Het vervaardigen van instelbare polyacrylamide hydrogels om de effecten van matrixstijfheid op stam-leydigcellen te bestuderen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de fabricage van polyacrylamide hydrogels met afstembare stijfheid om de effecten van matrixmechanica op het gedrag van stam-Leydig-cellen in een gecontroleerd tweedimensionaal kweeksysteem te bestuderen.

Samenvatting

Stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) reguleert het gedrag van stamcellen kritisch. Eerder toonden we aan dat pathologische toename van matrixstijfheid tijdens veroudering de homeostase van stamcellen (SLC) verstoort, wat leidt tot een daling van testosteron. Voortbouwend op deze ontdekking presenteren we hier een gedetailleerd protocol—oorspronkelijk ontwikkeld in ons laboratorium—voor het vervaardigen van polyacrylamide (PA) hydrogels met instelbare stijfheid om de testiculaire micro-omgeving in vitro te modelleren. Deze methode maakt het mogelijk om gels opnieuw te gieten over een stijfheidsbereik van 1–100 kPa, waarbij fysiologische tot pathologische omstandigheden worden afgedekt. Belangrijke stappen zijn onder meer nauwkeurige menging van acrylamide/bis-acrylamide, het evenwicht van gelzwelling, de activatie van het oppervlak met Sulfo-SANPAH en collageencoating ter ondersteuning van SLC-adhesie en -kweek. Wij bieden geoptimaliseerde formuleringen voor doelstijfheden en probleemoplossing voor veelvoorkomende problemen zoals onvolledige polymerisatie en slechte celhechting. Dit systeem maakt systematisch onderzoek mogelijk naar hoe substraatstijfheid de proliferatie, differentiatie en sterosteroogene functie van SLC onder gedefinieerde 2D-omstandigheden moduleert. Naast de voortplantingsbiologie dient het ook als een waardevol platform voor mechanobiologische studies in andere celtypen en voor het screenen van therapieën gericht op stijfheidsgerelateerde disfunctie.

Inleiding

De mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix (ECM) spelen een cruciale rol bij het reguleren van het lot van stamcellen, waaronder proliferatie, differentiatie en functioneel onderhoud 1,2,3,4. In de testis is leeftijdsgebonden ECM-versteviging in verband gebracht met de afname van de testosteronproductie. De onderliggende mechanobiologische mechanismen blijven echter slecht begrepen, deels door het ontbreken van gestandaardiseerde in vitro modellen die het fysiologische stijfheidsbereik van de testiculaire niche nauwkeurig weergeven. De fysiologische stijfheid van jong muistestikelweefsel is ongeveer 1–15 kPa, terwijl oud of fibrotisch weefsel 20–30 kPa of hoger kan bereiken.

Polyacrylamide (PA) hydrogels zijn uitgegroeid tot een veelzijdig platform voor het bestuderen van cel-matrixinteracties omdat hun stijfheid nauwkeurig kan worden afgestemd door de verhouding acrylamide tot bis-acrylamide ^5,6 te variëren. In vergelijking met andere substraten zoals collageengecoate glassoorten of commerciële hydrogels, bieden PA-gels onafhankelijke controle over stijfheid en biochemische liganddichtheid, waardoor systematische dissectie van mechanische aanwijzingen mogelijk is. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor PA-gelfabricage ^7,8,9, missen ze vaak gedetailleerde optimalisatie voor specifieke celtypen, met name voor zeldzame primaire cellen zoals SLC's.

Hier presenteren we een robuust en reproduceerbaar protocol voor de bereiding van PA-hydrogels met gedefinieerde stijfheid (1–100 kPa), speciaal voor het cultiveren van muis-SLC's. De methode bevat stapsgewijze instructies voor gelgieten, zwellingevenwicht, oppervlakfunctionalisatie met Sulfo-SANPAH en collageencoating om celadhesie te bevorderen. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers substraten genereren met afstembare stijfheid (variërend van 1 tot 100 kPa) die de mechanische omgeving van jonge (zachte) en verouderde (stijve) testikels nabootsen, waardoor kwantitatieve onderzoeken van stijfheidsafhankelijke SLC-responsen mogelijk zijn. Het systeem is ook aanpasbaar aan andere mechanosensitive celtypen en biedt een platform voor drugsscreening gericht op stijfheidsgerelateerde pathologieën.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Commissie voor Institutionele Dierenverzorging en Gebruik van de Sun Yat-sen Universiteit (Goedkeuringsnummer SYSU-IACUC-2026-B1278) en werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.

