Van weefsel naar morfometrie: Een stapsgewijze Golgi–Cox-workflow voor de analyse van neuronale en dendritische wervelkolom bij volwassen muizen

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een stapsgewijze methode voor Golgi–Cox-kleuring bij volwassen muizen, waarbij oplossingsvoorbereiding, weefselimpregnatie, cryoprotectie, sectie, ontwikkeling en montage worden behandeld. Het legt de nadruk op weefselbehoud en homogene, laag-achtergrondkleuring, waardoor een duidelijke visualisatie van neuronale morfologie mogelijk is. De methode labelt dendritische arborras en ondersteunt kwantitatieve morfometrische analyse van dendritische stekels.

Samenvatting

Analyse van neuronale morfologie in gezondheid en ziekte is fundamenteel voor het begrijpen van hersenfunctie en het beoordelen van de effecten van experimentele interventies. Golgi–Cox-kleuring blijft een klassieke, maar zeer relevante techniek om volledige neuronale arboren en dendritische stekels te visualiseren. Gepubliceerde protocollen verschillen echter vaak in kritieke procedurele stappen en missen vaak essentiële methodologische details, wat leidt tot aanzienlijke variatie in kleurkwaliteit en het tijdrovend en uitdagend maken van standaardisatie in het laboratorium. Hier wordt een uitgebreid, stapsgewijs Golgi–Cox-protocol voor volwassen muizen gepresenteerd, dat de volledige workflow omvat, van in vivo verwerking en weefselverwerking tot beeldvorming en morfometrische gegevensextractie. Het beschrijft praktische overwegingen en veelvoorkomende valkuilen die de impregnatie-efficiëntie, doorsnedeintegriteit en signaal-ruisverhouding beïnvloeden, en biedt methodologische richtlijnen om de reproduceerbaarheid te verbeteren. Over het algemeen maakt dit protocol betrouwbare visualisatie en kwantitatieve analyse van hele neuronen, dendritische segmenten en dendritische stekels mogelijk. Er wordt verwacht dat deze bron de implementatie van Golgi–Cox-kleuring met meer consistentie, transparantie en technische nauwkeurigheid zal vergemakkelijken, terwijl het een duidelijk kader biedt om de methode aan te passen aan diverse laboratoriumomgevingen.

Inleiding

Het algemene doel van de Golgi–Cox-kleurmethode is het mogelijk maken van een hoogwaardige visualisatie van volledige neuronale morfologie, inclusief dendritische arbors en dendritische stekels, in gefixeerd hersenweefsel 1,2,3,4. Deze techniek maakt gedetailleerde structurele analyse van individuele neuronen binnen complexe neurale circuits mogelijk, waardoor het bijzonder waardevol is voor studies naar synaptische plasticiteit, neuroontwikkeling, neurodegeneratie en ervaringsafhankelijke structurele remodellering ^5,6.

De reden voor de ontwikkeling en het voortgezet gebruik van op Golgi gebaseerde methoden ligt in hun unieke vermogen om spaarzame en volledige neuronale impregnatie^te produceren ^1,2. Oorspronkelijk beschreven door Camillo Golgi in 1873 en verfijnd in 1891 door Cox ^7,8, is de methode gebaseerd op de precipitatie van zilverchromaat binnen een beperkte subset neuronen, waardoor volledige morfologische reconstructie mogelijk is zonder overlappende labeling³. De Golgi–Cox-modificatie vervangt het zilvernitraat dat in de oorspronkelijke Golgi-methode werd gebruikt door mercurchloride, wat de weefselpenetratie en consistentie van de kleuring^{verbetert 2}. In vergelijking met alternatieve neuronale labelingtechnieken zoals fluorescerende eiwitexpressie, virale tracering of kleurstofvulling, biedt Golgi–Cox-kleuring verschillende voordelen. Het vereist geen genetische manipulatie, stereotaxische injecties of gespecialiseerde microscopieapparatuur, en het maakt visualisatie van dendritische stekels met hoog contrast mogelijk onder brightfield-microscopie ^1,2. Hoewel moderne fluorescentie-gebaseerde methoden celtypespecificiteit bieden, blijft Golgi–Cox-kleuring bijzonder voordelig voor onbevooroordeelde morfologische bemonstering ^9,10 en voor gebruik in soorten of experimentele omstandigheden waar transgene instrumenten niet beschikbaar zijn.

