Cytometrische kwantificering van weefselfactor-positieve bloedplaatjes door de totale bloedstroom: een geharmoniseerde multicentere workflow

Samenvatting

Hier presenteren we een geharmoniseerde workflow voor de kwantificering van flowcytometrie van weefselfactor-positieve bloedplaatjes in multicenterstudies. Het protocol beschrijft gestandaardiseerde procedures voor bloedafname, fixatie van heel bloed, kleuring en instrumentharmonisatie, waardoor analyse lokaal of centraal kan worden uitgevoerd, afhankelijk van de laboratoriumcapaciteiten.

Samenvatting

Weefselfactor (TF)pos-bloedplaatjes vormen een subset van de bloedplaatjespopulatie. Recentelijk is aangetoond dat deze subset de cardiovasculaire sterfte voorspelt bij patiënten met coronaire hartziekte, waardoor het een biomarker is die nuttig is voor de trombotische risicostratificatie. Nauwkeurige kwantificering van TF^pos-plaatjes door flowcytometrie vereist strikte standaardisatie van pre-analytische behandeling, kleuringsprocedures en instrumentinstellingen, vooral in multicenterstudies waar technische variabiliteit hun meting kan beïnvloeden. Dit protocol beschrijft een geharmoniseerde workflow voor de cytometriebeoordeling van de volledige bloedstroom van circulerende TF pos-trombocyten, ontworpen om reproduceerbaarheid te waarborgen tussen laboratoria met verschillende technische infrastructuren. De procedure omvat gestandaardiseerde bloedafname en volbloedfixatie om het in vivo bloedplaatjesfenotype te behouden. Twee verschillende methoden voor monstervoorbereiding worden aangeboden afhankelijk van de lokale laboratoriumcapaciteit: het verzenden van vaste monsters naar het Core Laboratory voor gecentraliseerde kleuring, acquisitie en analyse voor centra zonder flowcytometriefaciliteiten, of lokale kleuring en acquisitie voor centra uitgerust met flowcytometrie-instrumentatie en getraind personeel. De beoordeling van het percentage^TF pos-bloedplaatjes wordt gedaan door directe labeling met anti-TF Star Fluor 488 en anti-CD41 PerCP-Cy5.5 antilichamen om respectievelijk het doeleiwit en de plaatjespopulatiemarker te identificeren. Harmonisatie van de flowcytometer wordt bereikt door een gedeeld acquisitiesjabloon voor identieke cytometermodellen, hetzij door kraal-gebaseerde uitlijning voor verschillende platforms. De workflow omvat bovendien een gestandaardiseerde gatingbenadering en gecentraliseerde data-analyse om betrouwbare vergelijking van TF pos-bloedplaatjesmetingen tussen locaties mogelijk te maken. Representatieve resultaten toonden aan dat deze workflow reproduceerbare kwantificering van TF pos-plaatjes ondersteunt in de gevalideerde multicenter acquisitie-instellingen. Dit protocol kan een bredere toepassing van TF pos-trombocytbeoordeling in trombotische risicostratificatie faciliteren en een bredere standaardisatie van bloedplaatjesflowcytometrie in translationeel en klinisch onderzoek ondersteunen.

Inleiding

Weefselfactor (TF) is de belangrijkste initiator van de bloedstollingscascade en een belangrijke factor voor de aanmaak van trombine. Naast de klassieke expressie door subendotheelcellen en leukocyten, is TF ook geassocieerd met circulerende bloedplaatjes 1,2,3,4,5. Tijdens trombopoëse dragen megakaryocyten TF over naar een subset van de^{bloedplaatjes 6}. Onder fysiologische omstandigheden bevat ongeveer 20–30% van de circulerende bloedplaatjes TF opgeslagen in het open kanaalsysteem, ruimtelijk gescheiden van plasmafactor VII⁷. In deze gecompartimenteerde toestand is TF functioneel afgeschermd van circulerende stollingsfactoren en blijft inactief. Dienovereenkomstig vertoont slechts een klein deel van de bloedplaatjes detecteerbare oppervlakte-TF wanneer volbloed van gezonde personen wordt geanalyseerd met flowcytometrie, wat fysiologische homeostase ^2,8 weerspiegelt. Pathologische aandoeningen die worden gekenmerkt door bloedplaatjesactivatie en een trombo-inflammatoire disbalans kunnen dit evenwicht verstoren, wat leidt tot een verhoogde blootstelling aan TF aan het oppervlak. Verhoogde verhoudingen TF-positieve (TF^pos) bloedplaatjes zijn gerapporteerd bij verschillende trombotische aandoeningen^{: 9,10,11,12,13,14,15}. Opmerkelijk is dat bij coronaire hartziekte TF-pos-bloedplaatjesniveaus boven 4% onafhankelijk de cardiovasculaire sterfte bij 5-jaars follow-up voorspellen, waarmee het percentage TF-pos-bloedplaatjes als klinisch relevante biomarker van het trombotische risico¹⁶ wordt vastgesteld.

Nauwkeurige en reproduceerbare kwantificering van TF^pos-plaatjes is daarom essentieel voor zowel translationele als klinische onderzoekstoepassingen. Een eerder gepubliceerde flowcytometrieworkflow voor TF pos-bloedplaatjesbeoordeling heeft het onderzoek van dit eiwit in single-center settings verbeterd¹⁷ en geeft advies over het optimaliseren van geselecteerde pre-analytische of analytische stappen. Die aanpak was echter niet specifiek ontworpen om de extra logistieke en analytische uitdagingen van multicenterstudies aan te pakken, waaronder verzendprocedures, gestandaardiseerde monsterverwerking en ook het belang van het harmoniseren van monsterverzameling tussen verschillende flowcytometerplatforms. Daarnaast moeten ook de verschillende infrastructuren en niveaus van technische expertise van de deelnemende centra worden meegenomen.