1. Isolatie en kweek van primaire muis-SLC's

1. Ontleed testikels van C57BL/6 muizen en verwijder voorzichtig de tunica albuginea.
2. Snijd de testikels in kleine stukjes.
3. Loskoppel interstitiële cellen van samenvattubuli door te incuberen in 1 mg/mL collagenase type IV in DMEM/F12 bij 37 ºC gedurende 15 minuten.
4. Voeg DMEM/F12 toe met 10% foetaal runderenserum om de collagenase-activiteit te stoppen.
5. Centrifugeer op 1500 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
6. Suss de pellet opnieuw in PBS en filter door een 70 μm filter.
7. Verrijk CD51⁺-cellen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van een Influx Cell Sorter.
8. Zaad de verrijkte cellen in SLC-kweekmedium bestaande uit DMEM/F12, aangevuld met: 1 nM dexamethason, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L insuline-transferrine-natriumseleniet, 5% kipembryo-extract, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL basische fibroblastgroeifactor, epidermale groeifactor, bloedplaatje-afgeleide groeifactor en oncostatine M.
9. Kweek de SLC's onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO₂) totdat ze de gewenste dichtheid hebben bereikt om op hydrogels te zaaien.

2. Het samenstellen van de glascontainer voor gelgieten

1. Inspecteer en maak zorgvuldig de gespecialiseerde glazen platen en afstandhouders die worden gebruikt voor het gieten van polyacrylamide gel-elektroforese (PAGE) gels, zodat ze vrij zijn van stof, schade en residuen.
2. Assembleer de glazen platen, afstandhouders en klemmen correct volgens de instructies van de fabrikant, zodat de assemblage goed afgesloten is om lekkage tijdens het gelgieten te voorkomen.
3. Plaats de in elkaar gezette glazen container stevig op een laboratoriumstandaard, klaar om te gieten.
   OPMERKING: De gietopstelling maakt gebruik van standaard Western blot (natriumdodecylsulfaat [SDS]-PAGE) glasplaten met vaste afstandhouders van 1,0 mm dikte, wat zorgt voor reproduceerbare geldikte en een vlak oppervlak voor celkweek.

3. Bereiden van PAGE gelmixoplossing

1. Meet de volgende reagentia nauwkeurig volgens het experimentele ontwerp (zie Tabel 1) in een 15 mL of 50 mL steriele centrifugebuis: 40% acrylamide-olieoplossing, 2% bis-acrylamide-olieoplossing, 1M HEPES-buffer (pH 8,5), steriele ddH₂O.
   VOORZICHTIG: acrylamide en bisacrylamide zijn neurotoxines. Draag altijd handschoenen en een stofmasker bij het wegen van droog poeder om huidcontact en inademing van luchtdeeltjes te voorkomen. Procedures moeten worden uitgevoerd in een dampkap.

4. Initiator en katalysator toevoegen, en de gel uitgieten

1. Voeg het volgende aan de gemengde oplossing toe: 10% Ammoniumpersulfaat (APS): Fungeert als initiator om de polymerisatiereactie te starten. N,N,N',N'-Tetramethylethyleendiamine (TEMED): Fungeert als katalysator om de polymerisatiereactie te versnellen. Voor een totaal gelvolume van 6 mL voeg 60 μL van 10% APS en 6 μL TEMED toe (zie Tabel 1 voor schaalverdeling).
   OPMERKING: De polymerisatiereactie begint direct na toevoeging van TEMED; daarom moeten volgende stappen snel worden uitgevoerd.

5. Het gieten van de gemengde oplossing

1. Pipetteer of giet de gemengde oplossing onmiddellijk gestaag langs één rand van de glazen container om belletjes te voorkomen.

6. Het toestaan van de gel om te polymeriseren

1. Laat de gietgelcontainer onaangeroerd op kamertemperatuur staan.
   OPMERKING: Polymerisatie duurt meestal 15–30 minuten bij kamertemperatuur (20–25 °C).
2. Ga door naar de volgende stap zodra er een duidelijke grens is tussen het niet-gepolymeriseerde gelmengsel en de gepolymeriseerde gel en de gel volledig vast is (de gel vloeit niet wanneer de container wordt gekanteld).
3. Onmiddellijk na het gieten legt je zorgvuldig een dunne laag absolute ethanol (of waterverzadigde ethanol) bovenop het gelmengsel om atmosferische zuurstof uit te sluiten, wat radicale polymerisatie remt. De ethanol helpt ook bij het vormen van een vlak bovenoppervlak.
4. Na polymerisatie verwijder je de ethanol voordat je de platen uit elkaar haalt.

