toestemming gaven. Uitsluitingscriteria omvatten voetzweren die niet gerelateerd zijn aan diabetes mellitus (bijv. traumatische zweren), verwijzing vanuit andere zorginstellingen, onvermogen om geïnformeerde toestemming te geven vanwege kritieke ziekte, ontvangst van antibioticatherapie binnen 48 uur vóór de monsterafname en polymicrobiële infecties. Patiënten met polymicrobiële infecties werden uitgesloten om een nauwkeurige fenotypische, moleculaire en genomische karakterisering van Staphylococcus aureus-isolaten te waarborgen. Demografische en klinische gegevens, waaronder leeftijd, geslacht, diabetische complicaties, duur van diabetes mellitus, antibioticageschiedenis en comorbide aandoeningen, werden verzameld met behulp van een gestructureerde vragenlijst.

Klinische monsters werden binnen 2 uur na de verzameling onder gekoelde omstandigheden (4 °C) naar het microbiologisch laboratorium vervoerd met behulp van steriele transportwattenstaafjes met Amies-medium en onmiddellijk verwerkt voor microbiologische analyse. Alle procedures waarbij klinische monsters, bacteriële culturen, antimicrobiële gevoeligheidstesten, polymerasekettingreactie (PCR) en ultraviolet (UV) visualisatie betrokken zijn, zijn uitgevoerd onder laboratoriumomstandigheden van Biosafety Level 2 (BSL-2) volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Laboratoriumpersoneel gebruikte passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder laboratoriumjassen, wegwerphandschoenen, chirurgische mondkapjes en oogbescherming indien nodig. Strikte aseptische procedures werden gevolgd bij alle microbiologische en moleculaire procedures om besmetting en blootstellingsrisico's te minimaliseren. Speciale werkruimtes werden gebruikt voor het hanteren van bacteriële kweek en DNA-amplificatieprocedures om kruisbesmetting te voorkomen. Besmette materialen, waaronder kweekplaten, wattenstaafjes, pipettips en wegwerpartikelen, werden geautoclaveerd bij 121 °C en 15 psi gedurende 15–20 minuten voordat ze werden afgevoerd. Scherpe voorwerpen werden weggegooid in aangewezen doorboorde biohazard-containers. Biologisch afval werd beheerd volgens institutionele protocollen voor de verwerking van biomedisch afval. Deze bioveiligheidsmaatregelen zorgden voor de veilige omgang met multiresistente organismen, waaronder MRSA en vancomycineresistente isolaten (Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de klinische, microbiologische, moleculaire, whole-genome sequencing en bio-informatica workflow die in de studie wordt gebruikt. De figuur vat monsterverzameling, microbiologische kweek, antimicrobiële gevoeligheidstesten, PCR-gebaseerde moleculaire detectie, whole-genome sequencing en downstream bioinformatica-analyses samen. Deze figuur werd gegenereerd met hulp van het AI-gebaseerde ontwerpplatform Gamma Pro (Gamma App) en vervolgens door de auteurs beoordeeld, herzien en gevalideerd op wetenschappelijke nauwkeurigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De gegevens werden geanalyseerd met SPSS-software versie 22.0. Beschrijvende statistieken, waaronder gemiddelden en percentages, werden berekend. Associaties tussen categorische variabelen werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraattest. Een p-waarde <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

2. Verwerking en verzameling van monsters

Monsters werden verzameld uit het diepere deel van diabetische voetzweren met behulp van de diepe swab-techniek. Twee steriele wattenstaafjes, vooraf bevochtigd met steriele bouillon, werden na debridatie met een steriel scalpel stevig over de wondbasis gedraaid en gereinigd met steriele zoutoplossing om besmetting door koloniserende micro-organismen te minimaliseren. Eén wattenstaaf werd gebruikt voor Gram-kleuring, terwijl de tweede werd gebruikt voor microbiologische kweek. Direct Gram-gekleurde uitstrijkjes werden microscopisch onderzocht.

Botweefselmonsters werden verkregen van patiënten met klinisch vermoedelijke osteomyelitis onder steriele omstandigheden na chirurgische debridement. Voorafgaand aan de monsterafname werden de oppervlakken van zweren gereinigd met steriele normale zoutoplossing om oppervlakkige besmetting te verminderen. Botweefselmonsters werden aseptisch verzameld met steriele chirurgische instrumenten en onmiddellijk overgebracht naar steriele containers voor microbiologische verwerking.

