Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Summary

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Abstract

Connectome-studies hebben het begrip van synaptische connectiviteit in de zenuwstelsels van verschillende soorten sterk vergroot. Hoewel karakterisering van synaptische partners met behulp van elektronenmicroscopie (EM) gedetailleerde anatomische informatie biedt, vereisen functionele aspecten van neuronale netwerken complementaire benaderingen. Recente studies in Drosophila hebben niet alleen het volledige connectoom van de larvale en het mannelijke en vrouwelijke volwassen centrale zenuwstelsel onthuld, maar ook de cellulaire componenten van neuronale netwerken die specifiek gedrag reguleren, zoals het larvale nociceptieve netwerk. Tegen het derde larvale stadium van klasse IV vestigen multidendritische sensorische neuronen (nociceptoren) klasse IV dendritische arborisatie (cIVda) de meeste synaptische contacten met Basin-4 interneuronen. Om de functionele relevantie van deze anatomische verbindingen te beoordelen, werd de genetisch gecodeerde calciumindicator CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) gebruikt in levende, niet-dissecte larven van het derde stadium als activiteitsafhankelijke reporter om synaptische connectiviteit tussen cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen te evalueren. CaMPARI is een ratiometrische fluorescentie-indicator waarvan het emissiespectrum verandert als reactie op verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Onder basisomstandigheden fluoresceert CaMPARI groen; In aanwezigheid van hoge calciumconcentraties en bij blootstelling aan fotoconversielicht (~400 nm) schakelt het onomkeerbaar over naar rode fluorescentie. Omdat calciuminstroom in postsynaptische neuronen een kenmerk is van synaptische activatie, levert CaMPARI-fotoconversie een weergave van functionele synaptische signalering. Er wordt een stapsgewijze methode gepresenteerd om larven van het derde stadium op een microscoopglaasje te immobiliseren voor optogenetische activatie van cIVda-nociceptoren met behulp van de roodverschoven channelrhodopsine CsChrimson, gecombineerd met gelijktijdige CaMPARI-fotoconversie in Basin-4 neuronen. Calciumafhankelijke fotoconversie in Basin-4 neuronen, ondanks interne bewegingen en veranderingen in het focale vlak, levert functioneel bewijs van synaptische connectiviteit tussen deze cellen. Dit dient als bewijs van het principe voor het gebruik van CaMPARI in combinatie met presynaptische optogenetische stimulatie bij intacte, niet-ontleden Drosophila-larven .

Introduction

Het identificeren van precieze synaptische partners in het centrale zenuwstelsel (CZS) maakt het mogelijk om de vorming en verfijning van synaptische verbindingen tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel te volgen. Daarom zijn de inspanningen gericht op het gebruik van volumetrische elektronenmicroscopie (EM) om niet alleen volledige connectomen te reconstrueren in krachtige genetische modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans ^1,2 en Drosophila melanogaster ^3,4,5, maar ook op millimeterschaal EM-volumes van complexe zoogdierhersenen, waaronder de primaire visuele cortex⁶ van de muis en de menselijke temporale cortex⁷. Deze studies bieden unieke inzichten in de organisatorische principes die ten grondslag liggen aan synaptische connectiviteit op anatomisch niveau. Functionele karakterisering van synaptische partners biedt echter complementair inzicht in neuronale connectiviteit en is vereist om anatomische bevindingen te valideren.

Drosophila biedt tal van voordelen voor de studie van neuronale connectiviteit, waaronder de beschikbaarheid van complete connectomen voor het larvale³ evenals het vrouwelijke⁴ en⁵ mannelijke volwassen centrale zenuwstelsel, naast goed gekarakteriseerde neuronale circuits die voorspelbaar gedrag reguleren ^8,9,10. Het larvale nociceptieve netwerk vertegenwoordigt zo'n goed geschikt circuit voor het bestuderen van precieze synaptische connectiviteit¹¹. EM-reconstructie van dit netwerk heeft gedetailleerde synaptische partnerschappen aan het licht gebracht die nodig zijn voor het verwerken van nociceptieve stimuli, wat heeft geleid tot het karakteristieke ontsnappingsgedrag dat bekend staat als nocifensief rollen^12,13.