7. Het demonteren van de container en het oogsten van de gel

1. Haal de klemmen voorzichtig uit elkaar en gebruik een plastic wig of spatel om de glazen platen voorzichtig los te wrikken, zodat de gepolymeriseerde PAGE-gel intact blijft op één plaat.
2. Maak een kweekschaal met een ruime hoeveelheid steriele PBS.
3. Trek de gel voorzichtig van de glazen plaat met een spatel of een handschoen en laat het soepel in de PBS glijden.
4. Sluit het schaaltje met de gel af in PBS en laat het een nacht incuberen bij 4 °C.
   OPMERKING: Deze stap is cruciaal. De nieuw bereide gel wordt gedehydrateerd en moet volledig water opnemen en opzwellen tot de uiteindelijke afmetingen in PBS. Als deze stap wordt overgeslagen en de gel direct wordt gesneden, zal deze blijven uitzetten in het daaropvolgende celkweekmedium, waardoor waarschijnlijk het oppervlak van de kweekbron wordt overschreden en onbruikbaar wordt. De geldikte na zwelling is 1 mm. Dit is cruciaal omdat cellen bij een daling van de gel onder de 100 μm de stijfheid van de onderliggende stijve kweekplaat kunnen detecteren, wat de beoogde mechanobiologische metingen zou verstoren.

8. Het snijden en overbrengen van de gel naar een kweekplaat

1. De volgende dag haal je de gel uit 4 °C. Met een steriele biopsiepunch of messnijder (met een diameter die overeenkomt met de putgrootte van de kweekplaat, bijvoorbeeld 6-wellplaat), snijdt u de gel onder steriele omstandigheden.
2. Gebruik in een bioveiligheidskast een steriele pincet om de gesneden gelschijf voorzichtig op te pakken en in het midden van een lege, steriele kweekput te plaatsen.

9. Eerste wasbeurt en UV-bestraling

1. Voeg voldoende steriele PBS toe aan de put waarin de gel zit, zodat deze volledig ondergedompeld is.
2. Wieg voorzichtig de kweekplaat om het geloppervlak te wassen.
3. Aspiraat de PBS met een pipet.
4. Herhaal dit wasproces nogmaals, in totaal twee wasbeurten, elk van 3 minuten.
5. Voeg na het wassen voldoende steriel PBS toe om de gel weer te bedekken. Plaats de hele kweekplaat met het deksel op een kier onder een UV-lamp (in een bioveiligheidskast of een speciale UV-kruisverbinder) en bestral 1 uur voor eenvoudige sterilisatie.

10. Activatie van de Sulfo-SANPAH-kruisverbinder

1. In de bioveiligheidskast aspireert u voorzichtig de PBS uit de put.
2. Voor het aspireren scheid je de gel voorzichtig van de wanden en onderkant van de put met een pipettip om schade door vloeistofoppervlaktespanning te voorkomen.
3. Breng de gel over in een andere schone put in dezelfde kweekplaat met een steriele pincet.
   OPMERKING: Bij het overbrengen van de gel kan het toevoegen van een kleine hoeveelheid PBS aan de schone put helpen om luchtbellen te verwijderen die tussen de bodem van de put en de gel zitten bij het plaatsen, en het dient ook als extra wasbeurt.
4. Bereid een crosslinker werkoplossing voor: Maak vers een 0,2 mg/mL Sulfo-SANPAH werkoplossing door de voorraadoplossing te verdunnen (zie Tabel 1) met steriel water of de aanbevolen buffer (bijv. PBS).
   OPMERKING: Bescherm de oplossing tegen licht.
5. Voeg voldoende Sulfo-SANPAH-werkoplossing toe om de gel te bedekken (bijv. 250 μL voor een 12-wellplaat, 500 μL voor een 6-wellplaat), zodat de gel volledig bedekt is.
6. Plaats de plaat onder 365 nm golflengte /120 mJ/cm² UV-licht en bestral gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Deze stap activeert Sulfo-SANPAH, waardoor het kan binden aan functionele groepen op het geloppervlak.

