Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Summary

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Abstract

Connectome-studies hebben het begrip van synaptische connectiviteit in de zenuwstelsels van verschillende soorten sterk vergroot. Hoewel karakterisering van synaptische partners met behulp van elektronenmicroscopie (EM) gedetailleerde anatomische informatie biedt, vereisen functionele aspecten van neuronale netwerken complementaire benaderingen. Recente studies in Drosophila hebben niet alleen het volledige connectoom van de larvale en het mannelijke en vrouwelijke volwassen centrale zenuwstelsel onthuld, maar ook de cellulaire componenten van neuronale netwerken die specifiek gedrag reguleren, zoals het larvale nociceptieve netwerk. Tegen het derde larvale stadium van klasse IV vestigen multidendritische sensorische neuronen (nociceptoren) klasse IV dendritische arborisatie (cIVda) de meeste synaptische contacten met Basin-4 interneuronen. Om de functionele relevantie van deze anatomische verbindingen te beoordelen, werd de genetisch gecodeerde calciumindicator CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) gebruikt in levende, niet-dissecte larven van het derde stadium als activiteitsafhankelijke reporter om synaptische connectiviteit tussen cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen te evalueren. CaMPARI is een ratiometrische fluorescentie-indicator waarvan het emissiespectrum verandert als reactie op verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Onder basisomstandigheden fluoresceert CaMPARI groen; In aanwezigheid van hoge calciumconcentraties en bij blootstelling aan fotoconversielicht (~400 nm) schakelt het onomkeerbaar over naar rode fluorescentie. Omdat calciuminstroom in postsynaptische neuronen een kenmerk is van synaptische activatie, levert CaMPARI-fotoconversie een weergave van functionele synaptische signalering. Er wordt een stapsgewijze methode gepresenteerd om larven van het derde stadium op een microscoopglaasje te immobiliseren voor optogenetische activatie van cIVda-nociceptoren met behulp van de roodverschoven channelrhodopsine CsChrimson, gecombineerd met gelijktijdige CaMPARI-fotoconversie in Basin-4 neuronen. Calciumafhankelijke fotoconversie in Basin-4 neuronen, ondanks interne bewegingen en veranderingen in het focale vlak, levert functioneel bewijs van synaptische connectiviteit tussen deze cellen. Dit dient als bewijs van het principe voor het gebruik van CaMPARI in combinatie met presynaptische optogenetische stimulatie bij intacte, niet-ontleden Drosophila-larven .

Introduction

Het identificeren van precieze synaptische partners in het centrale zenuwstelsel (CZS) maakt het mogelijk om de vorming en verfijning van synaptische verbindingen tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel te volgen. Daarom zijn de inspanningen gericht op het gebruik van volumetrische elektronenmicroscopie (EM) om niet alleen volledige connectomen te reconstrueren in krachtige genetische modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans ^1,2 en Drosophila melanogaster ^3,4,5, maar ook op millimeterschaal EM-volumes van complexe zoogdierhersenen, waaronder de primaire visuele cortex⁶ van de muis en de menselijke temporale cortex⁷. Deze studies bieden unieke inzichten in de organisatorische principes die ten grondslag liggen aan synaptische connectiviteit op anatomisch niveau. Functionele karakterisering van synaptische partners biedt echter complementair inzicht in neuronale connectiviteit en is vereist om anatomische bevindingen te valideren.

Drosophila biedt tal van voordelen voor de studie van neuronale connectiviteit, waaronder de beschikbaarheid van complete connectomen voor het larvale³ evenals het vrouwelijke⁴ en⁵ mannelijke volwassen centrale zenuwstelsel, naast goed gekarakteriseerde neuronale circuits die voorspelbaar gedrag reguleren ^8,9,10. Het larvale nociceptieve netwerk vertegenwoordigt zo'n goed geschikt circuit voor het bestuderen van precieze synaptische connectiviteit¹¹. EM-reconstructie van dit netwerk heeft gedetailleerde synaptische partnerschappen aan het licht gebracht die nodig zijn voor het verwerken van nociceptieve stimuli, wat heeft geleid tot het karakteristieke ontsnappingsgedrag dat bekend staat als nocifensief rollen^12,13.

Binnen dit netwerk functioneren klasse IV dendritische arborisatieneuronen (cIVda)¹⁴ als primaire sensorische nociceptoren die verantwoordelijk zijn voor pijndetectie 11,12,13,15,16. Hun cellichamen en dendrieten bevinden zich perifeer in de lichaamswand, terwijl hun axonen projecteren in het larvale ventrale zenuwkoord (VNC)¹⁵. Binnen het CZS arboriseren cIVda-neuronen hun axonale uiteinden in een stereotiep patroon en vormen ze het merendeel van hun synaptische contacten met Basin-4 interneuronen ^11,12,13,17. Deze gedefinieerde synaptische relatie stelt cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen vast als een ideaal paar voor functionele beoordeling van synaptische connectiviteit in vivo. De ontwikkeling van methoden om functionele verbindingen tussen individueel geïdentificeerde synaptische partners te analyseren, zal het onderzoeken van mechanismen achter synaptische ontwikkeling en verfijning vergemakkelijken, met name in genetisch tractabele systemen met stereotiepe neurale circuits.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)¹⁸ is een genetisch gecodeerde ratiometrische fluorescentie-indicator waarvan het emissiespectrum verschuift als reactie op verhoogde intracellulaire calciumniveaus. Onder basisomstandigheden fluoresceert CaMPARI groen; In aanwezigheid van hoge calciumconcentraties en bij blootstelling aan fotoconversielicht (~400 nanometer (nm)), zet het onomkeerbaar om in rode fluorescentie¹⁸. Omdat calciuminstroom in postsynaptische neuronen een kenmerk is van synaptische activatie, levert CaMPARI fotoconversie een uitlezing van functionele synaptische signalering^19,20.

Naast CaMPARI kan neuronale activiteit worden gevisualiseerd met reversibele sensoren zoals genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zoals GCaMP of RCAMP²¹, evenals genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's)²² zoals Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ of VARNAM²⁵. Hoewel deze snelle, omkeerbare sensoren goed geschikt zijn voor het in realtime monitoren van tijdelijke activiteit, zijn ze gevoelig voor bewegingsartefacten tijdens in vivo beeldvorming. Daarentegen maken de integratieve en onomkeerbare fotoconversie-eigenschappen van CaMPARI het mogelijk om activiteit over een bepaald tijdsvenster vast te leggen, waardoor neuronale activatie kan worden gedetecteerd, zelfs wanneer focale vlakken tijdens beeldvorming²⁰ verschuiven. Daarnaast kan CaMPARI-fotoconversie worden afgestemd door de intensiteit van violet licht aan te passen, waardoor verminderde synaptische sterkte of subdrempel ingangen²⁶ kunnen worden gedetecteerd. Deze eigenschappen hebben het mogelijk gemaakt activiteitskaartlegging in vrij bewegende dieren zonder hoofdfixatie of aanbinding, waaronder studies in muiscortex²⁷, zebravishersenen²⁸, C. elegans²⁹ en volwassen Drosophila²⁰.

Er wordt een protocol beschreven voor het visualiseren van functionele synaptische partners via CaMPARI-fotoconversie gecombineerd met presynaptische optogenetische stimulatie met behulp van confocale microscopie in intacte, niet-dissecte Drosophila-larven. In deze benadering wordt CaMPARI gebruikt om postsynaptische calciuminstroom in Basin-4 interneuronen te detecteren na optogenetische activatie van cIVda-neuronen in levende larven van het derde stadium. cIVda-neuronen drukken het door rood licht geactiveerde kanaalrhodopsine CsChrimson ^30,31 tot expressie, terwijl Basin-4 interneuronen CaMPARI tot expressie brengen. Blootstelling aan rood licht activeert selectief nociceptoren, die een nociceptieve stimulus op een temporeel gecontroleerde manier nabootsen^16,30. Deze strategie maakt het mogelijk te beoordelen of presynaptische activatie calciumafhankelijke CaMPARI-fotoconversie induceert in postsynaptische neuronen, waardoor functioneel bewijs van synaptische connectiviteit wordt geleverd.

Verschillende technische voordelen ondersteunen het gebruik van CaMPARI in combinatie met CsChrimson voor de analyse van de cIVda–Basin-4 connectiviteit. Ten eerste vormen cIVda-dendrieten een complete, niet-overlappende betegeling van de larvale lichaamswand³², waardoor optogenetische activatie van intacte sensorische neuronen mogelijk is zonder verstorende effecten van door dissectie veroorzaakte schade¹⁶. Ten tweede, hoewel larven fysiek geïmmobiliseerd zijn op een microscoopobject, veranderen interne bewegingen vaak de positie en het focale vlak van het centraal tijdens beeldvorming; CaMPARI-fotoconversie is minder gevoelig voor dergelijke bewegingsartefacten en biedt een stabiele, tijdgeïntegreerde uitlezing van neuronale activiteit. Ten derde maken de integratieve en afstembare eigenschappen van CaMPARI het mogelijk synaptische activiteit te detecteren, zelfs wanneer de synaptische sterkte of het contactaantal is verminderd, zoals tijdens vroege ontwikkelingsstadia, wat toekomstige studies naar synapsvorming en -verfijning ondersteunt.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij Drosophila melanogaster betrokken was, werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen. Het genotype w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (verkregen door RRID:BDSC_54899¹² en RRID:BDSC_32079¹⁶ te recombineren) werd gebruikt om optogenetische en CaMPARI-expressie aan te sturen (met behulp van de lijn w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo verkregen door RRID:BDSC_81085 met markers van het tweede chromosoom) respectievelijk in pre- en postsynaptische partners. De onderzoeksinstrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van larven

1. Genetische kruisingen opzetten tussen maagdelijke vrouwtjes UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) en mannetjes van een vlieglijn met twee binaire systemen, bijvoorbeeld, waarbij de presynaptische neuron van belang de expressie van GAL4 aandrijft en de postsynaptische neuron van belang LexA^33,34 aanstuurt.
2. Stel genetische kruisingen in plastic flesjes met standaard maïsmeel-agar medium 35,36,37,38 aangevuld met 0,5 mM all-trans retinal (ATR) voor CsChrimson-activatie ^30,33. Bereid parallelle flesjes voor zonder ATR als geen ATR-controle.
   OPMERKING: Smelt het maïsmeel-agarmedium zonder te koken. Laat het afkoelen zonder te stollen. Maak een 40 mM ATR-voorraadoplossing (poeder ATR verdund in 95% ethanol volgens de fabrikantsinstructies), verdun vervolgens tot 0,5 mM in het medium en meng grondig.
3. Bedek de flesjes volledig met aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen.
   OPMERKING: Houd de opvoedingsomstandigheden in constante duisternis vanwege de lichtgevoelige aard van ATR en voorkom onbedoelde neuronale activatie. Hoewel CsChrimson het meest gevoelig is voor rood licht (590–680 nm), kan het ook worden geactiveerd door andere zichtbare golflengten^31,39.
4. Breng flesjes uit op 25 °C en verhoog de larven tot het derde stadium.

2. Larve-immobilisatie

1. Verzamel een larve van het derde stadium met een penseel. Was de larven in een micro-spot plate met drie putten met 0,1 M PBS om voedsel te verwijderen.
   OPMERKING: Verwijder overtollige PBS niet; Het helpt hydratatie te behouden.
2. Plaats een kleine hoeveelheid boetseerklei op elke hoek van een schone deklaag (18 × 18 mm). Plaats de larve in een druppel PBS op de deklaag en laat deze met de buikzijde naar beneden liggen.
   OPMERKING: Voor beeldvorming van het ventrale zenuwkoord (VNC) wordt de larve op de dorsale zijde geplaatst zodat het ventrale oppervlak contact maakt met de deklaag. Deze oriëntatie stelt Basin-4 interneuronen in de VNC in staat om het doelwit te bekijken via de coverslip.
3. Plaats een schoon microscoopglaasje over het dekstuk met de larve.
4. Bevestig de deklaag door extra modelleerklei op de hoeken aan te brengen. Oefen voldoende druk uit om de larve te immobiliseren, terwijl je een ruptie of dekbedekking voorkomt.

3. Stimulatie-, fotoconversie- en beeldvormingsworkflow

1. Verkrijg een baseline z-stack van postsynaptische neuronen die CaMPARI expresseren met gelijktijdige groene (488 nm, 0,8% laservermogen) en rode (~561 nm, 0,8% laservermogen) kanalen. Gebruik een Z-stap van 1 μm, 256 × resolutie van 256 pixels, lijngemiddelde van 2, bidirectionele scansnelheid en scansnelheid van 9 op een confocale microscoop uitgerust met een 40×/1,2 objectief. Voer alle beeldvorming uit in een donkere omgeving. Houd identieke z-stackparameters gedurende het hele experiment aan.
   OPMERKING: Verwacht felgroene cellichamen op stereotiepe posities in de larvale VNC en geen detecteerbare rode fluorescentie bij de basislijn.
2. Stimuleer de larve continu gedurende 30 seconden met gelijktijdig fotoconversielicht (405 nm, 0,5% laservermogen) en optogenetisch stimulatielicht (594 nm, 0,8% laservermogen).
3. Verkrijg een z-stack na stimulatie met dezelfde parameters als in stap 3.1 onder zowel rode (~561 nm) als groene (488 nm) kanalen. Verwacht VNC-cellichamen op vergelijkbare posities als in de basislijn. Detectie van rode CaMPARI-fluorescentie in neuronen die tijdens stimulatie worden geactiveerd in ATR-gevoede larven, met minimale fotoconversie in controles zonder ATR.
   OPMERKING: Workflow en parameters zijn samengevat in Figuur 1.

Figuur 1: Werkwijze voor stimulatie, fotoconversie (PC) en beeldvorming. Drie sequentiële beeldvormingsfasen werden gebruikt om calciumactiviteit in Basin-4 neuronen te beoordelen. Tijdens de basisfase werden z-stacks verkregen met 488 nm en 561 nm lasers om groene en rode CaMPARI-fluorescentie vast te leggen voorafgaand aan stimulatie. Tijdens de stimulatiefase werden cIVda-neuronen optogenetisch geactiveerd via CsChrimson (594 nm), terwijl gelijktijdige 405 nm-verlichting actieve CaMPARI fotoconverteerde van groene naar rode fluorescentie; Er werd geen beeldvorming uitgevoerd tijdens deze periode van 30 seconden. Tijdens de post-stimulatiefase werden z-stacks opnieuw verkregen met dezelfde laserinstellingen als bij de basislijn om het fotoomgezette rode signaal in de Basin-4 cellichamen te detecteren. Alle z-stacks werden verkregen op 256 × 256 pixels met 1 μm Z-stappen, lijngemiddelde van 2 en bidirectionele scanning onder donkere omstandigheden met een confocale microscoop uitgerust met een 40×/1,2 NA-objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beeldvormende analyse

1. Open z-stack afbeeldingen in Fiji (RRID:SCR_002285) met Bio-formaten ingeschakeld. Stel Stackweergave in op Hyperstack, Kleurmodus op Composite, en schakel Autoscale in. Scroll door Z-vlakken en selecteer het vlak met optimale focus. Dupliceer het geselecteerde vlak (Afbeelding → Duplicaat; Kanalen: 1–2; geselecteerd Z-vlak).
2. Splits rode en groene kanalen (afbeelding → kleur → gesplitste kanalen).
   OPMERKING: Pas helderheid en contrast aan met Image → Adjust → Brightness/Contrast → Auto voor beide kanalen.
3. Trek achtergrond af van beide kanalen (Proces → Achtergrond Aftrekken) met een rollende balstraal van 50 px.
4. Configureer metingen (Analyze → Set Measurements) om Area, Mean gray value, Integrated density (IntDen), standaarddeviatie en Min & Max grijswaarden te includeren.
5. Teken interessegebieden (ROI's) rond elke cel in het groene kanaal met behulp van de Freehand-tool. Voeg ROI's toe aan de ROI Manager en meet. Pas dezelfde ROIs toe op het rode kanaal en meet.
6. Noteer alle metingen in een spreadsheet, inclusief larve- en celidentificaties.
   OPMERKING: Voer metingen uit voor zowel pre- als poststimulatiebeelden.
7. Bereken rood-groen fluorescentieverhoudingen met behulp van geïntegreerde dichtheidswaarden om (R/G)_post en (R/G)_pre voor elke cel te verkrijgen. Gemiddelde celniveauwaarden per larve.
   OPMERKING: Geïntegreerde dichtheid (oppervlakte × gemiddelde) maakt vergelijking mogelijk over cellen van verschillende groottes.
8. Bereken Δ(R/G) als (R/G)_post − (R/G)_pre met behulp van larvale gemiddelden. Interpreteer positieve Δ(R/G)-waarden als verhoogde postsynaptische calciumactiviteit tijdens fotoconversie.
   OPMERKING: Negatieve Δ(R/G)-waarden kunnen ontstaan door ruis of achtergrondasymmetrie. Zet negatieve waarden op 0. In deze dataset liet één larve een negatieve waarde zien (−0,008), die op 0 werd gezet.

Results

Na dit protocol werd de functionele connectiviteit tussen cIVda-neuronen en Basin-4-interneuronen beoordeeld bij levende, niet-dissecte D. melanogaster derde instar larven met behulp van CaMPARI (Figuur 2). Voorafgaand aan stimulatie met fotoconversie (PC) licht of optogenetische activatie vertoonden Basin-4 interneuronen groene fluorescentie door cytosolische CaMPARI-expressie (Figuur 2A). Er werd geen rode fluorescentie gedetecteerd onder basisomstandigheden (Figuur 2B), wat de afwezigheid van fotoconversie vóór stimulatie bevestigt.

Gelijktijdige blootstelling aan PC-licht en optogenetische stimulatie resulteerde in CaMPARI-fotoconversie van groene naar rode fluorescentie (Figuur 2C, D). Om te verifiëren dat fotoconversie specifiek werd aangedreven door CsChrimson-gemedieerde neuronale activiteit, werd een negatieve controle uitgevoerd met larven van dezelfde genetische achtergrond (van dezelfde ouderlijke kruising) die zonder all-trans retinal (ATR) waren opgevoed. Omdat ATR een essentiële cofactor is voor de functie van CsChrimson, maakt het ontbreken ervan de opsin niet functioneel ondanks blootstelling aan 594 nm stimulatielicht. Deze controle richt zich ook op mogelijke nociceptoractivatie door 405 nm PC-licht zelf⁴⁰, aangezien ATR-vrije larven aan hetzelfde stimulatieprotocol werden onderworpen, inclusief PC-lichtblootstelling⁴⁰.

Hoewel een laag niveau van rode CaMPARI-fluorescentie werd waargenomen bij ATR-vrije controlelarven, wat consistent is met gedeeltelijke fotoconversie geïnduceerd door alleen PC-licht, toonde kwantificering van Δ(R/G) significant hogere waarden bij proefdieren vergeleken met controles (Figuur 2E). Deze toename geeft aan dat de verbeterde fotoconversie in experimentele larven afhankelijk is van CsChrimson-gedreven neuronale activiteit.

Beeldanalyse werd uitgevoerd in Fiji (RRID:SCR_002285) zoals beschreven in het protocol. Statistische vergelijking van Δ(R/G)-waarden tussen experimentele en ATR-vrije controlegroepen werd uitgevoerd in GraphPad (RRID:SCR_002798) met een ongepaarde t-test na bevestiging van de normale verdeling en ongeveer gelijke standaarddeviaties tussen groepen.

Figuur 2. CaMPARI-fotoconversie in Basin-4-interneuronen toont functionele synaptische activiteit na optogenetische stimulatie van cIVda-sensorneuronen in vivo. (A) Witte pijlen geven cellichamen van Basin-4 interneuronen aan binnen het larvale ventrale zenuwkoord (VNC) die groene CaMPARI-fluorescentie uitdrukken. (B) Afwezigheid van rode CaMPARI-fluorescentie in Basin-4-cellen, omlijnd door stippellijnen voorafgaand aan optogenetische stimulatie en vóór fotoconversielicht. Interessegebieden (ROI's) werden handmatig gedefinieerd rond groen-fluorescerende cellichamen in het groene kanaal met behulp van het vrijhandse selectiegereedschap in Fiji en vervolgens toegepast op het rode kanaal. (C) Rode en (D) groene CaMPARI-fluorescentie in Basin-4 interneuronen na gelijktijdige optogenetische stimulatie en fotoconversie-lichtblootstelling. (E) Elk datapunt vertegenwoordigt het gemiddelde Δ(R/G) per larve, berekend uit 1–4 cellen per individu (totale steekproefgroottes: controles, 8 larven, inclusief 23 cellen; experimentele groep, 9 larven, inclusief 19 cellen). Statistische analyse toont een significante toename van Δ(R/G) na optogenetische stimulatie en fotoconversie (experimentele groep) vergeleken met de basislijn in de conditie zonder ATR (controle). Schaalbalk: 10,2 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het hier beschreven protocol maakt kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van synaptische connectiviteit mogelijk tussen gedefinieerde synaptische partners in intacte D. melanogaster-larven . Deze benadering maakt gebruik van de combinatie van optogenetische stimulatie van cIVda-sensorneuronen met CaMPARI-gebaseerde visualisatie van geactiveerde postsynaptische Basin-4 interneuronen om synaptische activiteit in het centrale zenuwstelsel (CZS) van niet-dissecte larven te monitoren. Eerdere toepassingen van CaMPARI bij D. melanogaster richtten zich voornamelijk op volwassen stadia²⁰ of vereisten fysieke presynaptische stimulatie (bijv. nociceptieve thermische stimulatie)¹⁷. De huidige methode breidt het gebruik van CaMPARI uit naar eerdere ontwikkelingsstadia en introduceert een strategie voor functionele beoordeling van synaptische activiteit door het koppelen van optogenetische presynaptische stimulatie met CaMPARI-gebaseerde postsynaptische detectie. Optogenetische activatie zorgt voor prerecieze, temporele controle van presynaptische input, waardoor gecontroleerde stimulatie en daaropvolgende monitoring van de postsynaptische CaMPARI-respons mogelijk is.

Ondanks deze voordelen vereist de implementatie van deze aanpak zorgvuldige overweging van het experimentele ontwerp, geschikte controles en technische beperkingen. Negatieve controles, waaronder larven die zijn opgevoed zonder all-trans retinal (ATR), wat CsChrimson-activatie^{voorkomt 30,33}, of larven zonder CsChrimson-expressie, zijn nodig om de afwezigheid van CaMPARI-fotoconversie te bevestigen bij afwezigheid van presynaptische optogenetische stimulatie. Aanvullende factoren moeten ook worden meegenomen. Spontane of endogene postsynaptische activiteit kan samenvallen met fotoconversie (PC) lichtblootstelling, wat resulteert in presynaptisch-onafhankelijke CaMPARI groen-naar-rood conversie. Hoewel CsChrimson geoptimaliseerd is voor activatie door rood licht (590–680 nm), behoudt het gevoeligheid voor kortere golflengten³⁹, en beeldvormende lasers die vóór stimulatie worden gebruikt, kunnen onbedoeld een onbedoelde presynaptische activatie veroorzaken. Bovendien ontvangen postsynaptische neuronen input van meerdere presynaptische partners, zodat activatie door niet-doelinput kan samenvallen met PC-lichtblootstelling en kan leiden tot CaMPARI-fotoconversie onafhankelijk van gecontroleerde optogenetische stimulatie.

Zo ontvangen Basin-4 interneuronen synaptische input niet alleen van cIVda-neuronen, maar ook van klasse III multidendritische sensorische neuronen (cIIIda) en chordotonale (Ch) neuronen als onderdeel van het nociceptieve circuit 11,12,13,17. Deze interneuronen kunnen daarom worden geactiveerd door alternatieve exciterende inputs, waaronder mechanosensorische stimulatie geïnduceerd door druk van de dekmantel. Deze factor is specifiek voor de hier beschreven experimentele configuratie, maar benadrukt het belang van het meenemen van indirect netwerkgestuurde of niet-optogenetisch geïnduceerde CaMPARI-fotoconversie, vooral in controlecondities zonder ATR.

Om verder te controleren op niet-specifieke calciuminstroom en bijbehorende fotoconversie, kunnen larven worden onderverdeeld in twee groepen: één groep die alleen PC-licht ondergaat, en een tweede groep die gecombineerde PC-licht- en optogenetische stimulatie ondergaat, waarbij rode en groene z-stacks na elke aandoening worden verkregen om directe vergelijking tussen groepen mogelijk te maken. Fluorescentieintensiteiten die onder PC-only omstandigheden worden verkregen, kunnen vervolgens worden afgetrokken van die gemeten na gecombineerde stimulatie. Fotoconversieniveaus waargenomen onder controlecondities (geen ATR en alleen PC-stimulatie) geven een schatting van postsynaptische activatie als gevolg van stochastische endogene activiteit en netwerkgestuurde inputs.

Onder de beschreven experimentele omstandigheden resulteerde optogenetische stimulatie van cIVda-neuronen gecombineerd met CaMPARI-fotoconversie in Basin-4-interneuronen in een positieve Δ(R/G), wat wijst op synaptische activiteit tussen deze pre- en postsynaptische partners. Dit protocol biedt een kader voor het onderzoeken van functionele synaptische relaties in vivo en kan worden aangepast aan andere neuronale circuits in Drosophila. Door gerichte presynaptische activatie en activiteitsafhankelijke detectie in postsynaptische neuronen mogelijk te maken, ondersteunt deze aanpak validatie van synaptische verbindingen voorspeld door connectome-datasets en vergemakkelijkt het de studie van functionele connectiviteit tijdens ontwikkeling. Als zodanig vertegenwoordigt het een veelzijdige methode om de functie van neurale circuits in het genetisch hanteerbare zenuwstelsel van Drosophila te analyseren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Chemical used in solution to hydrate and mount larvae
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chemical added to food to activate optogenetic tools
Confocal Microscope	ZEISS	LSM900 Confocal	Confocal microscope, Objective lens (40×/1.2 NA), Light/laser source (405, 488, 561 nm)
Coverslips (18x18mm)	VWR	48366-205	Used to mount animals for imaging
Ethanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Used as solvent for powder ATR
Fiji (ImageJ)	Open source	RRID:SCR_002285	Used for imaging analysis
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Used for statistical analysis
Microscope slides	VWR	48300-041	Used to mount animals for imaging
Modeling clay	Flinn scientific	FB0600	Used to hold cover glass on microscope slide with larvae in between
Paintbrush	Genesee scientific	59-204	Used to transfer larvae between locations
Standard cornmeal agar medium	Genesee scientific	66-123	Food can also be prepared using similar standard recipes and ingredients
Standard Drosophila plastic vials (25mm x 95mm Drosophila narrow vials)	Genesee scientific	32-109	Large vials or bottles can also be used
Three-well micro spot plate	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Plate used to separate and clean individual larva
Drosophila stock (genotype: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Obtained from recombining RRID:BDSC_54899 and RRID:BDSC_32079
Drosophila stock (genotype: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Obtained from recombining RRID:BDSC_81085 with second chromosome markers