Exemplaren werden gehomogeniseerd of fijngehakt onder steriele omstandigheden en geïnënt op bloedagar, Mannitol Salt Agar (MSA), MacConkey agar en nutriëntagar. Platen werden aerob geïncubeerd bij 37 °C gedurende 18–24 uur. Bloedagar en nutriëntenagar ondersteunden de groei van gram-positieve en gram-negatieve organismen, terwijl MSA werd gebruikt voor selectieve isolatie en differentiatie van Staphylococcus-soorten , waaronder S. aureus. MacConkey-agar werd gebruikt voor het terugwinnen van gramnegatieve bacteriën. Kweekplaten werden na de incubatie onderzocht, en exemplaren zonder zichtbare groei na 48 uur werden gerapporteerd als "geen groei."

Voorlopige bacteriële identificatie was gebaseerd op koloniemorfologie, gramkleuring en biochemische kenmerken, gevolgd door moleculaire bevestiging van S. aureus met PCR-amplificatie van het nuc-gen . Biochemische identificatie omvatte catalasetesten, glaas- en buiscoagulasetests, mannitolfermentatie en DNase-testen. Bevestigde isolaten werden verder geïdentificeerd met het VITEK 2 Compact-systeem met de VITEK 2 GP-identificatiekaart. Identificatieresultaten werden alleen geaccepteerd wanneer het betrouwbaarheidsniveau ≥95% was. Discordante of laag-confidence resultaten werden opnieuw getest met herhaalde biochemische analyse en herhaalde VITEK-tests. Zuivere isolaten werden bewaard in 20% glycerol bereid in een hersenhartinfuus (BHI) bouillon voor latere moleculaire en genomische analyses (Figuur 1).

3. Antimicrobiële gevoeligheidstesten

Antimicrobiële gevoeligheidstests werden uitgevoerd met behulp van de Kirby–Bauer schijfdiffusiemethode volgens de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2022. Er werd getest op Mueller–Hinton-agar met een gestandaardiseerde agardiepte van 4 mm. Verse bacteriële culturen werden aangepast naar een 0,5 McFarland-standaard met behulp van een densitometer vóór de inenting. Steriele wattenstaafjes werden gebruikt om agaroppervlakken gelijkmatig te inoculeren.

De volgende antimicrobiële schijven werden gebruikt: ampicilline (10 μg), gentamicine (10 μg), amicacine (30 μg), cefoxitine (30 μg), cefuroxim (30 μg), piperacilline/tazobactam (100/10 μg), meropenem (10 μg), amoxicilline–clavulaanzuur (30 μg), oxacilline (1 μg), levofloxacine (5 μg), clindamycine (2 μg), tigecycline (15 μg), ciprofloxacine (5 μg), erytromycine (15 μg), trimethoprim–sulfamethoxazol (25 μg), linezolid (30 μg), en vancomycine (30 μg). Platen werden aerob geïncubeerd bij 37 °C gedurende 16–18 uur. Zonediameters werden geïnterpreteerd volgens CLSI-breekpunten.

Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) werd geïdentificeerd met behulp van cefoxitine (30 μg) screening volgens CLSI-aanbevelingen. Kwaliteitscontroletests werden uitgevoerd met S. aureus ATCC 25923. Alle experimenten werden dubbel uitgevoerd om reproduceerbaarheid te waarborgen. Multidrugresistente (MDR), extensief medicijnresistente (XDR) en pandrugresistente (PDR) isolaten werden geclassificeerd volgens internationale standaarddefinities op basis van antimicrobiële resistentieprofielen (Figuur 1).

4. Detectie van methicillineresistente S. aureus (MRSA)

Een cefoxitine (30 μg) schijfdiffusietest werd gebruikt als fenotypische methode voor MRSA-detectie. Isolaten met inhibitiezones ≥22 mm werden geclassificeerd als methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA), terwijl isolaten met inhibitiezones ≤21 mm werden geclassificeerd als MRSA volgens CLSI-criteria (Figuur 1).

5 Bepaling van Vancomycine-resistentie door Minimum Inhibitory Concentration (MIC) testen

Vancomycine minimale remmende concentraties (MIC's) werden bepaald met de bouillonmicroverdunningsmethode volgens CLSI-richtlijnen11. Seriële tweevoudige verdunning van vancomycine (4–512 μg/mL) werden bereid in Mueller–Hinton-bouillon. Bacteriële suspenties werden aangepast naar een McFarland-standaard van 0,5 en verdund tot ongeveer 1 × 105 CFU/mL.

Na incubatie bij 37 °C gedurende 24 uur werd de MIC gedefinieerd als de laagste concentratie waarbij geen zichtbare bacteriële groei werd waargenomen. Vancomycine gevoeligheid werd volgens CLSI-criteria als volgt geïnterpreteerd: vatbaar (≤2 μg/mL), intermediair (4–8 μg/mL) en resistent (≥16 μg/mL)11,12 (Figuur 1).