Binnen de bredere literatuur zijn Golgi-gebaseerde methoden uitgebreid toegepast om dendritische wervelkolomdichtheid en morfologie te kwantificeren in studies naar leren en geheugen⁵, stress- en psychiatrische stoornissen¹¹, leeftijd¹² en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 12,13,14. Het voortdurende gebruik ervan over decennia onderstreept de betrouwbaarheid voor structurele neuroanatomie². Deze methode is bijzonder geschikt voor onderzoekers die dendritische architectuur en wervelkolommorfologie in hersenweefsel analyseren wanneer volledige celvisualisatie^{vereist is}. Het is zeer geschikt voor vergelijkende morfologische studies tussen experimentele groepen. Onderzoekers die celtype-specificiteit, live imaging of moleculaire colocalisatie vereisen, kunnen echter meer profiteren van fluorescerende of genetisch gecodeerde labelingbenaderingen ^9,10.

Protocol

Volwassen vrouwelijke wildtype B6129SF2/J muizen (n = 3) werden in deze studie gebruikt. Vergelijkbare kleuring kan echter bij beide geslachten in de volwassen fase worden uitgevoerd. Alle experimentele procedures kregen eerdere goedkeuring van de Bio-ethische Commissie. (#117.A, Instituut voor Neurobiologie (INb), Nationale Autonome Universiteit van Mexico)

1. Voorbereiding van oplossingen

VOORZICHTIG: Merkuurchloride is zeer giftig en corrosief. Hanteer deze binnen een chemische dampkap terwijl je handschoenen, een labjas en oogbescherming draagt. Verwijder afval in een gelabelde container voor gevaarlijk afval. Kaliumdichromaat en kaliumchromaat zijn giftige en kankerverwekkende oxidatoren. Hanteer het in een chemische dampkap en vermijd huidcontact of inademing.

1. Bereid impregnatieoplossingen voor van de voorraad voor
   1. Weeg 15 g kaliumdichromaat. Los het op in 300 mL dubbel gedestilleerd water om een oplossing van 5% (w/v) te verkrijgen.
   2. Weeg 15 g kwikchloride. Los het op in 300 mL dubbel gedestilleerd water om een oplossing van 5% (w/v) te verkrijgen.
   3. Weeg 15 g kaliumchromaat. Los het op in 300 mL dubbel gedestilleerd water om een oplossing van 5% (w/v) te verkrijgen.
   4. Wikkel alle bakjes in aluminiumfolie en bewaar ze op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
2. Bereid Golgi–Cox-werkoplossing voor
   1. Meng 50 mL kaliumdichromaatoplossing, 50 mL mercurische chlorideoplossing en 40 mL kaliumchromaatoplossing.
   2. Voeg 100 ml gedestilleerd water toe en meng grondig.
   3. Incubeer het mengsel 48 uur op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
   4. Laat de neerslag zakken. Gebruik alleen de supernatant voor weefselimpregnatie.
      OPMERKING: De Golgi–Cox-oplossing kan tot 1 maand worden bewaard als deze beschermd wordt tegen licht. Om reagensafval te verminderen en versheid van de oplossing te waarborgen, bereid alleen het benodigde volume van zowel de voorraadoplossingen als de uiteindelijke Golgi–Cox-oplossing voor het experiment voor. Bereid minstens 23 mL per hersenen voor om 20 mL bruikbare supernatant te verkrijgen na neerslagverlies.
3. Bereid cryoprotectantoplossing voor
   1. Los 300 g sucrose op in 0,1 m fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, bereid met watervrij natriumfosfaatdibasisk, monogehydrateerd natriumfosfaatmonobas en natriumchloride.
   2. Stel het eindvolume in op 1 L.
   3. Bewaar tot een week op 4 °C.

2. Weefselverzameling en impregnatie

1. Voer intracardiale perfusie uit
   1. Verdoof het dier met natriumpentobarbital (252 mg/kg, i.p.). Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door het ontbreken van het terugtrekken van het pedaal voordat je verder gaat.
   2. Voer intracardiale perfusie uit met ongeveer 30 mL 0,1 M PBS (pH 7,4) totdat het effluent leeg is, zodat het bloed volledig uit het hersenweefsel wordt verwijderd. Er werd geen fixatief gebruikt; de Golgi–Cox-oplossing zelf dient als fixatief in deze workflow.
   3. Haal de hersenen voorzichtig uit en spoel ze af in gedestilleerd water. Zorg ervoor dat de hersenen goed worden doorbloed en vrij zijn van achtergebleven bloed (Figuur 1A).
2. Weefsel impregneren
   1. Verdeel de hersenen in hemisferen of coronale blokken (~3 mm dik) met behulp van een hersenmatrix om de bevruchting te verbeteren. Kleinere weefselblokken bevorderen een meer uniforme impregnatie en verminderen de variabiliteit, terwijl grotere monsters langere incubatietijden vereisen en mogelijk minder homogene kleuring vertonen.
   2. Plaats de hersenen in een 10 mL Golgi–Cox-oplossing. Bescherm tegen licht.
      OPMERKING: Een volume van 10 mL Golgi–Cox-oplossing is voldoende voor een volledig volwassen muizenbrein. Bij gebruik van een enkele hemisfeer of kleinere coronale blokken (~3 mm dikte) kan het volume van de oplossing proportioneel worden verminderd, mits het weefsel volledig ondergedompeld blijft. Als de hele hersenen worden gebruikt, wordt aanbevolen deze te doorsnijden terwijl het betreffende gebied behouden blijft om optimale reagenspenetratie en homogene impregnatie te waarborgen.
   3. Incubeer 24 uur op kamertemperatuur.
   4. Vervang door 10 mL verse Golgi–Cox-oplossing. Bred 10-14 dagen uit bij 22–25 °C in het donker.
      PAUZEPUNT: Bewaar weefsel tot 15 dagen in Golgi–Cox-oplossing zonder groot verlies van levensvatbaarheid.
      OPMERKING: Na Golgi–Cox-bevruchting ontwikkelt de hersenen een donkergouden uiterlijk en wordt zeer fragiel; behandel het daarom met zorg (Figuur 1B). Het gebruik van een plastic pincet voor manipulatie wordt aanbevolen om chemische reacties met staalmaterialen te voorkomen.

3. Cryobescherming

1. Breng het weefsel over in een cryoprotectieve oplossing van 10 mL (30% sucrose (w/v) in 0,1 M PBS, pH 7,4, bereid in stap 1.3).
2. Broed 24 uur (4 °C).
3. Bij dezelfde temperatuur (4 °C) vervang je met een verse cryoprotectieve oplossing en breng je minstens 4–7 dagen uit.
   PAUZEPUNT: Bewaar voor de sectie weefsel in cryoprotectieve oplossing tot 3 weken bij 4 °C.

4. Inbedding en doorsnijden

1. Inbedding van weefsel
   1. Bereid 8% (met alcohol) agarose in heet gedestilleerd water. Laat het afkoelen tot ongeveer 40 °C.
   2. Plaats het weefsel in inbeddingsmallen en oriënteer het op de juiste manier.
   3. Giet agarose over het weefsel en laat het 1 uur bij kamertemperatuur stollen, of 30 minuten bij 4 °C (Figuur 1C).
   4. Knip overtollige agarose uit het blok (Figuur 1D).
2. Sectieweefsel
   1. Bevestig het agaroseblok op het vibratoomstadium met lijm. (Figuur 1E)
   2. Vul de snijkamer met een cryoprotectantoplossing.
   3. Snijd weefsel in sectie van 100–200 μm dikte. Dunnere secties (bijv. 100–120 μm) worden aanbevolen voor dendritische wervelkolomanalyse om de beeldresolutie te verbeteren, terwijl dikkere secties (bijv. 150–200 μm) kunnen worden gebruikt voor reconstructie van hele neuronen. In deze studie werden doorsneden gesneden op 120 μm (Figuur 1F).
   4. Verzamel secties met een zachte borstel.
      OPMERKING: Noteer vibratoominstellingen in de Materiaaltabel. Spoel de slides onder geen enkele omstandigheid af nadat de secties zijn gemonteerd. De sucrose beschermt het weefsel tot aan de ontwikkelingsfase.

5. Montage

1. Bereiding van met gelatine gecoate spreiden
   1. Bereid een coatingoplossing door 0,5 g gelatine op te lossen in 100 mL (0,5% w/v) gedestilleerd water dat tot kookpunt wordt verwarmd.
   2. Roer tot de gelatine volledig is opgelost en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
   3. Voeg 0,05 g chroomkaliumsulfaat toe (0,05% w/v) en meng tot het volledig is opgelost. Verwijder restschuim indien nodig.
   4. Filter de gelatineoplossing door filterpapier om onopgeloste deeltjes en achterblijvend schuim te verwijderen, zodat de glaasjes een uniforme coating krijgen.
   5. Spoel het wasglas met neutrale wasmiddel en water, spoel grondig af en spoel daarna af met gedestilleerd water.
   6. Immerse schuift in 96% ethanol totdat er geen zichtbare druppels meer overblijven.
   7. Droog de schuilen in een oven op 50–60 °C gedurende 30 minuten of tot het helemaal droog is.
   8. Doop de glijplaten in de gelatineoplossing en laat overtollige oplossing afwateren.
   9. Plaats de slides in een oven op 50–60 °C gedurende 30 minuten of tot ze helemaal droog zijn.
   10. Herhaal het coating- en droogproces minstens vijf keer om een goede hechting te garanderen.
   11. Na de laatste droogstap laat je de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur in een stofvrije omgeving (bijvoorbeeld in een chemische dampafzuigkap) en bewaar je ze in een schone, gesloten container tot gebruik.
       OPMERKING: Bereid alleen de hoeveelheid gelatineoplossing voor voor het aantal te coaten preparaten. Reagenshoeveelheden kunnen proportioneel worden geschaald terwijl de gespecificeerde concentraties (w/v) behouden blijven.
2. Plaats secties op met gelatine gecoate microscoopglaasjes met een zachte borstel
   OPMERKING: Gebruik microscoopglaasjes die zijn bedekt met minstens vijf lagen 0,5% gelatine. Bereid de glaasjes vers voor om de weefselintegriteit tijdens de ontwikkeling te waarborgen. Elektrogeladen glaasjes werden niet getest in dit protocol.
3. Week absorberend papier met cryoprotectieve oplossing en leg het over de secties.
4. Druk voorzichtig met de handpalm om luchtbellen te elimineren en een gelijkmatig contact te garanderen tussen de weefselsectie en de met gelatine gecoate glaas, wat stabile hechting tijdens de verdere verwerking bevordert.
   OPMERKING: Zachte druk verbetert de hechting door het contact tussen de sectie en de gelatinelaag te maximaliseren, waardoor het risico op loslating tijdens de waterontwikkeling afneemt.
5. Verwijder het papier voorzichtig en laat de glaasjes 2–3 dagen in het donker drogen op kamertemperatuur.
   OPMERKING: Drogen in een omgeving met lage luchtvochtigheid is cruciaal voor stabiele hechting. Bescherming tegen licht minimaliseert fotochemische veranderingen van door Golgi–Cox geïmpregneerd weefsel, dat gevoelig is voor licht door de aanwezigheid van chromaatzouten. Daarnaast interfereert restagarose niet significant met het ontwikkelingsproces en kan het worden waargenomen rondom het weefsel in het ontwikkelde gedeelte (Figuur 2A). De aanwezigheid van agarose vergemakkelijkt een veiligere behandeling van het weefsel tijdens het monteren, omdat door Golgi–Cox geïmpregneerd weefsel zeer fragiel is. Indien gewenst kan overtollige agarose voorzichtig handmatig worden verwijderd nadat de secties op de slides zijn gemonteerd.
   PAUZEPUNT: Houd de glijbanen beschermd tegen licht.

6. Ontwikkeling

VOORZICHTIG: Xyleen is brandbaar en giftig bij inademing. Hanteer het in een chemische dampkap en vermijd open vlammen. Ammoniak is corrosief en produceert irriterende dampen. Nota in een dampkap.

1. Rehydratesecties
   1. Laat slides 5 minuten in gedestilleerd water dompelen.
   2. Overbrengen in vers gedestilleerd water voor 5 minuten.
   3. Laat het 5 minuten in 50% ethanol dompelen.
      OPMERKING: De stap van 50% ethanol zorgt voor een geleidelijke overgang van waterige omstandigheden naar uitdroging, wat de penetratie van reagens vergemakkelijkt en helpt de weefselintegriteit te behouden vóór de ontwikkelingsstap.
2. Ontwikkelkleuring
   1. Incubeer glaasjes in een waterige ammoniakoplossing, bereid door 2 volumes 25% ammoniak te mengen met 1 volume gedestilleerd water (2:1, v/v) gedurende 8 minuten
   2. Spoel 5 minuten in gedestilleerd water.
   3. Was het opnieuw in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
   4. Incubeer in 5% (w/v) natriumthiosulfaat in gedestilleerd water gedurende 10 minuten in het donker.
   5. Spoel 1 minuut in gedestilleerd water.
   6. Spoel opnieuw 1 minuut in gedestilleerd water.
      OPMERKING: Voltooi het ontwikkelproces zonder onderbreking zodra het is begonnen.
3. Droog en Clear
   1. Dompel het 5 minuten in 70% ethanol.
   2. Dompel het in 96% ethanol gedurende 5 minuten.
   3. Dompel het 5 minuten in 100% ethanol.
   4. Doe de glaasjes over in xyleen voor minstens 6 minuten.

7. Permanente montage

1. Breng Permount-montagemedium® (brekingsindex ~1,52) aan op elk gedeelte.
   OPMERKING: De brekingsindex van het montagemedium moet compatibel zijn met olie-onderdompelingsobjectieven om optimale beeldkwaliteit te garanderen.
2. Plaats voorzichtig een dekmantel om luchtbellen te voorkomen.
3. Dicht de randen af met doorzichtige nagellak.
4. Laat de preparaten 48 uur in het donker drogen op kamertemperatuur.

8. Beeldvorming

OPMERKING: Beeldvormingsmodaliteiten en acquisitieconfiguraties verschillen per microscoopmerk; De optimale instellingen moeten voor elk systeem worden bepaald.

1. Zet de microscoop aan.
2. Open de microscoopsoftware
3. Plaats een glaasje op het microscooppodium.
4. Maak een 2D-breedbeeldbeeld van het hersengedeelte met een objectief met lage vergroting zoals 1X/0,04 N.A. of 4x/0,10 (Figuur 2A, B).

9. Het beelden van hele neuronen

1. Leg hoogresolutie beeldstacks vast van het gebied waarin de neuron van belang is, met een 10x/0,25 N.A. of 20x/0,40 N.A. objectief (Figuur 2C).
   OPMERKING: Neuronen die voor analyse worden geselecteerd, moeten volledige en homogene Golgi–Cox-impregnatie vertonen, met duidelijk gedefinieerde dendritische arborras en minimale achtergrondkleuring. Cellen met afgeknotte processen, onvolledige impregnatie, overlappende structuren of een hoog achtergrondsignaal moeten worden uitgesloten om een nauwkeurige morfometrische analyse te garanderen.
2. Focus het beeld en pas de camera-instellingen aan, inclusief belichting en witbalans.
3. Stel de boven- en ondergrenzen in voor de image stack.
4. Stel de stapafstand in op 0,5 μm binnen het beeldverwervingsvenster.
5. Leg de image stack vast met het softwarecommando voor stack acquisition.
6. Herhaal bovenstaande stappen om elk interessegebied vast te leggen.
7. Sla het databestand op en bewaar alle afbeeldingsbestanden. TIFF-formaat voor externe verwerking.

10. Beeldvorming van dendritische stekels

1. Leg hogeresolutie beeldstacks vast van het gebied waarin de neuron van belang is, met behulp van een 63x/1.4 N.A. olie-immersieobjectief in een geschikte brightfieldmicroscoop (Figuur 2D).
   OPMERKING: In het huidige manuscript zijn hoogresolutiebeelden van dendritische stekels zoals weergegeven in Figuur 2D verkregen met behulp van de bright-field mode van een confocale microscoop, Zeiss-model LSM 780. Andere helderveldmicroscopen kunnen echter dienen om 63x hoogwaardige z-stack beelden te verkrijgen, waarvan de parameters door elk laboratorium gestandaardiseerd moeten worden.
2. Breng 1–2 druppels dompelolie aan op de glaasglaas en plaats het objectief op de glijbaan, waarbij je ervoor zorgt dat er contact is tussen het objectief en de olie.
3. Focus het beeld en pas de camera-instellingen aan, inclusief belichting en witbalans.
4. Stel de boven- en ondergrenzen in voor de image stack.
5. Stel de stapafstand in op 0,3 μm binnen het beeldverkenningsvenster.
6. Leg de image stack vast met het softwarecommando voor stack acquisition.
7. Herhaal bovenstaande stappen om elk interessegebied te bevatten
8. Sla het databestand op en bewaar alle afbeeldingsbestanden in TIFF-formaat voor externe verwerking.
   OPMERKING: Voor stap 9 en 10. Als de microscoop niet is uitgerust met een gemotoriseerd trapje voor Z-stack acquisitie, kunnen beelden handmatig worden verzameld door de micrometrische focus aan te passen. De afstand tussen optische secties kan echter minder precies zijn. In dit geval kunnen Z-stacks achteraf worden gereconstrueerd in beeldverwerkingssoftware (bijv. ImageJ) uit de verkregen beeldsequentie.

11. Morfometrische analyse

OPMERKING: Hiervoor kunnen verschillende benaderingen en gespecialiseerde softwareprogramma's worden gebruikt. Enkele gratis toegankelijke hulpmiddelen voor dendritische wervelkolomanalyse zijn onder andere ImageJ of, zoals in deze studie, PyReconstruct¹⁵. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van PyReconstruct en de functionaliteit ervan voor neuronale reconstructie en morfometrische analyse, zie de geraadpleegde bron.

1. Procedure voor dendritische spine morfometrische analyse
   1. Zodra het bestand in ImageJ is geopend, verander je het formaat naar RGB door Image > Type > RGB Color te selecteren.
   2. Converteer de Z-stacks naar een beeldreeks in ImageJ: klik op Bestand > Opslaan als > Afbeeldingsreeks. Sla elke beeldreeks op in een aparte map voor verdere analyse. In PyReconstruct laadt u de beeldreeks door te klikken op Bestand > Nieuwe > Van Afbeeldingen.
   3. Er verschijnt een dialoogvenster dat vraagt om het toewijzen van een naam aan het bestand (bijv. WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Drie opeenvolgende dialoogvensters verschijnen daarna. In het eerste venster voer je de kalibratiewaarde (μm/px) in. Deze informatie is beschikbaar in de Z-stack metadata en kan worden benaderd in ImageJ.
   5. In het tweede venster voer je de dikte van elke opeenvolgende optische sectie (μm) in. Ten slotte begint de beeldreeks automatisch te laden (Aanvullende Figuur 1A).
   6. Zodra het segment van interesse is geïdentificeerd, volgens de door de onderzoeker gedefinieerde inclusiecriteria, gaat u verder met het traceren om kwantitatieve gegevens te verkrijgen.
   7. Ken een aparte naam en domein toe aan elk type trace. Vind de domeinen in het onderste paneel, waar ze worden weergegeven door verschillend gekleurde geometrische vormen (Aanvullende Figuur 1B).
   8. Teken een lijn die overeenkomt met de gewenste samplelengte met behulp van het potloodgereedschap. Genereer vervolgens een tweede spoor via de Z-stack langs het dendritische segment met behulp van het Z-instrument.
   9. Gebruik de initiële trace om de juiste segmentlengte te bepalen en verifieer deze onder Lists > Z-trace List (Aanvullende Figuur 1B).
   10. Navigeer door de Z-stack en identificeer dendritische wervelkolomhoofden met optimale focus. Met het potloodgereedschap volgt u het breedste distale gebied van elke stekelhoofd. Gebruik vervolgens het Z-gereedschap om de nek van de rug door de Z-stack heen te trekken (Aanvullende Figuur 1C, D). Herhaal deze procedure totdat alle wervelkolomkoppen en -nekken binnen het geselecteerde dendritische segment zijn getraceerd.
2. Exportmaten van de wervelkolom
   1. Open de lijsten met metingen van de hoofdbreedte en -lengte van de ruggengraat. Toegang hierbij onder respectievelijk Lijsten > Tracelijst (voor breedte) en Lijsten > Z-trace Lijst (voor lengte).
   2. Exporteer de gegevens naar de gewenste locatie op de computer. Er worden twee aparte Excel-bestanden gegenereerd, elk met de bijbehorende meetgegevens.
3. Classificeer de morfologie van de wervelkolom en bereken dichtheid
   1. Haal de breedte- en lengtemetingen van rughoofden en -nekken uit de eerder gegenereerde Excel-bestanden.
   2. De gegevens moeten worden georganiseerd in de overeenkomstige kolommen met de aanduiding Breedte en Lengte voor morfologische classificatie op basis van de volgende criteria:¹⁶: filopodia (>2 μm), dun (< 2 μm), stubby (lengte-tot-kop breedteverhouding ≤1) en paddenstoel (kopbreedte >0,6 μm). (Aanvullende figuur 1E). Filopodia werden zelden waargenomen in de geanalyseerde dendritische segmenten en werden daarom niet meegenomen in de analyse.
   3. Het totale aantal stekels per geanalyseerd dendritisch segment wordt in dit stadium bepaald, samen met de stekeldichtheid (stekels per lineaire μm), evenals het type en aantal van elk stekelsubtype. De Excel-sjabloon¹⁶ die voor deze analyse wordt gebruikt, is beschikbaar in de geraadpleegde bron. Met deze methode werd de dichtheid van de basale dendritische wervelkolom gekwantificeerd in het CA1-gebied van de hippocampus bij 12 maanden oude vrouwelijke muizen.
   4. Exporteer gekwantificeerde data en genereer grafieken met gespecialiseerde wetenschappelijke softwaretoepassingen die zijn ontworpen voor data-analyse, grafieken en statistiek. Hier is de grafiek in Figuur 3 gebouwd met GraphPad Prism-software.