11. Activatie van kruisverbinders en laatste washes

1. Na bestraling aspireer je de Sulfo-SANPAH-oplossing uit de put in de bioveiligheidskast.
2. Voeg voldoende steriel PBS toe aan de put, wieg voorzichtig om het geloppervlak te wassen en aspiraat het PBS.
3. Herhaal dit wasproces nogmaals, in totaal twee wasbeurten, elk van 3 minuten, om eventuele niet-gereageerde Sulfo-SANPAH grondig te verwijderen.

12. Voorbereiden van een rattenstaart type I collageen werkoplossing

1. Gebruik een 0,02 M azijnzuuroplossing als oplosmiddel om de rat tail type I collageenvoorraadoplossing te verdunnen.
2. Stel de eindwerkoplossingsconcentratie aan op 60–100 μg/mL. Als bijvoorbeeld de collageenvoorraadconcentratie 4 mg/mL is, voeg dan 15–25 μL hout toe aan 985–975 μL 0,02 M azijnzuur om 1 mL werkoplossing te verkrijgen.

13. Collageencoating en incubatie

1. Voeg het juiste volume collageenwerkoplossing toe aan elke put met de geactiveerde gel volgens het plaattype: voeg 2 ml toe voor een 6-put plaat, of 1 mL voor een 12-well plaat.
2. Draai de kweekplaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de collageenoplossing de gel en de bodem van de put gelijkmatig bedekt.
3. Bedek de plaat en breng de nacht uit in een 37 °C, 5% CO₂ incubator zodat het collageen zich via Sulfo-SANPAH crosslinking aan het geloppervlak kan hechten.

14. Secundaire UV-bestraling en fixatie

1. De volgende dag verwijder je de plaat en bestral opnieuw onder ongeveer 120 mJ/cm² UV-licht gedurende 1 uur.

15. Verwijder ongebonden collageen- en zaadcellen

1. In de bioveiligheidskast aspireer je voorzichtig de collageenwerkoplossing van rattenstaart Type I uit de putten.
2. Voeg steriel PBS toe aan de wells, wieg voorzichtig om het geloppervlak te wassen en aspireer de PBS.
3. Herhaal de wasbeurt nogmaals, in totaal twee wasbeurten, elk van 3 minuten.
4. Na het wassen is de gelmatrix klaar. Suspendeer de voorbereide stam Leydig-cellen opnieuw in het volledige SLC-kweekmedium (samenstelling gedetailleerd in stap 1).
5. Zaad de celsuspensie direct op het geloppervlak. De aanbevolen zaaidichtheid is 2 × 10⁴ cellen/cm² (bijvoorbeeld ongeveer 2 × 10⁵ cellen per put voor een standaard 6-put plaat).
6. Incubeer de kweekplaten bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO₂-incubator.
7. Om de optimale levensvatbaarheid van cellen en steroïdoogene functie te behouden, verander je het kweekmedium elke 48 uur.

Resultaten

Succesvolle uitvoering van dit protocol levert polyacrylamide hydrogels met gedefinieerde stijfheid op (variërend van 1 tot 100 kPa) die stevig aan de kweekplaat blijven bevestigd en robuuste SLC-adhesie en verspreiding ondersteunen. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de gehele workflow, van gelcasting tot celzaaien, waardoor gebruikers de belangrijkste fasen van het protocol kunnen visualiseren.

Mechanische validatie va...