In deze context ligt de toegevoegde waarde van het huidige protocol in het bieden van een gedetailleerde workflow die gestandaardiseerde bloedafname en volbloedfixatie combineert, flexibele monsterverwerkingsprotocollen, cross-platform acquisitieharmonisatie en directe kleuring en gecentraliseerde kwaliteitscontrole via data-analyse.

Het doel van dit werk is daarom om een operationeel kader te bieden voor een geharmoniseerde multicenter-implementatie van TF pos-plaatjesanalyse in heel bloed door middel van flowcytometrie. Dit geïntegreerde ontwerp vermindert pre-analytische, analytische en inter-instrument variabiliteit, waardoor de voorwaarden worden gelegd voor de consistente beoordeling van TF-pos-bloedplaatjes in multicenteromgevingen.

Protocol

Alle bloeddonoren gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming, goedgekeurd door het Ethisch Comité van de instelling (nr. 70/24, CE 18.06.24).

De multicenterworkflow voor de kwantificering van de cytometrie van TF pos-bloedplaatjes in het geheel van het bloed wordt samengevat in Figuur 1. Het hieronder beschreven protocol begeleidt de gebruiker door vijf hoofdstappen.

Figuur 1: Multicenter workflow voor TF^pos-platelet analyse. Schematische weergave van de analytische pijplijn voor multicenterbeoordeling van circulerende TF pos-bloedplaatjes door middel van cytometrie van de volledige bloedstroom. Na opname van proefpersonen en bloedopname worden monsters vastgesteld en verwerkt volgens de technische middelen die beschikbaar zijn op elke klinische eenheid. Centra zonder flowcytometriefaciliteiten verzenden vaste monsters naar het Core Laboratory voor kleuring, verwerving en analyse. Centra uitgerust met flowcytometers kunnen op locatie kleuring en verwerving uitvoeren met behulp van gestandaardiseerde acquisitietemplates. Instrumentharmonisatie wordt bereikt door gedeelde sjablonen (hetzelfde instrumentmodel), sjablonen die in het Core Laboratory worden gegenereerd (ander model beschikbaar voor uitlijning), of kalibratie met fluorescerende kralen wanneer directe sjabloonharmonisatie niet haalbaar is. Data-analyse wordt centraal uitgevoerd met behulp van een gestandaardiseerde gating-workflow. Het diagram is gemaakt met ChatGPT (OpenAI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bloedafname

OPMERKING: De TF pos-trombocytenbeoordeling vereist maximaal 50 μL volbloed.

1. Verzamel perifere veneuze bloed uit de antecubitale vena met een 19-gauge vlindernaald. Breng de tourniquet alleen aan voor venipunctie en laat deze direct na het plaatsen van de naald los om ex vivo bloedplaatjesactivatie te minimaliseren.
2. Gooi de eerste EDTA-buis weg. Daarna verzamel je bloed in een 0,129 M natriumcitraat-vacutainer, waarbij de buis wordt gevuld tot aan het merk van de fabrikant om de juiste bloed-antistollingsverhouding te behouden.
3. Draai voorzichtig 5 keer om bloed en antistollingsmiddel grondig te mengen.
4. Houd de buis rechtop op kamertemperatuur, zodat je schudding, koeling of pneumatisch transport vermijdt.
5. Verwerk het monster binnen 3 uur na het afnemen.

2. Monstervoorbereiding

OPMERKING: Alle antistoffen moeten door het Core Laboratory worden aangeschaft en moeten allemaal uit dezelfde batch komen. Als een batchwijziging nodig wordt tijdens het lopende onderzoek, moet de nieuwe reagensbatch direct worden gekoppeld aan de in gebruik zijnde batch via parallelle tests onder dezelfde assay-omstandigheden en alleen worden toegepast als vergelijkbare prestaties worden bevestigd. Veelgebruikte reagentia (bijv. PBS – fosfaatgebuffte zoutoplossing – en PFA – paraformaldehyde) kunnen door elk deelnemend centrum worden aangeschaft; de productcodes moeten echter overeenkomen met die van het Core Laboratory, en batchconsistentie moet gedurende het hele onderzoek worden gehandhaafd.