Resultaten

Weefselimpregnatie en sectie
Het hier beschreven Golgi–Cox-protocol produceerde betrouwbare en homogene neuronale kleuring in volwassen muizenhersenweefsel. Na impregnatie in Golgi–Cox-oplossing kreeg de hersenen een karakteristieke donkergouden kleur, wat wijst op succesvolle diffusie van de kleuroplossing door het weefsel. Vibratoomsectie behield de structurele integriteit van neuronale somaten en dendritische processen.

Neuronale...

Discussie

De Golgi–Cox-kleuringsmethode blijft een van de meest gebruikte technieken om neuronale morfologie en dendritische stekels in gefixeerd hersenweefsel^te visualiseren ^3,4. Door een kleine, willekeurige subset neuronen te impregneren, maakt deze methode visualisatie van volledige dendritische bomen mogelijk met minimale achtergrondkleuring. In het huidige protocol maakte de techniek een duidelijke visualisatie mogelijk van hippocamp...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Life Technologies	15510-027	CAS 9012-56-6
Ammonia solution 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Gevaarlijk.
Anhydrous sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Bright-field Microscope	Nikon	Eclipse Ci
Chromium potassium sulfate	Sigma-Aldrich	243361
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 780
Digital balance	Accuris Instruments	W3200-1200
Embedding molds	Merck	E6032	Afmetingen: 22x22 mm
Ethanol	Meyer	394
Experimental animals	The Jackson Laboratory	2124-01	B6129SF2/J muisensoort
Gelatin powder	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad Prism Software	GraphPad Software Inc.		Versie 8.0.2
ImageJ Fiji Software	U.S. National Institute of Health		versie 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mercuric chloride	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Gevaarlijk.
Microscope Camera	Nikon	DS-Vi1
Microscope objective (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0.25 N.A.
Microscope objective (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.
Microscope objective (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0.40 N.A.
Microscope objective (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
Microscope objective (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Microscope slides	Sigma-Aldrich	S8902
Monohydrated sodium phosphate monobasic	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Nail Polish	SINFUL COLORS	BOLD COLOR	Transparant
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15-500
Potassium chromate	Productos Químicos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Gevaarlijk.
Potassium dichromate	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Gevaarlijk.
PyReconstruct Software	University of Texas, Austin		versie 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Sodium chloride	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Sodium thiosulfate	Productos Químicos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Gevaarlijk.
Sucrose	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66.55° Specifieke rotatie, ACS-reagens
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	SPEED 20 mm/s, AMPL – 0.60 mm
Xylene	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Gevaarlijk.