Binnen dit netwerk functioneren klasse IV dendritische arborisatieneuronen (cIVda)¹⁴ als primaire sensorische nociceptoren die verantwoordelijk zijn voor pijndetectie 11,12,13,15,16. Hun cellichamen en dendrieten bevinden zich perifeer in de lichaamswand, terwijl hun axonen projecteren in het larvale ventrale zenuwkoord (VNC)¹⁵. Binnen het CZS arboriseren cIVda-neuronen hun axonale uiteinden in een stereotiep patroon en vormen ze het merendeel van hun synaptische contacten met Basin-4 interneuronen ^11,12,13,17. Deze gedefinieerde synaptische relatie stelt cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen vast als een ideaal paar voor functionele beoordeling van synaptische connectiviteit in vivo. De ontwikkeling van methoden om functionele verbindingen tussen individueel geïdentificeerde synaptische partners te analyseren, zal het onderzoeken van mechanismen achter synaptische ontwikkeling en verfijning vergemakkelijken, met name in genetisch tractabele systemen met stereotiepe neurale circuits.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)¹⁸ is een genetisch gecodeerde ratiometrische fluorescentie-indicator waarvan het emissiespectrum verschuift als reactie op verhoogde intracellulaire calciumniveaus. Onder basisomstandigheden fluoresceert CaMPARI groen; In aanwezigheid van hoge calciumconcentraties en bij blootstelling aan fotoconversielicht (~400 nanometer (nm)), zet het onomkeerbaar om in rode fluorescentie¹⁸. Omdat calciuminstroom in postsynaptische neuronen een kenmerk is van synaptische activatie, levert CaMPARI fotoconversie een uitlezing van functionele synaptische signalering^19,20.

Naast CaMPARI kan neuronale activiteit worden gevisualiseerd met reversibele sensoren zoals genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zoals GCaMP of RCAMP²¹, evenals genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's)²² zoals Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ of VARNAM²⁵. Hoewel deze snelle, omkeerbare sensoren goed geschikt zijn voor het in realtime monitoren van tijdelijke activiteit, zijn ze gevoelig voor bewegingsartefacten tijdens in vivo beeldvorming. Daarentegen maken de integratieve en onomkeerbare fotoconversie-eigenschappen van CaMPARI het mogelijk om activiteit over een bepaald tijdsvenster vast te leggen, waardoor neuronale activatie kan worden gedetecteerd, zelfs wanneer focale vlakken tijdens beeldvorming²⁰ verschuiven. Daarnaast kan CaMPARI-fotoconversie worden afgestemd door de intensiteit van violet licht aan te passen, waardoor verminderde synaptische sterkte of subdrempel ingangen²⁶ kunnen worden gedetecteerd. Deze eigenschappen hebben het mogelijk gemaakt activiteitskaartlegging in vrij bewegende dieren zonder hoofdfixatie of aanbinding, waaronder studies in muiscortex²⁷, zebravishersenen²⁸, C. elegans²⁹ en volwassen Drosophila²⁰.

Er wordt een protocol beschreven voor het visualiseren van functionele synaptische partners via CaMPARI-fotoconversie gecombineerd met presynaptische optogenetische stimulatie met behulp van confocale microscopie in intacte, niet-dissecte Drosophila-larven. In deze benadering wordt CaMPARI gebruikt om postsynaptische calciuminstroom in Basin-4 interneuronen te detecteren na optogenetische activatie van cIVda-neuronen in levende larven van het derde stadium. cIVda-neuronen drukken het door rood licht geactiveerde kanaalrhodopsine CsChrimson ^30,31 tot expressie, terwijl Basin-4 interneuronen CaMPARI tot expressie brengen. Blootstelling aan rood licht activeert selectief nociceptoren, die een nociceptieve stimulus op een temporeel gecontroleerde manier nabootsen^16,30. Deze strategie maakt het mogelijk te beoordelen of presynaptische activatie calciumafhankelijke CaMPARI-fotoconversie induceert in postsynaptische neuronen, waardoor functioneel bewijs van synaptische connectiviteit wordt geleverd.