Discussie

De mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix spelen een fundamentele rol bij het reguleren van stamcelgedrag, maar de middelen om deze effecten systematisch in voortplantingscellen te bestuderen blijven beperkt. Ons eerdere onderzoek toonde aan dat pathologische matrixversteviging tijdens veroudering de homeostase van stamcellen Leydig-cel (SLC) via de Piezo1/ROS/Gli1-as verstoort, wat leidt tot een daling^{van testosteron 10}. Voortbouwend op deze ontd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	Cat#A6283	Verdunning voor rattenstaart collageen (0,02 M)
Acryamide	Sangon Biotech	Cat#A100341-0500	Monomeer voor de bereiding van polyacrylamide gel
Ammoniumpersulfaat (APS)	Sangon Biotech	Cat#A100486-0100	Initiator voor gelpolymerisatie
B27 supplement	Invitrogen	Cat#A1486701	Gedefinieerd supplement verrijkt met antioxidanten en hormonen; ondersteunt neuronale en stamcel overleving (2% v/v)
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Invitrogen	Cat#13256029	Mitogene groeifactor; bevordert SLC-proliferatie en stamcel eigenschappen (20 ng/mL)
Bis-acrylamide	Shanghai yuanye Bio-Technology	Cat#S14002	Crosslinker voor polyacrylamide gels
Kip embryo extract	US Biologicals	Cat#C3999	Rijke bron van groeifactoren en voedingsstoffen; ondersteunt SLC-groei en levensvatbaarheid (5% v/v)
Collageen, Type I, van rattenstaart	YEASEN	Cat#40125ES50	Bedekt het Sulfo-SANPAH-geactiveerde polyacrylamide hydrogel oppervlak om SLC-adhesie en cultuur te bevorderen.
Collageenase Type IV	Gibco	Cat#17104-019	1 mg/mL in DMEM/F12 voor testiculaire weefseldigeratie
CYP11A1 antilichaam	GeneTex	Cat#GTX56293	Voor western blotting
Dexamethason	Sigma-Aldrich	Cat#D1756	Glucocorticoïde receptor agonist; ondersteunt SLC-proliferatie en stamcel eigenschappen behoud (1 nM)
DMEM/F12 medium	Gibco	Cat#11320033	Basaal medium voor digestie, wassen en SLC-cultuur
Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	Cat#AF-100-15	Stimuleert SLC-proliferatie en handhaaft ongedifferentieerde toestand (20 ng/mL)
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	Cat#SE100-011	Gebruikt bij 10% om collageenase activiteit te stoppen
Fiji	N/A	https://imagej.net/Fiji	Beeldanalyse software
GADPH antilichaam	Proteintech	Cat#60004-1-Ig	Voor western blotting
Gel digestie enzymen	Accurate Biotechnology	Cat#GXDLFA	Enzymmix voor testiculaire weefseldigeratie en SLC isolatie
HEPES	Cytiva	Cat#SH30237.01	Buffer om pH 7,0-7,4 te handhaven
HSD3β antilichaam	Santa Cruz	Cat#sc-515120	Voor western blotting
Influx Cell Sorter	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
Insulin-Transferrin-Natriumseleniet (ITS)	Sigma-Aldrich	Cat#11074547001	Bevordert cel overleving, glucose opname en antioxidente verdediging (5 µg/L)
KnockOut serum vervanger (KSR)	Gibco	Cat#10828-028	Serumvervanger voor SLC-cultuur medium
LIF (Leukemia Inhibitory Factor)	Millipore	Cat#LIF1010	Cytokine dat stamcel pluripotentie en zelf-vernieuwing handhaaft (1 ng/mL)
Muizentestikels	Dit artikel	N/A	Geïsoleerd van C57BL/6 muizen
Muis: C57BL/6	Shenzhen TopBiotech	N/A	Muisras gebruikt voor teelbalverzameling
Muis: Testiculaire Stam Leydig Cellen (SLCs)	Dit artikel	N/A	Primaire cellen geïsoleerd uit muis testikels
N2 supplement	Invitrogen	Cat#17502001	Gedefinieerd serumvrij supplement dat neurale en stamcelculturen ondersteunt (1% v/v)
Niet-essentiële aminozuren	HyClone	Cat#SH30050.03	Biedt stikstofbronnen voor eiwitsynthese en celmetabolisme (1% v/v)
Oncostatin M (OSM)	PeproTech	Cat#300-10T	Cytokine betrokken bij SLC differentiatieregulatie en Leydig cel rijping (20 ng/mL)
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Gibco	Cat#10010023	Was- en resuspensiebuffer
Platelet-derived growth factor (PDGF)	PeproTech	Cat#100-14B	Ondersteunt celproliferatie, migratie en overleving (20 ng/mL)
Prism 9.0	GraphPad	https://www.graphpad.com/	Software voor statistische analyse en grafische weergave
StAR antilichaam	Proteintech	Cat#67130-1-Ig	Voor western blotting
Sulfo-SANPAH	MACKLIN	Cat#102568-43-4	Heterofunctionele crosslinker voor geloppervlak activering
TEMED	Phygene	Cat#PH0341	Katalysator voor polymerisatie
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	Cat#21985023	Vermindert oxidatieve stress en ondersteunt celgroei in cultuur (0,1 mM)