6. Moleculaire detectie

6.1 DNA-extractie

Isolaten van Staphylococcus aureus werden 24 uur gekweekt in een hersenhartinfusie (BHI) bouillon bij 37 °C. Bacterieel genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van een commerciële kit en een geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem. Het geëxtraheerde DNA werd opgeslagen bij −20 °C tot gebruik. De DNA-concentratie werd gemeten met een fluorometer om de geschiktheid voor PCR-amplificatie te evalueren. De gemiddelde DNA-concentratie was 85 ± 8,2 ng/μL.

Primers gericht op de can-, hlg- en klasse D β-lactamase (blaOXA-groep I) genen werden commercieel verkregen en gebruikt voor PCR-amplificatie zoals vermeld in Tabel1 13,14,15,16.

Tabel 1: Primersequenties gebruikt voor PCR-amplificatie van doelgenen die in deze studie zijn onderzocht. De tabel vat de doelgenen, primersequenties, verwachte amplicongroottes, annealingtemperaturen en referenties samen die worden gebruikt voor PCR-amplificatie van nuc-, mecA-, hlg-, can- en blaOXA-groep I-genen in Staphylococcus aureus-isolaten die zijn hersteld van diabetische voetinfecties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

6.2 Moleculaire detectie van virulentie en klasse D β-Lactamase (blaOXA-groep I) genen door PCR

De primersequenties die in deze studie zijn gebruikt, zijn vermeld in Tabel 1. PCR-amplificatie van mecA, nuc, virulentie-geassocieerde genen en klasse D β-lactamase (blaOXA-groep I) genen werd uitgevoerd in 25 μL reactiemengsels met 12,5 μL GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL MgCl2, 3 μL genomisch DNA-template, 1 μL elk van voor- en omgekeerde primers (10 pmol/μL), en 7 μL nucleasevrij water.

Thermische cycluscondities bestonden uit een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 30–35 versterkingscycli, waaronder denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s–1 min, annealing bij 50–62 °C gedurende 30 s–1 min, afhankelijk van de primerset, en extensie bij 72 °C voor 30 s–1 min. De laatste verlenging vond plaats bij 72 °C gedurende 7–19 minuten.

Versterkte PCR-producten werden gescheiden op 1,5%–2% agarosegels die met Safe Red waren gekleurd en onder ultraviolet licht werden gevisualiseerd met behulp van een geldocumentatiesysteem. Bij elke PCR-run werden negatieve controles opgenomen om de validiteit van de amplificatie te bevestigen.

7. Whole-genome sequencing (WGS)

Whole-genome sequencing (WGS) werd uitgevoerd op twee representatieve klinische Staphylococcus aureus-isolaten die werden teruggevonden uit botweefselmonsters afkomstig van patiënten met diabetische voetinfecties. De geselecteerde isolaten omvatten één multidrugresistent (MDR) en één extensief medicijnresistent (XDR) isolaat, geïdentificeerd door fenotypische antimicrobiële vatbaarheidstests en MIC-bevestigde resistentieprofielen. Deze strategie maakte representatieve genomische karakterisering van klinisch relevante resistente isolaten mogelijk (Figuur 1).

De kwaliteit, concentratie en integriteit van genomisch DNA werden vóór sequencing geëvalueerd om geschiktheid voor bibliotheekvoorbereiding en downstream bio-informatische analyse te waarborgen. DNA werd gekwantificeerd met een fluorometer en de integriteit werd geverifieerd door 1% agarosegelelektroforese bij 150 V gedurende 40 minuten. DNA-fragmenten van ongeveer 200–400 bp werden op maat geselecteerd met magnetische kraalzuivering, gevolgd door eindreparatie, 3′ adenylatie en adapterligatie.

Enkelstrengs circulaire DNA-moleculen werden gegenereerd door amplificatie, zuivering en circularisatie van adaptor-ligeerde fragmenten met behulp van spalkoligonucleotiden. DNA-nanoballen (DNB's) werden vervolgens gegenereerd door rolling-circle amplification. Sequencing werd uitgevoerd op het DNBSEQ-platform met behulp van combinatorische Probe-Anchor Synthesis (cPAS) chemie.