Verschillende technische voordelen ondersteunen het gebruik van CaMPARI in combinatie met CsChrimson voor de analyse van de cIVda–Basin-4 connectiviteit. Ten eerste vormen cIVda-dendrieten een complete, niet-overlappende betegeling van de larvale lichaamswand³², waardoor optogenetische activatie van intacte sensorische neuronen mogelijk is zonder verstorende effecten van door dissectie veroorzaakte schade¹⁶. Ten tweede, hoewel larven fysiek geïmmobiliseerd zijn op een microscoopobject, veranderen interne bewegingen vaak de positie en het focale vlak van het centraal tijdens beeldvorming; CaMPARI-fotoconversie is minder gevoelig voor dergelijke bewegingsartefacten en biedt een stabiele, tijdgeïntegreerde uitlezing van neuronale activiteit. Ten derde maken de integratieve en afstembare eigenschappen van CaMPARI het mogelijk synaptische activiteit te detecteren, zelfs wanneer de synaptische sterkte of het contactaantal is verminderd, zoals tijdens vroege ontwikkelingsstadia, wat toekomstige studies naar synapsvorming en -verfijning ondersteunt.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij Drosophila melanogaster betrokken was, werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen. Het genotype w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (verkregen door RRID:BDSC_54899¹² en RRID:BDSC_32079¹⁶ te recombineren) werd gebruikt om optogenetische en CaMPARI-expressie aan te sturen (met behulp van de lijn w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo verkregen door RRID:BDSC_81085 met markers van het tweede chromosoom) respectievelijk in pre- en postsynaptische partners. De onderzoeksinstrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van larven

1. Genetische kruisingen opzetten tussen maagdelijke vrouwtjes UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) en mannetjes van een vlieglijn met twee binaire systemen, bijvoorbeeld, waarbij de presynaptische neuron van belang de expressie van GAL4 aandrijft en de postsynaptische neuron van belang LexA^33,34 aanstuurt.
2. Stel genetische kruisingen in plastic flesjes met standaard maïsmeel-agar medium 35,36,37,38 aangevuld met 0,5 mM all-trans retinal (ATR) voor CsChrimson-activatie ^30,33. Bereid parallelle flesjes voor zonder ATR als geen ATR-controle.
   OPMERKING: Smelt het maïsmeel-agarmedium zonder te koken. Laat het afkoelen zonder te stollen. Maak een 40 mM ATR-voorraadoplossing (poeder ATR verdund in 95% ethanol volgens de fabrikantsinstructies), verdun vervolgens tot 0,5 mM in het medium en meng grondig.
3. Bedek de flesjes volledig met aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen.
   OPMERKING: Houd de opvoedingsomstandigheden in constante duisternis vanwege de lichtgevoelige aard van ATR en voorkom onbedoelde neuronale activatie. Hoewel CsChrimson het meest gevoelig is voor rood licht (590–680 nm), kan het ook worden geactiveerd door andere zichtbare golflengten^31,39.
4. Breng flesjes uit op 25 °C en verhoog de larven tot het derde stadium.

2. Larve-immobilisatie

1. Verzamel een larve van het derde stadium met een penseel. Was de larven in een micro-spot plate met drie putten met 0,1 M PBS om voedsel te verwijderen.
   OPMERKING: Verwijder overtollige PBS niet; Het helpt hydratatie te behouden.
2. Plaats een kleine hoeveelheid boetseerklei op elke hoek van een schone deklaag (18 × 18 mm). Plaats de larve in een druppel PBS op de deklaag en laat deze met de buikzijde naar beneden liggen.
   OPMERKING: Voor beeldvorming van het ventrale zenuwkoord (VNC) wordt de larve op de dorsale zijde geplaatst zodat het ventrale oppervlak contact maakt met de deklaag. Deze oriëntatie stelt Basin-4 interneuronen in de VNC in staat om het doelwit te bekijken via de coverslip.
3. Plaats een schoon microscoopglaasje over het dekstuk met de larve.
4. Bevestig de deklaag door extra modelleerklei op de hoeken aan te brengen. Oefen voldoende druk uit om de larve te immobiliseren, terwijl je een ruptie of dekbedekking voorkomt.

3. Stimulatie-, fotoconversie- en beeldvormingsworkflow

1. Verkrijg een baseline z-stack van postsynaptische neuronen die CaMPARI expresseren met gelijktijdige groene (488 nm, 0,8% laservermogen) en rode (~561 nm, 0,8% laservermogen) kanalen. Gebruik een Z-stap van 1 μm, 256 × resolutie van 256 pixels, lijngemiddelde van 2, bidirectionele scansnelheid en scansnelheid van 9 op een confocale microscoop uitgerust met een 40×/1,2 objectief. Voer alle beeldvorming uit in een donkere omgeving. Houd identieke z-stackparameters gedurende het hele experiment aan.
   OPMERKING: Verwacht felgroene cellichamen op stereotiepe posities in de larvale VNC en geen detecteerbare rode fluorescentie bij de basislijn.
2. Stimuleer de larve continu gedurende 30 seconden met gelijktijdig fotoconversielicht (405 nm, 0,5% laservermogen) en optogenetisch stimulatielicht (594 nm, 0,8% laservermogen).
3. Verkrijg een z-stack na stimulatie met dezelfde parameters als in stap 3.1 onder zowel rode (~561 nm) als groene (488 nm) kanalen. Verwacht VNC-cellichamen op vergelijkbare posities als in de basislijn. Detectie van rode CaMPARI-fluorescentie in neuronen die tijdens stimulatie worden geactiveerd in ATR-gevoede larven, met minimale fotoconversie in controles zonder ATR.
   OPMERKING: Workflow en parameters zijn samengevat in Figuur 1.

Figuur 1: Werkwijze voor stimulatie, fotoconversie (PC) en beeldvorming. Drie sequentiële beeldvormingsfasen werden gebruikt om calciumactiviteit in Basin-4 neuronen te beoordelen. Tijdens de basisfase werden z-stacks verkregen met 488 nm en 561 nm lasers om groene en rode CaMPARI-fluorescentie vast te leggen voorafgaand aan stimulatie. Tijdens de stimulatiefase werden cIVda-neuronen optogenetisch geactiveerd via CsChrimson (594 nm), terwijl gelijktijdige 405 nm-verlichting actieve CaMPARI fotoconverteerde van groene naar rode fluorescentie; Er werd geen beeldvorming uitgevoerd tijdens deze periode van 30 seconden. Tijdens de post-stimulatiefase werden z-stacks opnieuw verkregen met dezelfde laserinstellingen als bij de basislijn om het fotoomgezette rode signaal in de Basin-4 cellichamen te detecteren. Alle z-stacks werden verkregen op 256 × 256 pixels met 1 μm Z-stappen, lijngemiddelde van 2 en bidirectionele scanning onder donkere omstandigheden met een confocale microscoop uitgerust met een 40×/1,2 NA-objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beeldvormende analyse

1. Open z-stack afbeeldingen in Fiji (RRID:SCR_002285) met Bio-formaten ingeschakeld. Stel Stackweergave in op Hyperstack, Kleurmodus op Composite, en schakel Autoscale in. Scroll door Z-vlakken en selecteer het vlak met optimale focus. Dupliceer het geselecteerde vlak (Afbeelding → Duplicaat; Kanalen: 1–2; geselecteerd Z-vlak).
2. Splits rode en groene kanalen (afbeelding → kleur → gesplitste kanalen).
   OPMERKING: Pas helderheid en contrast aan met Image → Adjust → Brightness/Contrast → Auto voor beide kanalen.
3. Trek achtergrond af van beide kanalen (Proces → Achtergrond Aftrekken) met een rollende balstraal van 50 px.
4. Configureer metingen (Analyze → Set Measurements) om Area, Mean gray value, Integrated density (IntDen), standaarddeviatie en Min & Max grijswaarden te includeren.
5. Teken interessegebieden (ROI's) rond elke cel in het groene kanaal met behulp van de Freehand-tool. Voeg ROI's toe aan de ROI Manager en meet. Pas dezelfde ROIs toe op het rode kanaal en meet.
6. Noteer alle metingen in een spreadsheet, inclusief larve- en celidentificaties.
   OPMERKING: Voer metingen uit voor zowel pre- als poststimulatiebeelden.
7. Bereken rood-groen fluorescentieverhoudingen met behulp van geïntegreerde dichtheidswaarden om (R/G)_post en (R/G)_pre voor elke cel te verkrijgen. Gemiddelde celniveauwaarden per larve.
   OPMERKING: Geïntegreerde dichtheid (oppervlakte × gemiddelde) maakt vergelijking mogelijk over cellen van verschillende groottes.
8. Bereken Δ(R/G) als (R/G)_post − (R/G)_pre met behulp van larvale gemiddelden. Interpreteer positieve Δ(R/G)-waarden als verhoogde postsynaptische calciumactiviteit tijdens fotoconversie.
   OPMERKING: Negatieve Δ(R/G)-waarden kunnen ontstaan door ruis of achtergrondasymmetrie. Zet negatieve waarden op 0. In deze dataset liet één larve een negatieve waarde zien (−0,008), die op 0 werd gezet.

Results

Na dit protocol werd de functionele connectiviteit tussen cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen beoordeeld bij levende, niet-dissecte D. melanogaster derde instar larven met behulp van CaMPARI (Figuur 2). Voorafgaand aan stimulatie met fotoconversie (PC) licht of optogenetische activatie vertoonden Basin-4 interneuronen groene fluorescentie door cytosolische CaMPARI-expressie (Figuur 2A). Er werd geen rode fluorescentie gedetecteerd onder basisomstand...

Discussion

Het hier beschreven protocol maakt kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van synaptische connectiviteit mogelijk tussen gedefinieerde synaptische partners in intacte D. melanogaster-larven . Deze benadering maakt gebruik van de combinatie van optogenetische stimulatie van cIVda-sensorneuronen met CaMPARI-gebaseerde visualisatie van geactiveerde postsynaptische Basin-4 interneuronen om synaptische activiteit in het centrale zenuwstelsel (CZS) van niet-dissecte larven te monit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Chemisch middel gebruikt in oplossing om larven te hydrateren en te monteren
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chemisch middel toegevoegd aan voedsel om optogenetische hulpmiddelen te activeren
Confocal Microscope	ZEISS	LSM900 Confocal	Confocale microscoop, Objectieflens (40×/1.2 NA), Licht-/laserbron (405, 488, 561 nm)
Dekvlakken (18x18mm)	VWR	48366-205	Gebaten om dieren voor beeldvorming te monteren
Ethanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Gebaten als oplosmiddel voor poeder ATR
Fiji (ImageJ)	Open source	RRID:SCR_002285	Gebaten voor beeldanalyse
Prism versie 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Gebaten voor statistische analyse
Microscoopglazen	VWR	48300-041	Gebaten om dieren voor beeldvorming te monteren
Modelleerklei	Flinn scientific	FB0600	Gebaten om glasdekje op microscoopglaasje met larven ertussen vast te houden
Verfkwast	Genesee scientific	59-204	Gebaten om larven tussen locaties over te brengen
Standaard korenmeel-agar medium	Genesee scientific	66-123	Voedsel kan ook worden bereid met behulp van vergelijkbare standaardrecepten en ingrediënten
Standaard Drosophila-kunststof buisjes (25mm x 95mm Drosophila smalle buisjes)	Genesee scientific	32-109	Grote buisjes of flessen kunnen ook worden gebruikt
Drie-putjes micro spot plaat	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Plaat gebruikt om individuele larven te scheiden en te reinigen
Drosophila-stam (genotype: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Verkregen door recombinatie van RRID:BDSC_54899 en RRID:BDSC_32079
Drosophila-stam (genotype: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Verkregen door recombinatie van RRID:BDSC_81085 met tweede chromosoommarkeringen