1. Repareer het monster.
   OPMERKING: Bereid vóór het starten van bloedonderzoek 1% PFA voor door 4% PFA te verdunnen met PBS bij kamertemperatuur.
   VOORZICHTIG: PFA is giftig en moet worden behandeld met een chemische kap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, handschoenen en oogbescherming). Vermijd inademing en contact met huid of ogen. AFVALVERWIJDERING: Verzamel alle PFA-bevattende oplossingen, vaste monsters en besmette verbruiksmaterialen in correct gelabelde, gesloten containers voor gevaarlijk afval in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.
   1. Draai de vacutainer voorzichtig 5 keer om om bloed en antistollingsmiddel te mengen.
   2. Breng 50 μL bloed over in een buisje van 2 ml met 950 μL 1% PFA.
   3. Meng het monster voorzichtig en laat het 1 uur en 30 minuten incuberen op kamertemperatuur.
   4. Voeg 500 μL PBS toe.
   5. Centrifugeer op 1500 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
   6. Verwijder het supernatant en suspendeer het pelletje opnieuw in 1 mL PBS.
      OPMERKING: Technisch controlepunt: Controleer na centrifugatie of de pellet zichtbaar is voordat je het supernatant verwijdert. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Controleer na de resuspension of het monster homogeen is en vrij van zichtbare klonten of aggregaten.
   7. Stuur het vaste monster naar het Core Laboratory in temperatuurgecontroleerde verpakking die binnen 24 uur na fixatie op 2-8 °C wordt gehouden. Niet bevriezen. Tijd voor het verzamelen van documenten, fixatietijd en verzendtijd.
2. Monsterlabeling voor flowcytometrie-analyse.
   OPMERKING: Anti-TF Star Fluor 488 (kloon HTF1; anti-CD142) is gericht tegen Tissue Factor, terwijl anti-CD41 PerCP-Cy5.5 trombocytenintegrine alphaIIb herkent. Voordat de kleuringsprocedure begint, centrifugeer je antilichamen op 17.000 x g gedurende 5 minuten bij +4 °C om eventueel^{aggregaat 18} te verwijderen. Verdun het anti-TF Star Fluor 488-antilichaam (1:100) met PBS. Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 vereist geen tussenverdunning en moet worden gebruikt op het door de fabrikant aanbevolen volume.
   1. Maak vier 2 mL polypropyleenbuizen klaar.
   2. Geef 80 μL vast monster in elke buis.
   3. Voeg aan elke buis het juiste volume PBS en anti-TF Star Fluor 488-antilichaam toe zoals aangegeven in Tabel 1  (Dag 1).
   4. Meng de monsters voorzichtig.
   5. Broed O/N uit bij 4 °C in het donker.
   6. Voeg de volgende dag (dag 2) anti-CD41 PerCP-Cy5.5 toe aan buisjes 3 en 4 zoals aangegeven in Tabel 1.
   7. Meng de monsters voorzichtig.
   8. Incubeer 15 minuten op kamertemperatuur in het donker.
   9. Verdun elke buis met 300 μL PBS.
   10. Bewaar gekleurde monsters in het donker tot de verkrijgen van flowcytometrie.
       OPMERKING: Monsters kunnen tot drie dagen worden bewaard op 4 °C¹⁷ dagen. Langere opslag leidt tot progressieve signaalverval en moet worden vermeden.

		Dag 1		Dag 2
Nee.	Tube ID	1X PBS (μL)	Anti-TF Sterfluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Onbevlekt	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabel 1: Kleuringsprotocol voor TF pos-trotjes-evaluatie.

3. Standaardisatie van de verwerving van de flowcytometer

1. Het instellen van een verwervingssjabloon (door het Core Laboratory).
   1. Sjabloon ingesteld voor Flow Cytometer A.
      1. Open de software A v2.6.
      2. Maak een FSC-A/SSC-A puntgrafiek [Alle Gebeurtenissen] op log-schaal om celpopulaties te visualiseren (Figuur 2A).
      3. Maak een CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A dot plot [Alle Gebeurtenissen] op log-schaal om bloedplaatjes binnen een [Bloedplaatjes]-poort te identificeren (Figuur 2B).
      4. Maak een PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A pseudokleurplot [Alle Gebeurtenissen] om te controleren op spillover/compensatie (Figuur 2C).
      5. Maak een FSC-A/FSC-H puntdiagram aan in de [Platelets]-poort en definieer een regio om singlets te identificeren ([Singlets]; Figuur 2D).
      6. Maak een CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A dot plot in [Singlets]-poort om TF pos-bloedplaatjes te identificeren (Figuur 2E).
      7. Stel de drempel in op 1000 op SSC-H.
      8. Stel de debiet in op "Langzaam".
      9. Stel de B525-versterking in op 315 om optimaal onderscheid tussen positieve en negatieve gebeurtenissen te waarborgen; Pas indien nodig aan volgens het gebruikte instrument.
      10. Stel de B690-versterking in volgens de dagelijkse kwaliteitscontrole. Acquisitie is alleen acceptabel als de CD41 pos-bloedplaatjespopulatie volledig is opgelost vanuit de negatieve achtergrond en binnen de vooraf gedefinieerde referentiepoort blijft die tijdens de verwerving in het sjabloon is vastgesteld.
      11. Exporteer de template met de "Export Experiment Template".
      12. Download: De verwervingstemplate voor TF pos-plaatjesanalyse op de Flow Cytometer A is beschikbaar voor download als Supplementair Bestand 1 en Aanvullende Figuur 1.
          OPMERKING: Een grafiek om te controleren op spillover/compensatie (Figuur 2C), hoewel niet vereist voor deze multiparametrische analyse, is inbegrepen. Desondanks moet worden overwogen of een combinatie van fluorochromen die afwijkt van die in dit protocol voorgesteld, zal worden gebruikt.
   2. Maak een sjabloon voor Flow Cytometer B.
      1. Maak een protocolbestand aan dat de volledige acquisitie-opstelling bevat zoals beschreven in 3.1.1.
      2. Exporteer de template met de functie "Export Protocol" in software B v1.6, waarmee een protocolbestand wordt gegenereerd.
      3. Importeer het protocolbestand op het ontvangende instrument via de functie "Protocol importeren" binnen de software.
   3. Sjablooncreatie voor Flow Cytometer C.
      1. Maak een workspacebestand aan dat de volledige acquisitie-setup bevat zoals beschreven in 3.1.1. en exporteren.
      2. Importeer op het ontvangende instrument het workspace-bestand met de functie "Kopiëren" van de software C v3.1.
2. Harmonisatie van flowcytometers met kalibratiekralen.
   OPMERKING: Gebruik 6-piek Rainbow kalibratiekralen.
   1. Definitie van de doelwaarde.
      OPMERKING: Gebruik de volgende formule om de mediane fluorescentieintensiteit (MdFI) van de eerste piek in het B525-fluorescentiekanaal te definiëren:
      MdFI_CU =
      waarbij CU: Clinical Unit-instrumenten en RI: Reference Instrument.
   2. Monstervoorbereiding.
      1. Vortex het kralenflesje.
      2. Voeg 5 druppels kralen toe aan een monsterbuisje.
      3. Voeg 1 ml PBS toe.
      4. Vortex voor 5-10 seconden.
   3. Kralenverwerving.
      1. Maak een FSC-A/SSC-A puntdiagram op log-schaal met [Alle Gebeurtenissen] en definieer een regio genaamd [Beads] (Figuur 3A).
      2. Maak een FSC-A/FSC-H dotplot aan in [Beads]-poort en definieer een regio om singlets te identificeren [Singlet] (Figuur 3B).
      3. Maak een histogramplot voor het Star Fluor 488 fluorescentiekanaal (B525).
      4. Toon alleen [Singlet]  op het histogram.
      5. Teken een poort over de gehele breedte van de eerste piek (regio B in Figuur 3C).
      6. Toon in het Statistiekenlint X Mediaan (X-Med) waarden.
      7. Verwijder alle bestaande compensatie.
      8. Stel de debiet in op "Langzaam".
      9. Start de acquisitie in de "Run"-modus.
      10. Vanaf de "Acquisitie-instelling" past u de B525-spanning/versterking aan om het X-Med-doel te bereiken dat volgens de doelwaarde is berekend.
      11. Registreer een databestand van 10.000 gebeurtenissen in de [Singlet]-poort pas nadat dat acceptatiecriterium is bereikt. Neem geen studiemonsters voordat de streefgrens is bereikt.

Aanvullend Dossier 1: Aankoopsjabloon voor TF pos-plaatjesanalyse op de Flow Cytometer A beschikbaar voor download. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Screenshot van de verwervingstemplate voor TF pos-plaatjesanalyse op Flow Cytometer A. (A) De FSC-A vs SSC-A dot plot geeft een visuele weergave van de algehele gebeurtenisverdeling. (B) Bloedplaatjes worden geïdentificeerd in een CD41 versus SSC-A-grafiek en worden geblokkeerd als [Bloedplaatjes]. (C) Een PerCP-Cy5.5 versus Star Fluor 488-plot is opgenomen om mogelijke overloop te evalueren. (D) Doublets worden uitgesloten binnen de [Platelets]-poort met behulp van een FSC-A versus FSC-H-plot, waarmee de [Singlets]-populatie wordt gedefinieerd. (E) TF pos-bloedplaatjes worden geïdentificeerd binnen de [Singlets]-poort op basis van PerCP-Cy5.5 en Star Fluor 488 fluorescentie. (F-H) De verwervingsinstellingen, inclusief de steekproefstroomsnelheid (Langzaam), primaire drempel (SSC) en detectorversterkingen (B525 en B690), zoals geïmplementeerd in het sjabloon, worden weergegeven. Volledige details van de acquisitie-opzet en workflow zijn te vinden in sectie 3.1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 2: Acquisitiesjabloon en gatingstrategie voor identificatie van^{TF-pos-plaatjes}. (A) FSC-A/SSC-A puntdiagram (logschaal) dat alle gedetecteerde gebeurtenissen toont. (B) CD41-A/SSC-A dot plot gebruikt om de bloedplaatjespopulatie te identificeren. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 pseudokleurgrafiek gebruikt om spectrale overloop- en compensatievereisten te evalueren. (D) FSC-A/FSC-H-plot in [Platelets]-poort gebruikt om doublets uit te sluiten en singlets te definiëren. (E) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 dot plot in [Singlets] gebruikt om TF pos-trombocyten te identificeren. De statistiekvelden die tussen haakjes worden weergegeven, worden automatisch gevuld met steekproefspecifieke waarden wanneer de template wordt toegepast tijdens het verzamelen van monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Instrumentkalibratieprocedure op basis van de kraal. (A) FSC-A/SSC-A plot gebruikt om kralengebeurtenissen te identificeren. (B) FSC-A/FSC-H plot binnen kraalgebeurtenissen die worden gebruikt om aggregaten uit te sluiten en singlets te definiëren. (C) Histogram van Star Fluor 488 fluorescentie met kraalpieken en gating toegepast op de eerste kraalpiek voor mediane fluorescentieintensiteitsbepaling. De gevisualiseerde statistieken moeten als representatief worden beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Flowcytometriemonsterverwerving voor TF pos-trombocytenanalyse

1. Gebruik een FCM-sjabloon.
   1. Importeer de acquisitietemplate met de functie "Template importeren" binnen software A.
   2. Neem de monsters die in stap 2 zijn voorbereid.
   3. Controleer of de poorten van de plaatjes en singlet overeenkomen met de geometrie van de referentieplot voordat je de gegevens registreert. Pas de poorten aan indien nodig.
   4. Begin met opnemen na 5–10 seconden stabiele stroming. Registreer een databestand van 20.000 gebeurtenissen binnen de [Singlets] -poort  (zie Figuur 2D). Sla niet-gecompenseerde .fcs-bestanden op en stuur ze door naar het Core Laboratory.
2. Overname zonder FCM-sjabloon.
   1. Maak een verwervingswerkblad opnieuw zoals gerapporteerd in sectie 3.1, inclusief de vijf beschreven grafieken en de poorthiërarchie: Alle gebeurtenissen > bloedplaatjes > singlets > TF/CD41-kwadranten.
   2. Stel de drempel in op 1000 op SSC-H.
   3. Stel de debiet in op "Langzaam".
   4. Stel B525 spanning/versterking in zoals gedefinieerd in 3.2.3.
   5. Verkrijg het voorbeeld dat in stap 2 is voorbereid. Begin met opnemen na 5–10 seconden stabiele stroming; verkrijg 20.000 evenementen binnen de [Singlets]-poort. Sla niet-gecompenseerde .fcs-bestanden op en stuur ze door naar het Core Laboratory.
      OPMERKING: Acquisitie is alleen toegestaan als het dagelijkse QC-instrument wordt goedgekeurd. Als het doel van 20.000 CD41 pos-bloedplaatjes niet kan worden gehaald, neem dan minimaal 10.000^{CD41 pos-bloedplaatjes}.

5. Data-analyse

OPMERKING: De hieronder beschreven analyseworkflow is bedoeld ter ondersteuning van de activiteiten van het Core Laboratory dat verantwoordelijk is voor gecentraliseerde gegevensverwerking en kwaliteitscontrole.

1. Open een nieuw analysewerkblad en laad de .fcs-bestanden.
2. Voor elk monster maak je een analysesjabloon zoals weergegeven in Figuur 2. Voor niet-identieke platforms gebruik je een equivalent, platformspecifiek sjabloon met dezelfde poortstructuur en statistische output.
3. Controleer dat gating de bloedplaatjespopulatie correct identificeert volgens de vooraf gedefinieerde verstrooiingskenmerken en singlet-discriminatiestrategie (Figuur 4A,B,D).
4. Controleer op overloop/compensatie met behulp van een pseudokleurplot [Alle Gebeurtenissen] (Figuur 4C).
   OPMERKING: De fluorochroom Star Fluor 488 heeft een spectrale emissie van 520 nm, vergeleken met PerCP-Cy5.5, die een spectrale emissie heeft van 676 nm, wat het gebrek aan overlapping en de noodzaak van geen compensatie verklaart.
5. Pas de volgende gatingsequentie toe in de Star Fluor 488 dot plot (Figuur 5):
   1. Ongekleurd: definieer kwadranten met behulp van de ongekleurde controle zodat achtergrond^{TF-pos-events} op of onder 0,01% van de bloedplaatjesgebeurtenissen blijven, hierbij uitgesloten van bloedplaatjesautofluorescentie (Figuur 5A).
   2. TF: pas de kwadrantcoördinaten toe die in het ongekleurde monster zijn gedefinieerd om het^{TF-pos-signaal} in enkelkleurige monsters te identificeren (Figuur 5B).
   3. CD41: definieer kwadranten met behulp van het enkelvoudig gekleurde CD41-monster om de achtergrondfluorescentie van bloedplaatjes uit te sluiten (Figuur 5C).
   4. TF/CD41: gebruik dezelfde kwadrantcoördinaten om^{TF-pos-signaal} te identificeren in TF/CD41-gekleurde monsters (Figuur 5D).
      OPMERKING: Het definitieve TF pos-plaatjespercentage wordt verkregen uit de statistieken die door de analysesoftware worden gegenereerd en wordt gerapporteerd als het percentage CD41^{pos-gebeurtenissen} dat binnen het TF^pos-kwadrant van de gegated plateletpopulatie valt.
6. Voer centrale kwaliteitscontrole uit op bestandsnaamidentificatie, reagentenbatches, fixatie-tot-verwervingsinterval, verzendtemperatuur, gebeurtenistelling en uitschieters fluorescentieverdelingen. Bestanden die gedocumenteerde afwijkingen tonen in lokale afhandeling, verzending, fixatietiming of verwervingsinstellingen, moeten worden gemarkeerd, centraal worden beoordeeld en ofwel worden uitgesloten of herhaald, volgens het studie-specifieke afwijkingsbeheerplan.

Figuur 4: Sequentiële gatingstrategie voor TF pos-plaatjesanalyse. Representatieve analyseworkflow illustreert de identificatie van bloedplaatjespopulaties na het laden van .fcs-bestanden. (A-B) Dotplots bevestigen correcte gating van bloedplaatjespopulaties. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 pseudocolor plot gebruikt om spectrale overloop te beoordelen. (D) FSC-A/FSC-H-plot binnen de plaatletpoort die wordt gebruikt om doublets uit te sluiten en singlets te definiëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Sjabloon voor data-analyse. Representatieve dotplots van (A) ongekleurde controle gebruikt om de basislijn autofluorescentie en kwadrantpositie te definiëren. (B) TF enkelkleurig monster; (C) CD41 enkel gekleurd monster dat wordt gebruikt om kwadrantpositie te definiëren. (D) TF/CD41 dubbelkleurig monster gebruikt voor TF pos-plaatjesanalyse. De cijfers geven het percentage TF pos-bloedplaatjes aan in een representatieve steekproef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Deze workflow is specifiek ontworpen om centra met heterogene technische infrastructuren toe te staan deel te nemen aan multicenterstudies die kwantificatie van TF pos-plaatjes vereisen. Figuur 1 illustreert het organisatie-workflowdiagram dat is ontworpen ter ondersteuning van multicenterstudies gericht op het meten van circulerende TF-pos-bloedplaatjes via de cytometrie van de volledige bloedstroom. Verschillende procedures voor het voorbereiden van monsters worden toegepast, afhankelijk van de technische middelen die beschikbaar zijn bij de deelnemende centra. Specifiek, (i) wanneer een Klinische Eenheid geen flowcytometriefaciliteit of getraind personeel heeft, worden volbloedmonsters direct na de afname gefixeerd en vervolgens naar het Kernlaboratorium gestuurd voor gecentraliseerde kleuring, verwerving en analyse. (ii) Alternatief kunnen centra uitgerust met flowcytometriefaciliteiten lokaal kleuring en acquisitie uitvoeren. In deze gevallen volgt data-acquisitie een geharmoniseerde workflow die door het Core Laboratory is gedefinieerd. Als het instrumentmodel overeenkomt met dat in het Core Laboratory, wordt de acquisitie uitgevoerd met behulp van een gestandaardiseerde template die door het Core Laboratory wordt verstrekt. Wanneer verschillende instrumentmodellen worden gebruikt, kan harmonisatie worden bereikt door sjabloonoverdracht - wanneer instrumenten beschikbaar zijn voor uitlijning in het Core Laboratory - of via kraalgebaseerde kalibratieprocedures voorafgaand aan de monsterverwerving. Monsters kunnen vervolgens worden verzameld en geanalyseerd volgens de gestandaardiseerde workflow.

De volgende representatieve resultaten zijn bedoeld om de haalbaarheid van de workflow en belangrijke harmoniseringsstappen te illustreren, in plaats van formele multicenter assay-validatie te bieden. Om betrouwbare TF-detectie te waarborgen, werd de kleuringsstrategie eerst geëvalueerd op spectrale compatibiliteit en signaalstabiliteit. Bloedplaatjes werden geïdentificeerd met anti-CD41 PerCP-Cy5.5, terwijl TF-detectie gebaseerd was op een anti-TF monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan Star Fluor 488. Enkelkleurige controles werden gebruikt om de afwezigheid van fluorescentieoverloop tussen detectiekanalen te verifiëren. Zoals weergegeven in Figuur 6A, produceerden CD41 PerCP-Cy5.5 enkelkleurige monsters geen detecteerbaar signaal in het Star Fluor 488-kanaal. Consistent was het percentage TF pos-bloedplaatjes gemeten in dubbelgekleurde monsters vergelijkbaar met dat van TF enkelkleurige monsters (Figuur 6B).

Figuur 6: Validatie van kleuringsspecificiteit. (A) Enkelvoudig gekleurd anti-CD41 PerCP-Cy5.5 monster geanalyseerd in een PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 dot plot om de signaalspecificiteit te verifiëren. (B) De percentages TF pos-bloedplaatjes gemeten in TF enkelgekleurde versus TF/CD41 dubbelgekleurde monsters worden weergegeven als individuele gepaarde metingen (dots) en gemiddelde ± SD (n = 18 onafhankelijke proefpersonen). De gegevens werden geanalyseerd met de Wilcoxon matched-pairs signed-rank test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.De analytische gevoeligheid van de voorgestelde test werd geëvalueerd op monsters van n=200 gezonde proefpersonen. Met behulp van biologisch lege monsters was de berekende limiet van blanco (LoB) 0,39%, de detectiegrens (LoD) 0,77% en de kwantificatielimiet (LoQ) 1,12%, gedefinieerd als het laagste niveau dat geassocieerd is met een CV ≤ 20%. De reproduceerbaarheid van de gatingstrategie tussen operators werd beoordeeld op 40 onafhankelijke monsters die door 6 operators werden geanalyseerd met behulp van het vooraf gedefinieerde analysesjabloon, wat resulteerde in een ICC van 0,985 (95% BI: 0,978-0,990).

De stabiliteit van TF-detectie na volbloedfixatie werd vervolgens geëvalueerd door vaste monsters longitudinaal te kleuren. Vergeleken met basismonsters die op de dag van fixatie (D0) werden gekleurd, bleven de TF pos-trotjesniveaus tot vier dagen na fixatie stabiel (D3-D4), met slechts een niet-significante afname van ongeveer 22% bij D3-D4 (77,8 ± 7,2% - relatief percentage in TF^{pos-trombocyt}) ten opzichte van het D0-niveau. Wanneer de kleuring werd uitgevoerd bij D5-D6, daalde de detectie van TF pos-trombocyten significant tot 53,8% ± 20,7% (relatief percentage in TF^{pos-trombocyt}; p< 0,0001; Figuur 7). Deze resultaten geven aan dat vaste monsters betrouwbaar binnen vier dagen na fixatie kunnen worden geanalyseerd met slechts een bescheiden signaalverlies.

Figuur 7: Tijdsanalyse na monsterfixatie. Kwantificering van TF pos-bloedplaatjes gemeten op verschillende tijdstippen na fixatie aangegeven op de x-as als volgt: D0 = dag van bloedafname; D1 = dag 1; D2 = dag 2; D3-4 = dag 3 of 4; D5-6 = dag 5 of 6. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddeld ± SD-relatief percentage vergeleken met D0 (n = 7-10 gezonde proefpersonen, geëvalueerd over de aangegeven post-fixatietijden). De gegevens werden geanalyseerd met Anova, gevolgd door Dunnetts meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De prestaties van de geharmoniseerde acquisitieworkflow werden vervolgens geëvalueerd op verschillende flowcytometrieplatforms. Template-gebaseerde harmonisatie werd voor het eerst geëvalueerd met FACSLyrische en MACSQuant-instrumenten als referentiecytometers. Extra instrumenten van dezelfde modellen, geplaatst bij externe faciliteiten, werden gebruikt als testplatforms. Volbloedmonsters met rustbloedplaatjes werden verkregen op zowel referentie- als testinstrumenten met behulp van het gestandaardiseerde verwervingssjabloon. Zoals weergegeven in Figuur 8A,B, werden vergelijkbare TF pos-bloedplaatjespercentages verkregen via referentie- en testcytometers, wat de reproduceerbaarheid van de gedeelde-sjabloonbenadering bevestigt.

Figuur 8: Cross-instrument reproduceerbaarheid met gedeelde acquisitietemplates. Percentages TF pos-bloedplaatjes gemeten in volbloed van n=6 gezonde proefpersonen verkregen op referentie- en test: FACSLyrische (A) of MACSQuant (B) instrumenten via een gedeeld verwervingssjabloon toegepast over instrumenten. De gegevens worden uitgedrukt als individuele bepalingen (dots) en gemiddelde ± SD. De gegevens werden geanalyseerd met een gekoppelde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte werd op kralen gebaseerde harmonisatie geëvalueerd om instrumenten met verschillende configuraties uit te lijnen. Cytometer A werd gebruikt als referentieinstrument en een FACSymphony als testinstrument. De uitlijning werd uitgevoerd met 6-piek Rainbow kalibratiekralen door de FACSymphony 488 nm detectorspanning aan te passen totdat de fluorescentieintensiteit van de kralen binnen het vooraf gedefinieerde doelbereik viel. Histogramprofielen die de verdelingen van de kraalpieken voor en na de uitlijning illustreren, worden weergegeven in Figuur 9A. Volbloedmonsters werden vervolgens afgenomen op het testinstrument vóór en na de kalibratie. Voor de harmonisatie verschilden de percentages van TF pos-bloedplaatjes tussen de twee platforms. Na de op kralen gebaseerde uitlijning kwamen de waarden nauw overeen met die verkregen op de referentiecytometer (Figuur 9B), wat succesvolle cross-platform harmonisering en reproduceerbare TF-kwantificatie aantoonde.

Figuur 9: Harmonisatie van kralengebaseerde instrumenten. (A) Representatief fluorescentiehistogram van 6-piek Rainbow kalibratiekralen, verkregen vóór (rode pieken) en na (groene pieken) instrumentuitlijning. (B) Percentages TF pos-bloedplaatjes gemeten in rustmonsters bereid uit n=6 gezonde proefpersonen die op het testinstrument zijn verkregen vóór (Pre) en na (Post) harmonisatie. Metingen die op het referentie-instrument zijn verkregen, worden getoond ter vergelijking. De gegevens werden geanalyseerd met een gekoppelde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een stapsgewijze workflow voor de kwantificering van de totale bloedstroomcytometrie van TF pos-bloedplaatjes, specifiek ontworpen voor een multicenter-implementatie. Het belangrijkste methodologische voordeel ten opzichte van conventionele workflows gebaseerd op bloedplaatjesflowcytometrieanalyse is dat het het gehele analyseproces standaardiseert, van bloedafname en binding van volbloed tot het labelen van monsters, instrumentharmonisatie voorafgaand aan monsterverkrijgen, en gecentraliseerde analyse en kwaliteitscontrole van gegevens. Dit stelt centra zonder de mogelijkheid om monsters te verwerken in staat deel te nemen aan multicenterstudies, mits ze bloedmonsters kunnen afleveren. De huidige workflow behandelt de praktische bronnen van variabiliteit tussen centra die het meest relevant zijn, aangezien slechts een klein deel van de bloedplaatjes onder fysiologische omstandigheden detecteerbare oppervlakte-geassocieerde TF vertoont ^7,8. Deze bronnen omvatten verschillen in lokale monsterbehandeling, toegang tot flowcytometriefaciliteiten, instrumentconfiguratie en operator-afhankelijke data-analyse.

Om deze problemen te overwinnen, wordt volbloed kort na de afname gefixeerd, waardoor het in vivo bloedplaatjesfenotype wordt gestabiliseerd en onmiddellijke etikettering en monsterafname wordt overbodig. Representatieve resultaten geven aan dat deze fixed-sample benadering vertraagde gecentraliseerde verwerking binnen het gevalideerde post-fixatieinterval mogelijk maakt. Dit vergroot de mogelijkheid voor deelname aan studies naar centra zonder flowcytometriefaciliteiten ter plaatse, terwijl een consistente pre-analytische workflow behouden blijft. Een tweede voordeel van het protocol is het gebruik van een vereenvoudigde directe kleuringsstrategie met een eenvoudig tweekleurig paneel, wat de complexiteit van de procedure vermindert.

In het panel gebruikten we de goed gekarakteriseerde anti-TF monoklonale antilichaamkloon HTF1, die de katalytische plaats van TF herkent en concurreert met factor VII-binding, waardoor het een van de meest betrouwbare reagentia is voor TF-detectie, ook in bloedplaatjes^{14, 16, 17}. Het antilichaam werd geconjugeerd met Star Fluor 488, een helder, fotostabiel fluorochroom spectraal vergelijkbaar met FITC maar met verbeterde signaalstabiliteit. Belangrijk is dat excitatie op 488 nm monsterdetectie mogelijk maakt met de blauwe laserconfiguratie die beschikbaar is op vrijwel alle conventionele flowcytometers, inclusief instapinstrumenten. Deze combinatie van epitoopspecificiteit en eenvoudige fluorochroomdetectie verbetert de analytische gevoeligheid en schaalbaarheid over meerdere locaties. In deze assay werden positiviteitsdrempels gedefinieerd met behulp van ongekleurde en FMO-controles als een betere optie dan de isotypecontrole voor drempelplaatsing in laagfrequente populaties¹⁸.

Het gebruik van verschillende flowcytometers kan een bron van variabiliteit zijn in multicenter flowcytometriestudies 19,20,21. We hebben eerder advies gegeven over pre-analytische behandeling, kleuring instellen en lokale instrumentoptimalisatie¹⁷. Maar deze maatregelen zorgen niet voor consistente fluorescentiesignalen over verschillende platforms. De huidige workflow pakt dit probleem aan door gecentraliseerde analyse te combineren met prospectieve acquisitieharmonisatie. Gedeelde acquisitietemplates kunnen worden gebruikt wanneer identieke cytometers beschikbaar zijn, terwijl kraal-gebaseerde uitlijning kan worden toegepast wanneer verschillende platforms moeten worden opgenomen. Deze dubbele strategie biedt een praktisch voordeel ten opzichte van multicenter analytische modellen die uitsluitend vertrouwen op gecentraliseerde analyse na heterogene lokale acquisitie, door de variabiliteit van data-analyse ab initial te verminderen en meer reproduceerbare gate-toepassing over locaties te ondersteunen.

De generaliseerbaarheid van de workflow mag niet overschat worden. Het protocol werd gevalideerd met behulp van gespecificeerde volbloedfixatievoorwaarden, de anti-TF-Star Fluor 488 en anti-CD41 PerCP-Cy5.5 reagenscombinaties, harmonisatieprocedures en een beperkte set flowcytometerconfiguraties. Als andere anti-TF-klonen, fluorochroomcombinaties, fixatietijden of fixatieve concentraties, of flowcytometers met aanzienlijk andere optiek worden gebruikt, moet de analytische prestaties van de workflow worden gecontroleerd. Over het algemeen moeten eventuele protocolfouten worden beheerd via de voorgestelde vooraf gedefinieerde afwijkingsregels. Afhankelijk van de ernst van de afwijking kunnen gegevens worden gemarkeerd, herhaald of uitgesloten volgens het studie-specifieke afwijkingsplan. Binnen deze grenzen moet het huidige protocol worden beschouwd als een operationeel kader voor multicenter-implementatie van TF pos-plaatjesanalyse. Formele analytische validatie, inclusief bredere interlaboratoriumbeoordeling, verzendvalidatie en herhaalbaarheid van assays, wordt momenteel behandeld in een speciale internationale standaardisatiestudie van de International Society of Thrombosis and Hemostasis. De klinische relevantie van nauwkeurige kwantificatie van TF pos-bloedplaatjes wordt benadrukt door bewijs dat de prognostische waarde ervan toont bij coronaire hartziekte, waarbij niveaus van TF^{pos-bloedplaatjes} boven 4% onafhankelijk langdurige cardiovasculaire sterfte voorspellen bij vijfjaars follow-up¹⁶. Betrouwbare multicentermeting is daarom essentieel voor het valideren van TF^pos-plaatjes als biomarker en voor het uitbreiden van de toepassing ervan naar prospectieve klinische studies en praktijkregisters. Toekomstige implementatie van geautomatiseerde normalisatie-algoritmen en autogatingstrategieën kan de operatorbias verder verminderen en gedecentraliseerde analyse ondersteunen, terwijl cross-site vergelijkbaarheid behouden^{blijft 22,23}.

Samenvattend biedt deze geharmoniseerde workflow een praktische en reproduceerbare benadering voor de kwantificering van TF-pos-bloedplaatjes door middel van cytometrie van de volledige bloedstroom in multicenteromgevingen. Door gestandaardiseerde pre-analytische procedures, vereenvoudigde monsterverwerking en instrumentharmonisatiestrategieën te combineren, maakt het protocol betrouwbare cross-site vergelijking van TF^pos-plaatjes metingen mogelijk. Naast het ondersteunen van de beoordeling van TF^pos-plaatjes als biomarker van trombotisch risico, kunnen de hier beschreven principes bijdragen aan bredere inspanningen om de cytometrie van de bloedplaatjesflow te standaardiseren voor translationele en klinische onderzoekstoepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1X PBS zonder Calcium en Magnesium	Gibco	10010-015	Voor antilichamen en monsterverdunning
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anti menselijk CD41a monoklonaal antilichaam gebruikt als marker voor de trombocytenpopulatie; moet worden geleverd door het centrale laboratorium
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anti menselijke weefselfactor (CD142) monoklonaal antilichaam; moet worden geleverd door het centrale laboratorium
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	geen catalogusartikel	In de tekst, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	geen catalogusartikel	In de tekst, software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Voor het afnemen van bloed
CytExpert Software	Beckman Coulter	geen catalogusartikel	In de tekst, software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	geen catalogusartikel	In de tekst, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	geen catalogusartikel	In de tekst, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	geen catalogusartikel	In de tekst, software C
Eppendorf buisjes 2 mL	Eppendorf	120094	Voor hele bloedfixatie
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Om monsters te fixeren
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Om bloedmonsters over te brengen
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Om bloedmonsters over te brengen
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Om bloedmonsters over te brengen
Polystyreen ronde bodembuis 5 mL	Corning	352052	Nodig voor flow cytometer acquisitie
Rainbow kalibratiekralen (6 pieken)	Spherotech (BD)	556286	Voor harmonisatie van de flow cytometer
Vacutainer EDTA	BD	368857	Om de eerste 3 ml bloed te verzamelen
Vacutainer adapter voor meerdere monsters	BD	367300	Voor het afnemen van bloed
Vacutainer met eenmalig gebruik	BD	364815	Voor het afnemen van bloed
Vacutainer met 0,129 M natriumcitraat	BD	363079	Om bloed te verzamelen