Ruwe sequencing-reads ondergingen kwaliteitscontroleprocedures om laagwaardige reads, adapterbesmetting, ambigue reads en dubbele sequenties te verwijderen. Schone metingen werden gebruikt voor downstream-analyses. Genoomassemblage werd uitgevoerd om de genoomgrootte, GC-inhoud en de dekdiepte van de sequencing te schatten. De definitieve concept-genoomassemblages werden gegenereerd in FASTA-, GenBank- en NCBI-indieningsformaten.

Genoomannotatie identificeerde coderende sequenties (CDS), transfer RNA (tRNA), ribosomaal RNA (rRNA) en kleine RNA (sRNA) genen. Functionele annotatie van voorspelde genen werd uitgevoerd met behulp van meerdere databases, waaronder Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB en CARD, voor virulentie- en antimicrobiële resistentie-geassocieerde genen.

8. Bio-informatica analyse

Genoomassemblage en -annotatie werden uitgevoerd met behulp van het Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center (BV-BRC). Fylogenetische analyses werden uitgevoerd met behulp van PATRIC-instrumenten. Circulaire genoomvisualisatiekaarten werden gegenereerd om coderingssequenties, GC-inhoud, GC-scheefheid, determinanten van antimicrobiële resistentie, virulentie-geassocieerde genen en mobiele genetische elementen te illustreren.

Fylogenetische relaties werden bepaald met behulp van PATRIC globale eiwitfamilies (PGFams) die werden geïdentificeerd uit de dichtstbijzijnde referentiegenomen met behulp van Mash/MinHash-analyse. Eiwituitlijningen werden gegenereerd met behulp van MUSCLE, en overeenkomstige nucleotide-uitlijningen werden in kaart gebracht naar eiwitfamilies. Fylogenetische bomen zijn geconstrueerd met RAxML en snelle bootstrapping-analyse (Figuur 1).

Genoomcontigs werden bovendien geanalyseerd met Pathogenwatch voor soortbevestiging en detectie van antimicrobiële resistentiegenen. Virulentie-geassocieerde genen werden geanalyseerd met behulp van ABRicate. De PATRIC Genome Annotation Service gebruikte een k-mer-gebaseerde benadering om antimicrobiële resistentiegenen te identificeren en functionele annotaties, antimicrobiële klassen en resistentiemechanismen toe te wijzen. Circulaire genoomvisualisaties van representatieve MDR- en methicillineresistente S. aureus-isolaten werden gegenereerd zoals eerder beschreven17. Aanvullende Tabel 1 vat alle bioinformatica-tools, softwareversies, databases en analytische parameters samen die worden gebruikt in de genomische analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monsterverwerking en kweekpositiviteit

In totaal werden 125 klinische monsters verzameld en geanalyseerd in deze studie. Bacteriële groei werd waargenomen in 90 van de 125 monsters (72%). Deze kweekpositieve monsters werden vervolgens verwerkt voor bacteriële identificatie en antimicrobiële gevoeligheidstesten. Beschrijvende statistieken, waaronder frequenties en percentages, werden gebruikt om de verdeling van bacteriële isolaten onder alle k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetische voetinfecties (DFI's) veroorzaakt door multidrugresistente (MDR) micro-organismen nemen wereldwijd toe, waarbij slechte glycemische controle en onvoldoende voethygiëne bijdragen aan een toename van morbiditeit en sterfte 18,19,20,21. Hoewel DFI's vaak polymicrobieel zijn, blijft Staphylococcus aureus een van de belangrijkste ziekteverwekker...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die invloed hadden kunnen hebben op het werk dat in deze studie wordt gerapporteerd.

Bijdrage aan het auteurschap:

Shaymaa H. Al-Kubaisy droeg bij aan de conceptualisering, methodologieontwikkeling, onderzoek, formele analyse en voorbereiding van het oorspronkelijke conceptmanuscript. Rawaa A. Hussein droeg bij aan de validatie, het onderzoek en de voorbereiding van het oorspronkelijke conceptmanuscript. Mushtak T.S. Al-Ouqaili droeg bij aan conceptualisatie, supervisie, projectadministratie, onderzoek en manuscriptbeoordeling en redactie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen het gebruik van het AI-gebaseerde ontwerpplatform Gamma Pro (Gamma App) voor het genereren van Figuur 1. Alle gegenereerde inhoud werd zorgvuldig beoordeeld, bewerkt en gevalideerd door de auteurs om wetenschappelijke nauwkeurigheid, consistentie en integriteit te waarborgen. De auteurs ontvingen geen financiële steun voor het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Abricate SoftwareGitHub (T. Seemann)Open-sourceVirulentiegendetectie
AgaroseInvitrogen, USA16500-500Gelelektroforese
Agencourt AMPure XP KitBeckman CoulterA63881DNA-zuivering en grootteselectie
Amikacin (30 µg) DiscOxoid, UKCT0107BAST
Antibiotic Discs (Ampicillin 20 µg)Oxoid, UKCT0003BAntimicrobiële gevoeligheidstest
Blood Agar BaseOxoid, UKCM0055Isolatie van Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën
Brain Heart Infusion (BHI) BrothOxoid, UKCM1135Cultiveren en opslag van isolaten
Cefoxitin (30 µg) DiscOxoid, UKCT0119BMRSA-detectie
Cefuroxime (30 µg) DiscOxoid, UKCT0026BAST
Ciprofloxacin (5 µg) DiscOxoid, UKCT0425BAST
Clindamycin (2 µg) DiscOxoid, UKCT0064BAST
DNBSEQ PlatformBGI, ChinaVariousVolle genoomsequentie
Erythromycin (15 µg) DiscOxoid, UKCT0020BAST
FastQCSimon Andrews at the Babraham Institute (Babraham Bioinformatics)NAwachtrijsysteem
Gel Documentation SystemBio-Rad, USAGel Doc™ XR+Beeldvorming van elektroforese-gels
Gentamicin (10 µg) DiscOxoid, UKCT0024BAST
Glycerol (Molecular Grade)Sigma-AldrichG5516Gebruikt bij 20% voor langdurige isolaatbewaring
GoTaq Green Master Mix (2×)Promega, USAM7122PCR-amplificatiemix
Levofloxacin (5 µg) DiscOxoid, UKCT1587BAST
Linezolid (30 µg) DiscOxoid, UKCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, UKCM0007Selectief medium voor Gram-negatieve bacteriën
Mannitol Salt Agar (MSA)Oxoid, UKCM0085Selectief/differentieel medium voor Staphylococcus spp.
Meropenem (10 µg) DiscOxoid, UKCT0774BAST
MgCl2 SolutionPromega, USAVariousPCR-reactiecomponent
Mueller-Hinton AgarOxoid, UKCM0337Gebruikt voor Kirby–Bauer schijfdiffusie-test
MUSCLE Alignment ToolOpen-sourceVariousEiwitsequentie-uitlijning
Nuclease-Free WaterPromega, USAP1193PCR-reactiecomponent
Nutrient AgarOxoid, UKCM0003Algemeen gebruiksmedium
Oxacillin (1 µg) DiscOxoid, UKCT0159BAST
PathogenWatchWellcome Sanger InstituteOnline ToolSoort ID & AMR-gendetectie
PATRIC / BV-BRCBacterial Bioinformatics Resource CenterOnline PlatformGenoomsamenstelling & annotatie
Piperacillin/Tazobactam (100/10 µg) DiscOxoid, UKCT1628BAST
Proksee Genome Visualization ToolUniversity of TorontoOnline ToolGenoomkaartvisualisatie
Quantus FluorometerPromega, USAE6150DNA-kwantificering
Qubit FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238DNA-kwantificering voor WGS
RAxML SoftwareOpen-sourceVariousFylogenetische analyse
S. aureus ATCC 25923ATCC, USA25923Kwaliteitscontrolestrain voor AST
Safe Red StainiNtRON BiotechnologyVariousDNA-gelkleuring
SaMag Bacterial DNA Extraction KitSacace Biotechnologies, ItalyVariousGenoom-DNA-extractie
SaMag-12 Automated Extraction SystemSacace Biotechnologies, ItalySMG-12Geautomatiseerde nucleïnezuurextractor
Steriele katoenen wattenVerschillende fabrikantenVariousGebruikt voor diepe wattentechniek voor monsterverzameling
Steriele fysiologische zoutoplossingVerschillende fabrikantenVariousGebruikt voor het wassen van het oppervlak van de zweer voor bemonstering
Steriele scalpelmesjesVerschillende fabrikantenVariousGebruikt voor debridement van de zweer voorafgaand aan bemonstering
Tigecycline (15 µg) DiscOxoid, UKCT1849BAST
Trimethoprim-Sulfamethoxazole (25 µg) DiscOxoid, UKCT0052BAST
UV TransilluminatorVerschillende fabrikantenVariousVisualisatie van PCR-producten
Vancomycin (30 µg) DiscOxoid, UKCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMérieux, FranceVariousGeautomatiseerd identificatiesysteem
VITEK 2 GN ID CardsBioMérieux, FranceVariousIdentificatie van Gram-negatieve bacteriën

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

methicilline resistentantimicrobi le resistentiewhole genome sequencingmultidrug resistentpolymerasekettingreactiegenomische surveillanceKirby Bauer methode
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen